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The objective of this study was to evaluate the vitrification of bovine preantral follicles with dimethylsulfoxide (D) and sucrose (S) plus α-tocopherol 5mmol/L (T5) or 10mmol/L (T10) and, evaluate the thawed with minimal essential medium (m) with or without sucrose (s). Ovaries of cows were collected from slaughterhouse for the experiment I (n=66) and II (n=51). In the laboratory ovarian fragments were randomly assigned either to fresh control and 8 vitrification treatments (Controle and Dm; Dms, DSm; DSms; DST5m; DST5ms; DST10m; DST10ms). Ovarian fragments were placed in vitrification solution (5 min) and immersed in liquid nitrogen (-196°C), after a week, the fragments were thawed and analyzed. In the experiments I, preantral follicles were morphologically observed for histological evaluation, (normal; degenerated and developing of stage). In the experiment II, preantral follicles were mechanically isolated from ovarian tissue and examined with trypan blue, where dead and live corresponded to stained or non-stained. The treatments DSm, DSms and DST10m were effective in preserving the morphology in situ. However, the viability of isolated preantral follicles after vitrification remained high only in treatment DST10m. Thus, DST10m preserves survival rates and morphological integrity during vitrification of bovine preantral follicles. Resumo: Os objetivos deste estudo foram avaliar a vitrificação de folículos pré-antrais bovinos com dimetilsulfóxido (D) e sacarose (S) adicionando α-tocoferol 5mmol/L (T5) ou 10mmol/L (T10) e, avaliar o aquecimento com meio essencial mínimo (m) com ou sem sacarose (s). Ovários de fêmeas bovinas foram coletados de abatedouro, para o experimento I (n= 66) e II (n= 51). No laboratório fragmentos ovarianos foram distribuídos aleatoriamente para o controle fresco e 8 tratamentos de vitrificação (Controle e Dm; Dms, a DSm; DSms; DST5m; DST5ms; DST10m; DST10ms). Os fragmentos ovarianos foram colocados na solução de vitrificação (5 min) e imersos em nitrogênio líquido (-196°C). Após uma semana os fragmentos foram aquecidos e analisados. No experimento I, folículos pré-antrais foram observados morfologicamente para avaliação histológica (normal, degenerados e estádio de desenvolvimento). No experimento II, folículos pré-antrais foram mecanicamente isolados do tecido ovariano e examinados com o azul de trypan, observando mortos e vivos corados e não corados respetivamente. Os tratamentos a DSm, DSms e DST10m foram eficazes na preservação da morfologia in situ. No entanto, a viabilidade de folículos pré-antrais isolados após a vitrificação manteve-se elevada apenas no tratamento DST10m. Assim, DST10m preservou as taxas de sobrevivência e integridade morfológica durante a vitrificação de folículos pré-antrais bovinos.

This study aimed to evaluate the extract of Aloe vera (AV) associated or not with 10% Dimethylsulfoxide (DMSO) in cryopreservation of tambaqui semen. For the formation of the pools (n= 14), 30 males were hormonally induced twice. Each pool had the objective motility, curvilinear velocity, straight-line velocity, average path velocity and morphology analyzed before and after cryopreservation of semen. The means for cryopreservation were constituted of Powder Coconut Water-104 diluent added DMSO and/or AV (5 or 10%). After cryopreservation, motility, velocities and morphology were reduced significantly when compared to fresh semen. For sperm motility the best treatment was that using only DMSO (20,86±8,31) and DMSO + 5% AV (15.71±9.77). For the velocities, the worse treatment was DMSO+10% AV. Treatment with only the addition of DMSO had a significantly higher effect than others on percentage of morphologically normal sperm. The mean correlation found was between motilityand the rate of morphologically normal sperm (r = 0.687). In conclusion, the addition of AV does not provide greater protection for spermatozoa during cryopreservation.

Submitted by Beatrice Ingrid Macente null (beatrice.vetuel@yahoo.com.br) on 2017-12-13T17:24:54Z No. of bitstreams: 1 Tese de doutorado - FINAL.pdf: 1497835 bytes, checksum: ec09acb806dd08292a1d4ec818d596e7 (MD5) Approved for entry into archive by Karina Gimenes Fernandes null (karinagi@fcav.unesp.br) on 2017-12-13T18:29:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 macente_bi_dr_jabo.pdf: 1454157 bytes, checksum: 970c2725b03ed803688cfef9261d801c (MD5) Made available in DSpace on 2017-12-13T18:29:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 macente_bi_dr_jabo.pdf: 1454157 bytes, checksum: 970c2725b03ed803688cfef9261d801c (MD5) Previous issue date: 2017-11-06 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Esta pesquisa teve por justificativa ampliar os estudos acerca da criopreservação de tecido gonadal e células espermáticas de gatos domésticos, podendo servir de modelo experimental para felinos selvagens. Objetivou-se comparar os efeitos da criopreservação sobre diferentes tamanhos de fragmentos testiculares, empregando dois crioprotetores. Utilizaram-se os testículos de 31 gatos domésticos, submetidos à orquiectomia eletiva. Os testículos foram pesados e apenas os que apresentarem pesos entre 1 e 2 g foram empregados. O tecido testicular foi dissecado e cortado em fragmentos de tamanhos pré-determinados (0,3cm3 e 0,5cm3). Uma amostra foi direcionada para as avaliações a fresco: integridade de membrana e do DNA; histopatologia; incidência de apoptoses por imuno-histoquímica; e índice de peroxidação lipídica - TBARS. A criopreservação foi feita em meio Tris-gema Equex STM suplementado com 3% de crioprotetores (glicerol e propanediol) através da técnica congelação rápida. Após a descongelação, foram realizados os mesmos testes iniciais. Os primeiros resultados obtidos com os 12 gatos iniciais apontaram na avaliação histomorfológica e pelo teste de lipoperoxidação lipídica que o glicerol foi mais eficiente que o propanediol na criopreservação de fragmentos testiculares de gatos domésticos de 0,5cm3 (Capítulo 2). No experimento seguinte, avaliaram-se os fragmentos testiculares de outros 31 gatos domésticos, seccionados nos mesmos tamanhos e criopreservados nas mesmas condições do experimento anterior, empregando-se 3% glicerol ou 3% propanediol no meio diluente Tris-gema Equex STM, utilizando a técnica de congelamento rápido, seguindo das avaliações pelos testes para dano ao DNA dos espermatozoides por meio da acridina laranja; e análise dos fragmentos teciduais semi-quantitativamente por histomorfologia e imuno-histoquímica. A avaliação imuno-histoquímica foi mais eficiente em verificar os danos às células tubulares seminíferas, sendo possível observar a marcação diferenciada da caspase presente no citoplasma e núcleo das células espermáticas, bem como na cabeça dos espermatozoides. Por meio da caspase foram verificado que os fragmentos frescos já apresentavam danos consideráveis as células teciduais e que não diferiram dos achados para os fragmentos criopreservados, demonstrando a eficiência do protocolo de congelação adotado, sem a observação de superioridade entre os dois tamanhos de fragmentos ou entre os crioprotetores. Contudo, a avaliação apenas do espermatozoides tanto pela técnica de acridina laranja, como pela imuno-histoquímica, pode-se verificar a inferioridade do propanediol em relação ao glicerol para fragmentos de 0,5 cm³ (Capítulo 3). Novas pesquisas que possam complementar os testes realizados neste estudo, como o cultivo dos fragmentos, a fertilização in vitro por meio de ICSI, ou ainda, o uso dos fragmentos para xenotrasnplantes poderiam avaliar com maior acurácia os achados das pesquisas reportadas nesta tese. This research had the justification to broaden the studies about the cryopreservation of gonadal tissue and sperm cells of domestic cats, and could serve as an experimental model for wild cats. The objective of this study was to compare the effects of cryopreservation on different sizes of testicular fragments using two cryoprotectants. The testicles of 31 domestic cats submitted to elective orchiectomy were used. The testes were weighed and only those weighing between 1 and 2 g were used. The testicular tissue was dissected and cut into fragments of predetermined sizes (0.3cm3 and 0.5cm3). A sample was directed to fresh evaluations: membrane integrity and DNA; histopathology; incidence of apoptosis by immunohistochemistry; and lipid peroxidation index - TBARS. Cryopreservation was done on Tris-egg yolk Equex STM medium supplemented with 3% cryoprotectants (glycerol and propanediol) by the rapid freezing technique. After thawing, the same initial tests were performed. The first results obtained with the 12 initial cats showed that glycerol was more efficient than propanediol in the cryopreservation of testicular fragments of domestic cats of 0.5 cm3 (Chapter 2). In the following experiment, the testicular fragments from 31 other domestic cats, sectioned in the same sizes and cryopreserved under the same conditions as in the previous experiment, were evaluated using 3% glycerol or 3% propanediol in the Tris- egg yolk Equex STM medium, using rapid freezing technique, followed by evaluations for DNA damage of the spermatozoa by acridine orange; and analysis of the tissue fragments semi-quantitatively by histomorphology and immunohistochemistry. The immunohistochemical evaluation was more efficient in verifying the damage to the seminiferous tubular cells, being possible to observe the differentiated marking of the caspase present in the cytoplasm and nucleus of the sperm cells, as well as in the spermatozoa head. By caspase, it was verified that the fresh fragments already presented considerable damage to the tissue cells and did not differ from the findings for the cryopreserved fragments, demonstrating the efficiency of the adopted freezing protocol, without the observation of superiority between the two sizes of fragments or between the cryoprotectants. However, the evaluation of spermatozoa by both acridine orange and immunohistochemistry, the inferiority of propanediol to glycerol can be verified for fragments of 0.5 cm³ (Chapter 3). New research that could complement the tests performed in this study, such as the culture of fragments, in vitro fertilization using ICSI, or the use of fragments for xenotransplantation could more accurately assess the findings of the research reported in this thesis.

This study aimed to develop a protocol of semen cryopreservation of the mutton snapper Lutjanus analis. The interaction between three extenders ( pH 6.1; 7.8 and 8.2) , two concentrations of dimethyl sulfoxide ( DMSO, 5 and 10%) and three cooling rates ( -90; -60 and -30°C.min−1) on the sperm motility rate and motility time were analyzed by a factorial experiment. A sample of 30 fishes ( 1,261 ± 449 g) collected in the nature was kept in floating net cages. The semen was frozen by using cryogenic straws, in nitrogen vapour and transferred, later, to liquid nitrogen. Fertilization test was accomplished to evaluate the viability of the cryopreserved sperm. The highest sperm motility rate and motility time ( P < 0.05) was achieved by combining extender C ( pH 8.2) with DMSO ( 10%) and cooling rate of -60°C.min−1 ( P < 0.05) . The use of cryopreserved sperm presented fertilization rates higher than 59% validating the present protocol for mutton snapper. Este trabalho foi realizado com a finalidade de desenvolver um protocolo de crioconservação do sêmen da cioba Lutjanus analis. Em um experimento fatorial foram analisados os efeitos de três diluentes ( pH 6,1; 7,8 e 8,2) , duas concentrações de dimetilsulfóxido ( DMSO, 5 e 10%) e três velocidades de congelamento ( -90, -60 e -30°C.min−1) sobre a taxa de motilidade e tempo de motilidade espermáticas do sêmen crioconservado. Uma amostra de 30 exemplares com peso médio de 1.261,11 ± 449,0 g, oriunda da natureza, foi mantida em tanques-rede. O sêmen obtido foi congelado empregando-se palhetas criogênicas em vapor de nitrogênio e, posteriormente, transferido para nitrogênio líquido. Posteriormente um teste de fertilização foi realizado para avaliar a viabilidade do sêmen crioconservado. A combinação que propiciou maior taxa de motilidade e tempo de motilidade espermáticas ( P < 0,05) foi proporcionada pelo emprego do diluente de pH 8,2 com 10% de DMSO e uma velocidade de congelamento de -60°C.min−1 ( P < 0,05) . O sêmen crioconservado apresentou taxa de fertilização superior a 59% validando o presente protocolo para a cioba.

Experiments were conducted to improve the fertilization rate of cryopreserved semen of dourado, Salminus brasiliensis. The experiment tested two cryoprotectant solutions at different semen: cryoprotectant ratios (1:5, 1:15, 1:25 and 1:50). The standard solution for the species (mixture of dimethyl sulfoxide, glucose, egg yolk and distilled water) was compared to a 350 mOsm ACP(r)-104 solution, which is composed of powdered coconut water diluted in distilled water and methylglycol. Differences between the dilutions tested were significant only for ACP(r). The fertilization potential by using the standard solution at the lowest dilution (1:5) is equated when the sperm is diluted in ACP(r) at 1:25 or 1:50. These results show that the standard solution is the most suitable for the cryopreservation of dourado sperm, since the dilution did not alter the fertilization rate, requiring smaller storage space. RESUMO. Experimentos foram realizados, visando melhorar a taxa de fertilização com a utilização de sêmen criopreservado do dourado, Salminus brasiliensis. O experimento testou duas soluções crioprotetoras em diferentes diluições de sêmen:solução crioprotetora (1:5, 1:15, 1:25 e 1:50). A solução padrão para a espécie (mistura de glicose, água destilada, gema de ovo e dimetilsulfóxido) foi comparada com a solução ACP(r)-104 350 mOsm, composta por água de coco em pó diluída em água destilada e metilglicol. Foi observada diferença entre as distintas diluições testadas apenas para a ACP(r). O potencial de fertilização com o uso da solução padrão na menor diluição testada (1:5) é igualado apenas quando o sêmen em ACP(r) é diluído em 1:25 ou 1:50. Os resultados apontam que a solução padrão é mais vantajosa para a criopreservação de sêmen do dourado, uma vez que a variação da diluição do sêmen não altera a taxa de fertilização, requerendo, assim, menor espaço para armazenamento das amostras.

The objective of this work was to adapt the application of electrolytic conductivity and potassium leaching tests to assess the viability of cryopreserved embryos of 'Anão Verde do Brasil de Jiqui' (AVeJBr) coconut. The zygotic embryos were excised, sterilized and subjected to four cryoprotectant treatments combined with three incubation times (12, 16 and 20 hours), totaling 12 treatments. The pre-treatment of mature zygotic embryos of AVeJBr coconut using a cryoprotectant with 1.75 mol L-1 of sucrose + 15% glycerol for 12 and 16 hours promoted lower embryo humidity and increased viability in electrolytic conductivity and potassium leaching tests. Samples with ten embryos are sufficient for electrolytic conductivity analysis in cryopreserved or non-cryopreserved AVeJBr coconut zygotic embryos. The 4 to 8 hour imbibition period of the embryos is promising for the electrolytic conductivity analysis of non-cryopreserved mature zygotic embryos of AVeJBr coconut. O objetivo deste trabalho foi adaptar a aplicação de testes de condutividade elétrica e lixiviação de potássio para avaliar a viabilidade de embriões de coqueiro 'Anão Verde do Brasil de Jiqui' (AVeJBr) criopreservados. Os embriões zigóticos foram excisados, esterilizados e submetidos a quatro tratamentos crioprotetores combinados a três tempos de incubação (12, 16 e 20 horas), o que totalizou 12 tratamentos. O pré-tratamento de embriões zigóticos maduros de coco AVeJBr com crioprotetor contendo 1,75 mol L-1 de sacarose + 15% de glicerol por 12 e 16 horas promoveu menor umidade dos embriões e maior viabilidade em testes de condutividade elétrica e lixiviação de potássio. Amostras com dez embriões são suficientes para análise de condutividade elétrica em embriões zigóticos de coqueiro AVeJBr criopreservados ou não. O período de embebição de 4 a 8 horas é promissor para a análise da condutividade elétrica em embriões zigóticos maduros de coco AVeJBr não criopreservados.

ResumoAs biotécnicas aplicadas à reprodução animal como inseminação artificial, transferência e produção in vitro de embriões, indução e sincronização de cio e congelamento de gametas vêm sendo cada vez mais utilizadas na prática veterinária. No entanto, algumas biotécnicas ainda não alcançaram o seu total aperfeiçoamento técnico na reprodução equina, como a criopreservação de sêmen. Objetivou-se avaliar as características pós-descongelamento (motilidade total, vigor e integridade de membrana plasmática e acrosomal) dos espermatozoides de garanhões da raça Mangalarga Marchador (n=5), empregando-se três diluentes de criopreservação. Após a colheita, o sêmen foi diluído na proporção de 1:1 em meio à base de leite em pó desnatado e centrifugado a 600 G por 10 minutos. Após a centrifugação, o sobrenadante foi desprezado e o pellet obtido dividido e ressuspendido com Botucrio, FR5 ou FR6. As amostras foram envasadas em palhetas de 0,5 mL sendo a concentração ajustada para 200x106espermatozoides/mL. As palhetas foram distribuídas em uma plataforma-suporte e estabilizadas a 5 ºC/60 min., em refrigerador comercial. Para o congelamento, as palhetas, posicionadas horizontalmente, foram expostas por 15 minutos ao vapor de nitrogênio líquido, em uma caixa de isopor, a 6 cm acima do nível de nitrogênio líquido. Logo em seguida, as palhetas foram imersas no nitrogênio líquido, acondicionadas em raques e estocadas em botijão criogênico a -196 ºC, para posterior avaliação. Não houve diferença para as variáveis motilidade, vigor e integridade das membranas plasmática e acrossomais quando se utilizaram diluentes que contêm a associação de amidas e glicerol (Botucrio e FR6; P>0,05). As variáveis seminais no diluente contendo apenas glicerol foram inferiores em todas as avaliações (P AbstractThe techniques applied to animal reproduction such as artificial insemination, transfer and in vitro production of embryos, heat synchronization and induction, and gametes cryopreservation have been more utilized in veterinary practice each day. Nevertheless, some techniques have not achieved their full technical capacity within the equine reproduction field, such as semen cryopreservation. The aim of this study was to evaluate the characteristics of post-thawing semen (total motility, strength, plasmatic and acrosomal membrane integrity) of Mangalarga Marchador breed stallions, using three different extenders (Botucrio, FR5 and FR6). Ejaculates from five stallions were collected and the gel-free semen was diluted in a 1:1 dilution in skim milk extender, and centrifuged at 600 g for 10 minutes. After the centrifugation the supernatant was removed and sperm pellet was divided and re-suspended using three different extenders to a concentration of 200 x 106 cells/mL. The samples were packed into 0.5 mL straws, placed in a stainless steel support and kept inside the refrigerator (5 ºC) for one hour. Subsequently, these straws were kept at a height of 6 cm from liquid nitrogen for 15 minutes in an isotherm box and, after that, plunged into liquid nitrogen (-196 ºC) and stored in a liquid nitrogen holding tank. There were no differences in the parameters evaluated when extenders using mixed amides and glycerol (Botucrio and FR6) were used (P > 0.05). All parameters evaluated were lower for the extender containing only glycerol (P

Em três experimentos, avaliou-se a sensibilidade dos espermatozoides de dourado (Salminus brasiliensis) a diferentes soluções crioprotetoras. No experimento 1, o sêmen foi diluído, 1:10, em 12 soluções (quatro diluidores x três crioprotetores - dimetilsulfóxido (DMSO), metilglicol ou glicerol). Metade de cada amostra foi resfriada por uma hora e a outra, criopreservada. A motilidade espermática foi avaliada imediatamente após a diluição e após o resfriamento em todas as amostras e, após o descongelamento, apenas nas amostras criopreservadas em DMSO. No experimento 2, o sêmen foi diluído, 1:5, em cinco soluções contendo DMSO e resfriado, criopreservado e avaliado como no experimento 1. No experimento 3, o sêmen foi diluído, 1:5, em quatro soluções contendo DMSO e criopreservado e avaliado quanto à motilidade e à fertilidade. Quando o sêmen foi diluído 1:10, observou-se motilidade acima de 58% em todas as amostras resfriadas em DMSO e em NaCl-tris-metilglicol. Baixa motilidade foi observada nas amostras resfriadas nas outras combinações com metilglicol (5-32%) ou glicerol (0-8%) e naquelas criopreservadas (16-20%). Todas as amostras diluídas 1:5 apresentaram motilidade de 65-72% após o resfriamento e de 45-66% após o descongelamento (experimentos 2 e 3). As taxas de eclosão produzidas com sêmen criopreservado, entretanto, foram baixas (17-23%) em relação ao sêmen fresco (60%). The sensitivity of dourado (Salminus brasiliensis) spermatozoa to different cryoprotectant solutions was evaluated in three experiments. In experiment 1, semen was diluted, 1:10, in 12 solutions (four extenders x three cryoprotectants - dimethylsulphoxide (DMSO), methyglycol, or glycerol). Half of each sample was refrigerated for one hour while the other half was cryopreserved. Sperm motility was immediately assessed after dilution and after refrigeration in all samples, and after thawing in those cryopreserved in DMSO. In experiment 2, semen was diluted, 1:5, in five solutions containing DMSO, refrigerated, cryopreserved, and analyzed as in experiment 1. In experiment 3, semen was diluted, 1:5, in five solutions containing DMSO, cryopreserved and evaluated for motility and fertility. When semen was diluted 1:10, motility higher than 58% was observed in all samples refrigerated in DMSO and in NaCl-tris-methylglycol. Low motility was observed in samples refrigerated in the other combinations of methylglycol (5-32%) or glycerol (0-8%) and in those cryopreserved (16-20%). All samples diluted 1:5 yielded motility of 65-72% after refrigeration, and 45-66% after thawing (experiments 2 and 3). The hatching rates produced with cryopreserved semen, however, were lower (17-23%) compared to fresh semen (60%).

Avaliou-se a eficácia de diferentes associações de crioprotetores no congelamento de sêmen eqüino. Foram utilizados três ejaculados de oito garanhões para testar o diluidor lactose-EDTA-gema de ovo com as seguintes associações de macromoléculas e crioprotetores: T1 - glicerol 5% (controle); T2 - metilcelulose 0,5%, rafinose 0,15g e acetamida 2,5%; T3 - metilcelulose 0,5%, rafinose 0,15g e acetamida 3,5%; T4 - metilcelulose 0,5%, rafinose 0,15g e acetamida 5%; T5 - glicerol 5% e 2,4g de leite desnatado; T6 - 1% de glicerol, 4% de etilenoglicol e 2,4g de leite desnatado; T7 - 5% de etilenoglicol e 2,4g de leite desnatado. O sêmen foi diluído em meio Kenney (1:1), centrifugado a 400 x g por 12 minutos, ressuspendido nos diluidores para atingir a concentração de 100X10(6)/ml, envasado em palhetas de 0,5ml e congelado 3cm acima do nível de nitrogênio líquido por 10 minutos. O descongelamento foi realizado em banho-maria a 75°C por sete segundos. Após o descongelamento foram avaliados: motilidade total e progressiva, vigor, morfologia espermática e integridade estrutural e funcional da membrana plasmática. O T1 apresentou os maiores valores de motilidade total e progressiva (38,4% e 33,8%, respectivamente). O vigor e os resultados do teste HO não diferiram entre os tratamentos. Os diluidores contendo leite em sua composição (T5, T6 e T7) apresentaram maiores valores de integridade funcional e estrutural da membrana plasmática. Pode-se concluir que as modificações incorporadas aos meios diluidores testados não resultaram em melhor efeito crioprotetor que o meio à base de glicerol 5% no congelamento do sêmen eqüino. The efficacy of different combinations of cryoprotectants for equine semen was evaluated. Three ejaculates of eight stallions were used to test the lactose-EDTA-egg yolk extender with the following association of cryoprotectants: T1 - glycerol 5% (control group); T2 - methyl cellulose 0.5%, raffinose 0.15g, and acetamide 2.5%; T3 - methyl cellulose 0.5%, raffinose 0.15g, and acetamide 3.5%; T4 - methyl cellulose 0.5%, raffinose 0.15g, and acetamide 5%; T5 - glycerol 5% and 2.4g of dried skim milk; T6 - glycerol 1%, ethylene glycol 4%, and 2.4g of dried skim milk; T7 - ethylene glycol 5% and 2.4g of dried skim milk. After collection, Kenney extender was added to the semen 1:1, and centrifuged at 400 x g for 12 minutes. Sperm pellets were diluted to reach 100x10(6) cells/ml. Spermatozoa were frozen in 0.5ml straws 3cm above the nitrogen level, during 10 minutes. Thawing of samples was done at 75°C for seven seconds followed by immersion of the straw in a water bath at 37°C for 30 seconds. Post-thaw total and progressive motilities and sperm vigor were evaluated. Sperm membrane integrities of the tail and caput, respectively, were evaluated by the hypoosmotic swelling test and fluorescent dyes. T1 showed the highest post-thaw total and progressive motilities (38.4% and 33.8%, respectively). No significant difference was found among treatments for vigor and hypoosmotic swelling test. T5, T6, and T7 showed higher post-thaw values for sperm membrane integrity. It may be concluded that the association of cryoprotectants used in this experiment did not result in better cryoprotectant effect than 5% glycerol for equine semen cryopreservation.