Search

Ziel dieser Arbeit war es, ein enantiomerenspezifisches Analysenverfahren für die Bestimmung von Hexabromcyclododecan (HBCD) in Biota-Proben zu entwickeln und die bei erhöhten Temperaturen auftretende Isomerisierung der HBCD-Stereoisomere zu untersuchen. Als erstes wurden die sechs HBCD-Enantiomere isoliert, mittels Einkristallstrukturanalyse, NMR- und IR-Spektroskopie charakterisiert und erstmals die spezifischen Drehwinkel der reinen Enantiomere mit den absoluten Konfigurationen und der Elutionsreihenfolge auf einer chiralen beta-PM-Cyclodextrin-Phase korreliert. Die Untersuchungen der HBCD-Enantiomere in Biota-Proben wurden mit einem HPLC-Tandem-MS-System unter Verwendung einer Kombination aus einer C18- und einer chiralen beta-PM-Cyclodextrin-Phase durchgeführt. Das entwickelte Analysenverfahren wurde validiert und ein Messunsicherheitsbudget erstellt. Die mittlere Wiederfindung für die internen Standards lag im Bereich von 96 - 104 % und die Nachweisgrenzen lagen zwischen 6 und 21 pg/g. Mit Hilfe dieses Analysenverfahrens wurden sowohl maritime als auch Süßwasser Biota-Proben von verschiedenen Probenahmepunkten in Europa untersucht. Die ermittelten Enantiomeren-Verhältnisse, die in allen Fällen vom (±)-alpha-HBCD dominiert wurden, zeigten signifikante Abweichungen von den razemischen Zusammensetzungen. Auffällig hierbei war, dass eine bevorzugte Anreicherung der zuerst eluierenden HBCD-Enantiomere ((-)-alpha-, (-)-beta- und (+)-gamma-HBCD) stattfand. Im Ergebnis der Untersuchungen zur thermisch induzierten intramolekularen Isomerisierung der HBCD-Stereoisomere konnten die verschiedenen Isomerisierungsreaktionen eindeutig aufgeklärt und die jeweiligen Geschwindigkeitskonstanten bei einer Temperatur von 160 °C ermittelt werden. Ergänzend wurde die Isomerisierung mit Hilfe der statistischen Thermodynamik unter Verwendung eines neuen Ansatzes für die klassische Hybrid Monte-Carlo-Simulation untersucht. The major objectives of this thesis were the development of an analytical procedure for the enantio-specific determination of hexabromocyclododecane (HBCD) in biota samples and the investigation of the interconversion of the individual HBCD isomers at elevated temperatures. The six HBCD enantiomers were isolated, characterised by X-ray diffractometry, NMR- and IR-spectroscopy and the sense of rotation was correlated for the first time with the absolute configurations of the HBCD enantiomers as well as their order of elution on a chiral beta-PM-cyclodextrine-phase. Trace quantification of the individual HBCD enantiomers was achieved by means of high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry equipped with a combination of a C18- and a chiral analytical column. Validation data and an uncertainty budget were determined. The mean recoveries of the different enantiomeric internal standards ranged from 96 to 104 % and the limits of detection are in the range of 6 to 21 pg/g. The analytical procedure was successfully applied to marine and freshwater biota samples from different European sites. The enantiomeric pattern of the six HBCD enantiomers, with (±)-alpha-HBCD as the dominant diastereomer, was determined for all biota samples and showed in most cases a significant deviation from the technical racemate. In these cases a preferential enrichment of the first eluted enantiomers ((-)-alpha-, (-)-beta- and (+)-gamma-HBCD) could be observed. The unambiguous elucidation of the individual isomerisation reactions as well as the quantification of all respective rate constants for the interconversion of the HBCD stereoisomers at 160 °C was done. A mechanistic explanation for the differences of the rate constants which govern the composition of HBCD diastereomers at equilibrium was given. Additionally, the interconversion was investigated by means of statistical thermodynamics using a new approach to classical hybrid Monte-Carlo simulations.

Mykotoxine sind giftige Naturstoffe, die im Rahmen des Sekundärstoffwechsels von Schimmelpilzen beim Wachstum auf pflanzlichen Substraten gebildet werden. Zu den bekanntesten Mykotoxinen zählt das Ochratoxin A (OTA), welches überwiegend in Getreide und davon abgeleiteten Erzeugnissen, aber auch in Wein und Kaffee sowie Gewürzen und Bier nachgewiesen wurde. OTA ist unter anderem immunotoxisch, nephrotoxisch und besitzt teratogene sowie kanzerogene Eigenschaften. Darüber hinaus wird OTA eine hormonelle Wirkung zugesprochen. Aufgrund der Toxizität und des relativ häufigen Vorkommens in Lebensmitteln wurden für OTA Grenzwerte festgelegt. Diese liegen für Wein, Röstkaffee und diätetische Produkte zwischen 0,5 mikrogramm /kg und 10 mikrogramm /kg. Grenzwerte für Gewürze und Bier sind geplant. Im Rahmen der Methodenentwicklung zur Bestimmung von OTA in Lebensmitteln wurden verschiedene clean-up-Techniken miteinander verglichen. Dabei wurde vor allem den kombinierten Ionentauscher/reversed phase-Säulen und der LC-MS/MS wesentliche Bedeutung beigemessen. Innerhalb der Methodenvalidierung wurden die Ergebnisse mit dem entsprechenden Standardverfahren verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass mit oben genanntem Material in Kombination mit der LC-MS/MS sehr gute Ergebnisse erzielt werden können. Diese wurden im Rahmen der Validierung durch statistische Auswertung bestätigt. Ferner wurden im Rahmen der Methodenentwicklung, speziell bei der Bestimmung von OTA in Kaffee, Extraktionstechniken miteinander verglichen. Dabei wurde die bislang kaum beachtete ASE (Accelerated Solvent Extraction, Dionex) sowie Ultraschallextraktion mit der Schüttelextraktion aus der gültigen Norm verglichen und ihre Anwendbarkeit auf weitere Lebensmittel geprüft. In diesem Zusammenhang waren die ASE und Ultraschallextraktion der konventionellen Schüttelextraktion überlegen. Darüber hinaus wurde die Ultraschallextraktion in Kombination mit dem Ionentauscher/reversed phase clean-up erfolgreich auf Weizen und Chili angewandt. Parallel zur Methodenentwicklung wurde die Stabilität und Homogenität von OTA in Wein und Röstkaffee untersucht. Sowohl die Homogenität als auch die Stabilität des Analyten sind wichtige Faktoren bei der Entwicklung neuer Verfahren, da zusammen mit Ergebnissen der Validierung, die Messunsicherheit innerhalb neuer Verfahren eingegrenzt werden. Mycotoxins are naturally occurring toxic substances and produced as secondary metabolites by fungi which are growing on plants predominantly. One of the most interesting mycotoxins is ochratoxin A (OTA), which was found in several foods and feed stuff like wheat and its related products, wine, coffee, spices and beer. Among other things OTA is immunotoxic, nephrotoxic and has teratogenic and cancerogenic properties. Further more OTA shows hormonal effects. Because of its toxicity and common appearance in food and feed the OTA content had to be regulated in European and or national directives. The maximum values are determined between 0.5 micrograms/kg and 10 micrograms/kg for wine, roasted coffee and dietetic products. Other maximum levels for beer and spices are intended. During the investigation of analytical methods for the determination of OTA in food stuff different clean-up techniques were compared. Thereby the mixed anion exchange/reversed phase clean-up in combination with LC-MS/MS was researched intensively. Within method validation the results were compared with the corresponding standard methods. This work shows that the mixed mode clean-up in combination with LC-MS/MS gives excellent results. These results were statistically confirmed during method validation. Further more different extraction techniques were compared during the development of analytical methods, especially for the determination of OTA in coffee. Thereby the ASE (accelerated solvent extraction, Dionex) and the ultrasonic extraction were compared with the shaking technique from current standard methods. The adaptability for other food and feed products was researched as well. In this context the new extraction techniques were superior to conventional shaking techniques. In addition the ultrasonic extraction with mixed mode clean-up and LC-MS/MS detection was applied to chilli and wheat effectively. Besides the investigation of analytical methods the stability and homogeneity of OTA in wine and roasted coffee was researched. The homogeneity and stability of OTA in matrix are very important factors during the investigation of analytical methods. In combination with the relevant results of the method validation these results can be used to determine the uncertainty of the new analytical methods.

Bdellovibrionaceae sind außergewöhnliche Bakterien, da sie als die kleinsten bekannten räuberischen Organismen gelten. Seit ihrer Entdeckung in Bodenproben im Jahr 1962 durch Stolp und Starr konnte eine weite Verbreitung in der Natur nachgewiesen werden. Besonderes Interesse erlangten Bdellovibrionaceae durch ihre Fähigkeit bakterielle Erreger wie Escherichia coli, Salmonella und Yersinia zu attackieren. Der bestuntersuchte Vertreter der Familie Bdellovibrionaceae ist Bdellovibrio bacteriovorus. Er durchläuft einen komplexen Lebenszyklus, der nur partiell verstanden ist. In der Attack-Phase werden durch einen noch nicht aufgeklärten Mechanismus potentielle Beutebakterien erkannt und der interzelluläre Kontakt hergestellt. Nachdem eine Pore in der Zellwand der ausschließlich Gram-negativen Beutebakterien erzeugt wurde, dringt B. bacteriovorus in den periplasmatischen Raum ein. Nach etwa 30 Minuten ist der Invasionsprozess abgeschlossen und man kann die Ausbildung sphärischer Bdelloblasten beobachten. Im Beutebakterium verdaut B. bacteriovorus makromolekulare Bestandteile des Wirtes und wächst zu einem langen spiralförmigen Stäbchen aus. Es setzt schließlich die Zellteilung ein bei der 5 bis 30 Tochterzellen in Abhängigkeit zur Größe des Beutebakteriums freiwerden. Mit der Reproduktion ist der parasitäre Lebenszyklus nach etwa 3 Stunden beendet. Die komplexe Regulation der Expression von Proteinen konnte für die einzelnen Wachstumsphasen durch ein- sowie zweidimensionale Gelelektrophorese nachgewiesen werden. In der Vergangenheit haben verschiedene Studien die Komplexität der Wechselwirkung mit den Beutebakterien belegt. Hierbei wurde, neben dem offensichtlichen Abbau makromolekularer Bestandteile der Beutebakterien, ein Recycling und Einbau von Membranbestandteilen wie Lipopolysacchariden (LPS) und Outer Membrane Proteine (OmP) in das Membransystem von B. bacteriovorus diskutiert. Die biologische Interpretation dieses Phänomens ist eine erhöhte Effizienz in der Reproduktion von B. bacteriovorus wenn es Bestandteile des Wirtsbakteriums wiederverwertet im Gegensatz zur Eigensynthese. Trotz der morphologischen Ähnlichkeit und des ungewöhnlichen Lebensstils wurde festgestellt, dass die Familie der Bdellovibrionaceae phylogenetisch sehr heterogen ist. Es werden zur Zeit zwei Gattungen unterschieden Bdellovibrio und Bacteriovorax. Aufgrund von 16S rRNA Untersuchungen konnten auch innerhalb der Gattungen eine Vielzahl von phylogenetisch distinkten Arten nachgewiesen werden. In der Literatur wird eine regulierende Wirkung auf pathogene Gram-negative Bakterien für aquatische Systeme durch Bdellovibrionaceae beschrieben. Weiterhin konnten sie bei verschiedenen Nutztieren im Verdauungstrakt mikrobiologisch nachgewiesen werden. Ein positiver Einfluss auf die Gesundheit der Tiere wurde bei Vorkommen von B. bacteriovorus festgestellt. Für eine Charakterisierung von Umweltisolaten werden in der vorliegenden Arbeit genetische Methoden vorgestellt. Hierfür wurden Hybridisierungsmethoden und PCR-methoden entwickelt, die es ermöglichen aus der Umwelt isolierte Bdellovibrionaceae phylogenetisch einzuordnen. Es konnte gezeigt werden, das sowohl B. bacteriovorus als auch Bacteriovorax stolpii im Verdauungstrakt von Nutztieren vorkommen. Es ist weiterhin gelungen eine PCR-methode für Kotproben zu entwickeln, die einen direkten Nachweis ermöglicht ohne mikrobiologische Anzucht. B. bacteriovorus ist ein Gram-negatives Bakterium, allein dieser Sachverhalt spiegelt die Schwierigkeit wider, wenn der enzymattische Abbau von Zellwandbestandteilen der Beutebakterien Ziel der Untersuchung ist, da auch die Beutebakterien Gram-negativ sind. Es ergibt sich aufgrund eines ähnlichen Zellwandaufbaus ein immenses analytisches Problem die makromolekularen Bestandteile von Wirtsbakterium und Jäger zu trennen. Um dem Lebensstil angepasst Modifikationen von B. bacteriovorus zu untersuchen, wurde in dieser Arbeit LPS, charakteristischer Bestandteil der Äußeren Membran, von Wildtypstamm B. bacteriovorus HD100 und seiner wirtsunabhängigen Mutante HI100 isoliert und das Lipid A strukturell aufgeklärt. Die Isolation gelang durch die Ausnutzung unterschiedlicher Fällungseigenschaften des LPS von B. bacteriovorus HD100 gegenüber des E. coli K-12 LPS aus dem Extraktionsmittel. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, das B. bacteriovorus S-Form LPS besitzt. Die außergewöhnliche Struktur des Lipid A von B. bacteriovorus wurde im Detail mit massenspektrometrischen Methoden, ein- und zweidimensionalen NMR Methoden sowie mikrochemischer Methoden in Kombination mit der GC/MS charakterisiert. Der Fettsäureanker besteht aus a-D-ManpII-(1(R)4)-ß-D-GlcpN3NII-(1(R)6)-ß-D-GlcpN3NI-(1(R)1)-a-D-ManpI. Dies stellt eine neuartige Struktur dar, da an allen bisher bekannten Lipid A´s sich Brönstedtsäuren am hydrophilen Fettsäureanker befinden, die in physiologischer Lösung durch Protonenabgabe negative Ladungen tragen. Im Lipid A von B. bacteriovorus sind diese Substituenten durch den Neutralzucker Mannose ersetzt. Weiterhin wurden als Fettsäuren nur 3-Hydroxyfettsäuren nachgewiesen, wobei sich auf die 6 gebunden Fettsäuren etwa 1,5 Doppelbindungen verteilen. Dieses Lipid A zeigt eine wesentlich reduzierte endotoxische Aktivität im Vergleich zu E. coli Lipid A und weist als biophysikalische Besonderheit eine erhöhte Fluidität über einen weiten Temperaturbereich auf. Die vorgestellte 16S rRNA Analyse und die Strukturanalyse des Lipid A von B. bacteriovorus belegen seine besondere Stellung in der Welt der Bakterien., Bdellovibrionaceae are extraordinary bacteria known as the smallest predatory organism so far. Since their discovery in soil samples by Stolp and Starr 1963 they have been detected in a wide range of other natural habitats. Bdellovibrionaceae became the focus of attention concerning their ability to attack pathogens like Escherichia coli, Salmonella and Yersinia. For Bdellovibrio bacteriovorus the most detailed studies are available. The up to now only partially understood lifecycle consists of several complex phases. In the attack phase B. bacteriovorus is motile possessing flagella and the preys are recognized by an unknown mechanism. After attachment on the cell wall within 15 to 30 minutes a pore is formed which is used as entrance to the periplasmatic space of the Gram-negative prey bacteria. The completion of the invasion process can be observed by the change of the prey s shape to spherical bdelloblasts. Inside of the prey B. bacteriovorus degrades macromolecular compounds and transforms into a long spirally shaped rod. At the end of the lifecycle the rod divides yielding 5 up to 30 daughter cells depending on the size of the prey bacteria. This reproduction phase is completed within 3 hours. The complex regulation of expression of a certain number of proteins was observed by one and two dimensional gelelectrophoresis. The complexity of the interaction between predator and prey were examined in several studies. Besides the obvious degradation of macromolecular compounds of the prey, reutilising of lipopolysaccharides (LPS) and Outer Membrane Proteins (OmP) into the membrane system of B. bacteriovorus was discussed. The biological interpretation of such behaviour was that it is more efficient for reproduction to recycle components of the prey than to perform de novo synthesis. Unexpectedly, despite the unique predatory lifecycle and common morphological features, Bdellovibrionaceae show a great phylogenetical diversity based on 16S rRNA analyses. Bdellovibrionaceae are divided into the three species Bdellovibrio bacteriovorus, Bacteriovorax stolpii, Bacteriovorax starrii and some strains yet to be assigned. In two studies Bdellovibrionaceae were found as part of regulation processes for decreasing the number of pathogenic Gram-negative bacteria in aquatic systems. Furthermore, B. bacteriovorus were found in the intestinal tract of several domestic animals showing a positive influence on the state of health. For the phylogenetic characterization of environmental isolates techniques were developed based on hybridisation methods and the PCR. In this work we detected B. bacteriovorus and B. stolpii strains in the gut of animals. Furthermore, a PCR method for direct detection of Bdellovibrionaceae in fecal samples was developed. B. bacteriovorus are Gram-negative bacteria. This fact complicates the study of the degradation of the prey s cell wall as it possesses the architecture of Gram-negative bacteria also. Furthermore, the search for important modifications of the cell wall of B. bacteriovorus concerning the predatory lifestyle becomes an analytical problem. In this study we isolated LPS of the wild type strain B. bacteriovorus HD100 and its host independent mutant strain HI100. For the isolation of pure B. bacteriovorus HD100 S-form LPS we took advantage of different precipitation properties in the extraction solvent of E. coli K-12 LPS and the predator s LPS. The structure of the lipid A was examined in detail by mass spectrometric methods, one- and two-dimensional NMR and chemical analytical techniques. The novel structure consists of backbone built of a-D-ManpII-(1(R)4)-ß-D-GlcpN3NII-(1(R)6)-ß-D-GlcpN3NI-(1(R)1)-a-D-ManpI. This is the first known natural lipid A without negatively charged substituents in physiological solution. The lipid A of B. bacteriovorus carries the neutral sugar mannose instead of Brönstedt acids. Furthermore, the lipid A exclusively consists of 3-hydroxy fatty acids with approximately 1.5 double bounds distributed on six bounded fatty acids. This lipid A shows a significant decreased endotoxic activity in comparison to E. coli lipid A and revealed increased fluidity over broad temperature range as further remarkable biophysical property. The 16S rRNA analysis and the structural analysis of the lipid A of B. bacteriovorus document the unique position in the world of bacteria.

Die Globalisierung von Handel und Wirtschaft macht es nötig, nationale Analysenergebnisse international gegenseitig anzuerkennen. Dabei kann die Richtigkeit der Analysenwerte durch Ruckführung auf Einheitsnormale mittels Primärmethoden, Zertifizierte Referenzmaterialien (ZRM) und Referenzverfahren gewährleistet werden. Die quantitative hochauflösende 1H-SP-NMR bietet sich aufgrund ihrer ausgezeichneten Selektivität und ihrem Potenzial als relative Primärmethode geradezu als Referenzverfahren an. Für vier wichtige Anwendungsbereiche (Bestimmung von Stoffmengenverhältnissen und -anteilen in mol/mol bzw. mol/mol %, der Reinheitsbestimmung über die Hauptkomponentenanalyse in g/g % und der Gehaltsbestimmung in mg/g) wurden anhand idealer Modellsysteme in Lösung (5-Komponenten: Ethyl-4-toluolsulfonat, [2,2]-Paracyclophan, Durol, Cyclododekan, Oktamethylcyclotetrasiloxan; Maleinsäure; 3-Trimethyl-2,2,3,3-tetradeuteropropionsäure-Natriumsalz (TSP)) die Messgleichungen und vollständigen Unsicherheitsbudgets aufgestellt sowie Arbeitsanweisungen zur quantitativen Aufnahme und Auswertung von 1H-NMR-Messungen erarbeitet. Dazu war für die Reinheits- und Gehaltsbestimmung ein System interner NMR-Standards aufzubauen (ZRM Benzoesäure, Maleinsäure, TSP-Lösung, Durol), das den Forderungen nach metrologischer Rückführung genügte. Zur Minimierung der Messunsicherheit wurden systematisch die Einflüsse gerätespezifischer Parameter und der Auswertung umfangreich untersucht und quantifiziert. Mittels mitorganisierter nationaler und internationaler CCQM-Ringversuche konnten allgemeingültige (unabhängig von der Gerätekonfiguration) Aussagen über die Messunsicherheit der Methoden bzw. Verfahren getroffen werden. Für realitätsbezogene Fragestellungen der Reinheitsbestimmung möglicher Referenzmaterialien für den pharmazeutischen Bereich (Spiraeosid, Thymol, Loganin) sowie von Xylol-Isomeren-Gemischen und der Gehaltsbestimmung 0,1%-iger wässriger Ethanollösungen mussten teilweise die quantitative 1H-entkoppelte 13C-NMR validiert und der quantitative Einsatz der 1H-Wasserunterdrückung (Presaturation) erstmalig entwickelt werden. Um die Güte der quantitativen NMR-Verfahren als Referenzverfahren bewertet zu können, wurde durch Beteiligung an internationalen Ringversuchen auf höchstem metrologischen Niveau (CCQM) deren Messunsicherheiten mit denen anderer analytischer Verfahren verglichen. Es konnten somit vier Referenzverfahren durch Dokumentation der Prüfbereiche, Messunsicherheiten und Einsatzgebiete der quantitativen hochauflösenden 1H- und 13C-NMR formuliert werden. The globalisation of trade and economics makes requires mutual international recognition of analytical measurement results. The trueness of analytical results can be secured by establishing traceability to measurement standards for SI units using primary methods, certified reference materials (CRM) and reference methods. The quantitative high resolution 1H-SP-NMR offers itself as reference method due to its excellent selectivity and its potential as relative primary method. For four important areas of application (determination of amount-of-substance ratios and fractions in mol/mol and mol/mol %, respectively, purity determination by main component analysis in g/g %, and determination of minor component mass fractions in mg/g) the measuring equations and complete uncertainty budgets were set up, and work instructions for the acquisition and evaluation of quantitative 1H-NMR measurements were compiled, on the basis of ideal model systems in solution (5 components: Ethyl-4-toluenesulfonate, [2,2]-Paracyclophane, Durene, Cyclododecane, Octamethylcyclotetrasiloxane; Maleic acid; 3-Trimethyl-2,2,3,3-tetradeuteropropionic acid sodium salt (TSP)). In addition, a system of internal NMR standards had to be built up (CRM benzoic acid, maleic acid, TSP solution, Durene) for the determination of composition and purity, which meets the demands for metrological traceability. For the minimization of measurement uncertainty, the influences of instrument-specific parameters and data evaluation techniques were extensively examined and quantified. By means of national and jointly organized international CCQM intercomparisons generally applicable statements (independent of the measuring system configuration) about the measurement uncertainty for the different methods could be specified. For addressing real-life problems in purity determination of prospective reference substances for the pharmaceutical field (spiraeoside, thymol, loganin) as well as of xylene isomer mixtures and the analysis of 0,1 % aqueous ethanol solutions, the quantitative 1H-decoupled 13C-NMR had to be validated in part and the quantitative application of the 1H water suppression (presaturation) was developed for the first time. In order to estimate the power of quantitative NMR as a reference method, measurement uncertainties were compared with those of other analytical methods by participation in international intercomparisons on the highest metrological level (CCQM). Thus, four reference methods of the quantitative high resolution 1H- and 13C-NMR could be specified in terms of measuring ranges, measurement uncertainties and application fields.