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Doctoral thesis of the Doctoral Program on Chemical Engineer submitted to the Faculty of Sciences and Technology of the University of Coimbra Drug delivery systems have been designed to provide a pharmaceutical compound in a controlled manner, into a specific site. These systems are developed to reduce the drug side effects and control the biodistribution profile in order to improve therapeutic efficacy. One of the most common categories of these systems is the nanoparticle (such as hydrogels, liposomes and micelles). The drug is encaged inside the nanoparticle and driven to the required site (usually by the incorporation of target molecules or taking advantage of the enhanced permeability and retention effect of tissues), where the drug release will occur. In some applications, such as cancer therapy, a burst release of the drug could enhance the efficacy against the cancer cells. A range of stimuli can trigger the process of drug delivery. These stimuli can have internal (reactive oxygen species, pH, temperature) or external causes (ultrasound, magnetic field, light). For cancer therapy, micelles that release the drug upon an external stimulus are more advantageous, as the drug release is independent of the tumor-type or the specificity of the microenvironment of each cancer type/stage. The use of light, particularly, allows a controlled spatio-temporal drug release. In the electromagnetic spectrum, the deepest penetration in biological tissue is achieved by near-infrared light (NIR), which additionally, corresponds to less harmful effects on cells. This low energy radiation can unleash the drug release by generating highly reactive singlet oxygen (1O2) species through the excitation of a photosensitizer. The 1O2 can react with specific molecules, resulting in a hydrophilicity change or cleavage of the nanoparticle structure, thus promoting a fast drug release. The aim of this work was the development of light-sensitive polymers to be used in the design of nanocarriers for biomedical applications, namely cancer therapy. The strategy involved the synthesis of 1O2 sensitive molecules belonging to the vinyl disulfide family (1,2-bis(2-hydroxyethylthio)ethylene, BHETE and 1,2-bis(carboxyethylthio)ethylene, BCETE), that was covalently inserted into a polymer backbone. Three different types of polymers were developed, namely, two light-sensitive amphiphilic block copolymers, viz. poly(ethylene glycol)-BHETE-Poly(lactide) (PEG-BHETE-PLA) and PEG-Poly(1,4-dithio-7,10-dioxa-2-dodecene)-PEG (PEG-PDDD-PEG), and a light-sensitive BCETE based poly(ester amide). Additionally, a new concept of light cleavable molecules was developed. The PEG-BHETE-PLA copolymers were successfully synthesized under mild conditions, exhibiting a narrow polydispersity. The block copolymers were able to form micellar structures in an adequate size for a drug delivery system and also presenting a reasonable drug loading capacity (considering the physical encaging of doxorubicin inside a nanoparticle with a PLA core). The kinetic release of doxorubicin was studied and allowed to confirm the light-triggered micelle disassembly. In vitro tests were carried out with MCF7 cell lines and confirmed the non-cytotoxicity of the bare micelles. The anti-cancer efficacy of the micelles loaded with doxorubicin and the photosensitizer was tested in the same cell lines, and the results showed an increase in cell death in the systems that were irradiated with red light. Considering the advantages over the in situ burst release of drugs in cancer therapy, to enhance the eradication of the tumor cells, a strategy to boost the micelle disassembly was hypothesized. Hence, a new polymer (PDDD) bearing the light-sensitive moiety in each repeating unit was developed. The PDDD was easily synthesized under mild conditions and proton nuclear magnetic resonance (1H NMR) spectroscopy analysis proved that polymer cleavage is initiated by light. The covalent linkage of PEG blocks to PDDD (PEG-PDDD-PEG) yielded an amphiphilic triblock copolymer, that is able to form micellar structures with a drug loading capacity of doxorubicin, similar to the PEG-PLA micelles. The amount of drug released from PEG5k-PDDD-PEG5k micelles was found to be 7% higher than the amount released from PEG-BHETE-PLA. It is worth mentioning that the PEG5k-PDDD-PEG5k exhibited a burst release in the first 30 minutes. Light-sensitive poly(ester amide)s were prepared by interfacial polymerization using a diacyl chloride based on BCETE and an α-amino acid based diamine. The number of light-sensitive molecules in the poly(ester amide)s’ chain was controlled by varying the content of BCETE from 0 to 100%. The cleavage induced by light was confirmed by 1H NMR and size exclusion chromatography (SEC). Lastly, a new concept of light-sensitive moiety was evaluated. The cleavage strategy of this molecule was based on Photoinduced Electron Transfer for Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer (PET-RAFT) polymerization methodology, with the difference that a hydrogen donor was used to ensure the stability of the fragments resulting from the cleavage. The 2-(dodecylthiocarbonothioylthio)-2-methylpropionic acid (DDMAT, a commercial RAFT agent) was cleaved by light irradiation in the presence of a photosensitizer. This molecule can have the potential to be used as a new light-sensitive moiety in a polymer for application in drug delivery systems. Overall, this research work has contributed to the development of light-sensitive polymers and drug delivery systems. Simple polymer synthesis and straightforward nanoparticle preparation were used in order to develop a non-expensive and promising ‘magic bullet’ system. Sistemas de entrega de fármacos são projectados para permitir a libertação de maneira controlada e em locais específicos. Estes sistemas pretendem reduzir os efeitos secundários e controlar o perfil de biodistribuição do fármaco com o objetivo de melhorar a eficácia terapêutica. As nanopartículas (tais como hidrogeis, lipossomas e micelas) são uma das categorias mais comuns destes sistemas. Nestas, o fármaco é aprisionado no seu interior e é direcionado para o local alvo (geralmente por meio da incorporação de moléculas específicas ou tirando vantagem do efeito de aumento de permeabilidade e retenção nos tecidos, no caso de doenças tumorais. Em algumas aplicações, como na terapia contra o cancro, a libertação total e instantânea do medicamento pode levar a maior eficácia do tratamento. Para tal, vários estímulos são capazes de desencadear o processo de libertação do medicamento. Estes estímulos podem ser internos (espécies reactivas de oxigénio, pH e temperatura) ou externos (ultra-sons, campo magnético e luz). Na terapia contra o cancro, as nanopartículas capazes de realizar a libertação do medicamento através de estímulos externos podem trazer mais vantagens , já que a libertação do fármaco ocorre independentemente do tipo de tumor ou peculiaridades do microambiente de cada tumor. Em especial, o uso da luz permite a libertação do medicamento através de um controlo espacial e temporal. Dentro do espectro electromagnético, a luz que apresenta uma maior penetração em tecidos biológicos situa-se na zona do infra vermelho próximo, a qual demonstra o menor efeito nocivo para as células. Esta radiação com baixa energia pode iniciar a libertação do medicamento com a geração de espécies reactivas como o oxigénio singleto (1O2) por meio da excitação de fotosensibilizadores. O 1O2 pode reagir com moléculas específicas, resultando na mudança da hidrofilicidade ou na quebra da estrutura das nanopartículas, que promove uma rápida libertação do fármaco. O objectivo deste trabalho foi o desenvolvimento de nanopartículas poliméricas sensíveis a luz para serem usados em nanotransportadores para aplicações biomédicas, nomeadamente na terapia do cancro. A estratégia usada envolve a síntese de polímeros com base em moléculas sensíveis a 1O2 pertencentes a família dos disulfuretos vinílicos (1,2-bis(2-hidroxietiltio)etileno, BHETE e 1,2-bis(carboxietiltio)etileno, BCETE), os quais são covalentemente inseridos na cadeia principal do polímero. Três tipos diferentes de polímeros foram desenvolvidos, nomeadamente, dois copolímeros de bloco amfifílicos sensíveis a luz, como polietileno glicol-BHETE-poli (ácido lactico) (PEG-BHETE-PLA) e PEG-Poli(1,4-ditio-7,10-dioxa-2-dodeceno)-PEG (PEG-PDDD-PEG), e poli(ester amidas) sensíveis a luz. Adicionalmente foi desenvolvido um novo sistema de quebra de moléculas pela acção da luz. Os copolímeros de PEG-BHETE-PLA foram sintetizados sob condições de reacção suaves e apresentaram baixa polidispersividade. Os copolímeros foram capazes de formar estruturas micelares com um tamanho adequado para sistemas de libertação de fármacos e apresentaram uma razoável capacidade de encapsulação de doxorubicina. A cinética de libertação da doxorubicina encapsulada foi estudada e permitiu a confirmação da desestruturação das micelas quando sujeita à acção da luz. Testes in vitro com a linha cellular MCF7 foram realizados e confirmaram a ausência de toxicidade das micelas. A eficácia anticancerígena das micelas carregadas com doxorubicina e o fotossensibilizador (simultaneamente) foi testada e os resultados mostraram um aumento da mortalidade celular do sistema quando irradiado com a luz vermelha. Considerando as vantagens de uma libertação completa, imediata e in situ de medicamentos para promover a erradicação completa de células tumorais, na terapia contra o cancro, foi pensada uma estratégia para promover a destabilização tão completa quanto possível da nanopartícula transportadora do fármaco. a Um novo polímero (PDDD) contendo uma unidade sensível a luz em cada unidade de repetição foi desenvolvido. O PDDD foi facilmente sintetizado sob condições amenas e a análise por espectroscopia de ressonância magnética de protão (1H RMN) provou a quebra do polímero sob a acção da luz. A ligação covalente do PDDD a blocos de PEG (PEG-PDDD-PEG) produziu um copolímero tribloco anfífilico capaz de formar estruturas micelares com uma capacidade de encapsulação de doxorubicina similar a das micelas de PEG-PLA. A quantidade de medicamento libertada pelas micelas de PEG5k-PDDD-PEG5k foi 7% maior do que a quantidade libertada para a micelas de PEG-BHETE-PLA. É importante mencionar que o PEG5k-PDDD-PEG5k exibiu uma libertação “explosiva” nos primeiros 30 minutos. As poli(ester amidas) sensíveis a luz foram preparadas por polimerização interfacial usando um cloreto diacil baseado na molécula de BCETE e na diamina baseada em α-amino acidos. Foram preparados polímeros com diferentes valores de incorporação da molécula sensível à luz. A quebra da estrutura destes polímeros, induzida pela luz, foi confirmada pela 1H RMN e cromatografia por exclusão de tamanho (SEC). Por último, um novo conceito de unidade sensível a luz foi avaliado. A estratégia de quebra da molécula foi baseada na metodologia de polimerização chamada de Transferência de Electrões Foto-induzida por Transferência Reversível de Cadeia por Adição-Fragmentação (PET-RAFT), com a diferenciação de que um doador de hidrogénio foi usado para estabilizar os fragmentos resultantes da reacção de quebra. O ácido 2-(dodeciltiocarboniltioiltio)-2-metilpropiónico (DDMAT, um agente RAFT comercial) foi quebrado pela irradiação de luz na presença de um fotossensibilizador. Esta molécula pode ter potencial para ser usada como uma nova unidade sensível a luz em polímeros para a aplicação em sistemas de entrega de medicamentos. Em suma, este trabalho de pesquisa contribuiu para o desenvolvimento de polímeros sensíveis a luz para fazer parte de sistemas de entrega de fármacos. Os processos de síntese desenvolvidos são relativamente simples e os métodos de preparação de nanopartículas utilizados originaram sistemas de libertação efectivos,promissores e não dispendiosos. Ciências sem fronteira, CNPq

O poli(ácido láctico) (PLA) é um polímero caracterizado por ser rígido e quebradiço à temperatura ambiente. Neste contexto, o presente trabalho teve como principal objetivo o estudo da plastificação do PLA com recu rso à extrusão reativa (REx), utilizando três plastificantes diferentes: álcool ramificado (AR), diéster derivado do AR e oligómeros de ácido láctico funcionalizados com ligações duplas (OLA-HEMA de 1000 e 5000 g/mol) na presença de peróxido de dicumilo (DCP). O AR está disponível comercialmente, ao passo que o diéster e o OLA-HEMA foram sintetizados com sucesso no decorrer do trabalho. Os plastificantes foram depois usados em diferentes concentrações (4, 10 e 20 % m/m), tendo sido utilizados dois métodos de mistura das formulações: (i) dissolução dos componentes da mistura (PLA, DCP, plastificante) em clorofórmio, seguido de evaporação para a obtenção de um filme e (ii) mistura física dos componentes sem uso de solvente. De seguida as misturas foram submetidas à REx numa extrusora laboratorial de fuso simples com objetivo de enxertar os plastificantes nas cadeias do PLA. O PLA plastificado foi recolhido na forma de fios com cerca de 1.4 mm de diâmetro. Para alguns testes de caracterização, nomeadamente, análise dinâmica termomecânica (DMTA) e ensaios de tração, foi necessário obter provetes pelo que o fio extrudido foi sujeito a um processamento adicional (prensagem a quente). A partir da avaliação preliminar efetuada às misturas extrudidas, constatou-se que o efeito plastificante nos materiais misturados fisicamente e plastificados com OLA-HEMA de menor peso molecular (=1000 g/mol) não foi significativo, razão pela qual foram abandonados e o estudo passou a dar atenção aos materiais resultantes da REx a partir das misturas obtidas por dissolução dos componentes em clorofórmio, seguido de evaporação, e em cujas misturas foram usados como plastificantes o AR, diéster e OLA-HEMA de 5000 g/mol. Da avaliação efetuada, os resultados de análise termogravimétrica (TGA) revelaram maior estabilidade térmica (359 C) para os materiais plastificados com 10 % (m/m) de diéster em comparação com PLA puro (311 C). No entanto, é de salientar que nenhum dos outros plastificantes levou a um decréscimo acentuado da estabilidade térmica. A calorimetria diferencial de varrimento (DSC) revelou uma redução da Tg em 12 C e 13 C, para o PLA plastificado (na forma de fio) com 4 e 20 % (m/m) de diéster e OLA-HEMA, respetivamente. Os resultados de D MTA revelaram que as misturas não apresentaram nenhuma separação de fase relacionada com imiscibilidade do sistema PLA-plastificante, tendo-se verificado que todos os materiais plastificados tinham um módulo elástico (E') inferior ao apresentado para o PLA puro. Esta diminuição é mais evidente para a formulação com 10 % (m/m) de diéster (E'PLA/Ester- 10=1415 MPa vs E'PLA puro=2524 MPa). Os ensaios de tração revelaram aumento da elongação até 6 e 52 vezes para amostras em provetes (PLA/AR-10) e fios (PLA/OLA-10), respetivamente em relação ao PLA puro. O PLA plastificado com OLA-HEMA apresentou boa estabilidade química face ao ácido acético e etanol nos testes de migração. The poly(lactic acid) (PLA) is a polymer characterized by being hard and brittle at room temperature. In this context, this work aimed to study the plasticization of PLA by means of reactive extrusion (REx) using three different plasticizers: a branched alcohol (BA), a BA based diester and lactic acid oligomers functionalized with double bonds (OLA-HEMA, 1000 and 5000 g/mol) in the presence of dicumyl peroxide (DCP). The BA is commercially available, whereas the diester and OLA-HEMA were successfully synthesized in this work. Plasticizers were then used in different concentrations (4, 10 to 20 % wt.) and two blending methods were used: (i) dissolution of the components of the mixture (PLA, DCP, plasticizer) in chloroform, followed by evaporation to obtain a film and (ii) physical mixture of the components without solvent. Then the mixtures were subjected to REx on a laboratory single-screw extruder in order to graft the plasticizers onto PLA chains. The plasticized blends were collected in the form of strands with 1.4 mm in diameter. For some characterization tests, namely, dynamic thermomechanical analysis (DMTA) and tensile tests, it was necessary to obtain test pieces (e.g., dog-bone-shape) and in such cases the extruded strand was subjected to additional processing (hot melt pressing). From the preliminary studies performed on the extruded blends, it was found that the plasticization effect of the materials mixed physically and where lower molecular weight OLAHEMA (=1000 g/mol) was used as plasticizer was not significant and because of that, the work developed during the study focused essentially on the REx of the mixtures obtained by dissolving the components in chloroform, followed by evaporation, and mixtures in which the BA, diester and OLA-HEMA (5000 g/mol) were used as plasticizers. The results of thermogravimetric analysis (TGA) showed that the blends comprising 10 % (wt.) of the diester had better thermal stability (359 C) than neat PLA (311 C). However, it is noteworthy that none of the other plasticizers led to a significant decrease in thermal stability. The differential scanning calorimetry (DSC) showed a reduction of Tg by 12 C and 13 C for plasticized PLA (in the form of strands) with 4 and 20 % (wt) of diester and OLA-HEMA, respectively. The DMTA results revealed that the blends showed no phase separation related to the immiscibility of the PLA-plasticizer system, and it was found that all the plasticized materials had an elastic modulus (E') lower than that of neat PLA. This decrease is more evident for the formulation with 10 % (wt.) of the diester (E'PLA/Ester-10=141 5 MPa vs E'neat PLA=2524 MPa). Tensile tests showed increased elongation up to 6 and 52 times for samples on dog-bone-shaped samples (PLA/AR-10) and strands (PLA/OLA-10), respectively, compared to neat PLA. The plasticized PLA with OLA-HEMA showed good chemical stability against acetic acid and ethanol in the migration tests.