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Im Fokus der vorliegenden kumulativ angefertigten Arbeit stehen vier wissenschaftliche Untersuchungen, deren Thematik die Vibrationssensorik des Menschen darstellt. Die aus Vibrationen gewonnenen Informationen führen zu wichtigen Regulationsmechanismen zum Beispiel zur Aufrechterhaltung des Gleichgewichtes und des Ganges. Die Ermittlung von sogenannten Vibrationswahrnehmungsschwellen stellt eine Möglichkeit zur Quantifizierung des Funktionszustandes des somatosensorischen Systems dar. In diesem Zusammenhang ist die Kontrolle und Standardisierung einflussnehmender Messbedingungen auf die Bewertung der Vibrationssensorik wichtig. Im ersten Beitrag der vorliegenden Arbeit rückt die Rolle der Auflagekraft, mit welcher der Stößel der Messgeräte die zu untersuchende Hautpartie belastet, in den Fokus (Studie I). In den sich anschließenden Beiträgen werden die Wirkmechanismen der mechanischen Hauteigenschaften auf die Wahrnehmung von Vibrationen aus evolutionsbiologischer (Studie II) und pathologischer (Studie III) Sichtweise betrachtet. Im letzten Beitrag wird die potentielle Wirkung von unterschwelligen Rauschstimulationen als mögliche bewegungstherapeutische Maßnahme zur Verbesserung der sensorischen Leistungsfähigkeit untersucht (Studie IV). Am Ende der Arbeit erfolgt die übergreifende Diskussion der einzelnen Beiträge. Mit Hilfe der gewonnen Erkenntnisse werden Handlungsempfehlungen zur Verbesserung der Quantifizierung der Vibrationssensorik in klinischen und wissenschaftlichen Bereichen abgeleitet. Das erweiterte Verständnis über die Wirkmechanismen verschiedener Einflussgrößen auf die Vibrationssensorik unterstützt die gezielte Erforschung von bewegungstherapeutischen Maßnahmen zur Steigerung der sensorischen Leistungsfähigkeit des Menschen. The focus of the present cumulative dissertation is on four scientific investigations that deal with the human vibration sensory system. The information obtained from vibrations leads to important regulatory mechanisms, for example to maintain balance and gait. Determining so-called vibration perception thresholds represents a possibility to quantify the functional condition of the somatosensory system. In this context, it is important to control and standardize the measurement conditions that influence the evaluation of the vibration sensory system. The first article of the present dissertation focuses on the role of the contact force with which the probe of a measuring device loads the skin area to be examined (Study I). In the subsequent contributions, the action mechanisms of mechanical skin properties regarding vibration perception are considered from an evolutionary (Study II) and pathological (Study III) point of view. In the last paper, the potential effect of subliminal noise stimulation is examined as a possible exercise therapy intervention to improve sensory performance (Study IV). A comprehensive discussion of the individual contributions is included at the end of the present dissertation. Using the gained knowledge, recommendations are derived to improve the quantification of vibration sensation in clinical and scientific areas. The broadened understanding of the mechanisms of action of different influencing variables regarding vibration sensation supports the targeted research of exercise therapy interventions to increase sensory performance in humans.

Current preclinical models used to evaluate novel therapies for improved healing include both in vitro and in vivo methods. However, ethical concerns related to the use of animals as well as the poor physiological translation between animal and human skin wound healing designate in vitro models as a highly relevant and promising platforms for healing investigation. While current in vitro 3D skin models recapitulate a mature tissue with healing properties, they still represent a simplification of the in vivo conditions, where for example the inflammatory response originating after wound formation involves the contribution of immune cells. Macrophages are among the main contributors to the inflammatory response and regulate its course thanks to their plasticity. Therefore, their implementation into in vitro skin could greatly increase the physiological relevance of the models. As no full-thickness immunocompetent skin model containing macrophages has been reported so far, the parameters necessary for a successful triple co-culture of fibroblasts, keratinocytes and macrophages were here investigated. At first, cell source and culture timed but also an implementation strategy for macrophages were deter-mined. The implementation of macrophages into the skin model focused on the minimization of the culture time to preserve immune cell viability and phenotype, as the environment has a major influence on cell polarization and cytokine production. To this end, incorporation of macrophages in 3D gels prior to the combination with skin models was selected to better mimic the in vivo environment. Em-bedded in collagen hydrogels, macrophages displayed a homogeneous cell distribution within the gel, preserving cell viability, their ability to respond to stimuli and their capability to migrate through the matrix, which are all needed during the involvement of macrophages in the inflammatory response. Once established how to introduce macrophages into skin models, different culture media were evaluated for their effects on primary fibroblasts, keratinocytes and macrophages, to identify a suitable medium composition for the culture of immunocompetent skin. The present work confirmed that each cell type requires a different supplement combination for maintaining functional features and showed for the first time that media that promote and maintain a mature skin structure have negative effects on primary macrophages. Skin differentiation media negatively affected macrophages in terms of viability, morphology, ability to respond to pro- and anti-inflammatory stimuli and to migrate through a collagen gel. The combination of wounded skin equivalents and macrophage-containing gels con-firmed that culture medium inhibits macrophage participation in the inflammatory response that oc-curs after wounding. The described macrophage inclusion method for immunocompetent skin creation is a promising approach for generating more relevant skin models. Further optimization of the co-cul-ture medium will potentially allow mimicking a physiological inflammatory response, enabling to eval-uate the effects novel drugs designed for improved healing on improved in vitro models., Aktuelle präklinische Modelle zur Bewertung neuartiger Therapien für eine verbesserte Heilung um- fassen sowohl in vitro als auch in vivo Methoden. Ethische Bedenken im Zusammenhang mit der Ver- wendung von Tieren sowie die schlechte physiologische Übersetzung zwischen tierischer und mensch- licher Hautwundheilung bezeichnen In-vitro-Modelle jedoch als hochrelevante und vielversprechende Plattformen für die Heilungsforschung. Während die aktuellen in vitro 3D-Hautmodelle ein reifes Ge- webe mit heilenden Eigenschaften rekapitulieren, stellen sie dennoch eine Vereinfachung der in vivo- Bedingungen dar, bei denen beispielsweise die nach der Wundbildung entstehende Entzündungsreak- tion den Beitrag von Immunzellen beinhaltet. Makrophagen gehören zu den Hauptverursachern der Entzündungsreaktion und regulieren ihren Verlauf durch ihre Plastizität. Daher könnte ihre Implemen- tierung in die in vitro Haut die physiologische Relevanz der Modelle deutlich erhöhen. Da bisher kein volldickes, immunkompetentes Hautmodell mit Makrophagen berichtet wurde, wurden hier die für eine erfolgreiche Dreifach-Cokultur von Fibroblasten, Keratinozyten und Makrophagen notwendigen Parameter untersucht. Zuerst wurden die Zellquelle und die Kultur zeitlich festgelegt, aber auch eine Implementierungsstrategie für Makrophagen festgelegt. Die Implementierung von Makrophagen in das Hautmodell konzentrierte sich auf die Minimierung der Kultivierungszeit, um die Lebensfähigkeit und den Phänotyp der Immunzellen zu erhalten, da die Umgebung einen großen Einfluss auf die Zell- polarisation und Zytokinproduktion hat. Zu diesem Zweck wurde die Integration von Makrophagen in 3D-Gelen vor der Kombination mit Hautmodellen ausgewählt, um die in vivo-Umgebung besser nach- ahmen zu können. Eingebettet in Kollagenhydrogele zeigten Makrophagen eine homogene Zellvertei- lung im Gel, die die Zelllebensfähigkeit bewahrt, auf Reize reagiert und durch die Matrix wandert, die alle bei der Beteiligung von Makrophagen an der Entzündungsreaktion benötigt werden. Nachdem festgestellt worden war, wie Makrophagen in Hautmodelle eingeführt werden können, wurden ver- schiedene Kulturmedien hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf Primärfibroblasten, Keratinozyten und Makrophagen untersucht, um eine geeignete Medienzusammensetzung für die Kultur immunkompe- tenter Haut zu identifizieren. Die vorliegende Arbeit bestätigte, dass jeder Zelltyp eine andere Supple- mentkombination zur Aufrechterhaltung der Funktionsmerkmale benötigt und zeigte erstmals, dass Medien, die eine reife Hautstruktur fördern und aufrechterhalten, negative Auswirkungen auf die pri- mären Makrophagen haben. Hautdifferenzierungsmedien wirkten sich negativ auf die Makrophagen in Bezug auf Lebensfähigkeit, Morphologie, Fähigkeit, auf pro- und antiinflammatorische Reize zu rea- gieren und durch ein Kollagengel zu wandern aus. Die Kombination aus verwundeten Hautäquivalen- ten und makrophagenhaltigen Gelen bestätigte, dass das Kulturmedium die Teilnahme der Makro- phage an der Entzündungsreaktion, die nach der Wunde auftritt, hemmt. Die beschriebene Makrophagen-Einschlussmethode zur immunkompetenten Hautbildung ist ein vielversprechender An- satz zur Generierung relevanterer Hautmodelle. Eine weitere Optimierung des Co-Kulturmediums wird es möglicherweise ermöglichen, eine physiologische Entzündungsreaktion nachzuahmen und die Aus- wirkungen neuartiger Medikamente zur verbesserten Heilung auf verbesserte In-vitro-Modelle zu be- werten.

In dieser Arbeit werden mit Hilfe der Schwingungsspektroskopie die Wirkung einer nicht-thermischen Plasmabehandlung auf Biomoleküle der Haut, wie etwa L-Cystein, Lipid-Verbindungen und Kollagen, als auch Bakterien untersucht. Als Plasma-Quelle diente dabei eine dielektrische Barriereentladung (DBD). Die Ergebnisse zeigen diverse spektrale chemische Modifikationen, die einerseits die wundheilungsfördernde Wirkung des Plasmas auf chronische Wunden erklären können, andererseits konnten Veränderungen identifiziert werden, die auf irreversible Schäden bestehender Strukturen hindeuten. Darüber hinaus konnten mehrere chemische Gründe für die antimikrobielle Wirkung der DBD auf Bakterien benannt werden. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse eröffnen Wege zur Optimierung einer unbedenklichen Anwendung einer dielektrischen Barriereentladung in der Dermatologie bei gleichzeitiger detaillierter Kontrolle der biochemischen Prozesse durch nicht-invasive mikrospektroskopische Methoden.

In recent decades, the role of inter-α-trypsin inhibitor heavy chain (ITIH)-molecules was studied amongst a number of physiological and pathological conditions.Their only function known so far is the binding to hyaluronan and theresulting stabilization of the extracellular matrix. In line with this function, severalstudies show an evident influence of the ITIH-molecules on inflammatoryas well as carcinogenic and metastatic processes. The present study focuses onthe newest member of the ITIH protein family: ITIH5 encodes a secreted protein,whose expression is significantly downregulated in a variety of human tumortypes such as breast cancer. In this context, research data indicate that ITIH5could function as a tumorsuppressor in breast cancer.As a part of this work, gain-of-function models of different breast cancer celllines were successfully generated. A detailed characterization of phenotypic effectsdue to ITIH5-reexpression in the luminal-like breast cancer cell line MCF7and the basal-like breast cancer cell line BT-549 confirmed an influence of ITIH5on progressive tumor properties in functional in vitro assays. Depending on theITIH5-reexpression, the proliferation and colony formation capability of bothbreast cancer cell lines was significantly reduced, whereas cell-matrix adhesionand apoptosis rate were significantly increased. Furthermore, the applicationof recombinant ITIH5-protein inhibited the growth of different breast cancercells in vitro. Using an in vivo tumorigenesis model it was shown that ITIH5-expressing breast cancer cells which were engrafted into the breast tissue ofimmunosuppressed nude mice showed significantly reduced tumor growth comparedto the control group. The tumor growth inhibition could be associatedwith parameters of reduced angiogenesis. Overall, the experimental approachesdetermined a distinct tumorsuppressive effect of ITIH5.An ITIH5 knockout mouse model was generated for the first time to investigatethe consequences of the loss-of-function of ITIH5 in detail. This modelwas validated on the DNA, mRNA and protein level. The animals were fertileand enabled the establishment of a breeding colony. Initial phenotypic analysesshowed a trend towards reduced body weight of ITIH5 knockout mice as wellas individual abnormalities in blood and serum parameters compared to wildtypeanimals. In addition, the skin of ITIH5 knockout mice was examined forphenotypic abnormalities. Due to the functional loss of ITIH5, significant morphologicaldifferences were apparent compared to wild-type controls. The skinof ITIH5 knockout mice was thinner and exhibited an undifferentiated structureof the epidermis. The same result was obtained from successfully generatedthree-dimensional in vitro skin-models of these mice. An immunohistochemicalinvestigation of the hyaluronan structures in the skin-models indicated thatITIH5 exerts a stabilizing effect on the hyaluronan as it is described for otherfamily members.Up to now, the role of ITIH-proteins in human skin has not been studied indepth. Within this study, the expression of the individual ITIH-family memberswas investigated for the fist time in human skin, using a chip-based gene expressionanalysis. This analysis showed that ITIH5 is the most abundantly expressedmember of the ITIH protein family in human skin. Real-time PCR and westernblot studies indicated dermal fibroblasts as a main site of ITIH5-synthesis in theskin. Next, immunohistochemical analysis revealed an up-regulation of ITIH5 ininflammatory skin diseases. In this context, an animal model of allergic contactdermatitis revealed that ITIH5 is essential for the induction of an inflammatoryresponse.In summary this work confirmed the distinct tumorsuppressive function ofITIH5 in human breast cancer, both in vitro and in vivo. Moreover, ITIH5 wascharacterized for the first time in skin where it seems to play an evident role instructural and inflammatory processes.

Für die Homöostase der Haut ist das Gleichgewicht zwischen Proliferation, Differenzierung und Desquamation essentiell. Die Desquamation findet durch die proteolytische Spaltung der Korneo¬desmosomen durch Kallikreine statt. Deren Aktivität wird unter Anderem durch Serin-Protease-Inhibitoren wie hLEKTI1 reguliert. Kürzlich wurden zwei Homologe zu hLEKTI1, hSPINK9 und hSPINK6 beschrieben. hSPINK6 hemmt selektiv die Kallikreine KLK5, KLK7, KLK12, KLK13 und KLK14, welche wichtig für die Hauthomöostase sind und wird in verschiedenen Hautarealen exprimiert. hSPINK9 hingegen inhibiert nur spezifisch KLK5, ist nur in palmoplantaren Hautbereichen nachzuweisen und hat eine antimikrobielle Aktivität. In der vorliegenden Arbeit wurden diese Serin-Protease-Inhibitoren hSPINK9 und hSPINK6 näher charakterisiert. Es konnte mittels mRNA-Analyse gezeigt werden, dass die Expression beider Inhibitoren induzierbar ist. Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass sie in der Zelle vesikulär vorliegen und sowohl konstitutiv als auch stimulierbar sekretiert werden. Für das Gleichgewicht zwischen Proliferation und Differenzierung ist die MAPK-Kaskade für die Hauthomöostase ein wichtiger regulatorischer Bestandteil. Dieser Signalweg wird dabei hauptsächlich durch MAPK-Signalweges hauptsächlich durch den epidermal growth factor receptor (EGFR) vermittelt. Die Liganden des EGFR werden duch die ADAM-Metallproteasen freigesetzt, sodass die Regulation der ADAM-vermittelten Proteolyse ebenfalls für die Homöstase der Haut eine wichtige Komponente ist. Interessanterweise haben hSPINK9 und hSPINK6 strukturelle Ähnlichkeiten zu kationischen antimikrobiellen Peptiden (AMPs). Zwei Vertreter der AMPs, LL-37 und Melittin, sind in der Lage die Keratinozytenmigration zu fördern indem sie den EGFR durch eine gesteigerte ADAMs-vermittelte Proteolyse aktivieren. In vitro Wund¬heilungsversuche und Western Blots zeigten, dass auch hSPINK9 die Migration von Keratinozyten induziert indem der EGFR transaktiviert wird. Durch den Einsatz des Breitband-Metalloprotease-Inhibitors Mariamastat und des EGFR-blockiernden Antikörpers Cetuximab konnte nachgewiesen werden, dass eine gesteigerte ADAM-vermittelte Proteolyse der EGFR-Liganden zur Transaktivierung führt. Die klassischen P2-Rezeptoren-Antagonisten oxATP und PPADS blockierten die durch hSPINK9 ausgelöste EGFR-Aktivierung analog zu den kürzlich publizierten Erkenntnissen von LL 37 und Melittin. Dies lässt schlussfolgern, dass P2-Rezeptoren womöglich eine essentielle vermittelnde Funktion bei der Regulation der ADAM-vermittelten Proteolyse durch kationische AMPs spielt. Weitere Untersuchungen deuten daraufhin, dass hSPINK9 genauso wie andere kationische AMPs auch immunmodulatorisch wirkt. Es ist beispielsweise in der Lage, PBMCs anzulocken, indem es die Motilität der Zellen steigert und wird von Eosinophilen exprimiert. Erste Ergebnisse weisen daraufhin, dass hSPINK9 mit eosinophil extracellular traps freigesetzt wird und bei der Verteidigung gegen Bakterien und Parasiten involviert ist. Zusammenfassend hat diese Arbeit gezeigt, dass hSPINK9 neben der spezifischen Inhibition von KLK5 und der antimikrobiellen Aktivität weitere Funktionen besitzt. Durch die migrationsfördende und immunmodulatorische Wirkung als auch die regulatorische Rolle gegenüber der ADAM-vermittelten Proteolyse, kann hSPINK9 eine neue Perspektive zur Behandlung von Wunden und Hautbarriere¬störungen darstellen. The balance between proliferation, differentiation and desquamation is essential to maintain the skin homeostasis. The desquamation of the uppermost layers of the epidermis is mediated by kallikreins which proteolytically cleave the corneodesmosomes. These kallikreins are regulated inter alia by serine protease inhibitors like hLEKTI1. Recently, two homologs of hLEKTI1, namely hSPINK9 and hSPINK6, were described. hSPINK6 selectively inhibits the kallikreins KLK5, KLK7, KLK12, KLK13 and KLK14 and is expressed in various skin areas. In contrast, hSPINK9 is only expressed in palmoplantar skin and specifically inhibits KLK5. Furthermore it is proposed to be antimicrobially active against E. coli. In this study hSPINK9 and hSPINK6 were further characterized. mRNA analyses showed, that the expression of both inhibitors are inducible. Furthermore, hSPINK9 and hSPINK6 were found to be intracellularly localized in vesicles and are constitutive as well as inducible released. The MAPK cascade is responsible for the regulation of proliferation and differentiation in skin homeostasis. This signalling pathway is mediated by the activation of the epidermal growth factor receptor (EGFR). The ligands of the EGFR are shed by ADAM metalloproteases. Thus the regulation of ADAMs is an important component for the skin homeostasis. Interestingly, hSPINK9 and hSPINK6 have structural similarties to cationic antimicrobial peptides (AMPs). Recently, it was reported that the two AMPs LL 37 and melittin promote keratinocyte migration via activating ADAMs. In vitro wound healing assays and western blots showed that also hSPINK9 transactivates the EGFR resutling in cell migration. The increase in ADAM-mediated proteolysis by hSPINK9 was evidenced by suppression with the broad range metalloprotease inhibitor marimastat and the EGFR-blocking antibody Cetuximab. The classical purinergic receptor antagonists oxATP and PPADS effectively inhibited EGFR-transactivation by rSPINK9, indicating that in analogy to what has recently been reported for the AMPs LL 37 and melittin, purinergic receptors play an essential bridging role in promoting the upregulation of ADAM-function by the cationic peptide. Additional analyses indicated that hSPINK9, just like other cationic AMPs has an immunmodulatory function such as attracting PBMCs via increasing cell motility. Moreover it is expressed in eosinophil granulocytes. Preliminary data showed that hSPINK9 is released with eosinophil extracellular traps and might thus be involved in the defence against bacteria and parasites. Taken together, hSPINK9 has further functions besides its inhibition of KLK5 and its antimicrobial activity. As demonstrated by this work hSPINK9 can function as immunmodulator, migration promotor and trigger of ADAM-mediated transsignalling of the EGF receptor. Therefore it might support wound healing or skin barrier disorders.

Durch Methoden des Tissue Engineerings hergestellte dreidimensionale Hautäquivalente bilden die native humane Haut hinsichtlich ihrer histologischen Architektur, zellulären Zusammensetzung und metabolischen Aktivität ab. Diese Gewebe eignen sich daher als zellbasierte Wundauflagen für großflächige Hautdefekte oder als In-vitro-Testsysteme für den Ersatz von Tierversuchen. Bei bisherigen Hautäquivalenten fehlt jedoch ein funktionelles Blutgefäßsystem. Wird solch ein Gewebe als Implantat eingesetzt, führt das Fehlen von Blutgefäßen zu einer unzureichenden Versorgung mit Nährstoffen und zur Nekrose. Neben dieser klinischen Limitation ist auch das Anwendungsspektrum als In-vitro-Testsystem begrenzt. Bei nicht vaskularisierten Hautmodellen kann eine transdermale Penetration von Substanzen nicht akkurat abgeschätzt werden, da die zusätzliche Barriere, welche die gefäßauskleidenden Endothelzellen bilden, nicht enthalten ist. In Studien zur Integration eines Gefäßsystems in Hautäquivalente konnte bislang lediglich gezeigt werden, dass sich Endothelzellen zu gefäßartigen Strukturen zusammenlagern. Die Bildung von funktionellen perfundierbaren Gefäßen in einem in vitro generierten Hautäquivalent ist bisher jedoch noch nicht belegt. Entsprechend ist eine direkte Anastomose mit dem Blutkreislauf eines Patienten bei einem klinischen Einsatz als Hautimplantat nicht möglich. Bei einer Anwendung in In-vitro-Studien ist zudem das Gefäßsystem experimentell nicht zugänglich. In der vorliegenden Arbeit kann durch die Kombination einer biologischen, vaskularisierten Trägerstruktur (BioVaSc) mit einem neu entwickelten Bioreaktorsystems, ein Hautäquivalent mit einem perfundierbaren Gefäßsystem hergestellt werden. Die Generierung dieser sogenannten SkinVaSc erfolgt über die Besiedlung der BioVaSc mit humanen Keratinozyten (hEK) und Fibroblasten. Parallel dazu werden die eingebetteten Gefäßstrukturen der BioVaSc mit humanen mikrovaskulären Endothelzellen (hDMEC) rebesiedelt. Durch eine Anastomose zwischen den Gefäßen der BioVaSc und dem Bioreaktorsystem ist eine Perfusion mit physiologisch, gepulsten Drücken zwischen 80 und 120 mmHG möglich. Optimale Kulturbedingungen für die Haut- zellen können ferner durch zwei Kulturmodi generiert werden. Zur optimalen Versorgung der hEK innerhalb einer Proliferationsphase, die sich an die Zellaussaat anschließt, erfolgt eine kontinuierliche Versorgung der Oberfläche der SkinVaSc mit Medium. Der zweite Modus stimuliert die Differenzierung der hEK durch eine Kultivierung des Modells an der Grenzfläche zwischen Luft und Medium. Nach einer vierzehntägigen Kultivierung der SkinVaSc an der Luft Medium Grenzfläche lässt sich die Bildung einer hautspezifischen histologischen Architektur durch Hämalaun/Eosin und immunhistologische Färbungen belegen. Eine natürlich differenzierte Epidermis wird durch eine Basalmembran, die Kollagen Typ IV und Laminin 5 enthält von einen dermalen Teil getrennt. Die Dermale-Epidermale-Verbindung erscheint durch die Mikrostrukturierung der BioVaSc wellenförmig. Damit bildet die SkinVaSc die papillare Struktur der nativen humanen Haut ab. Innerhalb des dermalen Anteils können zudem Gefäßstrukturen ausgemacht werden. Die Innenseite der Gefäße sind durch eine Schicht aus hDMEC ausgekleidet, die endothelzellspe- zifische Oberflächenmarker wie "platelet endothelial cell adhesion molecule 1“ und "von Willebrand Faktor“ aufweisen. Eine zerstörungsfreie Überwachung der SkinVaSc hinsichtlich der epidermalen Differenzierung ist durch eine integrierte Sensortechnologie auf Basis der Impedanz-spektroskopie möglich. Dabei erlaubt ein entwickeltes mathematisches Modell die Extraktion von biologisch relevanten Informationen aus Impedanzspektren in einem Frequenzbereich zwischen 1 Hz und 100 kHz. Innerhalb dieser Studien ließ sich zeigen, dass die epidermale Differenzierung zu einer signifikanten Steigerung des ohmschen Widerstandes von 245,3 Ohm*cm2 zu 1108,1 Ohm*cm2 führt. Gleichzeitig sinkt die zelluläre Kapazität von 131,5µF/cm2 auf 5,4µF/cm2 ab. Durch diese Parameter ist es möglich die epidermale Barriere zerstörungsfrei über die Kultivierungszeit zu überwachen. Das Gefäßsystem der SkinVaSc ermöglicht es mehr dermatologische Fragestellungen in vitro zu untersuchen und damit Tierversuche zu ersetzen. Zudem kann auf Basis der SkinVaSc ein vaskularisiertes Hautimplantat entwickelt werden, das es ermöglicht tiefe Hautverletzungen zu behandeln., Tissue engineered three-dimensional skin equivalents can mimic the key anatomical, metabolic and cellular aspects of the human skin and thus can be employed as wound coverage for large skin defects or as in vitro test systems as an alternative to animal models. However, current skin equivalents lack a functional vasculature. Hence, their possible applications are limited in both fields. In a clinical application, the absence of a vasculature can lead to an insufficient supply of nutrients, which is a major reason for the failure of skin grafts. Moreover, without a vascular system, skin equivalents are not suitable to assess the transdermal penetration of substances accurately as the additional barrier of the endothelial cells is not present. Although there are approaches where endothelial cells are seeded into the dermal part of full thickness skin equivalents, which yield alignment of endothelial cells to vessel like structures, no functional perfusable vasculature is formed in vitro. Thus, no direct anastomosis of a skin graft with a patient’s blood flow is possible and the vasculature is not experimentally accessible in in vitro tests. Using a biological vascularized scaffold (BioVaSc) in combination with a custom developed bioreactor system, this thesis documents the in vitro generation of a vas- cularized skin equivalent with a perfused vascular network. The BioVaSc is based on a decellularized segment of a porcine jejunum and consists mainly of a collagen type III and I scaffold, in which the structure of the former vascular network is still embedded. For the formation of a vascularized skin equivalent (termed ‘Skin- VaSc’ in this thesis), the BioVaSc is initially constructed with human fibroblasts and keratinocytes. Following this, the embedded vascular structures in the BioVaSc are seeded with human micro vascular endothelial cells (hDMEC). This hDMEC vasculature in the BioVaSc is then connected to an outer fluidic system, which is provided by a developed bioreactor system. The fluidic system generates a physio- logical medium flow into the BioVaSc with a pulsatile pressure profile between 80 and 120 mmHg and can culture the SkinVaSc both under submersed conditions and at the air-liquid-interface. After culturing the SkinVaSc at the air-liquid interface for 14 days, histological hemalaun-eosin and immunohistological staining revealed specific histological architecture representative of the human dermis in vivo. A naturally differentiated epidermal layer and a dermal equivalent are separated by a basement membrane with components such as collagen type IV and laminin 5. Due to the villi structure of the BioVaSc, the dermal-epidermal-junction exhibits a papillary like architecture as seen in human skin in vivo. Additionally, hDMEC are detectable inside the per- fused vasculature and exhibit endothelial cell specific surface markers such as von Willebrand Factor (vWF) and platelet endothelial cell adhesion molecule 1. To monitor the formation of skin tissue inside the bioreactor, a non-destructive sen- sor technology based on impedance spectroscopy was established. A derived algorithm allows one to extract biologically relevant information from impedance spectra between 1 Hz and 100 kHz. Employing this algorithm, a drop from 131.5µF/cm2 to 5.4To monitor the formation of skin tissue inside the bioreactor, a non-destructive sensor technology based on impedance spectroscopy was established. A derived algo rithm allows one to extract biologically relevant information from impedance spectra between 1 Hz and 100 kHz. Employing this algorithm, a drop from 131.5µF/cm2 to 5.4µF/cm2 of the capacity and an increase from 245.3 Ohm*cm2 to 1108.1 Ohm*cm2 of the resistance was detectable from day 1 to day 12 of the culture at the air-liquid-interface. These changes could be correlated to the differentiation of the keratinocytes and the formation of a corneous layer. Thus, this method can be used to assess the epidermal differentiation non-invasively. Due to the integrated vasculature the SkinVaSc enables one to investigate additional dermatological questions in vitro and thus to replace animal experiments. Moreover, the SkinVaSc has enormous potential to be used as a vascularized skin graft for the treatment of deep skin wounds. µF/cm2 of the capacity and an increase from 245.3 Ohm*cm2 to 1108.1 Ohm*cm2 of the resistance was detectable from day 1 to day 12 of the culture at the air-liquid- interface. These changes could be correlated to the differentiation of the keratinocy- tes and the formation of a corneous layer. Thus, this method can be used to assess the epidermal differentiation non-invasively. Due to the integrated vasculature the SkinVaSc enables one to investigate additional dermatological questions in vitro and thus to replace animal experiments. Moreover, the SkinVaSc has enormous potential to be used as a vascularized skin graft for the treatment of deep skin wounds.

Interleukin(IL)-22, ein Zytokin der IL-10-Interferon-Familie, beeinflusst die Funktion von Gewebezellen, wirkt jedoch nicht auf Immunzellen. In dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass IL-22 in Keratinozyten nur eine begrenzte Anzahl von Genen in ihrer Expression reguliert, was eine Hemmung der terminalen Differenzierung und eine Steigerung der antimikrobiellen Abwehr und der zellulären Mobilität bewirkt. Diese IL-22-Effekte konnten in vivo aufgrund ihrer Induzierbarkeit durch eine IL-22-Behandlung in Mäusen bestätigt werden und fanden sich darüber hinaus in der läsionalen Haut von Patienten mit Psoriasis wieder. Eine pathogenetische Rolle von IL-22 bei Psoriasis wurde durch eine gefundene Erhöhung der IL-22-Spiegel im Blut dieser Patienten und eine Korrelation dieser mit dem Schweregrad der Erkrankung untermauert. Eine Untersuchung der Wirkung von IL-22 auf Hepatozyten zeigte, dass IL-22 in diesen Zellen die Produktion des LPS-Bindungsproteins (LBP) steigert, welches in hohen Konzentrationen bakterielle Bestandteile neutralisiert. In vivo zeigte sich, dass eine IL-22-Gabe in der Maus eine verstärkte Expression von LBP in der Leber und erhöhte sytemische LBP-Spiegel bewirkt. Diese Hepatozyten-spezifische IL-22-Wirkung spiegelte sich bei Patienten mit Morbus Crohn in erhöhten systemischen LBP-Spiegeln wieder. Bei der Psoriasis steht vor allem der regenerative Phänotyp der Keratinozyten, gekennzeichnet durch eine verminderte terminale Differenzierung und eine gesteigerte Mobilität, im Vordergrund und bildet die Ursache für die klinisch sichtbaren epidermalen Veränderungen. Demgegenüber könnte bei Morbus Crohn IL 22 durch die Induktion von hepatozytärem LBP zur Neutralisierung von durch die gestörte Darmbarriere ins Blut translozierte bakterielle LPS zur lokalen Begrenzung der Entzündung beitragen. Ausgehend von diesen Beobachtungen wäre eine IL-22-Neutralisierung bzw. IL-22-Applikation ein innovativer Therapieansatz für die Behandlung von Psoriasis und Morbus Crohn., Interleukin(IL)-22, a cytokine belonging to the IL-10-Interferon-family, regulates the function of tissue cells, but not of immune cells. Here, I could show, that in keratinocytes IL-22 regulates the expression of a limited number of genes leading to an inhibition of the terminal differentiation and an increase of the antimicrobial defense and cellular mobility. These IL-22 effects were also confirmed in vivo as they could be induced in mice by IL-22-treatment and moreover, were also found to be present in the lesional skin of psoriasis patients. A pathogenetic role of IL-22 in psoriasis was substantiated by the finding that IL-22 level are elevated in the blood of these patients and correlated with the disease severity. By investigating the influence of IL-22 on hepatocytes, I found an increase of LPS-binding protein (LBP) production by IL-22, a protein which neutralizes bacterial components at high concentrations. In vivo, IL-22 treatment of mice led to a high hepatic LBP expression and elevated blood LBP level. This hepatocyte-specific IL-22 effect was reflected in patients with crohn´s disease in elevated systemic LBP level. In psoriasis, especially the regenerative phenotype of keratinocytes, characterized by the distorted terminal differentiation and enhanced mobility, is a key feature and the basis for the clinically visible epidermal alterations. In contrast, in crohn´s disease by inducing hepatic LBP production IL-22 likely contributes to the neutralisation of LPS translocated into the blood via the distorted intestinal barrier and thereby to a local limitation of inflammation. Based on these observations a neutralisation or application of IL-22 would be an innovative therapeutic approach for the treatment of psoriasis and crohn´s disease, respectively.

Die lichtdurchlässige Cornea enthält lamellar organisierte, dünne Kollagen I/V-Fibrillen. Durchmesser und Zusammensetzung dermaler Kollagen I/III/V-Fibrillen sind hingegen heterogen. Zusätzlich zu seiner Funktion als Nukleationskeim für die Fibrillogenese, wurde Kollagen V in epithelialen Verankerungszonen der Haut und der Cornea gefunden. Dabei war das unmaskierte N-Propeptid der alpha 1-Kette des Kollagen V mit der alpha 5-Kette des Kollagen VI kolokalisiert. Dies führt zu der Annahme, dass Kollagen V zusammen mit Kollagen VI ein Bestandteil mikrofibrillärer Netzwerke der epithelialen Verankerungszonen ist. Außerdem wurden im Stroma der adulten Cornea dicke Kollagen II/III-Fibrillen identifiziert, die eine möglicherweise altersunabhängige Rolle bei der Aufrechterhaltung der cornealen Integrität spielen. Die optischen Eigenschaften der Cornea werden demnach durch die geringe Anzahl dicker Fibrillen nur unerheblich beeinträchtigt.

Dermal-epidermale Interaktionen, bei denen Keratinozyten und Fibroblasten über lösliche Faktoren miteinander kommunizieren, sind ein wesentlicher Bestandteil der Regulation des Wundheilungsprozesses der Haut (Fusenig, 1994). Über die genauen molekularen Mechanismen in Fibroblasten die diese Interaktion steuern ist wenig bekannt. In Fibroblasten nimmt die AP-1 Transkriptionsfaktor-Untereinheit c-Jun und die von ihr regulierten löslichen Faktoren eine Schlüsselrolle in der Regulation der epidermalen Proliferation ein (Szabowski et al., 2000). Die Aktivierung von c-Jun wird durch die Jun-aminoterminale Kinase JNK reguliert. Erstaunlicherweise ist in heterologen Cokulturen mit JNK-defizienten Fibroblasten nicht die Proliferation sondern der Eintritt in die terminale Differenzierung der Keratinozyten unvollständig bzw. blockiert. Vorarbeiten haben gezeigt, dass dieser Phänotyp auf der fehlenden Expression eines oder mehrerer löslicher JNK-abhängiger, c-Jun unabhängiger Faktoren beruht. Daher war es Ziel der vorliegenden Arbeit diese Faktoren zu identifizieren und zu charakterisieren. Mit Hilfe einer Proteom-Analyse wurden "pigment epithelium derived factor" (PEDF) und "bone morphogenetic protein-4" (BMP-4) als lösliche JNK-abhängige, c-jun unabhängigen Faktoren identifiziert. Diese beiden Faktoren werden sowohl in vitro als auch in vivo von dermalen Fibroblasten exprimiert. Während der in vivo Wundheilung weisen sie eine differenzielle Expression mit einer distinkten Lokalisation innerhalb der Wunde auf. Funktionelle Analysen im heterologen Cokultur-System ergaben, dass PEDF und BMP-4 die Proliferation von Keratinozyten inhibieren, die Stratifizierung des Epithels durch eine kombinatorische Wirkungsweise initiieren und für das vollständige Durchlaufen des terminalen Differenzierungsprogramms der Keratinozyten notwendig sind. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass der Eintritt der Keratinozyten in die terminale Differenzierung ein regulierter Prozess ist. Die Proliferation und die Differenzierung von Keratinozyten sind zwei entkoppelte Prozesse, die über PEDF und BMP-4 gesteuert werden. Somit kann die Epitheldicke unabhängig von der Proliferationsrate der Keratinozyten reguliert werden. Regeneration of the skin after wounding is modulated to a large extend by dermal-epidermal interactions (Fusenig, 1994) but little is known about the exact molecular mechanisms. A missing c-Jun activity in fibroblasts leads in heterologous cocultures to a decreased keratinocyte proliferation and modulation of late differentiation (Szabowski et al., 2000). In contrast, inactivation of the upstream kinase of c-Jun namly the c-Jun amino terminal kinase (JNK) in fibroblasts leads to enhanced keratinocyte proliferation and a missing entry to terminal differentiation. This JNK-dependent phenotype can be rescued by conditioned media derived from cultures containing c-Jun-deficient fibroblasts, indicating that the observed alterations are due to a missing or reduced expression of JNK-dependent but c-Jun-independent, soluble fibroblasts-derived factors, which regulate keratinocyte proliferation and stratification. Aim of this study was to identify and characterize these JNK-dependent, soluble factors. Using a proteomic screen "pigment epithelium derived factor" (PEDF) and “bone morphogenetic protein-4” (BMP-4) were identified as JNK-dependent, but c-Jun independent factors. Further characterisation revealed that both factors are expressed during skin homeostasis in vivo preferentially in the dermal compartment and are in vivo wound regulated. Functional analysis of either single application of one factor or the combination of both in the heterologous coculture model revealed on the one hand an anti-proliferative effect of PEDF and BMP-4 on keratinocytes. Most interestingly, the combined action of both factors is necessary for initiation of stratification and a sufficient entry to terminal differentiation. These data indicate that entry to terminal differentiation is a regulated process modulated by PEDF and BMP-4. Proliferation and differentiation of keratinocytes are therefore two uncoupled genetic processes which can be modulated separately. Thereby epithelial thickness can be modified independently from the proliferation rate of keratinocytes.

The barrier function of the human skin involves biochemical as well as immunological processes. The family of multidrug resistance-associated proteins (MRP) are efflux transporters which protect skin cells from xenobiotica and promote inflammatory defence responses against pathogens through the export of prostaglandins and leukotrienes. In the first part of this thesis we investigated the effect of interleukin-6 (IL-6) and oncostatin M (OSM) on the expression of MRP-1, -3, -4 and -5 in normal human epidermal keratinocytes and primary dermal fibroblasts. Using real-time PCR, RT-PCR, cDNA microarray, immunostaining and efflux assays we found that IL-6 in combination with its soluble receptor enhances MRP expression and activity in keratinocytes. Despite the expression of the OSM receptor (OSMR) we could not observe an increased expression of MRP-3 in keratinocytes while MRP-1 mRNA levels were elevated. On the other hand OSM turned out to be a more effective stimulator of MRP synthesis in dermal fibroblasts. Both cytokines induced a strong activation of STAT1 and STAT3 (signal transducer and activator of transcription) as well as the MAPK (mitogen-activated protein kinase) Erk1/2. In contrast to IL-6, OSM additionally activated protein kinase B/Akt and the stress-activated MAPK p38. While the activation of MAPK occurred transiently with a peak at 30 minutes, the tyrosine phosphorylation of STAT factors persisted over a time period of 24 hours. Using the MEK1 (MAPK/extracellular signal-regulated kinase kinase 1)-specific inhibitor U0126 we could exclude a stimulatory effect of MAPK on MRP gene expression. Inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase, however, indicated that this pathway might be involved in the OSM-mediated up-regulation of MRP-4 in dermal fibroblasts. It was known before that several inflammatory skin diseases show an enhanced expression of IL-6-type cytokines. This fact correlates well with the observed up-regulation of MRP-1 expression in lesional skin from patients with psoriasis. The second part of this thesis focussed on some aspects of the immunological skin barrier function and its dysregulation. We characterised the signalling capacities of the interleukin-31 receptor, which forms a receptor complex in combination with the OSMR for the recently identified cytokine IL-31. Furthermore the relevance of IL-31 for Th1/Th2-mediated inflammatory skin diseases was examined. Using a chimeric receptor system based on the extracellular parts of the IL-5 receptor as well as the transmembrane and intracellular regions of gp130, OSMR and IL-31R we identified the recruitment sites for STAT3 and STAT5 by site-directed mutagenesis of individual tyrosine residues. The activation of STAT1 was also dependent on tyrosine motifs, yet mutation of a single tyrosine residue was insufficient to abrogate STAT1 phosphorylation. Unlike gp130, LIFR or OSMR the IL-31R is unable to initiate ERK1/2 phosphorylation due to the lack of recruitment of the tyrosine phosphatase SHP2 or the adaptor protein Shc. The strong expression of IL-31 in many skin biopsies from patients with atopic dermatitis is in line with the severe pruritic skin phenotype of IL-31 transgenic mice. The very strong expression of IL-31 in some biopsies from patients with allergic contact dermatitis indicates an involvement of IL-31 in the pathogenesis of this disease. IL-31 expression correlates with increased IL-4 expression and is found only in biopsies from patients with atopic and allergic contact dermatitis, but not in biopsies taken from patients suffering from the Th1-lymphocyte mediated skin disease psoriasis. Therefore, the most likely candidate cells for the secretion of IL-31 are Th2-lmphocytes. In addition to the constitutive expression of IL-31R as well as the OSMR in primary human keratinocytes, we could show for the first time an expression of this receptor complex in dermal fibroblasts.

Das Ziel dieser Arbeit war es die Barrierefunktion (Durchlässigkeit) rekonstruierter humaner Hautmodelle mit menschlicher und tierischer Haut zu vergleichen, um zu sehen, ob sie als Ersatz für diese Häute im Rahmen von Permeationsuntersuchungen benutzt werden können. Das Vorgehen, um diese Frage zu beantworten lässt sich in zwei Abschnitte unterteilen. Im ersten Abschnitt wurden Arbeiten am experimentellen Ansatz durchgeführt während im zweiten Teil die eigentlichen vergleichenden Studien durchgeführt wurden, in deren Rahmen diese verschiedenen Häute miteinander verglichen werden. Die Arbeiten am experimentellen Ansatz umfassten unter anderem Einflüsse der Lagerzeit, Präparationstechnik , Temperierung und des Probenzugs. Ein besonders wichtiger Punkt bei der Entwicklung des experimentellen Ansatzes war die Erprobung einer Methode für die Durchführung von Integritätstests. Hierfür wurde das TEWAMETER ausgewählt. Die durchgeführten Untersuchungen zeigten, dass das TEWAMETER zwar in der Lage ist grossflächige, schwere Beschädigungen aufzuspüren aber kleine Löcher in der Haut nicht entdecken konnte. Aufgrund dieser Einschränkung wurde das TEWAMETER im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr verwendet und es wurde ohne Integritätstest weitergearbeitet. Mit dieser Untersuchung konnte der methodologische Teil zur Entwicklung des experimentellen Ansatzes abgeschlossen werden. Nach Klärung der den experimentellen Ansatz betreffenden Fragen konnten vergleichende Permeationsstudien mit humaner, tierischer und künstlicher Haut durchgeführt werden. In der ersten dieser Studien musste zuerst die Frage geklärt werden, welche Zubereitung menschlicher Haut am besten für Permeationsexperimente geeignet ist. Versuche mit menschlicher Vollhaut, dermatomisierter Haut, hitzeseparierter humaner Epidermis und trypsinisoliertem Stratum Corneum zeigten, dass hitzeseparierte Epidermis für diese Experimente am besten geeignet ist. Im Anschluss daran wurden mit hitzesparierter Haut und dem künstlichen Hautmodell Episkin von L';Oréal vergleichende Experimente durchgeführt, bei denen sich Episkin als deutlich permeabler als die menschliche Haut herausstellte. Porcine, bovine und humane Haut wurden in der nächsten Studie miteinander verglichen. Diese Untersuchung wurde durchgeführt, da für humane Haut und porcine Epidermis bereits umfangreiche Untersuchungen über ihre Eignung für Permeationsstudien durchgeführt worden waren. Die bovine Euterspalthaut allerdings war bisher nur selten untersucht worden. Zuerst wurde der allgemeine Aufbau der Häute miteinander verglichen, wobei grosse Übereinstimmungen gefunden wurden. Im Anschluss daran durchgeführte Permeationsexperimente mit Koffein, Flufenaminsäure, Benzoesäure und Testosterone zeigten bei humaner und porciner Haut ähnliche Ergebnisse, während Kuheuterhaut durchwegs permeabler war. Kuheuterhaut zeigte allerdings eine geringere Variabilität als die beiden anderen Hauttypen. Da Kuheuterhaut zudem als Schlachtabfall leicht erhältlich ist, macht dies diese Haut zu einer interessanten Alternative zur humanen Haut in Permeationsstudien. Die oben beschriebenen Erkenntnisse flossen in einer multizentrischen Prävalidierungsstudie zusammen. Unter standardisierten Bedingungen mit rekonstruierten Epidermen, humaner, boviner und porciner Haut durchgeführt. Die rekonstruierten Epidermen erwiesen sich wiederum als deutlich durchlässiger als humane und tierische Häute. Die Schlussfolgerung aus diesen Untersuchungen ist, dass rekonstruierte humane Epidermen nur sehr eingeschränkt als Alternative zur humanen und tierischen Haut gesehen werden können. Humane und tierische Haut werden deshalb in der nächsten Zukunft das Mittel der Wahl für Permeationsstudien bleiben. The aim of this work was to compare the barrier function of human skin and reconstructed epidermis models. Several aspects of the experimental setup were investigated (contamination, cryoconservation, heat separation technique, integrity testing, sampling). Several comparative studies were conducted with different skin preparation, reconstructed human epidermis and animal skins. Human and animal skin proved to have a superior barrier function than reconstructed human epidermis.

Dermal-epidermale Interaktionen, bei denen Keratinozyten und Fibroblasten über lösliche Faktoren miteinander kommunizieren, sind ein wesentlicher Bestandteil der Regulation des Wundheilungsprozesses der Haut (Fusenig, 1994). Über die genauen molekularen Mechanismen in Fibroblasten die diese Interaktion steuern ist wenig bekannt. In Fibroblasten nimmt die AP-1 Transkriptionsfaktor-Untereinheit c-Jun und die von ihr regulierten löslichen Faktoren eine Schlüsselrolle in der Regulation der epidermalen Proliferation ein (Szabowski et al., 2000). Die Aktivierung von c-Jun wird durch die Jun-aminoterminale Kinase JNK reguliert. Erstaunlicherweise ist in heterologen Cokulturen mit JNK-defizienten Fibroblasten nicht die Proliferation sondern der Eintritt in die terminale Differenzierung der Keratinozyten unvollständig bzw. blockiert. Vorarbeiten haben gezeigt, dass dieser Phänotyp auf der fehlenden Expression eines oder mehrerer löslicher JNK-abhängiger, c-Jun unabhängiger Faktoren beruht. Daher war es Ziel der vorliegenden Arbeit diese Faktoren zu identifizieren und zu charakterisieren. Mit Hilfe einer Proteom-Analyse wurden "pigment epithelium derived factor" (PEDF) und "bone morphogenetic protein-4" (BMP-4) als lösliche JNK-abhängige, c-jun unabhängigen Faktoren identifiziert. Diese beiden Faktoren werden sowohl in vitro als auch in vivo von dermalen Fibroblasten exprimiert. Während der in vivo Wundheilung weisen sie eine differenzielle Expression mit einer distinkten Lokalisation innerhalb der Wunde auf. Funktionelle Analysen im heterologen Cokultur-System ergaben, dass PEDF und BMP-4 die Proliferation von Keratinozyten inhibieren, die Stratifizierung des Epithels durch eine kombinatorische Wirkungsweise initiieren und für das vollständige Durchlaufen des terminalen Differenzierungsprogramms der Keratinozyten notwendig sind. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass der Eintritt der Keratinozyten in die terminale Differenzierung ein regulierter Prozess ist. Die Proliferation und die Differenzierung von Keratinozyten sind zwei entkoppelte Prozesse, die über PEDF und BMP-4 gesteuert werden. Somit kann die Epitheldicke unabhängig von der Proliferationsrate der Keratinozyten reguliert werden., Regeneration of the skin after wounding is modulated to a large extend by dermal-epidermal interactions (Fusenig, 1994) but little is known about the exact molecular mechanisms. A missing c-Jun activity in fibroblasts leads in heterologous cocultures to a decreased keratinocyte proliferation and modulation of late differentiation (Szabowski et al., 2000). In contrast, inactivation of the upstream kinase of c-Jun namly the c-Jun amino terminal kinase (JNK) in fibroblasts leads to enhanced keratinocyte proliferation and a missing entry to terminal differentiation. This JNK-dependent phenotype can be rescued by conditioned media derived from cultures containing c-Jun-deficient fibroblasts, indicating that the observed alterations are due to a missing or reduced expression of JNK-dependent but c-Jun-independent, soluble fibroblasts-derived factors, which regulate keratinocyte proliferation and stratification. Aim of this study was to identify and characterize these JNK-dependent, soluble factors. Using a proteomic screen "pigment epithelium derived factor" (PEDF) and bone morphogenetic protein-4 (BMP-4) were identified as JNK-dependent, but c-Jun independent factors. Further characterisation revealed that both factors are expressed during skin homeostasis in vivo preferentially in the dermal compartment and are in vivo wound regulated. Functional analysis of either single application of one factor or the combination of both in the heterologous coculture model revealed on the one hand an anti-proliferative effect of PEDF and BMP-4 on keratinocytes. Most interestingly, the combined action of both factors is necessary for initiation of stratification and a sufficient entry to terminal differentiation. These data indicate that entry to terminal differentiation is a regulated process modulated by PEDF and BMP-4. Proliferation and differentiation of keratinocytes are therefore two uncoupled genetic processes which can be modulated separately. Thereby epithelial thickness can be modified independently from the proliferation rate of keratinocytes.

Im Mittelpunkt der Arbeit stehen Betrachtungen zur Mobilität von epikutan applizierten ESR-Spinsonden, sowie noch weitgehend ungeklärte Fragen zu den Wechselwirkungen zwischen Liposomen und Haut. Dazu gehört vor allem die Frage nach der Integrität von epikutan applizierten Liposomen. Weiterhin wurden die Auswirkungen von Liposomen auf die Flexibilität der intercorneozytären Lipiddoppelmembranen, die Penetration von ESR-Spinsonden unterschiedlicher Hydro-/Lipophilie, sowie die Mobilität von ESR-Spinsonden in der Haut und die Polarität ihrer Mikroumgebung untersucht. Als wichtigste Ergebnisse der Arbeit sind folgende Punkte zu nennen. Liposomen verlieren nach epikutaner Applikation ihre Integrität und bilden auf dem Stratum corneum einen Lipidfilm aus. Dabei nimmt nicht nur der Dispersitätsgrad der Liposomen sondern auch die Flexibilität ihrer Membranen ab. Entgegen der Erwartung führt die epikutane Applikation von liposomalen Zubereitungen nicht zu einer stärkeren Fluidisierung der intercorneozytären Lipiddoppelmembranen als Phosphatpuffer, wohingegen durch Ölsäure eine deutlich stärkere Fluidisierung erreicht wird. Liposomen mit rigiden Membranen führen zu höheren Spinsondenkonzentrationen in der Haut als Liposomen mit fluiden Membranen, und solche aus partialsynthetischen Lipiden führen zu höheren Konzentrationen als Liposomen aus Sojabohnenphospholipiden. Der Vergleich der Penetration von ESR-Spinsonden in die Haut nach epikutaner Applikation von Liposomen mit der Penetration der Spinsonden aus anderen topischen Zubereitungen zeigt, dass eine generelle Aussage zur Penetrationsförderung durch die Anwendung von Liposomen problematisch ist. Es konnte ein Polaritätsprofil der Mikroumgebung von Spinsonden in der Haut erstellt werden, das belegt, dass die Polarität in der Epidermis geringer ist als in der Dermis. Mit zunehmender Inkubationsdauer konnte ein Anstieg der Polartiät in den Hautproben nachgewiesen werden. Die Anwendung eines durch Freed et al. entwickelten Computerprogramms zur Bestimmung von Rotationskorrelationszeiten sich langsam bewegender Moleküle aus Spektren, die mittels spektral-räumlich aufgelöster ESR-Tomografie erhalten wurden, erlaubt die Erstellung von Viskositätsprofilen der oberen Hautschichten in Abhängigkeit von den epikutan applizierten Zubereitungen. Die Bandbreite der ortsabhängig berechneten Rotationskorrelationszeiten von CAT-1 und TEMPOL in der Haut nach epikutaner Applikation der Spinsonden in Liposomen reicht von 5,94 ns bis 1,97 ns. Dies entspricht einer Viskosität der Mikroumgebung von 118 bis 26 mPas., The present thesis was focused on the mobility of epicutaneously applied ESR spinprobes and open questions concerning the interactions between liposomes and skin e.g. the integrity of liposomes after epicutaneous application. Additionally the effect of liposomes on the flexibility of lipid membranes in the stratum corneum, the penetration of ESR spinprobes with different hydrophilic / lipophilic properties as well as the mobility and polarity of the microsurrounding of ESR spinprobes in the skin were investigated. The main results of the investigations are mentioned in the following. There will be a loss of integrity of epicutaneously applied liposomes and a lipid film will be formed on the stratum corneum. At the same time the degree of dispersity and the flexibility of their membranes decreases. Contrary to the expectation the application of liposomal formulations does not lead to a stronger fluidity of the lipid membranes of the stratum corneum than the incubation of the samples with phosphate buffer, whereas the incubation with oleic acid results in a substantial increase of the fluidity. The application of ESR spinprobes in liposomes with rigid membranes leads to higher spinprobe concentrations in the skin than with liposomes having fluid membranes. At the same time the application of liposomes made from semi-synthetic lipids leads to higher concentrations of the spinprobe in the skin, than the application of liposomes made from soybean phospholipids. The penetration of spin probes into the skin out of liposomes compared to other topical preparations shows, that a general statement concerning the penetration enhancing effect of liposomes is difficult. On using the ESR tomography a polarity profile of the skin was obtained, showing that the polarity in the epidermis is lower than in the dermis. With increasing incubation time of the skin samples the polarity increases. The application of a computer program, developed by Freed et al. in order to determine rotational correlation times for slowly tumbling molecules, to spectra, obtained from spectral-spatially resolved ESR tomography, allowed the establishment of viscosity profiles for the upper skin layers in dependency on the applied formulations. The range of the calculated rotational correlation times of CAT-1 and TEMPOL in the skin reaches from 5.94 ns to 1.97 ns. This corresponds to a viscosity of the spinprobes microsurrounding from 118 to 26 mPas.

Die Expression von Haupthistokompatibilitätsantigenen auf der Zelloberfläche kernhaltiger Zellen ist die Hauptursache für die Detektion durch das Immunsystem und die Rejektion allogener Transplantate. Eine vielversprechende Strategie, die MHC-I-Expression auf der Zelloberfläche zu senken, ist der Einsatz intrazellulär lokalisierter Antikörpern, sogenannter Intrabodies. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals versucht, eine die Expression an MHC-I-Molekülen auf der Zelloberfläche durch den Einsatz von anti-MHC-I-Intrabodies zu verhindern. Ein Hauptproblem in der Transplantation ist der Mangel an geeignetem Spendermaterial. Um diesem Zustand entgegenzuwirken, wird versucht, adäquaten Organersatz durch Tissue Engineering bereitzustellen. Die in vitro-Züchtung autologer epithelialer Zellen zur Generierung transplantierbarer Hautstücke spielt heute bereits eine große Rolle bei der Transplantation artifizieller Gewebe. Ferner werden diverse vollsynthetische Materialien für diesen Zweck hergestellt. Eine Verbesserung in diesen Bereich würde die Generierung von nicht-immunogenen allogenen Keratinozyten darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden primäre Rattenkeratinozyten mit anti-MHC-I-Intrabodies transfiziert. Diese Zellen zeigten einen MHC-I-"knock-out"-Phänotyp - eine starke Expression der Intrabodies war jedoch essentiell für die vollständige Zurückhaltung aller MHC-I-Moleküle in der Zelle. Neben der Applikation von Intrabodies in Rattenkeratinozyten konnte die MHC-I-Expression auf der Zelloberfläche von 293-Zellen und primären humanen Keratinozyten ebenfalls durch die Expression von anti-MHC-I-Intrabodies vermindert werden. Im Vergleich mit dem ebenfalls MHC-I-bindenden adenoviralen Protein p19 bewirkten die eingesetzten anti-MHC-I-Intrabodies bei gleich starker Expression eine wesentlich stärkere "Downregulation" der MHC-I-Oberflächenexpression von 293-Zellen. Intrabody-exprimierende Zellen zeigten keine signifikanten morphologischen oder physiologischen Veränderungen gegenüber untransfizierten Zellen: Wachstum, die Expression anderer Oberflächenmoleküle und morphologische Erscheinung waren unverändert. Es konnte lediglich eine verstärkte intrazelluläre Akkumulation von MHC-I-Molekülen detektiert werden. Die funktionelle Bedeutung der MHC-I-"Downregulation" durch Intrabodies konnte durch die stark verminderte zytolytische Aktivität zytotoxischer T-Zellen gegenüber Intrabody-exprimierender Rattenkeratinozyten im Vergleich zu unmodifizierten Zellen gezeigt werden. In der vorliegenden Arbeit ist es erstmals gelungen, Zellen mit einem vollständigen MHC-I-"knock-out"-Phänotyp zu erzeugen - bisherige Modifikationen der MHC-I-Oberflächenexpression durch die Generierung _2-Mikroglobulin- oder TAP-defizienter Mäuse führte zu keinem restlosen Verlust der Klasse-I-Moleküle auf der Zelloberfläche. MHC-I-"downregulierte" Keratinozyten könnten in der Hauttransplantation anstelle der limitiert zur Verfügung stehenden autologen Zellen eingesetzt werden oder in Kombination mit synthetischen Materialien verwendet werden, wo sie durch die Sekretion von heilungsfördernden Faktoren eine Verbesserung des Wundheilungsprozesses bewirken würden. The expression of major histocompatibility antigens on the surface of eucaryotic cells is the predominant reason for immunologic detection and the rejection of allogeneic transplants. A promising strategy to lower the MHC I expression on the cell surface is the use of intracellular localized antibodies, termed intrabodies. In this work it has been tried for the first time to prevent the expression of MHC class I molecules on the cell surface by intrabody expression. A major problem in transplantation is the shortage of suitable donor material. To overcome this situation tissue engineering has and will continue to enlarge the scope of organ grafting. Today, the in vitro culture of autologous epithelial cells to generate transplantable skin sheets plays an important role in the transplantation of artificial tissues. Furthermore various fully synthetic materials are produced for transplantation. An improvement in this field could be the generation of non-immunogeneic allogeneic keratinocytes. Within this work primary rat keratinocytes have been transfected with anti-MHC-I-Intrabodies. These cells show a MHC I "knockout" phenotype - yet a strong intrabody expression was essential for the complete retention of all MHC I molecules inside the cell. Besides the application of intrabodies in keratinocytes the MHC I expression on the surface of 293 cells and human primary keratinocytes could be reduced by anti-MHC I intrabodies as well. In comparison with the also employed adenoviral protein p19 the applied intrabodies generated at the same expression level a much stronger down-regulation of the MHC I surface expression of 293 cells. Intrabody expressing cells did not show any significant morphologic or physiologic alterations compared to untransfected cells: growth, the expression of other surface molecules and the morphological appearance were unaltered. Merely an enhanced intracellular accumulation of MHC I molecules could be detected. The functional relevance of the MHC I down-regulation by intrabodies could be shown by the strong diminished cytolytic activity of cytotoxic T cells to intrabody expressing rat keratinocytes in comparison to unmodified cells. In this work cells with a completely MHC I knock-out phenotype has been successfully generated for the first time - modifications of the MHC I surface expression by generation of _2-microglobulin or TAP deficient mice did not lead to a complete loss of all MHC I molecules on the cell surface so far. MHC I down-regulated keratinocytes could be employed in skin transplantation instead of the limited available autologous cells or utilized in combination with synthetic materials where they would induce an improvement of the healing process by the secretion of cytokines.