Search

Second generation protein products are studied and products are developed in recent years. Aim of this thesis is to add a new alternative to second generation drug development approaches with filgrastim. For this purpose, enzymatic conjugation of filgrastim with transglutaminase is designed by using a polymer which is not used for this aim before. Conjugation studies are conducted with hydrolysates of chitosan, which is a natural polymer in the polysaccharide structure. Conjugate formation is shown by SEC-HPLC, RP-HPLC, Fourier transform infrared spectroscopy, mass spectroscopy, SDS-PAGE gel electrophoresis, isoelectric focusing and western blot analysis. In addition, HPLC, FTIR and mass spectral analysis showed that conjugate is formed of three similar molecular weight subfraction. After the conjugate formation, effects of parameters such as temperature, reaction period, pH and different ratios of components on the formation and stability of conjugates are studied. Polymer ratio is found to be the main factor on conjugate formation. Solution and lyophilized forms of conjugate is found stable at 5±3oC for four months. Bioactivity of the conjugate solution is studied on cell cultures complying with the European Pharmacopeia by using NFS-60 cells and conjugate is seen more active than reference filgrastim. TÜBİTAK (SBAG 114S759 nolu 1001 projesi) ONAY SAYFASI iii YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv ETİK BEYAN v TEŞEKKÜR vi ÖZET vii ABSTRACT viii İÇİNDEKİLER ix SİMGELER VE KISALTMALAR xiii ŞEKİLLER xvi TABLOLAR xx 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 4 2.1. Rekombinant DNA Teknolojisi ile Üretilen Proteinler 4 2.1.1. Rekombinant Büyüme Faktörleri 5 2.2. İkinci Kuşak Protein İlaçlar 10 2.3. Protein-Polimer Konjugatları 11 2.3.1. Kimyasal Konjugasyon 12 2.3.2. Enzimatik Konjugasyon 13 2.4. Polimerler 15 2.4.1. Polietilen Glikol (PEG) 15 2.4.2. Kitosan 16 2.5. Enzimler 20 2.5.1. Transglutaminaz 20 2.6. Protein Analizinde Kullanılan Yöntemler 22 2.6.1. Kromatografik Yöntemler 23 2.6.2. Spektroskopik Yöntemler 26 2.6.3. Elektroforetik Yöntemler 28 2.6.4. Diğer Yöntemler 29 2.7. Filgrastimin Biyotayini 30 3. GEREÇ VE YÖNTEM 31 3.1. Kullanılan Maddeler ve Cihazlar 31 3.2. Filgrastimin Fizikokimyasal Özellikleri 34 3.2.1. Filgrastim Çözeltisinin Hazırlanması 34 3.2.2. Filgrastimin UV Spektroskopik Analizi 34 3.2.3. Filgrastimin HPLC ile Analizi 34 3.3. Kitosanın Fizikokimyasal Özellikleri 40 3.3.1. Kitosan Çözeltisinin Hazırlanması 40 3.3.2. Kitosan Hidrolizatlarının Elde Edilmesi 41 3.3.2. Düşük Molekül Ağrılıklı Kitosan ve Kitosan Hidrolizatlarının UV Spektrumu 41 3.4. Transglutaminazın Fizikokimyasal Özellikleri 41 3.4.1. Transglutaminaz Çözeltisinin Hazırlanması 41 3.5. Enzimatik Yöntemle Konjugatların Oluşturulması 42 3.6. Konjugat Oluşumunun Tayini 43 3.6.1. HPLC ile Tayinler 43 3.6.2. Elektroforetik Yöntemlerle Yapılan Analizler 44 3.6.3. Preparatif Amaçlı Kromatografi Çalışmaları 50 3.6.4. Spektroskopik Tayinler 51 3.6.5. Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) 51 3.6.6. Konjugattan Ayrılan Filgrastimin Tayini 52 3.6.7. Hücre Kültürlerinde Filgrastimin ve Konjugatının Biyoetkinliğinin Tayini 53 3.6.8. Proteinin Konjugattaki Kararlılığı 56 4. BULGULAR 57 4.1. Filgrastimin Fizikokimyasal Özelliklerinin Tayini 57 4.1.1. Filgrastimin UV Spektroskopik Analizi 57 4.1.2. Filgrastimin Ters-Faz HPLC ile Miktar Tayini ve Yöntemin Validasyonu 59 4.1.3. Filgrastimin Büyüklük Dışlama HPLC (SE-HPLC) Kromatografisi ile Tayini-1 64 4.1.4. Filgrastimin Büyüklük Dışlama HPLC (SE-HPLC) Kromatografisi ile Tayini-2 64 4.2. Kitosanın Fizikokimyasal Özellikleri 65 4.2.1. Düşük Molekül Ağırlıklı Kitosan ve Hidrolizatlarının UV Spektrumu 65 4.3. Konjugat Oluşumunun Tayini 66 4.3.1. HPLC ile Tayinler 66 4.3.2. Elektroforetik Yöntemlerle Yapılan Analizler 75 4.3.3. Preparatif Amaçlı Kromatografi Çalışmaları 87 4.3.4. Spektroskopik Tayinler 89 4.3.5. Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) 93 4.3.6. Konjugattan Ayrılan Filgrastimin Tayini 94 4.3.7. Hücre kültürlerinde Filgrastimin ve Konjugatının Biyoetkinliğinin Tayini 95 4.3.8. Proteinin Konjugattaki Kararlılığı 97 5. TARTIŞMA 99 5.1. Filgrastimin Fizikokimyasal Özelliklerinin Tayini 99 5.1.1. Filgrastimin UV Spektroskopik Analizi 99 5.1.2. Filgrastimin Ters-Faz HPLC ile Miktar Tayini ve Yöntemin Validasyonu 99 5.1.3. Filgrastimin Büyüklük Dışlama HPLC (SE-HPLC) Kromatografisi ile Tayini-1 100 5.1.4. Filgrastimin Büyüklük Dışlama HPLC (SE-HPLC) Kromatografisi ile Tayini-2 101 5.2. Kitosanın Fizikokimyasal Özellikleri 101 5.2.1. Düşük Molekül Ağırlıklı Kitosan ve Hidrolizatının UV Spektrumunun Belirlenmesi 101 5.3. Konjugat Oluşumunun Tayini 102 5.3.1. HPLC ile Tayinler 102 5.3.2. Elektroforetik Yöntemlerle Yapılan Analizler 105 5.3.3. Preparatif Amaçlı Kromatografi Çalışmaları 109 5.3.4. Spektroskopik Tayinler 110 5.3.5. Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) 111 5.3.6. Konjugattan Ayrılan Filgrastimin Tayini 111 5.3.7. Hücre Kültürlerinde Filgrastimin ve Konjugatının Biyoetkinliğinin Tayini 112 5.3.8. Proteinin Konjugattaki Kararlılığı 113 6. SONUÇ VE ÖNERİLER 114 7. KAYNAKLAR 116 8. EKLER EK-1: Tez Çalışması ile İlgili Poster EK-2: Tez Çalışması ile İlgili Yayın 9. ÖZGEÇMİŞ Son yıllarda ikinci kuşak protein ilaçlar üzerinde araştırmalar yapılmakta ve ürünler geliştirilmektedir. Bu tez çalışmasında proteinlerle ikinci kuşak ilaç geliştirme yaklaşımlarına bir yenisini eklemek amaçlanmıştır. Bu amaçla filgrastimin mikrobiyal transglutaminaz aracılığı ile daha önce bu yaklaşımla üzerinde çalışma yapılmamış bir polimer ile konjugatının hazırlanması planlanmıştır. Konjugasyon çalışmaları polisakkarit yapıda doğal bir polimer olan kitosanın hidrolizatları ile yapılmıştır. SEC-HPLC, RP-HPLC, Fourier transform infrared spektroskopisi, kütle spektroskopisi, SDS-PAGE jel elektroforezi, izoelektrik odaklama ve western blot ile yapılan analizlerle konjugat oluşumu gösterilmiştir. Ayrıca HPLC, FTIR ve kütle spektroskopisi analizlerinde konjugatın birbirine yakın büyüklükte üç farklı moleküler yapıdan oluştuğu belirlenmiştir. Konjugat oluşumu başarıldıktan sonra sıcaklık, bekletme süresi, pH, bileşenlerin farklı oranları gibi etkenlerin konjugat oluşumu ve dayanıklılığı üzerindeki etkileri incelenmiş ve konjugat oluşumunda polimerin oranının etkili olduğu görülmüştür. Konjugatın çözeltisinin ve liyofilize formunun kararlılığının dört ay 5±3o C derecelik bekletme koşulunda değişmediği görülmüştür. Konjugat çözeltisinin biyoetkinliği hücre kültürü çalışmaları ile Avrupa Farmakopesi’ne uygun şekilde NFS-60 hücreleri kullanılarak araştırılmış ve referans filgrastime göre oluşan konjugatın daha etkili olduğu görülmüştür.

ÖZET Eratalay A., Hepatit B antijenini kodlayan plazmit DNA içeren mikroküre şeklindeki aşı formülasyonunun geliştirilmesi, Hacettepe Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü Farmasötik Biyoteknoloji Programı Doktora Tezi, Ankara, 2004. Bir viral proteini kodlayan DNA aşılarının bağışık yanıt oluşturarak virüslere karşı koruma sağladığı son zamanlarda gösterilmiştir. Hepatit B virüsü sağlık alanında çok önemli sorunlara neden olmakta ve hepatit B virüsü (HBV) infeksiyonuna karşı profilaktik immünizasyon şu anda rekombinant HBV aşılanyla sağlanmaktadır. Bu aşılar etkin ve güvenilir olmakla birlikte kullanılan antijene ve adjuvanlara bağlı olarak lokal granuloma, ağrı, ateş gibi yan etkiler de oluşturabilmektedir. Bir antijeni veya antijenlerin karışımını kodlayan plazmit DNA konakçıya çıplak halde veya taşıyıcı sistemler içerisinde uygulanmaktadır. Bu tez çalışmasında hepatit B yüzey antijenini ve IL-2 sitokinini beraber kodlayan pS2-S/pIL-2 plazmit DNA aşı tasarımı amacıyla mikrokürelere yüklenmiştir. Mikroküreler in vitro olarak mikroskobik görünüm, partikül büyüklüğü, hazırlama verimi, enkapsülasyon verimi, zeta potansiyel, mikrokürelere yüklenen plazmit DNA'nın formülasyon içerisindeki stabilitesi ve gama radyasyonla sterilizasyonun pDNA üzerindeki etkileri bakımından değerlendirilmiştir. Yapılan in vitro salım deneyi sonucunda pDNA'nın mikrokürelerden 45 gün boyunca değişmeden salındığı gösterilmiştir. Bağışıklandırma çalışması fareler üzerinde yapılmış ve tüm formülasyon gruplarında anti-HBs antikorları elisa testi ile saptanmıştır. Anahtar Kelimeler: Genetik bağışıklama, hepatit B yüzey antijeni, IL-2, pS2-S/pIL-2 plazmit DNA, mikroküre, anti-HBs antikorları ABSTRACT Eratalay A., Development of a vaccine as a microsphere is containing plasmid DNA coding hepatitis B surface antigen, Hacettepe University, Health Sciences Institute, PhD Thesis in Pharmaceutical Biotechnology, 2004. In recent years, DNA vaccines encoding a viral protein have been shown to induce immune response and provide protection against viruses. Due to the Hepatitis B virus serious problems were raised in the health area and presently profilactic immunization against hepatitis B virus infection can be provided by recombinant HBsAg vaccines. Although these vaccines are safe and effective preparations they also cause some adverse effects such as local granulomas, ache and fever which are related to used antigen and adjuvant. Plasmid DNA encoding either individual or a collection of antigens is administered to a host nakedly or in delivery systems. In this research, pS2-S/pIL-2 plasmid DNA encoding both Hepatitis B surface antigen and IL-2 cytokine gene, was loaded to microspheres for the purpose of vaccine design. Microspheres were evaluated in vitro for their microscopic appearance, particle size, yield, encapsulation efficiency, zeta potentials, stability of plasmid DNA in microsphere formulations and effects of the gama sterilization on pDNA structure. According to the in vitro release studies pDNA was released from the microspheres without conformational changes in 45 days period. Immunization studies were carried out on mice and anti-HBs antibodies were detected in mouse sera by applying elisa test for all formulation groups. Key Words: Genetic immunization, hepatitis B surface antigen, IL-2, pS2-S/pIL-2 plaşmid DNA, microsphere, anti-HBs antibodies VI 203

vıı ABSTRACT Demir D., Production of Bacillus peptide pheromone with recombinant DNA technology and optimisation of transformation efficiency, Hacettepe University, Health Sciences Institute PhD Thesis in Pharmaceutical Biotechnology, Ankara, 2004. With the advent of recombinant DNA technology bacteria are being genetically manipulated to produce products. By this way it is possible to modify organisms either by introducing foreign genes or by altering existing ones. The main strategy for introducing specific genes into host organisms, is transformation with a cloned vector-gene construct. In certain growth media Bacillus species express a set of proteins called, pheromones, involved in the transformation of foreign DNA. Genome of Bacillus species is well explained, Bacillus expression systems are non pathogenic, free of endotoxin, have high capacity for protein production but they are not used in the pharmaceutical applications extensively. In this theses study, Bacillus Com X pheromone genes were cloned into a plasmid vector so as to be expressed as a fusion protein. Prior to cloning studies desired PCR products for a 1 1 aa peptide of Bacillus mojavensis RO-B-2 strain ComX pheromone (GLQIYTNWVPS) were designed and amplified by using two complementary primers without any template DNA for the formation of primer- dimers. Taq polymerase amplified ComX PCR products were ligated directly without any modification by T4 DNA ligase into pGEM®-T Easy vector, which has a single overhanging T residue at the 3' end. Ligation mixture were transformed into Escherichia coli JM 109 and XL-1 Blue competent cells and clones were determined by ampicillin selection. Clones which have inserts are inframe with Lac Z promoter site to express fusion protein. Clones having inserts in the right or wrong position were determined by using PCR method, restriction endonucleases and DNA sequencing. Polyclonal antisera were raised against synthetic ComX pheromone peptide in the rabbits in order to be used in Western Blot analysis. Antibody titers were measured by using ELISA technique. Escherichia coli JM 109 and XL-1 Blue strains having ComX - pGEM®-T Easy vector construction were grown in liquid LB medium. Supernatants and inclusion bodies were isolated from growth medium andvi ayırt edildikten sonra, biyotinlenmiş füzyon protein içerikleri yönünden SDS-PAGE, Dot Blot ve Western Blot analizleri ile araştırılmışlardır. Jellerde ve nitroselüloz membranda beklenen yerde (6.5kDa) protein bantları gözlenmiştir. Bacillus mojavensis'in transformasyon etkinliği standart yöntem, sentetik peptit feromon ve füzyon protein ortamı karşılaştırılarak araştırılmış, sentetik peptit feromonun etki etmediği, füzyon protein ortamı ile ise transformasyonun arttığı görülmüştür. ı Anahtar Kelimeler: Rekombinant DNA teknolojisi, Escherichia coli, Bacillus Com X feromonu, klonlama, transformasyon' vıı ABSTRACT Demir D., Production of Bacillus peptide pheromone with recombinant DNA technology and optimisation of transformation efficiency, Hacettepe University, Health Sciences Institute PhD Thesis in Pharmaceutical Biotechnology, Ankara, 2004. With the advent of recombinant DNA technology bacteria are being genetically manipulated to produce products. By this way it is possible to modify organisms either by introducing foreign genes or by altering existing ones. The main strategy for introducing specific genes into host organisms, is transformation with a cloned vector-gene construct. In certain growth media Bacillus species express a set of proteins called, pheromones, involved in the transformation of foreign DNA. Genome of Bacillus species is well explained, Bacillus expression systems are non pathogenic, free of endotoxin, have high capacity for protein production but they are not used in the pharmaceutical applications extensively. In this theses study, Bacillus Com X pheromone genes were cloned into a plasmid vector so as to be expressed as a fusion protein. Prior to cloning studies desired PCR products for a 1 1 aa peptide of Bacillus mojavensis RO-B-2 strain ComX pheromone (GLQIYTNWVPS) were designed and amplified by using two complementary primers without any template DNA for the formation of primer- dimers. Taq polymerase amplified ComX PCR products were ligated directly without any modification by T4 DNA ligase into pGEM®-T Easy vector, which has a single overhanging T residue at the 3' end. Ligation mixture were transformed into Escherichia coli JM 109 and XL-1 Blue competent cells and clones were determined by ampicillin selection. Clones which have inserts are inframe with Lac Z promoter site to express fusion protein. Clones having inserts in the right or wrong position were determined by using PCR method, restriction endonucleases and DNA sequencing. Polyclonal antisera were raised against synthetic ComX pheromone peptide in the rabbits in order to be used in Western Blot analysis. Antibody titers were measured by using ELISA technique. Escherichia coli JM 109 and XL-1 Blue strains having ComX - pGEM®-T Easy vector construction were grown in liquid LB medium. Supernatants and inclusion bodies were isolated from growth medium andvııı analysed for their biotinylated protein content by using SDS-PAGE, Dot Blot and ;drpteee-(6.5 kBa)- on the gel and nitrocellulose membrane. Transformation efficiency of Bacillus mojavensis was compared by using standart method, synthetic peptide pheromone and fusion protein medium. Synthetic peptide pheromone did not affect transformation but fusion protein medium increased transformation efficiency. Key Words: Recombinant DNA technology, Escherichia coli, Bacillus Com X pheromone, cloning, transformation < 252

ÖZET Özbatır B., Rekombinant insan interferonunun sıvı ve katı formlarının dayanıklılığı üzerinde çalışmalar, Hacettepe Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü Farmasötik Biyoteknoloji Programı Bilim Uzmanlığı Tezi, Ankara, 2004. Oral uygulama yolu ilaçlar için en uygun yol olmasına rağmen peptid-protein yapılı ilaçların fiziksel ve kimyasal dayanıksızlık göstermesi ve biyoyararlanımlarmm düşük olması, onların bu yoldan uygulanmalarını sınırlamaktadır. Alternatif uygulanan yollar arasında mukoza yoluyla absorpsiyon peptid ve proteinler için umut verici görünmektedir. Oral mukozal yoldan ilaç uygulanmasında ilk geçiş etkisinin atlanması ve doğrudan sistemik etki sağlaması bu yola üstünlük sağlamaktadır. Rekombinant insan interferon alfa-2b (RHuIFN-a2b) 19.269 molekül ağırlığında bir proteindir. Kanserlerin ve değişik enfeksiyon hastalıklarının tedavisinde önemli bir terapötik etkinliğe sahiptir. Sık uygulama gerektiren ve yan etki riski olan konvansiyonel parenteral piyasa preparatlarmın yanısıra son yıllarda oral mukozal yoldan düşük-doz EFN tedavisine yönelik çalışmalar yapılmaya başlanmıştır. Bu tez çalışmasında da oral mukozal yoldan uygulanmak için rHuIFN-a2b'nin katı formları geliştirilmiş ve bu formların etkin madde içeriği yönünden dayanıklılığı hazırlanan sıvı çözeltileri ve piyasa preparatı (Intron A)® ile karşılaştırılarak in vitro olarak değerlendirilmiştir. Ağızda dağılan katı formlar geliştirildiği için çalışmalar yapay tükrük ortamında (pH=6.7) yapılmıştır. Sıvı çözeltiler ve katı formlar + 4°C ve + 25°C'de 1 ve 3 ay bekletilmiş, etken madde yönünden dayanıklılık niceliksel ve niteliksel olarak HPLC (Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi) ve SDS-PAGE (Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi) yöntemleri kullanılarak değerlendirilmiştir. Bu yöntemlere göre geliştirilen katı formülasyonlann, + 4°C ve + 25°C'de 1 ay süresince kararlılığım koruduğu bulunmuştur. Anahtar Kelimeler: Rekombinant insan interferon alfa-2b (RHuIFN-a2b), oral mukozal yol, sıvı formlar, katı formlar, dayanıklılık V ABSTRACT Özbatır B., Studies on stability of liquid and solid forms of recombinant human interferon, Hacettepe University, Health Sciences Institute, M.Sc. Thesis in Pharmaceutical Biotechnology, 2004. Although oral administration route is the most appropriate route for drugs, physical and chemical instability of peptid-protein drugs - together with their low bioavailability - limit their oral application. Among alternative application routes, mucosal absorption seems to be a promising way for peptide and proteins. Bypassing the first hepatic elimination and providing direct sistemic effect make this route advantageous in oral mucosal applications. Recombinant human interferon alfa-2b (RHuIFN-a2b), having a molecular weight of 19.269 kDa, has a significant therapeutic potential in treatments of cancer and various infective diseases. Besides conventional parenteral preparations that require not only frequent injections but also have side-effect risks, studies on low dose treatment of rHuIFN-a2b by oral mucosal route have begun in recent years. Hence, in this thesis study, solid forms of rHuIFN-a2b for oral mucosal administration were developed and their stability against the active substance is evaluated in vitro by comparing with prepared liquid solution forms and the commercial product Intron A®. Studies were carried out in an artificial saliva medium (pH=6.7) due to the disintegration of solid forms in the oral cavity allowed. Liquid solutions and solid forms were kept at 4°C and + 25°C for 1 month and 3 months, then stability respect to the amount of the active substance was determined by using HPLC (High Performance Liquid Chromatography) quantitatively and SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) qualitatively. It was observed that the solid forms developed within this scheme preserve their stability for one month at both +4°C and +25°C. Keywords: Recombinant human interferon alfa-2b (RHuIFN-a2b), oral mucosal route, liquid forms, solid forms, stability VI 130

ÖZET Barut, D., Gen tedavisine yönelik, katyonik yüzey etkin madde içeren emülsiyon şeklinde taşıyıcı sistem üzerinde çalışmalar, Hacettepe Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Farmasötik Biyoteknoloji Programı Bilim Uzmanlığı Tezi, Ankara, 2001. Gen tedavisi bir hastalığı tedavi etmek ya da seyrini hafifletmek için hastanın hücrelerine yararlı genlerin sunulması esasına dayanan yeni bir terapötüc yaklaşımdır. Tedavinin başarılı olabilmesi, DNA'nın dayanıklı ve etkin bir taşıcı sistem kullanılarak hücrelere ulaştırılmasına bağlıdır. Bu amaçla kullanılan viral gen taşıyıcıların kısa ve uzun vadeli risklerinin bulunması, DNA transferi için viral olmayan sistemlerin araştırılmasına neden olmuştur. Bu çalışmada bir DNA taşıyıcı sistem olarak katyonik emülsiyon formülasyonu geliştirilmesi planlanmıştır. CTAB içeren bir katyonik emülsiyon formülasyonu, üçgen faz diyagramı kullanılarak geliştirilmiştir. Dayanıklı ve parenteral kullanıma uygun özellikte olduğu belirlenen ve sıvı kristal içeren B13d kodlu emülsiyon formülasyonunun pH, viskozite ve damlacık büyüklüğü gibi özellikleri belirlenmiş, sıcaklık ve bekletme sûresinin bu özellikler üzerindeki etkileri araştırılmıştır. 25°C saklama sıcaklığının her üç özellik için de uygun olduğu belirlenmiştir. Taze hazırlanmış boş ve pDNA yüklü emülsiyonların partikül büyüklüğü ~350 nm olarak tespit edilmiştir. pDNA ile katyonik emülsiyon arasındaki kompleks oluşumu jel retardasyonu ve DNA kondensasyon yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. Kompleksin dayanıklılığı, pDNA'nın DNaz I nükleaz enziminden ne ölçüde korunduğuna bakılarak belirlenmiş, 1:2.74 (ug/nmol) oranında pDNA:emülsiyon kompleksinin, pDNA'yı DNaz I yıkımından oldukça etkin bir şekilde koruduğu gözlenmiştir. İnsan serumu ortamında yapılan deneyler in vivo koşullarda formülasyonun ne ölçüde dayanıldı olacağı konusunda fikir vermiştir. 1:2.74 (ug/nmol) oranında pDNAremülsiyon kompleksinde serumla 24 saat inkübasyon sonunda hala süperkıvnmlı pDNA formu bulunduğu belirlenmiştir. Çalışmamızda elde edilen sonuçlar ümit verici olup, geliştirilen B13d kodlu emülsiyon formülasyonunun bir gen taşıyıcı sistem olabilecek potansiyele sahip olduğunu göstermiştir. Ancak daha ileri çalışmalarla bu potansiyelin desteklenmesine ihtiyaç duyulmaktadır. Anahtar Kelimeler: Gen Tedavisi, Setiltrimetilamonyum bromür (CTAB), katyonik Emülsiyonlar VI ABSTRACT Barut, D., Studies on a carrier system of emulsion containing a cationic surfactant for the purpose of gene therapy, Hacettepe University, Institute of Health Sciences, Pharmaceutical Biotechnology Programme MSci. Thesis, Ankara, 2001. Gene therapy is a new therapeutic approach involving presentation of useful genes into the cells of a patient for the purpose of curing or diminishing the course of a disease. Success of the therapy depends on the use of a stable and efficient DNA carrier system for transfer of DNA into the cells. The observation of the short and long term limitations associated with the viral gene carriers being used for this purpose resulted in investigations on non viral systems for DNA transfer. In this study, development of a cationic emulsion formulation as a DNA carrier system was planned. A cationic emulsion formulation containing CTAB was developed using the ternary phase diagrams. The emulsion formulation B13d containing liquid crystal phase found to be stable and suitable for the use of parenteral application was characterized in terms of its pH, viscosity and particle size, and the effects of temperature and storage on these parameters were investigated. 25°C was determined to be convenient storage temperature for these parameters. Particle sizes of the freshly prepared empty and pDNA associated emulsions were estimated to be around 350 nm. The complex formation between pDNA and emulsion was determined by the use of gel retardation and DNA condensation techniques. Stability of the complexes was analyzed by determining the protection of pDNA from the digestion of DNaz I endonuclease, and the pDNA:emulsion complex mixed at the ratio of 1:2.74 (ug/nmol) was found to be relatively effective for protecting pDNA from DNaz I attack. The experiments performed in the presence of human serum gave an information about the stability of formulation for in vivo application. In pDNA: emulsion complex at the ratio of 1:2.74 (ug7nmol), the super coiled pDNA was still observable after 24 hour incubation in the presence of serum. The results obtained in this study were found to be very promising, and indicated the fact that the emulsion formulation developed (B13d) has a potential of gene carrier system. Nevertheless, further studies are required for the support of this potential Key Words: Gene Therapy, CetyltrimethylamnMiüum bromide (CTAB), Cationic Emulsions 128

ÖZET Cumbul, £., Kan yedeği ve oksijen taşıyıcısı olarak perflorokarbon ve hemoglobin taşıyıcılarının hazırlanması ve değerlendirilmesi, Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Farmasötik Biyoteknoloji Programı Bilim Uzmanlığı Tezi, Ankara, 2000. Perflorokarbon emülsiyonları ve modifiye hemoglobinler olmak üzere başlıca iki kan yedeği preparatı vardır. Bu formülasyonlar konvansiyonel hacim genişleticilere göre klinik üstünlükler taşırlar. Perflorokarbonlar (PFC), içerisinde oksijenin çözünebildiği sentetik sıvılardır. Oksijen taşıyıcılar olarak mikronaltı emülsiyonlarda formüle edilebilirler. PFC oksijen taşınmasında kolay bir yaklaşımdır ve büyük miktarda üretilebilirler. Hemoglobin (Hb) oksijen taşınması için eritrositlerin başlıca proteinidir, fakat eritrositlerin dışına çıkınca kan yedeği olarak kullanılamaz. Tatmin edici bir parenteral oksijen taşıyıcı kan yedeği henüz başarılamamıştır. Bu tezde bu iki ana kan yedeği üzerinde çalışılmıştır. Bir PFC parenteral emülsiyon formülasyonu geliştirilmiş ve farmasötik açıdan karakterize edilip bir oksijen taşıyıcı olarak değerlendirilmiştir. Önce oksijen kısmi basıncı yüksek, damlacıkları çok küçük olan ve hemolitik olmayan bir emülsiyon hazırlanmıştır. Daha sonra ikinci kısımda mikroküre formunda bir modifiye Hb formülasyonu geliştirilmiştir. Hb taşıyan kitosan mikroküreleri emülsiyon polimerizasyon tekniği ile hazırlanmıştır. Hb mikroküreleri karakterize edilmiş ve oksijen taşıyıcılar olarak değerlendirilmiştir. Hb mikrokürelere herhangi bir zararlı etki olmadan yüklenmiştir ve Hb mikroküreleri uygun bir kısmi oksijen basıncı ve oksijen taşıma kapasitesi göstermiştir. Hem PFC emülsiyonu hem de Hb mikroküreleri ile elde edilen bu sonuçlara göre her iki formülasyon oksijen taşıyıcısı olarak kullanılabilir ve birlikte uygulanabilir. Daha ileri in vivo çalışmalar bu in vitro bulguları destekleyecektir. Anahtar Kelimeler: Perflorokarbon emülsiyonları, perflorotribütilamin, hemoglobin mikroküreleri, kitosan mikroküreleri, kan yedekleri VI ABSTRACT Cumbul, E Preparation and evaluation of perfluorocarbon and hemoglobin carriers as blood substitute and oxygen carrier, Hacettepe University Health Sciences Institute Master Thesis in Pharmaceutical Biotechnology, Ankara, 2000. There are two major preparations of blood substitutes: perfluorocarbon emulsions and hemoglobins. These formulations offer clinical advantages than conventional volume expanders. Perfluorocarbons (PFC) are synthetic fluids in which oxygen can dissolve. They can be formulated into fine emulsions as oxygen carriers. PFCs provide a simpler approach to oxygen transport and they can be produced in large amounts. Hemoglobin (Hb) is the major protein of erythrocytes for the transport of oxygen but it cannot be used as blood substitute when it is outside the red blood cell. A satisfactory parenteral oxygen carrying blood substitute has not been achieved yet. In this thesis, studies are performed on these two major types of blood substitutes. A PFC parenteral emulsion formulation was developed and characterized from the pharmaceutical standpoint and evaluated as an oxygen carrier. Firstly a stable, finely dispersed, non-hemolytic emulsion was prepared with an high oxygen partial pressure. Then, in the second part a modified Hb formulation is developed in the form of microsphere. Hb carrying chitosan microspheres were prepared by emulsion polymerisation technique. Hb microspheres were characterized and evaluated as oxygen carriers. Hb can be loaded into the microspheres without any harmful effect and Hb microspheres showed satisfactory partial oxygen pressure and carrying capacity. According to these results obtained with PFC emulsion and Hb microspheres, both of the formulations can be used as oxygen carriers and they can be applied together. Further in vivo studies will support these in vitro results. Keywords: Perfluorocarbon emulsions, perfluorotributylamine, hemoglobin microspheres, chitosan microspheres, blood substitutes YÜKSEKÖ?RETİM KURULO 113

ÖZET Genetik kökenli hastalıklar üzerinde süregelen çalışmalar giderek artmakta olup, çalışmalar ex-vivo ve in-vivo gen tedavisi olmak üzere iki başlık altında yapılmaktadır. Yöntemlerden ex-vivo gen tedavisi zorluklan nedeniyle tercih edilmemektedir. Uygulaması çok daha kolay olan in-vivo gen tedavisi bir farmasötik formülasyon uygulaması şeklinde olduğu için diğer yöntemlere üstünlükler taşımaktadır. İn-vivo gen tedavisinde en önemli sorunlarından birisi, terapötik genler için uygun taşıyıcı ilaç formülasyonların geliştirilmesidir. Bugüne kadar basan ile uygulanan sistemler arasında en yaygın olarak araştırılan katyonik lipid-DNA kompleksleri gen tedavisi amacına yönelik olarak çalışılan başlıca formülasyonlardır. Bu tez çalışmasında, plazmid ve genomik DNA için katyonik lipid taşıyıcı sistemler hazırlanarak, formülasyonlar üzerinde etkili parametreler ve hücre transformasyon etkinliği değerlendirilmiştir. E.coli XL-1 blue hücrelerinden, Ampisilin'e karşı direnç oluşturan beta- laktamaz geni içeren pBluescribt plazmid DNA ve koyun kanından ise genomik DNA izole edilerek biyolojik materyal sağlanmıştır. Elde edilen plazmid ve genomik DNA'nın miktar ve saflık tayinleri spektrofotometrik olarak yapılmıştır. Formülasyonlarda ESCORTT katyonik lipid karışımı kullanılarak katyonik lipid-DNA kompleksleri hazırlanmış, farklı DNAılipid oranlarının ve inkübasyon sürelerinin komplekslerin oluşumuna etkisi değerlendirilmiş ve her iki parametrenin de kompleks oluşumu üzerinde etkili olduğu sonucuna varılmıştır. Farklı oranlarda DNAılipid kompleksleri hazırlanarak içerisindeki DNA'nın, DNaz I varlığındaki stabilitesine bakılmış ve katyonik lipid oranı fazla olan komplekslerdeki DNA'nın nükleaz enzimine karşı daha dayanıldı olduğu görülmüştür. E.coli XL-1 blue hücreleri 1:2, 1:1, 1:0.5, 1:0.25 ve 1:0.125 a/a oranlarında hazırlanan DNAkatyonik lipid kompleksleri ile transforme edilmiş ve katyonik lipidlerin transformasyon verimi üzerindeki etkisi değerlendirilmiştir. 1:1 a/a DNA: katyonik lipid oranına kadar, katyonik lipid miktarı arttıkça transformasyon verimi artmıştır. 1:1 a/a oranından sonra katyonik lipidlerin toksisiteleri nedeniyle transformasyon verimi azalmıştır. Noniyonik ve zwitteriyonik surfaktanlar ve aminoasitler içeren plazmid DNA : katyonik lipid formülasyonlarının transformasyon verimleri farklı yöntemler geliştirilerek incelenmiş ve en etkin formülasyonun plazmid DNA : katyonik lipid (1:1 a/a) + Zwittergent® (3-08) olduğu görülmüştür. Anahtar Kelimeler: Gen tedavisi, Katyonik lipid : DNA kompleksleri, Transformasyon, Zwitteriyonik ve noniyonik surfaktanlar, Aminoasitler iv ABSTRACT Recently, studies about genetic disorders, which are carried out under ex-vivo and in-vivo gene therapy categories are increasing. Ex-vivo gene therapy is not preferred, due to the difficulties of the method. In-vivo gene therapy, is an easy method and is more advantages than the other methods since, the method is administration of a gene in a pharmaceutical dosage form. One of the most important problems in the in-vivo gene therapy is to develop effective carrier pharmaceutical formulations for therapeutic genes. Cationic lipid - DNA complexes are the most widely investigated succesful systems among others studied for the purpose of gene therapy. In this study, cationic lipid carrier systems have been prepared for plasmid and genomic DNA and then effective parameters on formulations and cell transformation efficiences have been evaluated. The biological material was provided by isolating pBluescribt plasmid DNA (carries P-lactamase gene and resistant to Ampisilin) from E-coli XL-1 blue cells and by isolating genomic DNA from sheep blood. Assays and purity determinations on the isolated plasmid DNA and genomic DNA, were done spectrofotometrically. In these formulations; cationic lipid-DNA complexes have been prepared by using ESCORTT cationic lipid mixture, and effects of DNA:Lipid ratios and incubation times on the formation of the complexes have been evaluated. Both of the parameters have been found effective on the complex formation. Stability of the DNA was investigated by using different DNA:Lipid complexes in the presence of DNase I enzyme. The DNA in the complexes with higher cationic lipid contents was found more resistant to nuclease digestion. E-coli XL-1 Blue Cells,were transformed with DNALipid complexes prepared at 1:2, 1:1, 1:0.5, 1:0.25 and 1:0.125 w/w ratios, and effect of the lipid on transformation efficiency was evaluated. Transformation efficiency of the complexes increased as the cationic lipid ratio increased, but above l:l(a/a) DNAlipid amounts transformation efficiency decreased due to the toxicity of the lipids. Transformation efficiency of the plasmid DNA: cationic lipid formulations; which include nonionic and zwitterionic surfactants and aminoacids; studied by applying various methods, and among investigated formulations plasmid DNA: cationic lipid (1:1 a/a) + Zwittergent®(3-08) formulation has been found to be the most effective one. Key Words: Gene therapy, Cationic lipid : DNA complexes, Transformation, Zwitterionic and nonionic surfactants, Aminoacids. 120

ÖZET Doğru S. T., Kalsitoninin oral çoklu emülsiyon formülasyonunun geliştirilmesi üzerinde çalışmalar, Hacettepe Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü Farmasötik Biyoteknoloji Programı Yüksek Lisans Tezi, Ankara, 2000. Peptid- proteinlerin mide barsak kanalının üst kısmında karmaşık etkileşmelerine bağlı olarak bu çeşit ilaçların oral yoldan taşınmasının geliştirilmesi güç bir iştir. Kalsitonin ~3600 Dalton molekül ağırlığına sahip makromoleküler bir peptiddir. Terapötik peptidler çoklu emülsiyonun iç fazına eklendiği zaman, taşıyıcı sistem peptidleri mide barsak kanalında proteolitik parçalanmadan koruyabilir, öte yandan formülasyonun koruyucu etkisini artırmak için dış faza proteaz inhibitörleri eklenebilir. Bu çalışmanın amacı, salmon kalsitoninin (sCT) oral yoldan taşınması için Su/Yağ/Su (SAT/S) çoklu emülsiyon sistemi formüle etmek, in vitro ve in vivo değerlendirmektir. Bu çalışmada sCT, emülsiyonun iç fazına, aprotinin ise dış fazına ilave edilmiştir. İn vitro difüzyon çalışmaları üç farklı ortamda [fosfat tamponu (pH=6.4), yapay mide sıvısı (pH=1.2) ve yapay barsak sıvısı (pH=7.5)] yapılmıştır. Bu çalışmalar sCT'nin iç faza eklenmesi ile ilacın dış çevreden korunabildiğini, dış su fazında aprotinin bulunduğu zaman ilacın daha da fazla korunabildiğini göstermiştir. Formülasyonlann hipokalsemik etkileri in- vivo sıçan modeli kullanılarak değerlendirilmiş ve sonuçlar karşılaştınlmıştır. Formülasyonlar, grup I (baz S/Y/S emülsiyon), grup II (iç su fazında sCT içeren SAT/S emülsiyon), grup IH (iç su fazında sCT, dış su fazında aprotinin içeren S/Y/S emülsiyon) ve grup IV (i.m. çözelti (Miacalcic®) ve baz SAT/S emülsiyon) olmak üzere gruplandrnlmıştır. sCT'nin üç formülasyonu da baz emülsiyona göre daha iyi bir hipokalsemik profil vermiştir. Anahtar Kelimeler: Salmon kalsitonin, SA7S tip çoklu emülsiyon, aprotinin, oral yol, in vitro difüzyon, in vivo hayvan modeli. Destekleyen Kurum: TÜBİTAK, SBAG 1773 VI ABSTRACT Doğru S. T., Studies on oral multiple emulsion formulation of calcitonin, Hacettepe University, Health Sciences Institute MSc Thesis in Pharmaceutical Biotechnology, Ankara, 2000. Improving the oral delivery of peptide and protein type drugs has been challenging task because of the complex processing of peptides/proteins in the upper gastrointestinal tract. Calcitonin is a macromolecular peptide drug having a molecular weight of ~360O Daltons. When therapeutic peptides are located in the inner phases of a multiple emulsion, the delivery system might protect the peptides from proteolytic degradation within the GI tract. On the other hand, protease inhibitors are located in the outer phase for the contribution of the protecting effect to the formulation. The objective of this study, is to formulate a water/oil/water (W/O/W) multiple emulsion (ME) system for oral delivery of salmon calcitonin (sCT) and to evaluate in vitro and in vivo. In this study, sCT was incorporated into the inner phase of the ME while aprotinin was incorporated into the outer water phase of the emulsion. In vitro diffusion studies were performed in three different mediums [phosphate buffer (pH=6.4), simulated stomach solutions (pH=1.2) and simulated intestine solutions (pH=7.5)]. These studies have shown that incorporating sCT in the inner aqueous phase could protect the drug from the environment and the drug was further protected in presence of aprotinin in the outer aqueous phase. In vivo rat model was used to evaluate hypocalcemic effects of the formulations comparing with each other. These formulations were grouped as group I (W/O/W emulsion base), group II (W/O/W emulsion containing sCT in the inner phase), group HI. (W/O/W emulsion containing sCT in the inner phase and aprotinin in the outer phase) and group IV. (i.m. (Miacalcic®) and W/O/W emulsion base). Three of the sCT formulations have shown better hypocalcemic profile than emulsion base control. Keywords: Salmon calcitonin, W/O/W multiple emulsion, aprotinin, oral route, in vitro diffusion, in vivo animal model Supported by: TÜBİTAK, SB AG 1773 `û?eö;, r.TAs/im mmmM 152

ÖZET REKOMBİNANT HEPATİT B YÜZEY ANTİJENİNİN IMMUNOADJUVAN TAŞIYICILAR KULLANILARAK AŞI FORMÜLASYONLARININ HAZIRLANMASI ÜZERİNDE ÇALIŞMALAR Rekombinant aşılar saf ve güvenilir olmaları açısından klasik aşılara göre üstünlüğü olan ancak uygun adjuvanlar ile formüle edilerek koruyucu özelliklerinin iyileştirilmesi gereken aşılardır. Bu tez çalışmasında rekombinant hepatit B yüzey antijeni giderek artan önemi nedeniyle model antijen olarak seçilmiş ve uygun adjuvan sistemler tasarlanarak bunlar üzerinde in vitro ve in vivo çalışmalar yapılmıştır. Adjuvan taşıyıcı sistem olarak üzerinde çalışılan formülasyonlar; S/Y/S çoklu emülsiyonu ve niozom dozaj şekilleridir. Bu formülasyonlar içerisine antijen uygun şekilde eklenerek formülasyonlar geliştirilmiştir. Ön formülasyon çalışmalarından sonra en uygun S/Y/S çoklu emülsiyon ve niozom formülasyonlan seçilmiştir. Bunlar homojenlik, partikül büyüklüğü, viskozite ve makroskobik ve mikroskobik görünüşleri açısından değerlendirilmiştir. Formülasyonlar enjeksiyon yoluyla uygulanacağı için bu özelliklerin enjektör iğnesinden geçebilmeye uygun olması dikkate alınmıştır. Taze insan kanı kullanılarak formülasyonlann hemoliz yapma etkileri değerlendirilmiştir. Sonuçta emülsiyonun en düşük hemoliz yüzdesine sahip olduğu bulunmuştur. Bunu sırasıyla piyasa preparatı, niozom ve alüminyum fosfat jeli izlemiştir. Toksisite çalışmaları literatürde önerilen testlerden ikisine göre serum kreatin fosfokinaz düzeyleri ölçülerek ve farelere ve kobaylara ağırlık artışı testi uygulanarak yapılmış ve formülasyonların hepsi kabul edilebilir bulunmuştur. Aşı uygulamasının 44.günü farelerde gecikmiş tip hipersensitivite testi yapılmış ve hiçbir formül ile hipersensitivite reaksiyonu gözlenmemiştir. İn vivo çalışmalar fareler üzerinde yapılmış ve kanda toplam IgG ve hepatit B antikor düzeyleri ELISA yöntemi kullanılarak ölçülmüştür. Yukarıdaki formülasyonlara ek olarak piyasadaki rekombinant aşılardan birisi farelere kontrol grubu olarak injekte edilmiş ve sonuçlar değerlendirilmiştir. Aynı süre içerisinde en yüksek titreli antikor yanıtı niozom formülasyonu ile elde edilmiştir. Anahtar Kelimeler : Adjuvan taşıyıcılar, Rekombinant hepatit B yüzey antijeni, S/Y/S Emülsiyonu, Niozom, Serum antikor düzeyi IV ABSTRACT STUDIES ON PREPARATION OF VACCINE FORMULATIONS USING REKOMBINANT HEPATITIS B SURFACE ANTIGEN WITH TMMUNOADJUVANT VEHICLES Recombinant vaccines have more advantages than classical vaccines due to their safety and purity. However they must be formulated with suitable adjuvants for prolonging their effectiveness. In this research, recombinant Hepatitis B surface antigen was selected as a model antigen because of their increasing importance. Suitable adjuvant systems were designed and in vitro-in vivo studies were carried out. Formulations investigated as adjuvant systems were W/OAV multiple emulsion and niosome. The antigen was included with an appropriate method into the formulation. After the preliminary formulation studies, the most suitable W/OAV multiple emulsion and niosome formulations were selected. They were evaluated by observing their homogenicity, particle size, viscosity and macroscopic and microscopic appearance. Since these formulations will be applied by parenteral route, their ability to pass through syringe needle was also taken into consideration. Using fresh human blood samples, blood hemolysis activity of the formulations were evaluated. As a result, emulsion formulation was found to yield the lowest hemolysis percent. This was followed by the commercial product, niosome and aluminum phosphate gel, respectively. Toxicity studies were carried out by measuring of serum creatine phosphokinase activity and weight gain test in mice and guinea pigs which were two of the recommended tests in the literature. It was found that all of the formulations were acceptable. On the 44th day of the vaccine application, delayed type hypersensitivity test was performed in mice. However, no skin hypersensitivity reaction was observed any of the formulations. Mice were used as animal model in the in vivo studies and total IgG and Hepatitis B antibody titers in blood serum were determined by using ELISA technique. One of the recombinant vaccines in the market, were injected to the mice as control and results were evaluated. In the same period, highest antibody titers were obtained with the niosome formulation. Key Words : Adjuvant vehicles, Recombinant hepatitis B surface antigen, W/OAV Emulsion, Niosome, Serum antibody titer 98

ÖZET REKOMBİNANT İNSAN İNSÜLİNİNİN ORAL MULTİPL EMÜLSİYON FORMÜLASYONUNUN GELİŞTİRİLMESİ ÜZERİNDE ÇALIŞMALAR Biyoteknoloji ürünü ilaçlar rekombinant DNA (rDNA) teknolojisi ile bakteri, maya veya hayvansal hücre kültürlerinde üretilmiş peptit ve protein yapıdaki ilaçlardır. Protein yapıdaki bu maddelerin üretim ortamından saf olarak ayrılması ve hastanın alabileceği bir ilaç haline getirilmesi zor ve uzun çalışmalarla mümkün olabilmektedir. Günümüzde 20 den fazla biyoteknoloji ürünü ilaç piyasaya çıkmış olup, hemen hemen hepsi parenteral yolla hastaya uygulanmaktadır. Kalan pek çok ilaç onay almak üzere sırada beklemekte ve en kolay uygulama ile en etkili ve dayanıklı ilacın geliştirilmesi amaçlanmaktadır. Bu amaca yönelik olarak en eski biyoteknoloji ürünü olan rekombinant insan insülini (Humulin) nin oral multipl emülsiyon formülasyonları üzerinde bir çalışma planlanmıştır. Farklı hazırlama yöntemlerine göre (tek basamaklı ve iki basamaklı) iki ayrı S/Y/S multipl emülsiyon formülasyonu tasarlanmış ve S/Y/S I ve S/Y/S II olarak kodlanmıştır. Çalışılan pek çok formül arasından en iyi iki emülsiyon seçilmiştir. Bunlar homojenlik, ayrılma, partikül büyüklüğü ve görünüşlerine bakılarak makroskopik ve mikroskopik olarak değerlendirilmiştir. S/Y/S I formülünde iç ve dış su fazları aynı bileşimde olup insülin ve proteaz inhibitörü aprotinini birlikte içermektedir. S/Y/S II de ise insülin iç su fazına, aprotinin ise dış su fazına eklenmiştir. in vitro salım, emülsiyonların bir diyaliz ortamına (yapay barsak ortamına) yerleştirilmesi ile gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmalardan, insülinin iç su fazına konulması ile ilacın çevre ortamından iyi korunduğu, ayrıca dış faza aprotinin eklenerek daha da ileri koruma sağlandığı bulunmuştur.III insülini ve aprotinini iç ve dış su fazlarında birarada içeren S/Y/S I formülü de proteolitik aktiviteyi azaltabilmiştir. in vivo çalışmalar normal tavşanlar kullanılarak ve kan glukoz düzeyleri ölçülerek yapılmıştır. Hipoglisemik etkilere bakılarak SİY/S II formülünün plazma glukoz düzeyinde yüzde 20 düşüşe neden olduğu görülmüştür. Bu tez çalışmasından S/Y/S tipi taşıyıcı emülsiyon formülasyonlarmın insülinin oral uygulanması için yararlı olabileceği sonucuna varılmıştır. Anahtar kelimeler: farmasötik biyoteknoloji, rekombinant DNA teknolojisi, rekombinant insan insülini, S/Y/S tipi multipl emülsiyonlar, oral insulin emülsiyonları. IV ABSTRACT STUDIES ON THE DEVELOPMENT OF ORAL MULTIPLE EMULSION FORMULATIONS OF RECOMBINANT HUMAN INSULIN Biotechnology derived drugs are peptides and proteins which are produced by recombinant DNA (rDNA) in the culture medium of bacteria, yeast and animal cells. Purification of the proteins from production medium and their formulations for use of a patient, can be achieved after long and difficult studies. Currently, over 20 biotechnology derived drug products are in the drug market and almost all of them are applied parenterals. Many other drugs also awaiting approval and the objective is to develop the most effective, stable and easily applicable products. By taking this objective into consideration, preformulation studies of the oral multiple emulsion formulations of the earliest biotechnology product, recombinant human insulin (Humulin) have been planned. Two different W/O/W multiple emulsion formulations with different manufacturing procedures (one step and two step methods) were designed and were coded as W/O/W I and W/O/W II. Among many formulas two best emulsions were selected. They were evaluated macroscopically and microscopically by observing homogeneity, separation, particle size and appearance. In W/O/W I internal and external aqueous phases were identical and it has included insulin and protease inhibitor (aprotinin) together. In W/O/W II, insulin was incorporated into the inner water phase and aprotinin was incorporated into the outer water phase. In vitro release was determined by placing emulsions in dialysis medium (simulated intestinal medium). These studies have shown that incorporating insulin in the inner aqueous phase protected the drug from theenvironment and the drug was further protected with aprotinin in the outer aqueous phase. W/O/W I formula containing insulin and aprotinin together in the inner and outer aqueous phases could reduce proteolitic activity too. In vivo studies were carried out by using normal rabbits and by measuring blood glucose levels. By looking at the hypoglycemic effects W/O/W II formula caused 20 percent reduction on the plasma glucose levels. It can be concluded from the present investigation these W/O/W type carrier emulsion formulations could be utilized for oral administration of insulin. Key words: pharmaceutical biotechnology, recombinant DNA technology, recombinant human insulin, W/O/W multiple emulsions, oral emulsions for insulin. 88

ÖZET Bu tez çalışmasında ilaç taşıyıcı sistem olarak sıçan eritrositleri bir kortikosteroid ilaç olan deksametazon sodyum fosfat ile yüklenmiş ve in vivo-in vitro araştırmalar yapılmıştır. Yapılmakta olan çalışmalarda bilindiği gibi eritrositler ilaç ile yüklendikten sonra çeperlerinde bir hasar oluşmakta ve dayanıklıkları azalmaktadır. Bu durumu düzeltmek için literatürde görülen çalışmalarda çapraz bağlayıcı aldehitler kullanılmaktadır. Tezimizde bu amaçla formaldehit kullanılmıştır. Ayrıca aldehitlerin toksik olması nedeniyle çeper yıpranmasını engellemek üzere doğal bir madde olan lesitin kullanılmıştır. în vitro çalışmalarda eritrosit özellikleri araştırıldıktan ve salım deneyleri yapıldıktan sonra lesitinin muamelesinin formaldehit kadar salımı geciktirdiği bulunmuştur. în vivo çalışmalar adjuvan ile artrit oluşturulan sıçanlar üzerinde yapılmıştır. Hergün uygulanan çözelti tipi preparat ile on günde bir subplantar bölgeye subkütan uygulanan lesitin ile muamele edilmiş deksametazon sodyum fosfat yüklü eritrositlerin çok benzer sonuç verdiği ve kontrol grubundan farklı antienflamatuvar etki oluşturduğu gözlenmiştir. 73 SUMMARY In this study rat erythrocytes, as drug carrier systems, were loaded with dexamethasone sodium phosphate and in vitro-in vivo investigations were carried out. As it is known from the studies, drug loaded erythrocytes have some damages on their membrane and became less stable. In order to repair this damage crosslinking aldehydes being used in these studies seen in the literature. In this thesis for the same purpose formaldehyde was used. Additionally, due to the high toxicity of aldehydes lecithin was also used as a natural material in order to prevent membrane damage. In vitro characterization and release studies showed that lecithin treatment sustained the release of a drug as much as formaldehyde treatment. In vivo experiments were carried out on the rats which have adjuvant induced arthritis. Similar results were obtained with the corticosteroid solution (everyday applied) and lecithin treated loaded erythrocytes. It was observed that the lecithin and formaldehyde treated loaded erythrocytes showed better antiinflammatory effects than the control groups. 74 87

132 ÖZET Çalışmamızda öncelikle rekombinant bir protein olan rhGM- CSF'in yara iyileştirici etkisini göstermesi için taşıyıcı formülasyonlar saptanmıştır. Bu amaçla non-iyonik sürfaktanlar (Brij 92, Brij 96 ve Brij 92:96 (1:1)), sıvı parafin ve sudan oluşan sistemlere ait üçgen faz diyagramları oluşturularak sıvı kristal ve emülsiyon taşıyıcılar için optimum formülasyon bölgeleri seçilmiştir. Bölgeler gözle ve polarizan mikroskop altında yapılan mikroskobik inceleme ile ayrılmıştır. Çalışmada kullanılan üçüncü taşıyıcı olan non-iyonik sürfaktan veziküller (niozom) ise dört değişik yöntem ve farklı sürf aktan-kolesterol oranları kullanılarak optimum yöntem ve oran tespit edilmiştir. Formülasyonlarm in vitro incelemeleri zamana karşı viskozite, partikül büyüklüğü ve DSC termal... spektrumları alınarak yapılmıştır. Ayrıca in vitro oklusivite ölçülerek in vivo bulgularla ilişkisine bakılmıştır. rhGM-CSF içeren ve boş taşıyıcıların yara iyileştirici etkinlikleri sağlıklı fareler üzerinde tam kalınlıkta yaralar açılarak yapılan bir hayvan modeli ile incelenmiştir. Çalışmada yaralara uygulanan ve etkinlikleri incelenen gruplar niozom baz, rhGM-CSF içeren niozom, emülsiyon baz, rhGM-CSF içeren emülsiyon, sıvı kristal baz, rhGM-CSF içeren sıvı kristal ve kontrol gruplarıdır. Yara alanlarındaki değişmeler ölçülmüş ve deney sonunda biyopsiler alınarak histolojik ve immünohistokimyasal değerlendirme amacıyla.kullanılmıştır. Sonuçta topik taşıyıcıların kendilerinin bir dereceye kadar yara iyileştirici etkisinin olduğu ancak yara iyileştirici özelliği bilinen ve son yıllarda üzerinde çalışmaların arttığı rekombinant insan granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör (rhGM-CSF) 'ün eklenmesi ile yaraların daha çabuk ve düzgün iyileştiği bulunmuştur. 133 SUMMARY Initially, ternary phase diagrams were formed of non-ionic surfactants (Brij 92, Brij 96 and Brij 92:96 (1:1)), liquid paraffin and water in order to determine the optimum formulations for the preparation of liquid crystalline and emulsion vehicles. This evaluation was made by microscopic examination under a polarizing microscope. The third vehicle used in this study was non-ionic surfactant vesicle (niosome) which was prepared with four different methods and with different ratios of surfactant-cholesterol and the optimum formulation was determined. The in vitro examinations of these formulations were assesed by different methods such as measuring the occlusivity, the effect of time on viscosity, mean particle size and DSC spectra of the formulations. The in vivo wound healing effect was observed by opening full-thickness wounds on healthy mice. The groups applied and investigated in this study were niosome base, niosome with rhGM-CSF, emulsion base, emulsion with rhGM-CSF, liquid crystalline base, liquid crystalline with rhGM-CSF and control groups. Change in wound areas of the mice was mesured and biopsies were taken at the end of the experiment for the histological and immunohistochemical evaluation of the healing wounds. It was determined that topical vehicles themselves had wound healing effects to some extent but with rhGM-CSF containing groups faster and neater healing was observed. 151

ÖZET t.V. emülsiyonların beslenme amacıyla 30 yıldan beri kliniklerde geniş çapta kullanılması ve 5 um' den küçük partiküllerinin silomikron adı verilen organizmadaki doğal yağ partiküllerine benzer özellikte olması 1970 'li yıllarda ilaç taşıyıcı sistemleri olarak kullanımlarını gündeme getirmiştir. Çalışmamızda öncelikle mısır yağı, yumurta lesitini, pluronik F-68 ve pluronik F-88 veya karışımları halindeki emülgatörler kullanılarak etken madde içeren ve içermeyen i.V. emülsiyon formülasyonları geliştirilmiştir. Bu formülasyonlar içinde makroskobik yönden uygun olan EıS, LZP-Exe, Ex-*, LZP-Eı-z,EıS, LZP-Eı-, kodlu 6 formülasyon fiziksel stabilite ve toksisite açısından en önemli koşul olan partikül büyüklüğü açısından da uygun bulunmuş olup, ortalama partikül büyüklükleri 0.7-0.8 um arasındadır. Bundan sonraki çalışmalarımız bu 6 formülasyon üzerinde yürütülmüş olup E17 ve LZP-Eı-z kodlu emülsiyon formülasyonları geliştirilen formülasyonlar içinde en uygun formülasyonlar olarak saptanmış tır. i.V. ticari preparatının toksisite problemlerinin olması ve istenmeyen yan etkilere sahip olması nedeniyle lipof ilik özellikte olan LZP (Lorazepam) etken madde olarak seçilmiştir. Filtrasyonla sterilize edilen LZP' m PEG'deki çözeltisi otoklav ile sterilize edilen emülsiyonlara 1.2 mg/ml konsantrasyonda ilave edilmiştir. LZP çözeltisinin ilavesinde ortamın pH'sı ve ilave ediliş hızı önemli parametrelerdir. 1 ml/saat hızla pH 7-8 arasında max. LZP miktarı ilave edilebilmiştir. Miktar tayinleri Y.B.S.K. ile yapılmıştır. 1028 ay süre ile +4°C'de ve nötral pH'da bekletilen LZP-Elo, LZP-Ex-t- ve LZP-E1=3 kodlu emülsiyonlarda etken maddenin bozunmadan kaldığı tesbit edilmiştir. Değişik pH, süre ve sıcaklıkların LZP'ın dehidratasyonu üzerindeki etkileri araştırılmış ve % kalan LZP miktarları ile süre pH ve sıcaklık arasındaki ilişki incelendiğinde yüksek sıcaklıkta pH 7-9 dışındaki durumlarda bozunmanın arttığı görülmüştür. Lipofilik ilaçların piyasadaki preparatları hemolitik ve toksik etkileri olan susuz çözücüler ile hazırlanmaktadır. LZP'ın t.V. uygulanan piyasa preparatına uygun hazırlanan formül ve çözücüleri emülsiyon formülasyonları hemolitik etki açısından karşılaştırılmış ve emülsiyonların kullanılan susuz çözücülere göre 10 kez daha az hemoliz yaptığı saptanmıştır. 103 SUMMARY The extensive use of i.v. emulsions in clinics for nutritio nal purposes for 30 years and that of particles smaller then 5 um having similarities to the naturel lipid partic les in the organism called chylomicrons bring out to update to be used as drug carrier systems in seventies. In our study corn oil, egg lecithin, Pluronic F-68 and F-88 or their mixtures are used as surfactants with or without active substance for the development (preparation) of the i.v. emulsions formulations. From these formulations codified emulsions as Exs,LZP-EiS El7 LZf=,-Ei^, E1S and LZP-Ei-s are chosen because of their appropriate macroskopic appearence and of their particle size that is one of the most important parameter of physical stability and toxicity and average particle sizes are found between 0.7 and 0.8 um. Our study is carried out with these three chosen formulations and codified emulsions as. EXv and LZP-Ei-? are found to be the best ones among the others. Lipophilic LZP is selected (chosen) as a model drug because of the toxicity problems and unwanted side effects of the commercial i.v. LZP preparation. LZP solution in PEQ40o sterilized by filtration was incorporated into the emulsions sterilized by autoclaving at a concentration of 1.2 mg/ml. pH of the medium and the rate of addition speed are the most important parameters by the time of addition of LZP solution. The max. LZP amount can be added with an addition speed of 1 ml/hr. at pH 7-8. The assay of LZP added into the emulsions was carried out by HPLC method. 104For 8 months codified as LZP-Eıe, LZP-Eiv and LZP-Ex» emulsions are stored at 4°C and at neutral pH. During this storage time no degradation product relating to LZP was observed. The effects of different pH's, temperatures and time to the dehidration of LZP was investigated. When the relation between time, pH, temperature and remaining % of LZP are examined. It is found that at higher temperatures and at pH below 7 and above 9 an increasing degradation occured.. It's a common way to prepare commercial i.v. preparations of lipophilic drugs with non-aqueous solvents that have hemolitic and toxic effects. The preparation having equivalent formulation of the commercial i.v. LZP preparation their non-aqueous solvents and emulsion formulations are compared with each other according to their hemolitic effects and it was determined that the hemolitic effect of the emulsions are 10 times less than the solvents. 105 123