Search

[eng] Chemical protein synthesis has become a potent tool for the synthesis of proteins, especially those which are not easily accessed by DNA recombinant methods, such as proteins with posttranslational modifications. The key reaction in chemical protein synthesis is Native Chemical Ligation, which implies a chemoselective ligation between two unprotected peptide fragments in aqueous solution. It requires a cysteine residue at the N-terminal of one peptide, and a thioester moiety at the C-terminal of the other fragment. Several strategies have been developed for the synthesis of C-terminal thioester peptides using Fmoc-SPPS. In our group thioester peptides are obtained following the N-acylurea approach, developed by Blanco- Canosa and Dawson, which gives N-acyl-N’-methylacylurea (MeNbz) peptides as precursors of thioesters. However, this approach just enables the ligation of peptides on the C to N direction. In the last years, other strategies using masked or cryptothioesters used for the synthesis of proteins by KCL have been reported. In the present thesis, we have developed new derivatives from the N-acylurea (MeDbz) linker which are acylated with p-cyanophenylchloroformate, rendering the p- cyannophenyloxycarbonyl-MeDbz peptides (abbreviated as pCN-Phoc-MeDbz). Upon activation under slightly basic conditions in solution, the linker cyclizes to render the corresponding MeNbz peptide, which in presence of thiols will suffer a thioesterification to finally yield the C-terminal thioester peptide able to undergo ligation. Essentially, this new linker derivative can act as a masked thioester and thereby, allows the presence of a N- terminal cysteine in the same peptide. We used this new methodology to perform Kinteic Controlled Ligations (KCL) in model peptides and successfully obtained the desired product. Moreover, we have demonstrated that the pCN-Phoc-MeDbz linker is orthogonal with the common reactions used during chemical proteins synthesis, such as desulfurization or Acm and Thz removal. This new methodology has been used for the synthesis of an analog of the Sonic Hedgehog protein (ShhN). The natural ShhN is a 174-mer lipoprotein with a palmitic residue at the N- terminal and a cholesterol molecule at the C-terminus. The interest of this protein relies on its important biological functions. ShhN is the main ligand on the Hedgehogh (Hh) signaling pathway, which is implicated in patterning during the embryo development. In adults, the Hh regulates the cell growth, and it is implied in the maintenance of stem cells and also in tissue regeneration. Aberrant activity on this pathway has been related to several types of cancer, and the majority are ligand dependent. Although the importance of ShhN in this aberrant activation, most of the inhibitors of the Hh pathway target downstream components of the signaling cascade. Actually, only two molecules, are known to bind ShhN. The main goal of the thesis was to synthetize the natural ShhN and also some analogs that could be used for further biological studies such as phage display in order to find ligands to the protein. We applied the methodology developed to chemically synthetize the natural ShhN and two analogues. Unfortunatelly, due to the high hydrophobic character of the natural ShhN, we could not obtain the natural protein. Nevertheless, we succeeded on the synthesis of two analogs of ShhN. On one side, we synthetized Palm-ShhN-biotin, which maintained the natural palmitic acid at the N-temrinus, but changed the cholesterol moiety at the C-terminus by a biotin. On the other side, an analog harboring an Ile dipeptide at the N-terminus and a biotin at the C-terminus was also prepared. After peptide assembly to achieve the final ShhN analogues, they were properly folded to undergo further biological studies. The next stage on our project was to find binders to the synthetic ShhN analogs. To this end, we envisaged to use phage display technology to possibly find new peptide binders to ShhN analogs. This technique allows the winnowing down from libraries with high diversity, up to 109, to finally obtain few binders. Although the first encountered ligands may have high Kd values, affinity maturation allows the obtainment of tighter binders derived from the first selected. We carried out a research stay at Professor Sidhu’s lab, who is an expert in phage display. There, we screened eight scaffold peptide libraries against the synthetic targets. Although the libraries were completely naïve for our target, we obtained few binders. And fortunately, after performing affinity assays, the estimate IC50 of the binders were 40 nM. Future work will be focused on the construction of affinity maturation libraries and on the validation of the affinity of the selected binders off phage., [cat] La síntesis química de proteïnes s’ha convertit en una alternativa en aquells casos en els quals la seva obtenció per mètodes biotecnològics és més difícil, com en el cas de les proteïnes modificades post-translacionalment. La síntesis química de proteïnes es basa en la reacció de Lligació Química Nativa (NCL, de l’anglès Native Chemical Ligation), la qual implica la reacció en entre dos fragments peptídics desprotegits en el qual un té una cisteïna a l’extrem N-terminal, i l’altre un tioèster en el C-terminal. Fins fa uns anys, una de les limitacions de la NCL era la preparació de tioèsters peptídics en C-terminal. En la present tesis s’ha desenvolupat una metodologia basada en el linker N-acilurea (MeDbz), en la qual s’ha procedit a l’acilació de l’amina amb p-cianofenil cloroformat per obtenir els pèptids p-cianofeniloxicarbonil-MeDbz. Aquests, després d’activar-se en solució a pH lleugerament bàsic, permeten la ciclació del linker i posterior tioesterificació per donar els corresponents tioèsters peptídics. Aquesta metodologia pot ser utilitzada per a la síntesi de proteïnes mitjançant Lligacions Cinètiques Controlades (KCL, de l’anglès Kinetic Controlled Ligations). Per a confirmar la utilitat d’aquesta nova metodologia en la síntesis de proteïnes, en aquesta tesis hem sintetitzat dos anàlegs de la proteïna Sonic Hedgehog (ShhN). La ShhN, una proteïna relacionada amb diferents tipus de càncer, és originalment una lipoproteïna que té units un àcid palmític i un colesterol. Degut a problemes de solubilitat només va ser possible la síntesis de dos anàlegs menys hidrofòbics, un amb el palmític en N-terminal i una biotina en C- terminal, i l’altre en el qual el palmític va ser substituït per un dipèptid d’isoleucina. Els dos anàlegs van ser sintetitzats amb èxit, i plegats posteriorment. Finalment, amb l’objectiu de trobar lligands que s’unissin als anàlegs sintètics de ShhN, vam realitzar phage display. Aquesta tècnica va permetre l’obtenció de vuit lligands peptídics amb una afinitat aproximada de 40 nM per les proteïnes d’interès.

Para frenar la creciente resistencia del Plasmodium, el parásito causante de la malaria, se necesitan nuevos fármacos con modos de acción diferentes a los de los fármacos actualmente existentes. Esta tesis se centra en el estudio de las enzimas aminoacil-tRNA sintetasas (ARS) como potenciales dianas terapéuticas. El objetivo principal es el de diseñar y sintetizar distintas quimiotecas de compuestos que actúen como inhibidores específicos y selectivos de las enzimas ARS del Plasmodium falciparum para el tratamiento de la malaria. Las enzimas ARS son las responsables de la síntesis proteica mediante la traducción de la información genética contenida en el ARN mensajero (ARNm). Además, son muy específicas, esenciales y conservadas. Cada especie contiene como mínimo 20 ARS distintas, una por cada aminoácido. Desde un punto de vista teórico, las ARS son potenciales dianas terapéuticas para el tratamiento de la malaria por cuanto: a) son esenciales, pues su inhibición conlleva la inviabilidad celular y muerte del parásito; b) son enzimas altamente expresadas durante el ciclo asexual intraeritrocítico que tiene lugar en el huésped; y c) aunque no se conoce su estructura de rayos-X, son estructuralmente viables para diseñar modelos homólogos. Además, las ARS son dianas terapéuticas validadas, ya que se ha demostrado que existen compuestos, en su mayoría antibióticos y antifúngicos, capaces de inhibir su funcionalidad. Todas las ARS del P. falciparum tienen su enzima homóloga humana. No obstante, existen diferencias filogenéticas que otorgan cierta divergencia estructural a las enzimas, por lo que podrían ser inhibidas selectivamente, como podría ser el caso de las ARS apicolásticas del parásito. El apicoplasto es un orgánulo presente en casi todos los apicomplejos, éste, tiene carácter bacteriano, está evolutivamente bien conservado y fue descubierto hace relativamente poco, por lo que se desconocen muchas de sus funcionalidades. Sin embargo, se trata de un orgánulo que contiene información genética y es esencial para la supervivencia del parásito. Para diseñar los posibles inhibidores de ARS del P. falciparum, se ha contado con información biológica a nivel molecular y celular del parásito proporcionada por los distintos grupos de investigación que forman parte del proyecto Mephitis, así como por la realización de varios ensayos biológicos de los compuestos sintetizados para determinar su actividad antimalárica y su capacidad de inhibir las funcionalidades del apicoplasto del parásito. Durante el transcurso de esta investigación, se han sintetizado cuatro familias de compuestos; - Miméticos del intermedio Lisil-ARNt sintetasas. Mediante síntesis en fase sólida y en solución se sintetizaron compuestos basados en el complejo intermedio Lisil-adenilato. Se demostró mediante ensayos in vitro que dos de ellos fueron capaces de inhibir selectivamente la Lisil-ARNt sintetasa del apicoplasto sin alterar la funcionalidad de la enzima homóloga humana. - Ligandos múltiples basados en los beta-aminoácidos cispentacina e icofungipen. Los beta-aminoácidos cispentacina e icofungipen están descritos como inhibidores de la Proy la Ile-ARNt sintetasa de C. albicans respectivamente. La idea inicial fue sintetizar ligandos múltiples uniendo los farmocóforos antes citados, mediante un aminoácido, formando tripéptidos. Al no obtener resultados satisfactorios en los ensayos in vitro frente a P. falciparum de los di- y tri-péptidos formados con la cispentacina, se abandonó la síntesis del icofungipen. - Derivados del benzimidazol Se decidió crear una quimioteca de derivados del benzimidazol como posibles compuestos duales, es decir que inhibieran más de una enzima ARS. Los compuestos se sintetizaron a partir de distintas o-fenilendiaminas substituidas, distintos aminoácidos utilizados como espaciadores y distintos ácidos carboxílicos que dieron diversidad a la quimioteca. Aunque no se pudo evaluar el modo de acción ni la diana de dichos compuestos, se obtuvieron seis derivados del benzimidazol con actividad antimalárica in vitro (IC50 menor de 40 milimicras) pero no in vivo. - gamma-péptidos derivados de la prolina A partir de un péptido patrón sintetizado previamente en nuestro laboratorio, formado con cadenas laterales indólica que mimetiza al triptófano, se sintetizó en fase sólida una quimioteca de derivados de aquél. Seis de los gamma-péptidos mostraron actividad antimalárica in vitro (IC50; 1.3-3.6 milimicras). No se pudo determinar el modo de acción de dichos compuestos., The resistance of malaria parasites to available drugs continues to grow, which makes the need for new antimalarial therapies pressing. The main goal of this research is the design and synthesis of new specific and selective inhibitors of the aminoacyl-tRNA synthetases (ARSs) of Plasmodium falciparum. Aminoacyl-tRNA synthetases (ARSs) are essential and conserved enzymes that catalyze the esterification of a specific amino-acid to its cognate transfer RNA (tRNA). Despite the fact that every species has a set of ARSs, there are some differences among them that can becurcial in the sense of selectivity. One example is the apicoplast, an organelle present in almost all the apicomplexan parasites that derived from a secondary endosymbiosis of cyanobacteria. Although the main role of this organelle is unknown, it is essential for the parasite’s survival. The apicoplastic ARSs differed substantially from the mammalian homologues enzymes. Even more, the ARSs are well-established antimicrobial drug targets. For all these reasons, ARSs represent an interesting new target for antimalarial drug discovery. During the research, we collaborated with different teams of scientists in Mephities consortium. They gave us the biological and molecular information needed for the design of potentially antimalarial compounds. With the aim of inhibiting different ARSs of P. falciparum, we synthesized four different libraries of compounds based on: 1) mimetic of Lys-ARSs intermediated; 2) beta-amino acids derivatives; 3) benzimidazole derivatives and 4) some gamma-peptides derived from L-Proline. We demonstrated that some compounds are active in vitro against P. falciparum at a millimicrons range. And, what is more, we confirmed that two of them had inhibited the apicoplastic Lys- ARS of P. falciparum. Some compounds were assayed in vivo but none of them cured the disease.

[cat] Les proteïnes bacterianes associades al nucleoide (NAPs) juguen un paper clau en l’organització, la replicació, la segregació, la reparació i l’expressió del cromosoma. L’estudi de nous membres de les famílies de NAPs, així com de proteïnes paràlogues a les ja conegudes, és important per entendre millor el seu paper biològic. Aquest projecte d’investigació té com a objectiu avançar en l’estudi de paràlegs a Escherichia coli de la proteïna Hha. Les proteïnes objecte d’estudi han estat YdgT, la subunitat θ de l’ADN polimerasa III (també anomenada en aquest treball HolE) i la proteïna YmgB. Pel que fa referència a YdgT, proteïna considerada fins al moment paràloga d’Hha, s’ha dut a terme una anàlisi transcriptòmica de mutants hha i ydgT per tal de comparar els corresponents patrons d’expressió gènica. Els mutants senzills hha i ydgT mostren un patró d’expressió gènica més diferent del que s’esperaria. De fet, el patró del mutant hha conté molts gens induïts mentre que en el mutant ydgT la majoria estan reprimits. Per tant, en general Hha té una funció repressora mentre que YdgT actuaria principalment com un activador. Dins del capítol dedicat a l’anàlisi de mutants hha i ydgT i durant l’estudi del fenotip del doble mutant hha ydgT, es van obtenir uns resultats prou rellevants com per ser considerats un nou apartat dins del present treball. Es tracta de la detecció i anàlisi de l’origen de clons no hemolítics que apareixen en mutants hha ydgT portadors del plasmidi hemolític pANN202-312R en plaques d’agar sang que contenen l’antibiòtic kanamicina. La presència de kanamicina (marcador de la mutació hha) és la causant de l’aparició de colònies sense halo d’hemòlisi. En el present estudi s’han identificat les regions per on es produeix l’escissió i s’ha observat que pertanyen a seqüències d'inserció IS91 parcials. Aquest procés s’ha estudiat també en una soca salvatge amb un plasmidi parental de baix número de còpies (pHly152) en presència de concentracions subinhibitòries de kanamicina i d’ampicil•lina. Pel que fa a la subunitat θ del nucli de l’ADN polimerasa III, s’ha detectat una similitud estructural amb la proteïna associada al nucleoide Hha. En aquest cas, també s’ha realitzat l’anàlisi transcriptòmica del mutant en aquesta subunitat (holE). Això ha permès comprovar que el conjunt de gens alterats en un mutant holE és molt més similar al del mutant ydgT que al del mutant hha. Una part significativa dels gens comuns alterats en els mutants holE i ydgT pertanyen a operons de motilitat, seqüències intergèniques i ARN petits. Aquests resultats i la recent publicació dels estudis que relacionen la sobreexpressió d’ydgT amb la complementació del fenotip de recuperació de la polaritat transcripcional en mutants rho, han permès atribuir també a la subunitat θ de l’ADN polimerasa III un paper en processos de terminació prematura de la transcripció. En el cas de la proteïna YmgB, els estudis duts a terme en aquest treball estableixen noves relacions entre aquesta proteïna i les proteïnes associades al nucleoide H-NS/Hha. Els resultats més interessants que aporta aquest treball s’han obtingut sobreexpressant ymgB. L’anàlisi de l’efecte de la sobreexpressió d’ymgB sobre el patró d’expressió de proteïnes ha permès evidenciar la regulació d’enzims relacionats amb la resistència a l’àcid (lisina descarboxilasa i glutamat descarboxilasa) i de la proteïna ribosomal L2, la qual sembla jugar un paper en la traducció. A més, la sobreexpressió d’ymgB té efectes sobre l’expressió de les proteïnes associades al nucleoide H-NS i Hha, així com sobre l’expressió de gens regulats per aquestes (bgl, proU i hly)., [eng] The bacterial nucleoid-associated proteins (NAPs) play a key role in the organization, replication, segregation, repair and expression of the chromosome. The study of new members of NAP families, as well as paralogue proteins of the ones which are already known, is important in order to understand their biological roles better. This research project aims to advance the study of paralogues of protein Hha in Escherichia coli. The proteins which were studied were YdgT, the θ subunit of DNA polymerase III and the protein YmgB. With regard to YdgT, a protein considered until now a paralogue of Hha, we carried out a transcriptomic analysis of hha and ydgT mutants and we compared the corresponding patterns of gene expression. We found out that in general Hha has a repressor function, while YdgT acts mainly as an activator. In the chapter which is dedicated to the analysis of hha and ydgT mutants and during the study of the phenotype of the double mutant hha ydgT, we obtained results relevant enough to be considered as a new section in the present work. This is the detection and analysis of the origin of non-hemolytic clones appearing in hha ydgT mutants carrying the hemolytic plasmid pANN202 312R in blood agar plates containing the antibiotic Kanamycin. Looking at the θ subunit of DNA polymerase III, initially we could detect a structural similarity to the Hha protein. In this case, we also performed a transcriptomic analysis of the mutant in this subunit (holE). This has revealed that the set of genes altered in a holE mutant is much more similar to the set of the ydgT mutant than the one of the hha mutant. A significant proportion of common genes altered in the holE and ydgT mutants belongs to motility operons, intergenic sequences and small RNA. These results and the recent publication of studies that link overexpression of ydgT to the complementation of the phenotype of recovery of transcriptional polarity in rho mutants, have allowed us to attribute to HolE a role in the process of premature transcription termination. Finally and regarding the protein YmgB, research conducted in this study establishes new relationships between this protein and nucleoid-associated proteins H-NS/Hha. The most interesting results provided by this study were obtained by overexpressing ymgB.

[cat] L'activació de SUMO està catalitzada per l'heterodímer SAE2/SAE1 en una reacció depenent d'ATP. La subunitat SAE2 està organitzada en tres dominis funcionals: el domini d'adenilació, on SUMO és adenilat, el domini Cys que conté la cisteïna catalítica involucrada en la formació del tioéster amb l'extrem C-terminal de SUMO, i el domini UBL que s'ha descrit el seu paper en el reclutament de E2 per E1. La subunitat petita SAE1 presenta una contribució menor a la formació del domini d'adenilació i aparentment no estableix contacte amb SUMO. Arabidopsis expressa dues isoformes de SAE1, SAE1a i SAE1b i en aquesta tesi s'ha estudiat la rellevància biològica d'aquestes. Els nostres resultats indiquen que AtSAE1a és més estable que AtSAE1b tan in vitro com in vivo, i la taxa de conjugació de SUMO és depenent de la isoforma AtSAE1 present en la barreja de reacció, suggerint que l'activació de SUMO pot ser regulada pels nivells relatius de les isoformes de AtSAE1 presents in vivo. Per altra banda, s'ha descrit la capacitat de SUMO per interaccionar de manera no covalent amb el seu corresponent E2. Els determinants estructurals responsables d'aquesta interacció estan conservats a humans i llevat, suggerint que és un mecanisme conservat. A Arabidopsis s'ha detectat expressió de 5 isoformes de SUMO (AtSUMO1, 2, 3 i 5), de les quals només AtSUMO1 i 2 són capaços d'establir aquestes interaccions no covalents amb E2. Posteriorment, s'ha avaluat si aquestes diferències comporten una conseqüència a l'hora de ser conjugades a un substrat in vitro. Com a molècula acceptora de SUMO s'ha utilitzat el domini C-terminal de la catalasa 3 d'Arabidopsis. S'ha observat que AtSUMO1, 2 i 3 són capaços de ser conjugats al substrat, tot i que AtSUMO3 es conjugat d'una manera més ineficient, amb una taxa fins a quatre vegades inferior que AtSUMO1 i 2. En canvi, AtSUMO5 no es conjugat en nivells que es puguin detectar en cap de les situacions estudiades. Paral·lelament, durant aquesta tesi s'ha descrit que el domini AtE1 UBL disminueix l'eficiència de la conjugació de SUMO in vitro. S'han generat plantes transgèniques que expressen el domini AtE1 UBL i s'ha observat que l'expressió d'aquest domini in vivo provoca un fenotip de nanisme i floració primerenca. A més, en situacions d'estrès, aquestes plantes són incapaces d'acumular el mateix nivell de conjugats de SUMO que plantes silvestres. Amb tots aquests anàlisis es dedueix que la maquinària de sumoilació a Arabidopsis presenta una gran complexitat en quant a nombre de components, entre els quals podria existir una especificitat de funció. A més, la sumoilació es un procés essencial i està regulant processos tan importants com la floració, el creixement i el desenvolupament de les plantes., [eng] SUMO activation is catalyzed by the heterodimer SAE2/SAE1 in an ATP-dependent reaction. The SAE2 subunit is organized into three functional domains: the adenylation domain, where SUMO is adenylated, the Cys domain containing the catalytic cysteine involved in the thioester formation with SUMO Ct, and the UBL domain which has been involved in E2 recruitment. To E1. The small subunit SAE1 has a minor contribution to the adenylation domain formation and apparently it does not establish direct contacts with SUMO. Surprisingly, Arabidopsis expresses two SAE1 isoforms, AtSAE1a and AtSAE1b and we have investigated the biological relevance of this. Our results indicate that AtSAE1a is more stable than AtSAE1b both in vivo and in vitro, and that SUMO conjugation rate is dependent on the AtSAE1 isoform present in the reaction mixture, suggesting that SUMO activation could be regulated by the relative levels of AtSAE1 isoforms present in vivo. Together, our results suggest that SUMO activation could be a rate limiting step in the conjugation cascade in vivo.

Tesis del Departament de Química Orgànica de la Universitat de Barcelona (UB).-- Fecha de defensa 30-06-2008., [EN] Protein-protein interactions are essential in biological processes and thus, they have become very promising therapeutic targets. Nevertheless, the artificial modulation of protein complexes remains a challenge. Since most work to date has been focused on the inhibition of protein-protein interactions, there is little precedent on the design of molecules which can induce, stabilize or recover the oligomerization state of proteins. In this context, the system comprised of the tetramerization domain of protein p53 (p53TD) and its oncogenic mutants with defective oligomerization properties is an outstanding case of study for the design and evaluation of molecules which can recover the tetrameric structure, Through a collaboration with Prof. Javier de Mendoza, a family of para-guanidinomethyl-calix[4]arenes able to interact simultaneously with the four monomers of the p53 tetramerization domain was rationally designed; hence, the interaction with these compounds would stabilize the whole tetrameric assembly. In order to evaluate experimentally said calix[4]arenes, three natural oncogenic mutants of the p53TD with defective assembly abilities were biosynthesized. Namely, they are: G334V, R337H and L344P., Once synthesized and purified the calix[4]arenes compounds, their molecular recognition properties were tested through a battery of biophysical techniques, including nuclear magnetic resonances (on both the protein and the ligand), circular dichroism, differential scanning calorimetry, crystallography, mass spectrometry and chemical cross-linking. The results clearly show that these calix[4]arenes interact with the proteins as intended and, the most important, they can thermally and kinetically stabilize the tetrameric state., These results are the perfect evidence of the proof-of-concept initially sought: a little synthetic ligand can stabilize the oligomeric state of proteins which are structurally defective. In addition, the study of several ligands with different functionalizations provides further understanding about the basis of molecular recognition events. On the one hand, the guanidinium group has a vital role for high affinity interactions. On the other hand, structural flexibility, in both the protein and the ligand, enables the molecules to adopt the optimal conformation for the tightest interaction, thereby underscoring the ambiguous and unpredictable role of the entropy in interaction processes., [ES] Las interacciones proteína-proteína son esenciales en muchos procesos biológicos y por ello resultan dianas terapéuticas muy prometedoras. Sin embargo, modular artificialmente complejos proteicos resulta todavía un gran reto. Hasta la fecha, los esfuerzos se han dirigido básicamente hacia la inhibición de interacciones proteína-proteína; pocos precedentes describen el diseño de moléculas que puedan inducir, estabilizar o recuperar el estado oligomérico de proteínas. En relación a lo último, el sistema formado por el dominio de tetramerización de la proteína p53 (p53TD) y sus mutantes oncogénicos con oligomerización defectuosa representa un excelente modelo para el diseño y la evaluación de moléculas que puedan recuperar el estado tetramérico nativo., En colaboración con el Prof. Javier de Mendoza, se diseñaron racionalmente compuestos para-guanidinometil-calix[4]arenos capaces de interaccionar con simultáneamente con las cuatros unidades que estructuran el dominio de tetramerización de p53, de tal modo que podrían estabilizar el estado oligomérico de la proteína. Para la evaluación experimental de dichos ligandos calix[4]arenos, se biosintetizaron tres mutantes naturales de p53TD con tetramerización defectuosa: G334V, encontrado en cánceres de pulmón; R337H, asociado al carcinoma adrenocortical infantil; y L344P, asociado al síndrome Li-Fraumeni., Tras la síntesis y purificación de los compuestos guanidinometil-calix[4]arenos, sus capacidades de interacción con las proteínas se estudiaron por técnicas biofísicas, que incluyen resonancia magnética nuclear (sobre la proteína y sobre el ligando), dicroismo circular, calorimetría diferencial de barrido, calorimetría isotérmica de titulación, cristalografía, espectrometría de masas y entrecruzamiento químico. Los resultados muestran claramente que los calix[4]arenos pueden interaccionar con las proteínas tal y como se habían diseñado; en consecuencia, estos ligandos son capaces de estabilizar térmica y cinéticamente las proteínas mutantes, recuperando así su estado tetramérico., Estos resultados son la perfecta prueba del concepto inicialmente planteado: un pequeño ligando sintético diseñado puede estabilizar el estado oligomérico de proteínas estructuralmente defectuosas. El estudio de varios ligandos con diferentes grupos funcionales también pone de manifiesto otros fenómenos de particular relevancia en el campo del reconocimiento de superficies proteicas. Por una parte, el grupo guanidinio tiene un papel clave para la afinidad de la interacción. Por otra parte, la flexibilidad estructural de ambos componentes: la proteína y el ligando, permite que se establezcan interacciones más estrechas y fuertes, lo que refleja el papel tan ambiguo e impredecible de la entropía en procesos de interacción.

L'avidina i l'estreptavidina són proteïnes tetramèriques molt conegudes degut a la seva elevada constant d'associació (Ka ≈ 1015 M-1 i 2.5 x 1013 M-1 respectivament) al seu lligand natural, la biotina. Aquesta forta unió ha fet possible la utilització del sistema (estrep)avidina-biotina en moltes aplicacions biomèdiques. L'objectiu del present treball ha estat la síntesi de nous lligands d'avidina (Av) i estreptavidina (SAv) i l'estudi de la seva interacció. S'han sintetitzat lligands monovalents d'Av i SAv amb un sistema bicíclic de tipus [3.3.1], tant de tipus propandiurea (PDU), com dimetilpropandiurea (DMPDU) i s'ha demostrat que aquests lligands s'uneixen a les proteïnes Av i SAv. S'ha observat que aquests lligands presenten les següents característiques: - El canvi de sistema bicíclic de DMPDU a PDU es tradueix en un augment de la constant d'associació tant a Av com a SAv. - La introducció d'una cadena lateral de valerat sobre l'àtom de N per a generar l'enantiòmer (+) comporta un augment important de la constant d'associació (Ka) a SAv i Av, tant en el sistema de tipus PDU com en el de tipus DMPDU. En canvi, quan s'introdueix la cadena de valerat sobre el N per a generar l'enantiòmer (-), els canvis en la Ka són molt menors i de signe contrari, és a dir, hi ha un petit increment en el cas de la DMPDU, però una petita disminució en el cas de la PDU quan s'uneix a SAv. En canvi, amb Av es produeix sempre una disminució de Ka.- En els lligands de tipus DMPDU, passar de tenir la cadena de valerat unida del C cap de pont a tenir-la unida al N del grup ureido com a enantiòmer (+), comporta un augment de la Ka, més important en Av que en SAv.- En els lligands amb cadena de valerat unida al N, l'enantiòmer (+) té una major afinitat per Av i SAv que l'enantiòmer (-), tant en els lligands de tipus PDU, com en els de tipus DMPDU.- En el compost DMPDU-C-C4-COOH, la derivatització de la cadena lateral d'àcid carboxílic en forma d'amida afecta poc a la seva Ka a SAv, però fa disminuir bastant la Ka en el cas d'Av.- El compost (+)-PDU-N-C4-COOH és el que presenta major Ka, tant a Av com a SAv, essent inclòs superior a la del compost anàleg derivat del glicoluril (+)-Gril-N-C4-COOH.Per algunes aplicacions pot resultar interessant l'ús de lligands divalents, els quals tenen dues unitats d'un lligand monovalent unides covalentment a través d'un espaiador. La longitud òptima de l'espaiador hauria de ser coneguda per tal d'evitar processos d'oligomerització. En aquest sentit pot resultar útil la utilització de lligands monovalents amb una moderada constant d'associació a Av i SAv, per tal d'obtenir lligands divalents reversibles. Amb aquests lligands es poden mesurar fàcilment les constants d'associació a Av i SAv, donant una indicació de com d'apropiat és l'espaiador per a cada proteïna amb la finalitat de formar el complex intramolecular. Amb aquest objectiu, s'han sintetitzat una sèrie de lligands, i s'ha mesurat la constant d'associació a SAv. La unitat monovalent d'aquests lligands es basa en el sistema bicíclic dimetilpropandiurea, el qual presenta una moderada constant d'associació (Ka = 2.8 x 105 M-1) per SAv. Els braços espaiadors dels lligands divalents eren o bé cadenes alifàtiques o bé cadenes de polièters d'etilenglicol, amb la formació de lligands que presenten una major constant d'associació per SAv que el lligand monovalent de referència.La introducció de l'anell aromàtic a l'espaiador es tradueix en un augment significatiu de la constant d'associació a SAv, com a resultat de la preorganització del lligand divalent. Aquestes diferències han estat inferiors o pràcticament inapreciables per a Av.Finalment s'han explorat noves rutes de síntesis de nous lligands divalents amb una part rígida més extensa que en els lligands anteriors., ENGLISH VERSION:TITLE OF THE THESIS: "Synthesis of monovalent and divalent semi-rigid ligands of avidin and streptavidin and study of their interaction"SUMMARY: Avidin and streptavidin are tetrameric proteins well-known for their high binding affinity (Ka ≈ 1015 M-1 and 2.5 x 1013 M-1 respectively ) towards biotin, its natural ligand. This strong binding has allowed to use the (strept)avidin-biotin system in many biochemical applications. The aim of the present work was the synthesis of new ligands of avidin and streptavidin and the study of their interaction. New monovalent ligands with a bicyclic framework [3.3.1], of the type propanediurea (PDU) or dimethylpropanediurea (DMPDU) has been synthesized and proved to bind the proteins avidin and streptavidin. For some applications it might be interesting to use divalent ligands, i.e. those having two units of a monovalent ligand covalently linked via a spacer arm. In order to design these divalent ligands, the optimal spacer length should be known, otherwise oligomerization could be placed. More informative could be the use of divalent ligands having two units of a monovalent ligand of moderate binding affinity for avidin and streptavidin. With these reversible ligands it should be possible to easily measure the binding constants of the complexes with avidin and streptavidin, giving an indication of how appropiate a given spacer is for each protein in order to form the intramolecular complex.For this purpose, a series of divalent ligands has been synthesized, and their binding affinity to streptavidin has been measured. The monovalent unit of these divalent ligands is based on the dimethylpropanediurea bicyclic framework, and shows a moderate binding affinity (Ka = 2.8 x 105 M-1) for streptavidin.The spacer arms of the divalent ligands were either aliphatic or polyethers chains derived from ethylene glycol, with the former ligands showing a higher binding affinity for streptavidin than the monovalent ligand of reference. Introduction of an aromatic ring into the spacer arm lead to a significant increase in the binding affinity for streptavidin, as a result of the preorganization of the divalent ligand. These semi-rigid divalent ligands have effective molarities of up to 2.7 M towards streptavidin, which means that they preferentially form of the divalent complex (intramolecular binding) with streptavidin in a broad range of concentrations up to their effective molarity.Several ways for the synthesis of new divalent ligands with a more extended rigid part were explored.

1) "Diseño, síntesis y caracterización de inhibidores de la fusión de VIH-1 análogos del péptido C34 de gp41 con D aminoácido"En el proceso de fusión del virus del VIH-1 a la célula diana intervienen las proteínas de la cubierta viral gp120 y gp41. La gp120 al interaccionar con el receptor CD4 y co-receptores sufre un cambio conformacional que enseguida causa cambios en la estructura de gp41. Esta proteína sufre una reorganización que conduce al acercamiento entre la región N-terminal y la región C-terminal de gp41 aproximando las membranas celular y viral entre si. El péptido C34 tiene buenas propiedades como inhibidor de la fusión viral y forma complejos estables con el péptido N36 derivado de la región N-terminal de gp41. En este capítulo se discute el efecto de cambiar la quiralidad del péptido C34 total o parcialmente, para aumentar la estabilidad de este péptido frente a proteasas. Mientras los péptidos derivados de C34 con todo-D aminoácidos fueron incapaces de inhibir la fusión del VIH-1. Los péptidos heteroquirales, especialmente el péptido M3C34, son capaces de formar complejos estables con N36 e inhibir la fusión.2) "Identificación de complejos heteroquirales entre péptidos todo-D y el fragmento N-terminal del dominio de B de la proteína A de Staphyloccus aureus"La proteína A es un factor patogénico encontrado en la superficie del Staphylococcus aureus. Esta proteína es capaz de unirse al fragmento cristalizable de las inmunoglobulinas G. El dominio B, un trímero de hélices antiparalelas, es uno de los cinco dominios responsables de este reconocimiento. Péptidos derivados de la región N-terminal de este dominio no tienen una estructura estable en disolución. Sin embargo, la presencia de la de péptidos correspondientes a la región C-terminal del dominio forman complejos que aumentan el contenido helicoidal del sistema. En este capitulo se diseñó una quimioteca OBOC (del ingles "one bead one compound") de 4096 péptidos con aminoácidos D derivados de la secuencia de la hélice C-terminal el domino B, con el objetivo de identificar péptidos todo-D capaces de interactuar con el fragmento N-terminal del domino B y de formar complejos no covalentes heteroquirales. 3) "Síntesis, caracterización estructural y evaluación de la interacción con inmunoglobulina G de nuevos análogos del dominio B de la proteína A de Staphylococcus aureus"Los fragmentos correspondientes a la hélice C-terminal y región N-terminal del domino B de la proteína A de Staphylococcus. aureus forman complejos que aumentan la helicidad del sistema. En nuestro grupo se identificaron dos péptidos derivados de la hélice C-terminal del dominio B que forman complejos con el fragmento N-terminal con mutaciones en los residuos Ser 44 y Leu 47. En esta parte se describe la caracterización estructural y evaluación de la actividad de los complejos no covalentes formados entre estos péptidos y el fragmento N-terminal del dominio B y los dominios enteros. Después de comprobar que el fragmento N-terminal interaccionaba con los análogos no naturales de la hélice C-terminal se sintetizaron los dos dominios análogos con las modificaciones encontradas en la región C-terminal (Ser44Phe Leu47Lys y Ser44Phe Leu47Val). El análisis de estructura por dicroísmo circular reveló que los análogos mostraban estructura helicoidal y eran térmicamente estables. Por resonancia de plasmon superficial se encontró que los análogos se unían a inmunoglobulina de conejo y al fragmento cristalizable de las inmunoglobulinas humano con una afinidad similar, aunque con cambios en las cinéticas de asociación y disociación. La información estructural de cada residuo se analizó por medio de resonancia magnética nuclear. Este estudio mostró que los dominios análogos conservan tres regiones helicoidales y de acuerdo a los experimentos de intercambio H/D se pliegan de forma similar al dominio natural., This thesis is divided in three parts. The first part is about the design, synthesis and characterization of new peptide inhibitors of the HIV-1 fusion derived of the C-terminal region of gp41. In the second part was described the design and synthesis of a library of all-D peptide derived of the C-terminal region of B domain of protein A of Staphylococcus aureus to identify all-D peptides which could interact with the N-terminal fragment of B domain to get heteroquiral non covalent complexes. The third part is about the synthesis, structural characterization and activity evaluation of two new analogues en B domain of protein A of Staphylococcus aureus with mutations in Ser44 and Leu47.

Scp160 és una proteïna de Saccharomyces cerevisiae que conté 14 dominis KH de tipus I, un domini conservat present en un gran nombre de proteïnes. Scp160 presenta homologia amb la proteïna de metazous coneguda com a vigilina. Aquestes proteïnes es troben conservades en el grup dels fongs i els metazous. Les vigilines han sigut associades en diferents processos cel·lulars entre els que cal destacar: la regulació general de la síntesi proteica, la estabilització de mRNAs específics i la contribució a la segregació dels cromosomes en mitosi.La vigilina de Drosophila melanogaster, la proteïna DDP1, va ser aïllada en el nostre laboratori com una proteïna associada a la heterocromatina pericentromèrica d'aquest organisme. Donada la conservació d'aquestes proteïnes entre els fongs i els metazous ens em plantegat l'estudi de la possible contribució de la proteïna Scp160 en la formació i manteniment de la heterocromatina de S. Cerevisiae.Les cèl·lules mutants scp160 presenten, en ser analitzades per FACS, nivells de ploidia aberrants suggerint la presencia de problemes en el procés de segregació cromosómica d'aquestes cèl·lules. Consistent amb la presencia de alteracions en al procés de segregació cromosòmica les cèl·lules scp160 presenten hipersensibilitat a drogues desestabilitzadores de microtubuls com el benomyl. La expressió de la proteïna DDP1 de forma ectópica en cèl·lules de S. Cerevisiae es capaç de complementar la manca de la proteïna Scp160 indicant que ambdues proteïnes no només són homòlegs estructurals, sinó que també són homòlegs funcionals.Per tal de analitzar la contribució de la proteïna Scp160 a la estructuració de la heterocromatina als diferents loci silenciats que hi ha en el genoma de S. Cerevisiae, per això hem realitzat la deleció del gen SCP160 en soques que portaven marcadors inserits en les regions telomèriques, els locus silenciats del mating type i el locus del rDNA, observant-se que la deleció del gen SCP160 es comporta com un supressor de variegació en les seqüències telomèriques i en el locus del mating type, preo no té cap efecte en el silenciament del locus del rDNA.Consistent amb el efecte de desrepresió observat en les seqüències telomèriques la mutació scp160 presenta una desregulació en la longitud de les seqüències telomèriques, suggerint una implicació d'aquesta proteïna en el manteniment d'aquestes seqüències.Per tal de aprofundir en el defecte de silenciament que presenten les cèl·lules mutants scp160 hem estudiat mitjançant CHIP la presència de la proteïna Sir3 en les regions telomèriques de les cèl·lules mutants, observant-se una disminució significativa dels nivells de Sir3 en comparació amb cèl·lules wild type. Consistent amb aquest efecte la sobreexpresió de la proteïna Sir3 es capaç de recuperar la pèrdua de silenciament telomèric observat en les cèl·lules scp160. Així mateix el fenotip de desrepresió associat a la deleció del gen SCP160 no s'estableix en cèl·lules que sobreexpressen Sir3 o que presenten mutacions que reforcen el silenciament telomèric, com la mutació de la histona desacetilasa Rpd3 o de les proteïnes telomèriques Rif1 i Rif2.Tots aquest resultats no ens permeten discernir entre una implicació directa de la proteïna Scp160 en aquest processos o una acció indirecta deguda a la regulació d'altres processos cel·lulars. La proteïna Scp160 presenta una localització perinuclear compatible amb la presència d'aquesta proteïna a les seqüències heterocromàtiques de S. Cerevisiae, però no ha pogut ser localitzada en les regions telomèriques d'aquest organisme mitjançant CHIP. Són necessaris estudis posteriors per a determinar la presència d'aquesta proteïna en les regions heterocromàtiques d'aquest organisme.ENGLISH, Vigilins are highly conserved proteins found in fungi and metazoan. Vigilins contains 14-15 KH domains, a protein domain involved in single stranded nucleic acids binding.Drosophila melanogaster vigilin, the protein DDP1, was isolated in our lab as a protein associated with pericentric heterochromatin. As these proteins are conserved among fungi and metazoan, we wanted to study the possible implication of Scp160, Saccharomyces cerevisiae vigilin, in the formation and maintenance of heterochromatin.Mutants cells scp160 shows aberrant DNA content upon analysis with FACS. Consistent with alterations in the chromosome segregation process, these cells show hypersensitivity to benomyl, a microtubule depolymerising drug. Ectopic expression of Drosophila DDP1 in yeast cells was able to complement scp160 mutation in yeast. In order to analyse the contribution of Scp160 to heterochromatin formation we have deletes SCP160 gene in strains bearing markers at different loci that are silenced in the Saccharomyces cerevisiae genome: telomeric regions, mating type locus and rDNA locus. We have seen that SCP160 deletion behaves like a suppressor of variegation in telomeric and mating type region, but not in rDNA region.Scp160 protein shows perinuclear localization compatible with its presence in heterochromatic regions, but we could not detect this protein in the telomeric regions by chromatin immunoprecipitation experiments.

En les bactèries entèriques, les proteïnes de la família Hha/YmoA juguen un paper important en la regulació de l'expressió genica en resposta a factors ambientals. La proteïna Hha d'Escherichia coli fou identificada com a regulador de l'expressió de la toxina α-hemolisina. Ja ha estat prèviament descrit que la proteïna Hha interacciona amb la proteïna H-NS i que el complex nucleoproteic format és responsable de la termoregulació de l'expressió de l'operó hly d'E. Coli.També ha estat descrit que E. Coli i altres enterobactèries contenen una proteïna paràloga a H-NS, la proteïna StpA. Aquesta proteïna s'expressa molt poc en condicions normals, però s'indueix en mutants hns. La sobreexpressió de StpA suprimeix parcialment molts dels fenotips causats per la mutació hns.En aquesta tesi s'ha identificat en el genoma d'E.coli el gen ydgT, que codifica per a una proteïna amb elevada homologia amb proteïnes de la família Hha/YmoA. Aquesta nova proteïna paràloga a Hha (38% d'identitat i 68% de similitud), té un comportament similar a StpA en el context d'H-NS: es sobre-expressa en mutants hha i pot compensar, almenys parcialment, el fenotip hemolític provocat per la mutació hha.A mes també hem demostrat que la proteïna YdgT es capaç d'interaccionar tant amb H-NS com amb StpA, per tal de formar complexes hetero-dimèrics in vivo. En canvi, la proteïna YdgT no interacciona amb la seva proteïna paràloga Hha.En aquesta memòria també s'ha establert una xarxa de regulacions creuades entre les proteïnes Hha, YdgT, H-NS i StpA. Les mutacions hha i/o hha ydgT provoquen una disminució dels trànscrits d'hns i stpA. Ha estat analitzat l'efecte en el patró d'expressió proteica de les mutacions hha, ydgT i hha ydgT. Els resultats obtinguts mostren el fenotip pleiotròpic del doble mutant. Hem estat capaços de detectar diverses diferencies i hem identificat algunes de les proteïnes que mostren expressió diferencial entre les diferents soques estudiades: OmpA, OmpC, Triptofanasa, dTDP-L-ramnosa sintetasa, proteïna precursora de la proteïna periplasmàtica d'unió a D-ribosa. Aquestes proteïnes, entre d'altres funcions, juguen un paper important en la conjugació, osmo-regulació, formació de biofilms, formació de LPS i quimiotaxis, respectivament.

Tesis del Departament de Química Orgànica de la Universitat de Barcelona (UB).-- Fecha de defensa 29-03-2004., En la majoria de processos cel•lulars, hi ha multitud de proteïnes que interaccionen entre sí, essent aquests contactes proteïna-proteïna, fonamentals per al correcte funcionament de cadascun d’aquests processos. Aquests contactes, es donen a través de les superfícies de les diferents proteïnes, de manera que aquestes superfícies són unes dianes terapèutiques potencialment molt interessants., Donada la importància del reconeixement de superfícies proteiques, aquest treball de tesis doctoral s’ha dirigit a l’estudi de la utilització de lligands peptídics per al reconeixement de superfícies proteiques riques en carboxilats. En concret, com a diana, s’ha escollit el domini de tetramerització de la proteïna supressora de tumors p53., Així, partint dels estudis previs realitzats en el grup de recerca basats en la interacció de molècules tetraguanidíniques no peptídiques amb petits pèptids model amb quatre residus àcids distribuïts en i / i+3 / i+6 / i+9, s’ha pogut dissenyar i sintetitzar un pèptid (Ac-AGAAGWARGRARSR-NH2), el qual és capaç de reconèixer la superfície rica en carboxilats de la p53. Per poder dur a terme aquests estudis, ha estat necessari establir la metodologia per obtenir mitjançant expressió en cultius bacterians, el domini de tetramerització de la p53 (amb i sense marca isotòpica). El pèptid s’ha dissenyat mitjançant eines de modelat molecular, i la interacció s’ha estudiat mitjançant la combinació de diferents tècniques com són l’espectroscòpia de fluorescència, la ressonància magnètica nuclear, la ressonància de plasmó superficial i la microcalorimetria. A partir d’aquest estudis s’ha pogut concloure que la constant d’afinitat és de l’ordre de 10 milimicres. A més a més, s’ha pogut comprovar que el pèptid Candidat 4, és capaç de creuar la membrana cel•lular, fet que obre les portes a poder avaluar aquesta interacció in vivo., A partir del pèptid Candidat 4, s’ha dissenyat una quimioteca de 40 pèptids amb l’objectiu d’optimitzar l’afinitat i entendre quins són els factors que controlen aquest procés de reconeixement. La quimioteca corresponent s’ha sintetizat, purificat i avaluat la seva interacció amb el domini de tetramerització de la p53 mitjançant espectroscòpia de fluorescència. A partir d’aquests estudis, s’ha comprovat que s’han pogut preparar quatre pèptids amb una afinitat fins a un ordre de magnitud superior i s’han pogut extreure idees de caràcter més general que poden ser útils per al disseny de lligands per a altres superfícies proteiques.