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Fish viscera are part of the solid waste discarded after consumption and processing of these animals. However, they can be utilized as a rich resource of enzymes. The traíra, Hoplias malabaricus (Bloch, 1794), little studied fish and having scarce of information about the enzymes produced by it, is a fish with great potential to be explored. In addition, the enzyme trypsin can be isolated from the traíra and present application in the scientific and technological field. However, it is necessary to know its structural and biological characteristics. With this information, this work pursued the purification and characterization of trypsin from traíra. With the traíra’s pyloric cecum was made a crude extract, which was fractionated by the precipitation with organic solvent and the precipitation with ammonium sulphate. Enzymatic hydrolysis tests were performed with the substrate N-α-benzoyl-L-arginine-4-nitroanilide (BApNA) in all fractions of the precipitations and it was observed that the fraction 20-40% of the saline precipitation had higher activity. Gel filtration chromatography (Sephacryl S-100 – 60 x 1 cm) of the 20-40% fraction showed a peak with high trypsin hydrolytic activity and low protein concentration, in others words, high specific activity. SDS-PAGE demonstrated the isolation of trypsin after saline precipitation and gel filtration on the Sephacryl S-100 column. . The enzyme isolated was characterized and showed high activity at pH 9.0 and temperature of 50 ºC, besides having inhibition of 98,95% by phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 94.04% by the soybean trypsin inhibitor (SBTI) and 94,74% by benzamidine, showing to be a serine protease The kinetic constant for this enzyme had Km with 1.62 mM and Vmax with 0.69 mM s-1. It is concluded in this work that trypsin from traira was partially isolated by two purification methods and that the enzyme showed catalytic efficiency in temperature and pH conditions distinct from others trypsins isolated from fish, thus demonstrating great potential for possible biotechnological applications. CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior As vísceras de peixes são parte dos resíduos sólidos descartados após o consumo e processamento desses animais. No entanto, elas podem ser aproveitadas como recurso rico de enzimas. A traíra, Hoplias malabaricus (Bloch, 1794), peixe pouco estudado e com poucas informações sobre enzimas produzidas, representa um grande potencial a ser explorado. Além disso, a enzima tripsina pode ser isolada da traíra e apresentar aplicação no âmbito científico e tecnológico. Porém, é necessário antes conhecer as características estruturais e biológicas da enzima de interesse. Diante dessas informações, esse estudo buscou a purificação e caracterização a tripsina da traíra. Com o ceco pilórico da traíra foi feito o extrato bruto, que foi fracionado pela precipitação com etanol e a precipitação com sulfato de amônia. Foram realizados testes de hidrólise enzimática com o substrato N-α-benzoil-L-arginina-4-nitroanilida (BApNA) em todas as frações das precipitações e foi observado que a fração 20-40% da precipitação salina teve maior atividade. A cromatografia de gel filtração Sephacryl S-100 (60x1 cm) da fração 20-40%, mostrou um pico com alta atividade hidrolítica de tripsina e baixa concentração de proteína, ou seja, alta atividade específica. O SDS-PAGE demonstrou o isolamento da tripsina após precipitação salina e gel filtração na coluna Sephacryl S-100. A enzima parcialmente isolada foi caracterizada e apresentou pH ótimo 9,0 e temperatura ótima de 50 ºC, além de ter inibição de 98,95% por fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF), 94,04% pelo inibidor da tripsina da soja (SBTI) e 94,74% pela benzamidina, mostrando ser uma serinoprotease. A constante cinética para essa enzima teve Km de 1,62 mM e Vmax de 0,69 mM s-1. Conclui-se nesse trabalho que a tripsina da traíra foi parcialmente isolada por dois métodos de purificação e que a enzima mostrou eficiência catalítica em condições de temperatura e pH distintas das demais tripsinas isoladas de peixes, assim demostrando ter grande potencial para possíveis aplicações biotecnológicas.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2014. As proteases se referem a um grupo de enzimas cuja função catalítica é hidrolisar proteínas. Enzimas proteolíticas encontram ampla aplicação em diversas indústrias e preparações farmacêuticas. Os fungos filamentosos são usados em muitos processos industriais para a produção de enzimas e metabólitos. Alguns desses fungos são produtores de uma série de enzimas, como amilases, pectinases e proteases. O presente trabalho teve como objetivo principal caracterizar proteases expressas por fungos filamentosos isolados de diferentes amostras do Cerrado do Centro-Oeste brasileiro, frente à produção de proteases de interesse industrial e farmacêutico em diversas condições de cultivo. Inicialmente, foi realizada uma triagem para avaliar a capacidade de 17 fungos quanto à produção de protease em meio de cultura contendo Ágar-leite. Oito espécies formaram halo no cultivo em placas de Petri contendo 10% de leite desnatado em Ágar indicando serem produtoras de proteases. Em seguida, quando cultivadas em estufa, no meio sabouraud, peptona e leite desnatado, seis espécies de fungos apresentaram altas atividades de protease sendo então cultivadas sob condição de agitação. Uma melhoria nas atividades de protease para as espécies Aspergillus foetidus, Penicillium variotti, Penicillium citrinum e Penicillium fellutanum foi obtida quando utilizado o cultivo em shaker. Um importante aumento na atividade proteolítica foi obtido para a espécie P.restrictum e P. fellutanum quando avaliado meio de cultivo contendo resíduo agroindustrial. No meio contendo farelo de trigo como fonte de carbono, a maior atividade proteolítica foi identificada quando realizado cultivo por P. restrictum (81,1 UI/mL), a as proteases presentes no meio possuem temperatura ótima igual a 45 °C e pH ótimo em uma faixa de 5,0 a 9,0. Sendo termoestáveis por 2 horas em pH e temperatura ótima. Desta forma, estas enzimas podem ser consideradas promissoras para aplicação industrial. Proteases are a group of enzymes whose catalytic function is the hydrolysis of proteins. Proteolytic enzymes have wide application in various industries and pharmaceutical preparations. Due to technical and economic advantage, microorganisms are the preferred source of industrial application of protease enzymes, although it can be obtained from animals and plants. Filamentous fungi have beeb used in many industrial processes for the production of enzymes and metabolites. Some of these fungi are producers of several enzymes as amylases, proteases and pectinases. This work aimed to characterize proteases expressed by filamentous fungi isolated from different samples of the Cerrado of Central Brazil, focusing the production of these enzymes of industrial and/or pharmaceutical interest in different growing conditions. Initially, a screening was performed to assess the ability of 17 fungi initially isolated for production of proteases in culture media containing 10% skim milk in agar. Eight species formed a clear zone surrounding colonies, indicating production of protease. These species were then cultivated in Sabouraud broth, peptone and skim milk. Six species showed high protease activity and were then incubated under agitation. Protease activity for the species Aspergillus foetidus, Penicillium variotti, Penicillium citrinum and Penicillium fellutanum improved when used in the cultivation in shaker.A significant increase in proteolytic activity was obtained for the species Penicillium restrictum and Penicillium fellutanum when evaluated in culture media containing agro industrial residues. In a media containing wheat bran as carbon source, the major proteolytic activity has been identified as performed by growing Penicillium restrictum (81.1 IU/mL). Proteases present in the medium have an excellent temperature of 45 °C and optimum pH in a range 5.0 to 9.0. We evaluated the physicochemical characterization and the enzymatic profile of the species Penicilliumrestrictum and Penicillium fellutanum for production of protease in different culture media. Thus, these enzymes can be considered promising for industrial application.

Tribunal: Dra. Adriana Esteves, Dra. Laura Franco Fraguas, Dr. Raúl Platero.

Mestrado em Biotecnologia Durante vários anos, as proteases foram vistas como enzimas cuja função era, fundamentalmente, a degradação de proteínas em processos como a digestão, coagulação sanguínea entre outros. Contudo, com o aumento do conhecimento científico da estrutura e função destas enzimas, esta visão foi sendo progressivamente alterada e atualmente as proteases são reconhecidas pela sua importância na sinalização celular em diversos processos biológicos. A caracterização do modo de atuação destas enzimas é importante. Para tal, o desenvolvimento de abordagens experimentais que permitam o enriquecimento e caracterização de proteases será crucial. No presente trabalho, foram sintetizadas e caracterizadas nanopartículas magnéticas de óxido de ferro, acopladas com inibidores específicos para proteases existentes em diversos biofluidos. Estudou-se o efeito da funcionalização química da superfície das nanopartículas magnéticas na estrutura e morfologia das nanopartículas. Após o acoplamento com os inibidores, foi testada a capacidade de interação destas nanopartículas com as proteases presentes nos biofluidos. Os resultados evidenciaram que após a funcionalização e acoplamento com os inibidores em estudo, não ocorreu alteração da estrutura cristalina e da morfologia das nanopartículas, não se tendo ainda verificado fenómenos de aglomeração. Os resultados obtidos por SDS-PAGE permitiram constatar que as nanopartículas com grupos carboxilo com ação quelante à superfície (NPs@EDTA) apresentaram capacidade para enriquecer especificamente metaloproteases, uma família de proteases cujo centro catalítico possui catiões metálicos (Zn2+). Estes resultados foram ainda validados por zimografia tendo-se a ocorrência de ligações específicas entre as metaloproteases e os inibidores ligados às nanopartículas magnéticas. No caso dos resultados do SDS-PAGE das NPs@aprotinina foi possível observar especificidade das interações entre as NPs e proteínas-alvo da saliva, não se tendo observado a ligação de proteínas abundantes na saliva, como a amilase, às NPs. Em suma, no presente trabalho desenvolveu-se um sistema de enriquecimento de proteases de sistemas biológicos envolvendo nanopartículas magnéticas que se revelou eficaz. Proteases have been seen as enzymes involved in protein degradation, in processes like digestion or blood coagulation. However, with the increase of the scientific knowledge and comprehension about their structures and functionality, this notion has evolved and now proteases are known to participate in a wide range of biological processes. Although, the importance of proteases on those processes is recognized, studies focused on their mechanism of action are very important. In this sense, strategies that allow proteases enrichment from biological samples followed by its characterization will be crucial. In the present work, iron oxide magnetic nanoparticles were synthetized and then coupled with specific inhibitors to proteases present in human biofluids. These nanoparticles were analyzed based on its morphology, stability in solution and other properties to evaluate the effects of the functionalization strategy. The ability of these magnetic nanoparticles coupled with inhibitors to interact with specific proteases from human biofluids was also evaluated. The results showed that after functionalization and coupling with inhibitors, the magnetic nanoparticles maintained their morphology, dispersibility in solution and the crystalline structure. SDS-PAGE data evidenced that nanoparticles surface functionalized with chelating carboxyl groups (NPs@EDTA) allows the specific enrichment of metaloproteases, a family of proteases whose active-site has metallic ions. These results were further validated by zymography in which a substrate for metalloproteases (gelatin) was incorporated. In the zymography gel, the presence of metaloproteases was confirmed, which corroborates the specificity of the interaction between metalloproteases from biological samples and the nanoparticles coupled with inhibitors. Regarding SDS-PAGE data of NPs@aprotinine it was observed the existence of specific interactions between NPs and salivary target proteins, not being observed the binding of abundant salivary proteins, such as amylase, to the NPs. In conclusion, functionalized magnetic nanoparticles coupled with proteases inhibitors showed high potential to be applied as specific capture systems for the characterization of proteases from biological samples.

Tribunal: Dra. Magela Laviña, Dra. Silvia Batista, Dra. Ana Ramón. Orientador: Dra. Susana Castro Sowinski

Este trabalho descreve a purificação e a caracterização bioquímica parcial de duas proteases das peçonhas de Bothrops alternatus (Balt-F1 e Balt-F2) e uma de Bothrops moojeni (Bmoo-F). As enzimas foram purificadas em colunas cromatográficas contendo as resinas DEAE Sephacel, Sephadex G-75 e Heparina-Agarose. O peso molecular aparente analisado em SDS-PAGE sob condições redutoras, mostrou bandas homogêneas de 26.200, 29.900 e 24.800, respectivamente. Todas as enzimas hidrolisaram as cadeias A-a e B-p do fibrinogênio bovino. A Balt-F1 não apresentou atividades coagulante e desfibrinogenante. As enzimas Balt-F2 e Bmoo-F, quando injetadas i.p. tornaram o sangue de camundongos incoagulável. A inibição da atividade proteolítica sobre o fibrinogênio bovino das enzimas Balt-F1, Balt-F2 e Bmoo-F por agentes quelantes de íons metálicos, permite classificá-las como metaloproteases. This work describes the purification and partial biochemical characterization of two proteases from Bothrops alternatus venoms (Balt-F1 and Balt-F2) and one from Bothrops moojeni (Bmoo-F). The enzymes were purified on chromatographic columns containing the DEAE Sephacel, Sephadex G-75 and Heparin-Agarose resins. The apparent molecular weight analyzed in SDS-PAGE under reducing conditions, showed homogeneous bands of 26,200, 29,900 and 24,800, respectively. All enzymes hydrolyzed bovine fibrinogen A-a and B-p chains. Balt-F1 did not show coagulating and defibrinogenating activities. The enzymes Balt-F2 and Bmoo-F, when injected i.p. made the blood of mice uncoagulable. The inhibition of proteolytic activity on bovine fibrinogen from the enzymes Balt-F1, Balt-F2 and Bmoo-F by metal ion chelating agents, allows them to be classified as metalloproteases. Dissertação (Mestrado)

A partir de frutos verdes de Bromelia hieronymi Mez se obtuvieron dos preparaciones proteolíticamente activas, que manifiestan su máximo poder caseinolítico a 60ºC y pH 6.85, observándose un segundo pico a pH 7.57. Al ser sometidas a cromatografías de intercambio aniónico (DEAE-Sephacel) ambas preparaciones se resuelven en tres fracciones activas: la primera de ellas es la de mayor potencialidad proteolítica, pero no es contenida por el intercambiador usado, aunque si por uno catiónico (SP Sephadex C50), que la descompone en dos fracciones proteicas, una de las cuales retiene la capacidad caseinolítica