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CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais αKlotho é uma proteína de antisenescência celular, a qual está relacionada a ações antitumorais, regulando o crescimento, a proliferação e a invasividade em diversos tipos de tumores, incluindo o câncer de mama. O diagnóstico e prognóstico do câncer de mama são baseados em características intrínsecas do tumor, como a presença de receptores estrogênicos, especialmente o ERα. Por sua vez, o ERβ apesar de demonstrar ações antitumorais, permanece com papel incerto na carcinogênese da mama e seu uso clínico é limitado. O objetivo do estudo foi analisar a relação entre αKlotho e os receptores de estrogênio, bem como avaliar os níveis séricos desta proteína em pacientes com câncer de mama de acordo com características histopatológicas e imunohistoquímicas do tumor. As linhagens luminal e triplo-negativa de câncer de mama MCF-7 e MDA MB-231 foram cultivadas e expostas aos agonistas dos ER, E2 e DPN, para determinação da expressão de αKlotho, posteriormente foram realizados ensaios de proliferação e de avaliação da EMT nas células MCF-7 tratadas com os mesmos agonistas. Para os ensaios de αKlotho solúvel, amostras de soro de 75 pacientes com câncer de mama e 63 controles saudáveis foram randomizadas e os níveis séricos foram avaliados por ELISA sanduíche. Dados clínicos e diagnósticos foram obtidos dos prontuários e bases de dados do hospital. Nas células MCF-7 houve um aumento considerável na expressão de αKlotho após estímulo do ERβ com DPN (p

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Glicosilfosfatidilinositol (GPI) é um complexo glicolipídico que ancora diversas proteínas e glicoproteínas à membrana celular, considerada essencial para a interação de diversos protozoários com seus hospedeiros. Atribui-se a resistência a parasitos aos indivíduos com altos títulos de anticorpos anti-GPI. Assim, os objetivos deste estudo foram desenvolver anticorpos de fragmento variável de cadeia única (scFv) selecionados por Phage Display contra GPI de Plasmodium falciparum e avaliar a capacidade em diminuir a mortalidade de camundongos com malária cerebral, bem como neutralizar a invasão celular de parasitos protozoários intracelulares. O sucesso do objetivo primário também levou ao desenvolvimento de peptídeos ligantes ao scFv com maior afinidade ao GPI. A seleção de scFv ligante à GPI de P. falciparum foi realizada a partir de uma biblioteca de Phage Display contendo uma diversidade aproximada de 2x106 sequências combinatórias de scFv. A expressão e especificidade dos clones foram analisadas por ELISA. O DNA extraído do clone com maior reatividade foi submetido ao sequenciamento e posterior análise de bioinformática, com modelagem molecular para predizer a estrutura tridimensional, bem como as regiões determinantes de complementariedade (CDRs) e frameworks (FWRs). Camundongos C57BL/6 infectados com P. berghei- cepa ANKA foram tratados com o clone de scFv e análises de parasitemia e curva de mortalidade dos animais foram realizadas. Avaliou-se ainda a reatividade do scFv com extratos de P. falciparum, Toxoplasma gondii e Trypanosoma cruzi, bem como sua capacidade de impedir a invasão celular. Por fim, foi realizado um novo processo de biopanning por Phage Display para selecionar peptídeos miméticos à molécula GPI de P. falciparum. A reatividade dos clones de peptídeos fusionados aos fagos com o scFv selecionado foi avaliada por Phage-ELISA, e os clones mais reativos foram validados na presença de soro de camundongos com malária cerebral. Dentre os clones de scFv selecionados, oito (G1-G8) apresentaram sequência distintas, e expressaram scFv (G7) que se ligou com maior afinidade à GPI de P. falciparum. O clone G7 diminuiu a parasitemia dos animais e foi capaz de protegê-los dos sintomas de malária cerebral, impactando significativamente na sobrevivência. O clone G7 também apresenta alta afinidade por T. cruzi e T. gondii, além de não ser tóxico para a célula nem para o parasito. Após o tratamento in vitro houve menos internalização de parasitos quando comparado ao grupo controle. Quanto à seleção de peptídeos miméticos à GPI, 11 clones (F1, E1, F2, D2, C4, E4, D5, H5, A6, H6 e F7) apresentaram sequências distintas, sendo que quatro (F1, E1, F2 e A6) foram mais reativos ao G7, dos quais dois (E1 e F1) distinguem soro de camundongos com malária dos saudáveis. Em resumo, o scFv-G7 ligante de GPI de amplo espectro foi selecionado apresenta grande potencial como um promissor imunobiológico aplicado ao tratamento de doenças parasitárias, como malária, toxoplasmose e doença de Chagas. Adicionalmente, seus peptídeos ligantes, miméticos à GPI, também apresentam potencial teranóstico, podendo atuar no futuro próximo tanto no diagnóstico quanto como antígenos vacinais. Glycosylphosphatidylinositol (GPI) is a glycolipid complex that anchors several proteins and glycoproteins to the cell membrane, considered an essential molecule for the interaction of several protozoa with their hosts. Parasite resistance is attributed to individuals with high anti-GPI antibody titers. Thus, the objectives of this study were to develop antibodies of single-chain variable fragments (scFv) selected by Phage Display against GPI of Plasmodium falciparum and to evaluate their ability to decrease the mortality of mice with cerebral malaria, as well as to neutralize parasitic cell invasion of broad intracellular protozoa. The success of the primary goal also led us to the development of scFv-binding peptides with greater affinity for GPI. The selection of P. falciparum GPI-binding scFv was performed from a Phage Display library containing an approximate diversity of 2x106 scFv combinatorial sequences. The expression and specificity of clones were analyzed by ELISA. The DNA extracted from the highest reactivity clone was subjected to sequencing and subsequent analysis of bioinformatics, with molecular modeling to predict the three-dimensional structure, as well as the complementarity determining regions (CDRs) and frameworks (FWRs). C57BL / 6 mice infected with P. berghei-ANKA were treated with the scFv clone and analyzes of parasitemia and mortality curve of the animals were performed. The reactivity of scFv with extracts of P. falciparum, Toxoplasma gondii and Trypanosoma cruzi was also evaluated, as well as its ability to prevent cell invasion. Finally, a new biopanning process was performed by Phage Display to select mimetic peptides to the GPI molecule of P. falciparum. The reactivity of phage-fused peptide clones with the selected scFv was evaluated by Phage-Elisa, and the most reactive clones were validated in the presence of serum from mice with cerebral malaria. Among selected scFv clones, eight (G1-G8) presented different sequences, and the expressed scFv G7 had the highest affinity to the P. falciparum GPI. G7 decreased the parasitemia of the animals and was able to protect animals from symptoms of cerebral malaria, significantly impacting survival. The G7 clone also presented high affinity for T. cruzi and T. gondii extracts, besides not being toxic to cells or to the parasites. After in vitro treatment, we have observed a reduction of parasites internalization when compared to the control group. Regarding the selection of mimetic peptides to GPI, 11 clones (F1, E1, F2, D2, C4, E4, D5, H5, A6, H6 and F7) presented different sequences, four of which (F1, E1, F2 and A6) were more reactive to G7, of which two (E1 and F1) distinguished serum from mice with malaria from the healthy ones. In summary, the broad spectrum GPI scFv G7 antibody presents great potential as a promising immunobiological drug that may be applied to the treatment of parasitic diseases, such as malaria, toxoplasmosis and Chagas disease. In addition, its binding peptides, mimetic to GPI, may also have theranostic potential, by acting in the near future both in diagnosis and as vaccine antigens. Tese (Doutorado) 2022-07-29

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais Os patógenos membros do filo apicomplexa são uma grande ameaça para a saúde humana e animal no mundo. O Toxoplasma gondii é um dos protozoários pertencente a esse filo, capaz de infectar qualquer célula nucleada. Por ser um protozoário intracelular obrigatório, a entrada na célula hospedeira é um processo fundamental para a sua sobrevivência. A invasão é um processo ativo durante a qual o parasito recruta parte da membrana da célula hospedeira para formar o vacúolo parasitóforo (VP). Apesar da importância da VP em proteger o parasito da eliminação pelas células hospedeiras, a membrana do vacúolo parasitóforo (MVP) forma uma barreira que priva o parasito de uma vasta fonte de nutrientes do sistema endocítico e exocítico do hospedeiro. Para contornar esse problema, o parasito secreta proteínas que se associam a MVP, alterando a sua permeabilidade, possibilitando assim a difusão passiva, bidirecional, de moléculas pequenas, através de poros na membrana do VP. Por outro lado, as células hospedeiras são capazes de reconhecer moléculas parasitárias em contato com suas membranas ou que são lançadas para dentro de seu citoplasma, induzindo a ativação de mecanismos cruciais para a sua resistência frente a infecção. Até o momento, as bases moleculares da formação do poro hipotético ainda não foram relatadas, bem como há pouco conhecimento sobre as moléculas do parasito que são agonistas de receptores inatos, sendo estes os objetivos centrais de investigação deste trabalho. Em uma primeira abordagem, GRA17 foi identificada como uma proteína secretada para a MVP que medeia o transporte de pequenas moléculas através da MVP, sendo que sua deleção induz lenta proliferação parasitária e queda abrupta de virulência em camundongos. Apesar da predição de múltiplas estruturas alfa (α)-hélice na composição de GRA17, esses ainda não foram funcionalmente caracterizados. No primeiro capítulo deste trabalho, predizemos oito domínios α-hélices para GRA17, que foram individualmente truncados utilizando o sistema Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR/ CRISPR associated protein 9-CAS9 (CRISPR/CAS9), com o intuito de se caracterizar funcionalmente esses domínios. Por meio desta abordagem, demonstramos que, com exceção do motivo α-8, todos os demais são indispensáveis para ação, localização proteica e estabilidade do VP. O truncamento desses 7 motivos resulta em falhas na localização de GRA17 na MVP e surgimento de vacúolos parasitóforo aberrantes. Além disso, a deleção das 7 sequências α-hélices resulta em uma drástica diminuição na proliferação e sobrevivência do parasito, nos levando a conclusão de que as estruturas α-hélice de GRA17 são cruciais para função proteica e consequente viabilidade do parasito. Por outro lado, buscamos compreender os mecanismos de resistência do hospedeiro decorrentes da liberação de antígenos durante o processo de replicação. Com tal intenção, utilizamos modelo estabelecido em ratos da linhagem Lewis, que resulta na total eliminação do parasito. Estudos anteriores demonstraram que essa resistência é mediada pela ativação do receptor inato citoplasmático NLRP1, que resulta na rápida morte da célula hospedeira através da piroptose, limitando a replicação parasitária. Até o momento, não foram identificados os alvos antigênicos envolvidos na ativação de NLRP1. Para identificar os genes parasitários que induzem a ativação desta via, utilizamos um ensaio de mutagênese química que nos levou a identificar três proteínas secretadas de grânulos densos, TGGT1_226380 (GRA35), TGGT1_237015 e TGGT1_236870, que individualmente estão envolvidas na ativação de NLRP1 e indução de piroptose. A deleção dessas proteínas por CRISPR/CAS9 resulta na inibição da piroptose em macrófagos oriundos de rato Lewis. Uma busca mais detalhada dos clones gerados pelo ensaio de mutagênese revela que fatores adicionais podem estar envolvidos na indução de piroptose. Como a família da GRA35 é composta por três outros genes (TGGT1_225160, TGGT1_213067, TGGT1_257970), decidimos investigar o envolvimento dessas proteínas na indução de piroptose. A deleção desses genes em T. gondii não alteram a taxa de viabilidade de BMDMs de Lewis em comparação com a cepa WT, o que demonstra que, diferentemente da GRA35, essas proteínas não estão envolvidas na ativação do inflamassoma de NLRP1 e indução de piroptose. Em conclusão, demonstramos que as proteínas de grânulos densos são parte essencial dos mecanismos de sobrevivência dentro do vacúolo parasitóforo, controlando o transporte de moléculas através da membrana do VP, bem como são reconhecidas pelos sensores inatos do hospedeiro, iniciando a montagem de uma resposta de controle contra o protozoário, mediada pela ativação do inflamassoma e indução de piroptose. Apicomplexan pathogens are the greatest threats to human and animal health in the world. Toxoplasma gondii is one of the protozoa belonging to this phylum, capable of infecting any nucleated cell. As an obligate intracellular protozoan, entry into the host cell is a crucial event to its survival. The host cell invasion is an active process in which the parasite recruits part of the host cell membrane to form the parasitophorous vacuole (PV). Whereas the PV helps protect the parasite from host cell elimination, the PV membrane (PVM), forms a physical barrier which deprives parasites of an abundant source of nutrients from the host’s endocytic and exocytic system. To overcome this problem the parasite secretes proteins that associate with the PVM, modulating its permeability allowing bidirectional diffusion of small molecules, probably through pores in the PVM. On the other hand, the host cells are able to recognize parasitic molecules in contact with their membranes or that are released into their cytoplasm, inducing the activation of crucial mechanisms for their resistance to infection. However, so far, the molecular basis of this hypothetical pore has not been reported, as well as there is little knowledge about the parasite agonists of innate receptors, being these the central goals of investigation in this work. In a first approach, GRA17 was identified as a protein secreted to the PVM that mediates passive transport of small molecules across the PVM, and its deletion induces slow parasitic proliferation and abrupt decline in virulence. Besides strongly predicted α-helices in the GRA17 composition, these were not functionally characterized. In the first chapter, we predict eight α-helix domains in the secondary structure of GRA17, which were individually truncated using the system Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR/ CRISPR associated protein 9-CAS9 (CRISPR/CAS9), in order to functionally characterize them. Through this approach, we show that with the exception of α-8, all the others predicted α-helices are required for GRA17 normal function, localization and PV stability. The truncation of these 7 motifs results in GRA17 mislocalization on the PVM and an aberrant PV morphology. Furthermore, GRA17 truncated parasites proliferate slowly and shows a decrease viability, leading us to the conclusion that the 7 α-helix structures of GRA17 are crucial for protein function and consequent viability of the parasite. Furthermore, we sought to understand the mechanisms of host resistance, arising from the antigens release during the replication process. We use Lewis rats that was identified to be completely resistant to Toxoplasma infection. Previous findings have established that this resistance is mediated by the activation of the cytosolic sensor NLRP1, which results in the rapid host cell death through piroptose, limiting parasitic replication. However, the targets involved in NLRP1 activation were not identified. To identify the parasite genes involved in the activation of this pathway, we used a chemical mutagenesis screen, which led us to identify three proteins secreted from dense granules, TGGT1_226380 (GRA35), TGGT1_237015 e TGGT1_236870, which are individually involved in NLRP1 inflammasome activation and pyroptosis induction. Deletion of these proteins (by CRISPR/CAS9) results in significantly less pyroptosis in Lewis macrophages. A more detailed search of the clones generated by the mutagenesis assay reveals that additional factors may be involved in the induction of pyroptosis. As GRA35 family is composed by three other genes (TGGT1_225160, TGGT1_213067, TGGT1_257970) we decided to test the involvement of these proteins in pyroptosis induction. Deletion of these genes in T. gondii does not alter the viability of Lewis BMDMs compared to WT strain, which shows that, unlike GRA35, these proteins are not involved in the activation of NLRP1 inflammasome and induction of pyroptoisis. In conclusion, we demonstrate that dense granule proteins are an essential part for the parasite survival within the parasitophorous vacuole, controlling the transport of molecules through the PV membrane, as well as for being recognized by the host innate sensors, initiating a response that control the protozoan, through inflammasome activation and pyroptoisis induction. Tese (Doutorado)

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O câncer é compreendido como um conjunto de doenças com características semelhantes, mas com grande heterogeneidade que ocorre de maneira aleatória e abrange tanto as células tumorais quanto células inflamatórias e imunitárias. Os tumores gástricos, no Brasil e notavelmente no Estado do Pará, apresentam alta incidência. Em geral o câncer gástrico apresenta etiologia multifatorial. A comunicação e sinalização celular que regulam o sistema imunológico são facilitados pelas interleucinas que representam pequenas e específicas proteínas, apresentam funções diversificadas, estas controlam genes, regulam fatores de transição, governam a inflamação, diferenciação, proliferação e secreção de anticorpos. Polimorfismo de um único nucleotídeo, em particular a do gene da interleucina pró-inflamatória IL-1B, estão associado a resposta imunológica a infecção por H. pylori. Com isso, variações dentro dos genes das família da IL-1 foram associados com a suscetibilidade para o desenvolvimento de câncer gástrico. Neste estudo do tipo caso-controle, foram investigados se os polimorfismos IL-1BF1 (rs16944) e IL-1BE1 (rs1143627) têm associação com o risco ao desenvolvimento de câncer gástrico em uma população do norte do Brasil; comparados com seus respectivos genótipos, haplótipos, controlados pela ancestralidade genética. Os SNPs foram genotipados, por meio de sondas marcadas com fluoróforo VIC/FAM (real Time PDR, Life Technologies, CA, USA). As análises bioestatísticas evidenciaram que para as variáveis demográficas, houve diferenças significantes entre os grupos de ancestralidades europeia e africana. Para a distribuição das frequências genotípicas, alélicas e dos haplótipos do gene da IL-1B não houve diferenças estatisticamente significante entre os grupos. Necessita-se de estudos e análises mais abrangentes, para auxiliar o melhor entendimento dos motivos pelos quais nesta população estudada, tais poliforfismos parecem não ter associação com o desenvolvimento da doença em questão. Cancer is understood as a set of diseases with similar characteristics, but with great heterogeneity that occurs in a random manner and covers both tumor and inflammatory and immune cells. Gastric tumors, in Brazil and notably in the State of Pará, have a high incidence. In general, gastric cancer has a multifactorial etiology. Communication and cellular signaling that regulate the immune system are facilitated by interleukins that represent small, specific proteins, have diverse functions, they regulate transcription factors, role genes, inflammation, differentiation, proliferation, and secretion of antibodies. Single polymorphism nucleotide, in specific IL-1B proinflammatory interleukin gene, is associated with the immune response to H. pylori infection. Thefore variations within the IL-1 family genes were associated with susceptibility to the development of gastric cancer. In this case-control study, we investigated whether the polymorphisms IL-1BF1 (rs16944) and IL-1BE1 (rs1143627) are associated with the risk of developing gastric cancer in a population from the north of Brazil; Compared to their respective genotypes, defined haplotypes and these related to ancestry and their rates. SNPs were genotyped by VIC / FAM (Real Time PCR, Fluorescent, Life Technologies, CA, USA) labeled probes. The biostatistical analyzes showed that for the demographic variables, there were significant differences between the groups in European and African ancestry. The distribution of the genotypic, allelic and haplotype frequencies of the IL-1B gene was not statistically significant between the groups. More comprehensive studies and analyzes are needed to help understand better why these polymorphisms in this population do not appear to be associated with the development of the disease in question.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico IEC - Instituto Evandro Chagas A dengue é a arbovirose mais prevalente no mundo, causada pelo vírus dengue (DENV) está presente em todos continentes. Por mais de três décadas tem sido um constante problema de saúde pública frequentemente fatal nos casos de dengue hemorrágica (DHF). A patogenia da dengue é intimamente relacionada à resposta imune do hospedeiro, atingindo quadros de inflamação exacerbada e autoimunidade transitória onde todos tecidos são atingidos, sendo o fígado um dos mais importantes no contexto de evolução dos quadros graves devido a intensa replicação viral nesse órgão e sua função significativa no metabolismo. O estudo de microRNAs (miRNA) como elementos regulatórios do metabolismo e da resposta imune durante a infecção é crucial para o entendimento dos mecanismos de regulação da expressão gênica durante a infecção pelo DENV, e pode auxiliar no desenvolvimento de métodos diagnósticos e terapias anti-virais. Utilizamos a abordagem de miRA-Seq, utilizando a plataforma MySeq (Illumina) para identificar o perfil de miRNAs expressos no tecido hepático parafinizado de dez casos de óbito por DHF, comparando com cinco amostras de tecido sem infecção por DENV. Oito miRNAs apresentaram expressão diferencial no fígado de pacientes com DHF, sendo o miR-126-5p (molécula de regulação da proliferação de células endoteliais), e miR-133a-3p, regulados positivamente na DHF e miR-122-5p (um miRNA hepatoespecífico), miR-146a-5p (regulador de Interferon), miR-10b-5p, miR-204-5p, miR-148a-5p, e miR-423-5p regulados negativamente. A análise funcional de vias KEGG e GO, a partir dos genes alvo preditos dos miRNAs superexpressos, identificou a maioria de vias de regulação daapoptose e da resposta imune com envolvimento de genes MAPK, RAS, CDK e FAS e da resposta imune com destaque para NF-kB, famílias CC e CX, Il e TLR. A mesma análise dos genes alvo dos miRNAs sub-expressos também identificou na maioria vias de apoptose e biossintéticas. No nosso conhecimento, essa é a primeira descrição in vivo do perfil de miRNAs no tecido hepático de pacientes com DHF. Os resultados em conjunto mostram uma provável relação dos miRNAs: miR-126-5p, miR-122-5p e miR-146a-5p com a patogenia do DENV no fígado no quadro de DHF através da regulação do reparo endotelial e permeabilidade vascular, controle da homeostase do fígado e regulação da expressão de citocinas inflamatórias. Dengue is the most prevalent arbovirosis in the world caused by Dengue virus (DENV) and is present in all continents, for more than three decades has been a constant public health concern and often fatal by dengue hemorrhagic fever (DHF). The pathogenesis of dengue is closely related to the host immune response, reaching exacerbated inflammation and transient autoimmunity. All tissues are affected, which liver is one of the most important in severe conditions, due its intense viral replication and its significant role in metabolism. The study of microRNAs (miRNA) as regulatory elements of metabolism and immune response during infection is crucial to understanding the regulatory mechanisms of gene expression on DENV infection, and can help in diagnostic development of anti-viral therapies. We sequenced the miRNoma in MySeq platform (Illumina) to identify the miRNAs profile expressed in FFPE liver tissue, ten DHF fatal cases were compared to five control cases. Eight miRNAs exhibited differential expression in DHF liver, miR-126-5p, a regulatory molecule of endothelial cells, and miR-133a-3p are upregulated in dengue and miR-122-5p, a liver-specific miRNA, miR- 146a-5p, interferon regulator, miR-10b-5p, miR-204-5p, miR-148a-5p and miR-423-5p were downregulated. Functional analysis of KEGG pathways and GO terms with predicted target genes of overexpressed miRNAs found regulatory pathways of apoptosis and immune response, involving MAPK gene, RAS, CDK and FAS; immune response pathways showed NF- kB, CC and CX families, IL and TLR. The same analysis with target genes of downregulated miRNAs also identified in most pathways of apoptosis and biosynthetic pathways of metabolism. In our knowledge, this is the first description of the liver miRNA profile in DHF, the results together show a feasible relationship of miR-126-5p, miR-122-5p and miR-146a-5p with liver pathogenesis of DHF, through endothelial repair and vascular permeability regulation, control of homeostasis and liver expression regulation of inflammatory cytokines.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais As plantas do gênero Lippia pertencem à família Verbenaceae e caracterizam-se por possuir diversas espécies com propriedades medicinais. Dentre os aspectos químicos e farmacológicos investigados em Lippia, destacam-se aqueles relacionados aos seus óleos essenciais. Os óleos essenciais pertencem ao metabolismo secundário, são misturas complexas de substâncias voláteis e lipofílicas. O objetivo deste estudo foi investigar efeitos citogenotóxicos de óleos essenciais extraídos de Lippia alba (acesso BGEN 09) e Lippia origanoides (acessos oro, ors e orv). Allium cepa (cebola) foi utilizado como modelo de avaliação de citogenotoxidade. As raízes de cebola foram expostas por 24 horas em diferentes concentrações de óleo essencial (diluído em 2,5% de acetona) (50, 100, 200, 300 e 400μg/mL). Como controle negativo foi utilizado água destilada e acetona 2,5%. E como controle positivo o Metil Metano Sulfonato (4x10-4M). Para ao preparo das lâminas a técnica utilizada foi o esmagamento. Parâmetros de ciclo celular e indução de alterações cromossômicas foram avaliados. Os óleos obtidos foram analisados por Cromatografia com fase gasosa acoplada com espectrometria de Massa (CG-EM). Os constituintes majoritários dos óleos essenciais foram: citral, trans-hidrato sabineno, 1,8-cineol e carvacrol para Lippia alba, L. origanoides, acessos oro, ors e orv respectivamente. De um modo geral, todos os óleos investigados interferiram na dinâmica normal do ciclo celular (interferência sobre índices mitóticos ou índices de fases). Estes efeitos foram mais evidentes para o óleo extraído de L. alba. Do mesmo modo, a exposição aos óleos essenciais evidenciou o aumento nos percentuais de algumas alterações cromossômicas, como cromossomos aderentes, perda de cromossomos, pontes cromossômicas e segregação tardia. Dentre os resultados observados, o envolvimento de alterações aneugênicas parece ser o efeito mais evidente. Possíveis relações entre as substâncias encontrados nos óleos destas espécies com as alterações observadas são discutidas. Este estudo sugere, portanto, o uso racional de plantas da espécie de Lippia para fins terapêuticos e mostra a necessidade de mais estudos sobre seu potencial citogenotóxico. Many species of the genus Lippia (Verbenaceae family) characterized by their medicinal properties. Among the chemical and pharmacological aspects investigated in Lippia, those related to its essential oils stand out. Essential oils are produced by secondary metabolism and are complex mixtures of volatile and lipophilic substances. The aim of this study was to investigate the cytogenotoxic effects of essential oils from Lippia alba (BGEN 09 acess) and Lippia origanoides ( oro, ors and orv access). Allium cepa (onion) was used as a model for cytogenotoxicity evaluating. The onion roots were exposed for 24 hours at different concentrations of essential oil (diluted in 2.5% acetone) (50, 100, 200 , 300 and 400μg/mL). As a negative control was used distilled water and 2.5% acetone. And as the positive control Methyl methane sulfonate ( 4x10- 4M ). The slides were prepared by squashing. Parameters of cell cycle and induction of chromosomal alterations were evaluated. The oils were analyzed by Gas Chromatography - Mass Spectrometry (GC -MS). The major constituents of the essential oils were citral, trans - sabinene hydrate , 1,8- cineole and carvacrol for Lippia alba , L. origanoides (oro, ors and orv accesses) respectively. In general , all oils investigated interfered in the normal dynamics of the cell cycle (interference on mitotic index or phases indices). These effects were most evident for the oil extracted from L. alba. Similarly, exposure to the essential oils showed some increase in the percentage of chromosomal alterations, as adherent chromosomes, loss of chromosomes, later segregation and bridges. Among the observed results, the involvement of aneugenic changes seems to be the most obvious effect. Possible relationships between the compounds found in oils of these species with the changes observed are discussed. This study therefore suggests the rational use of plants of the species Lippia for therapeutic purposes and shows the need for more studies on its cytogenotoxic potential.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-05T18:08:01Z No. of bitstreams: 1 TESE_FINAL_PUBLICADA_Gutavo_Milson_Fabricio_da_Silva.pdf: 1606112 bytes, checksum: 53e5a0450f29b167c24f1e8832bc10c2 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-05T18:08:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE_FINAL_PUBLICADA_Gutavo_Milson_Fabricio_da_Silva.pdf: 1606112 bytes, checksum: 53e5a0450f29b167c24f1e8832bc10c2 (MD5) Previous issue date: 2013-06-03 Hepatitis C virus infection is one of the most common blood-borne infections worldwide. Approximately, 20% of infected patients successfully eliminate the virus, whereas the majority of patients develop chronic infection with a wide spectrum of liver lesions, ranging from a minimal inflammation to cirrhosis. The host's immune response is an important correlate of HCV infection outcome and disease progression. The aim of this study was to explore the possibility of the inheritance of cytokine gene polymorphisms as a candidate for susceptibility to persistent HCV infection or HCV clearance in a sample of Rio de Janeiro (Brazil) population. Genetic polymorphisms in the cytokines TNFA (-308), TGFB1 (codon 10 and 25), IL10 (-1082, -592), IL6 (-174) and IFNG (+874) were analyzed by polymerase chain reaction-sequence-specific primer (SSP) in 245 chronic hepatitis C (HCC) patients, 41 spontaneous recovery (SR) patients and 189 healthy volunteers. Further, IL28B (rs12979860, rs12980275 and rs8099917) were assessed by real-time PCR in all groups. Liver fibrosis and inflammation staging, response to treatment and virus genotype were also tested to influence in HCV chronic infection. IL28B rs12989760 CC and rs12980275 AA genotypes were significantly associated with spontaneous recovery of HCV infection and response to therapy. Likewise, C allele (rs12979860) and A allele (rs12980275) were also more frequent in SR group, while C allele of IL6 (-174) is associated with persistence to HCC. No association was found between other cytokine gene polymorphism and susceptibility to HCV infection and response to treatment. Multivariate analysis showed male, IL28B rs12979860 CT and TT and TGFB1 (codon 10) TC genotypes to be factors associated with HCC. TNFA (-308) GG genotype seems to be associated with moderate stage of inflammation. Also, ethnicity according self-declared is supposed to influence the distribution IL6 (-174) and IL28B rs12979860 and rs8099917 polymorphisms. These results suggest that the IL28B polymorphisms are associated with spontaneous clearance of HCV and response to therapy in a Brazilian population. Moreover, these results could be useful to further association between cytokine polymorphism and HCV infection outcome in Brazilian admixture population. A infecção pelo vírus da hepatite C (VHC) é uma das mais comuns infecções ao redor do mundo. Aproximadamente, 20% dos pacientes infectados eliminam espontaneamente o vírus, porém a maioria dos indivíduos infectados desenvolve infecção crônica com amplo espectro de lesões hepáticas, desde inflamação leve até cirrose. A resposta imune do hospedeiro exerce grande influência sobre o desfecho da infecção pelo VHC. O objetivo deste trabalho foi analisar a influência dos polimorfismos genéticos de citocinas na susceptibilidade ou persistência da infecção por VHC e no clareamento espontâneo em uma amostra de pacientes da população do Rio de Janeiro (Brasil). Os polimorfismos genéticos das citocinas TNFA (-308), TGFB1 (codon 10 e 25), IL10 (-1082, -592), IL6 (-174) e IFNG (+874) foram analisados por PCR-SSP em 245 pacientes com hepatite C crônica (HCC), 41 pacientes que alcançaram o clareamento viral espontâneo e 189 indivíduos controle saudáveis. Além disso, os polimorfismos próximos ao gene da citocina IL28B (rs12979860, rs12980275 e rs8099917) foram analisados por PCR em tempo real em todos os grupos. O grau de fibrose e inflamação, a resposta ao tratamento e o genótipo do vírus também foram levados em consideração quanto ao desfecho da HCC Os genótipos IL28B rs12979860 CC e CT e rs12980275 AA e AG foram significativamente associados ao clareamento espontâneo e à resposta à terapia anti-viral. Da mesma forma, o alelo C (rs12979860) e o alelo A (rs12980275) foram significativamente maior no grupo Clareamento. O alelo C de IL6 (-174) foi associado com o Clareamento. Nenhuma associação entre as demais citocinas e o desfecho da HCC foi encontrada. O Genótipo TNFA (-308) GG parece estar associado com menor grau de inflamação. Além disso, a etnia auto declarada influencia a distribuição dos polimorfismos em IL6 (-174) e IL28B rs12979860 e rs8099917. Nossas observações indicam que os polimorfismos próximos ao gene da IL28B estão associados com o clareamento viral e resposta ao tratamento na população do Rio de Janeiro. Além disso, nossos resultados podem ser úteis para futuras investigações entre os polimorfismos de citocinas e a infecção por VHC numa população heterogênea como a Brasileira.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-05T18:07:51Z No. of bitstreams: 1 Tese Magda final biblioteca.pdf: 2208603 bytes, checksum: aaf44977fa27c4b8cbc5bb553622edb0 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-05T18:07:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Magda final biblioteca.pdf: 2208603 bytes, checksum: aaf44977fa27c4b8cbc5bb553622edb0 (MD5) Previous issue date: 2013-03-27 It is estimated that the overall prevalence of the average world population with hepatitis C is 3%. Little is known about the treatment response with respect to viral resistance. Some mutations in the 109-aminoacid fragment of NS5B are associated to Interferon (IFN) and Ribavirin (RBV) resistance. Molecular and clinical studies have identified factors associated with the host and related viruses associated with response to treatment, as the gene encoding IL-28B. This study was divided into two phases whose objectives were to characterize the frequency of mutations conferring resistance to HCV viral evaluating the relevance of these in Responders (R) or Non-Responders (NR) patients to treatment and to characterize genetically the populations regarding genetic polymorphisms SNPs IL-28B in relation to prognosis of response to treatment for HCV. Patient samples were subjected to tests for genotyping and viral load. The sequences generated were compared in the BLAST and the Los Alamos database HCV. We conducted the alignment of homologous sequences and mutations identified. Based on virological parameters genotype and viral load determined the classification of patients according to response to therapy. Genomic DNA was isolated from peripheral blood for carrying out the typing of SNPs of IL-28B. The methodology used was real-time PCR using TaqMan probes specific SNPs. Data analysis was performed using GraphPad Prism with chi-square, relative risk (RR), Odds Ratio (OR) and confidence interval of 95% with a significance level of P

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_neida_lucia_conrad.pdf: 1248896 bytes, checksum: effbf3a6777d64f323ea5206861ef2dd (MD5) Previous issue date: 2013-03-12 The infectious bronchitis (IB) is an acute and highly contagious disease caused by a coronavirus that infects mainly cells of the respiratory and genitourinary of chicken. The economic importance of this disease results from decreased production, such as internal and external quality of eggs, reduced hatchability, feed efficiency and weight gain, increased mortality, condemnation of carcasses at slaughter, and also with drugs spending to suppress secondary bacterial infections. The diagnosis of IB is based on virus isolation, together with serology. The use of monoclonal antibodies (MAbs) has been collaborated to diagnosis of this type of disease, but their use are still limited because the MAbs used are imported, increasing the cost of such methodologies. This work reports the production, characterization and application of MAbs against the virus of infectious bronchitis (IBV). For the production of MAbs, Balb/c mice were immunized intraperitoneally with classic IBV (M41) or variant IBV. We generated two hybridomas secreting MAbs anti-IBV (IgM isotype) from the fusion of B-lymphocytes from a mouse immunized with the variant IBV and myeloma cells. Following the characterization by ELISA and Western blot, it was observed that MAbs recognize the IBV classic and variant, showing more intense reactions with IBV variant. The AcM 2 G4 seems to be specific for protein S1. The applicability of the MAbs was assessed using the immunohistochemistry technique on histological tissues of birds inoculated experimentally with classic IBV. These MAbs anti-IBV had the same pattern of label of the MAb used as positive control, labeling predominantly inflammatory cells. This result can be explained by the fact that in severe cases of infection with IBV, the antigen may be located also in inflammatory cells. It was concluded that the MAbs obtained have potential for use in immunodiagnostic for IB. A bronquite infecciosa das galinhas (BI) é uma doença aguda, altamente contagiosa, causada por um Coronavírus que infecta principalmente células dos aparelhos respiratório e genito-urinário das galinhas. A importância econômica dessa doença decorre da diminuição na produção e qualidade interna e externa dos ovos, da redução da eclodibilidade, da diminuição da eficiência alimentar e do ganho de peso e do aumento da mortalidade e da condenação de carcaças ao abate, além dos gastos com medicamentos para debelar infecções bacterianas secundárias. A confirmação do diagnóstico de BI é baseada no isolamento viral, em conjunto com a sorologia. O uso de anticorpos monoclonais (AcMs) tem colaborado e facilitado o diagnóstico desse tipo de enfermidade, porém seu uso ainda é limitado, pois os AcMs utilizados são importados, elevando o custo de tais metodologias. Este trabalho relata a produção, caracterização e aplicação de AcMs contra o vírus da bronquite infecciosa das galinhas (VBI). Para a produção dos AcMs, camundongos Balb/c foram imunizados intraperitonealmente com o VBI clássico (M41) local ou com o variante. Foram gerados dois hibridomas secretores de AcMs anti-VBI do isotipo IgM a partir da fusão entre os linfócitos B de um camundongo imunizado com o VBI variante e células de mieloma. Foi observado, na caracterização por ELISA indireto e Western blot, que os AcMs reconhecem o VBI clássico e variante, sendo as reações com o VBI variante mais intensas. O AcM 2G4 parece ser específico para a proteína S1. A aplicabilidade dos AcMs foi avaliada através da técnica de imuno-histoquímica em tecidos de aves inoculadas experimentalmente com o VBI clássico. Os AcMs anti-VBI apresentaram o mesmo padrão de marcação que o AcM utilizado como controle positivo, ou seja, marcaram predominantemente células inflamatórias. Este resultado pode ser explicado pelo fato de que, em casos mais severos da infecção por VBI, o antígeno pode ser localizado também em células inflamatórias. Concluiu-se que os AcMs obtidos apresentam potencial para uso no imunodiagnóstico para BI.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_juliano_lacava_pereira.pdf: 1194037 bytes, checksum: 9990bc185909cc08288cd6230c0a9be6 (MD5) Previous issue date: 2011-07-18 Several recombinant proteins have been studied as immunocontraception agents in mammals, among them the Gonadotropin-releasing hormone (GnRH). Nevertheless, due to its low molecular weight, GnRH needs to be conjugated with a carrier protein. Among the eukaryotic platforms the yeast Pichia pastoris, which are able of promoting post-translational modifications to expressed recombinant protein. The aim of this study was to clone and express the GnRH/LTB chimera in P. pastoris, and to test it as an immunocontraceptive. In order to accomplish this, sequences of P. pastoris codons usage were synthesized and cloned into the plasmid pPICZαB. The plasmid containing the sequence were propagated and transformed into yeast by electroporation. The transformed colonies were selected by resistance to antibiotics and confirmed by Colony Blotting. The selected clone was cultivated, induced and the protein expressed in supernatant. The protein was concentrated and used as a vaccine antigen. BALB/c males mice were vaccinated twice 15 apart with 100µg de LTB/GnRH adjuvanted with aluminum hydroxide. The immune response was evaluated by ELISA, showing seraconversion in vaccinated animals. The sperm concentration in the control group was 16.93 x 107 and 8.00 x 107 sperm/mL in the immunized group. Vaccination caused a reduction of spermatogenesis (p < 0,05), vacuolization and disorganization of the seminiferous tubules. We concluded that the yeast was able to express the recombinant protein LTB/GnRH, and it demonstrated immunocontraceptive potential in mice. Diversas proteínas recombinantes estão sendo pesquisadas para utilização na imunocontracepção de mamíferos. Entre elas, o hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH), entretanto devido ao seu baixo peso molecular há necessidade de associá-lo a uma molécula carreadora. Dentre as plataformas eucarióticas, encontra-se a levedura Pichia pastoris que tem possibilitado expressão e modificações pós-traducionais das proteínas recombinantes. O objetivo deste trabalho foi clonar e expressar a quimera LTB/GnRH em P. pastoris, visando sua utilização como imunocontraceptivo. Para tanto, sequências com os códons preferenciais de P. pastoris da proteína foram sintetizadas e clonada no plasmídeo pPICZαB. O plasmídeo foi propagado e transformado na levedura por eletroporação. As colônias transformadas foram selecionadas por resistência antibiótica e confirmadas por Colony Blotting. O clone selecionado foi cultivado e após indução expressou a proteína no sobrenadante. A proteína foi concentrada e utilizada como antígeno vacinal. Camundongos BALB/c machos foram vacinados com duas doses de 100µg de LTB/GnRH adsorvidas em hidróxido de alumínio com intervalo de 15 dias. A resposta imune foi avaliada por ELISA, mostrando soroconversão nos animais imunizados. A concentração espermática no grupo controle foi 16,93 x 107 e no grupo imunizado 8,00 x 107 espermatozóides/mL. A imunização induziu a redução da espermatogênese (p < 0,05), vacuolização nos túbulos seminíferos e desorganização testicular. Concluiu-se que a levedura foi capaz de expressar a proteína LTB/GnRH recombinante e a mesma apresentou potencial imunocontraceptivo em camundongos.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_vanessa_galli.pdf: 1411317 bytes, checksum: f2cb4b3ef71fd9550e04ca13f65ab510 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 Mycoplasma hyopneumoniae is the causative agent of Porcine Enzootic Pneumonia (PEP), one of the most common respiratory diseases in swine industry worldwide. Commercially available vaccines are inactivated whole-cell preparations (bacterin), which provide only partial protection and do not prevent microorganism colonization. In this context, it is necessary to search new alternatives prophylaxis. Potential antigens are being tested in different vaccination strategies; however none was more efficient than commercial bacterins for PEP control. This work aimed the production and evaluation of antigenicity and immunogenicity of M. hyopneumoniae antigens delivered as naked DNA and/or recombinant subunit vaccines, aiming the development of a vaccine against PEP. Recombinant subunit vaccines were obtained by the expression of eleven M. hyopneumoniae recombinant proteins in E. coli and purification by affinity chromatography, whereas the DNA vaccines were obtained by cloning four M. hyopneumoniae genes in pcDNA3 vector. Recombinant proteins antigenicity was verified against convalescent pig serum. The humoral and cellular immune response elicited by these vaccines was evaluated in mice immunized intramuscularly. All recombinant proteins evaluated were recognized by convalescent pig serum, in ELISA and/or Western blot assay, especially MHP0418, indicating that they are expressed during disease. These recombinant proteins, as well as P37, P42, P46 and P95 showed immunogenic capacity, eliciting both Th1 and Th2 immune response. The P37, P42, P46 and P95, and the DNA vaccine pcDNa3/P46 were also able to elicit INFγ expression, the cytokine associated with cellular immune response, and decrease TNFα and IL1 expression, both associated with pig lesions, during M. hyopneumoniae infeccion, suggesting their potencial as candidate vaccines. The immunization strategy using proteins combinated potencialized the immune response, and the MHP0443 and MHP0372 proteins were the main responsable for the Mix1 and Mix2 immunogenicity, respectivally. Moreover, MHP0107, MHP0418 and MHP0372 elicited antibodies that react against proteins from M. hyopneumoniae strains 7448, 4722 and J, and did not show cross reaction with M. hyohinis and M. flocculare. Thus, these proteins could be used in imunodiagnosis assay. Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da Pneumonia Enzoótica Suína (PES), uma das doenças respiratórias de maior incidência na criação de suínos no mundo. As vacinas disponíveis comercialmente consistem de células inteiras inativadas (bacterina), as quais proporcionam apenas uma proteção parcial e não previnem a colonização pelo microrganismo. Neste contexto, faz-se necessária a busca de novas alternativas para a profilaxia da PES. Alguns antígenos vêm sendo testados em diferentes sistemas de vacinação, porém nenhum deles foi mais eficiente que as bacterinas comerciais no controle da PES. Este trabalho teve como objetivo a produção e avaliação da antigenicidade e imunogenicidade de antígenos de M. hyopneumoniae administrados como vacinas de DNA e/ou subunidade recombinante, visando o desenvolvimento de uma vacina contra a PES. As vacinas de subunidade recombinante foram obtidas através da expressão de onze proteínas recombinantes de M. hyopneumoniae em E. coli e purificação por cromatografia de afinidade, enquanto que as vacinas de DNA foram obtidas pela clonagem de quatro genes de M. hyopneumoniae no vetor pcDNA3. A antigenicidade das proteínas recombinantes foi verificada confrontando-as com soro de suínos convalescentes. A imunidade humoral e celular destas vacinas foi avaliada em camundongos imunizados intramuscularmente. Todas as proteínas recombinantes avaliadas foram reconhecidas pelo soro de animais convalescentes, em ensaios de ELISA e/ou Western blot, em especial a proteína MHP0418, indicando serem expressas durante o processo infeccioso. Estas proteínas recombinantes, bem como P37, P42, P46 e P95 apresentaram capacidade imunogênica, induzindo ambas as respostas imune Th1 e Th2. As proteínas P37, P42, P46 e P95, e a vacina de DNA pcDNa3/P46 também foram capazes de induzir a expressão de INFγ, citocina associada a resposta imune celular e reduzir a expressão de TNFα e IL1, relacionadas com as lesões em suínos, durante infecção por M. hyopneumoniae, sugerindo o potencial destas como candidatas vacinais. A estratégia de imunização utilizando proteínas combinadas potencializou a resposta imune, sendo que as proteínas MHP0443 e MHP0372 foram as principais responsáveis pela imunogenicidade induzida pelos Mix1 e Mix2, respectivamente. Além disso, MHP0107, MHP0418 e MHP0372 induziram anticorpos que reagiram especifiamente contra proteínas das cepas 7448, 4722 e J de M. hyopneumoniae, não apresentando reação cruzada com M. hyohinis e M. flocculare, podendo, portanto, serem utilizadas em ensaios de imunodiagnóstico.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_lorena_leonardo_souza.pdf: 798251 bytes, checksum: b0213429356f32517eb7b25ac76b2eeb (MD5) Previous issue date: 2009-12-17 The rabies virus has two major antigens: the nucleoprotein, a conserved internal protein antigenically and genetically and glycoprotein, a protein responsible for the external adsorption of virus two the host cell and induction of neutralizing antibodies. The development of recombinant DNA technology has opened a new perspective on the control of rabies, since recombinant vaccines have residual pathogenicity and are produced with the antigenic proteins of the virus, without their presence. Furthermore, recombinant proteins can be expressed in order to be used in diagnosis. The objective of this study was to review the literature about rabies, cloning and express the nucleoprotein and glycoprotein of rabies virus using the system Pichia pastoris and evaluate the antigenicity and the immunogenicity of these proteins by Dot blotting, SDS page, Western blotting and ELISA. Glycoprotein synthetic antigen proved to be recognized by anti-rabies from animals experimentally infected with rabies virus strain CVS. And recombinant nucleoprotein expression was confirmed by the techniques of Dot blotting and Western blotting to be recognized by monoclonal anti-histidine. Thus, we conclude that the cloning and expression of synthetic glycoprotein and cloinig and expression nucleoprotein rabies virus by the yeast P. pastoris has been effective, which makes these products an alternative for the production of immunobiological. O vírus da raiva apresenta dois antígenos principais: a nucleoproteína, uma proteína interna conservada antigênica e geneticamente e a glicoproteína, uma proteína externa responsável pela adsorção do vírus à célula hospedeira e pela indução da produção de anticorpos neutralizantes. O desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante iniciou uma nova perspectiva no controle da Raiva, já que vacinas recombinantes não têm patogenicidade residual e são produzidas com as proteínas antigênicas do vírus, sem sua presença. Além disso, as proteínas recombinantes podem ser expressas com a finalidade de serem usadas em diagnóstico. O objetivo deste trabalho foi clonar e expressar a glicoproteína e a nucleoproteína do vírus da raiva utilizando o sistema Pichia pastoris e avaliar a antigenicidade e imunogenicidade destas proteínas através do Dot blotting, SDS page, Western blotting, inibição da imunofluorescência e ELISA. A glicoproteína demonstrou ser antigênica ao ser reconhecida por anticorpos anti-rábicos provenientes de animais experimentalmente infectados com o vírus rábico cepa CVS. A nucleoproteína recombinante teve sua expressão confirmada pelas técnicas de Dot blotting e Western blotting ao ser reconhecida por anticorpos monoclonais anti-histidina. Podemos concluir que a levedura P. pastoris é um sistema eficiente para clonagem e expressão da nucleoproteína e glicoproteína do vírus rábico.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_carina_moraes.pdf: 479524 bytes, checksum: 9bdbed7287bcee59185e68ac89b72108 (MD5) Previous issue date: 2008-10-13 Strangles is a contagious disease of the upper respiratory tract of horses caused by Streptococcus equi subsp. equi. Asymptomatic carriers responsible for maintaining the infection in the herd can only be detected by serological or microbiological methods and vaccines used for the control of the disease induce levels of protection generally not exceeding 50%. Considering that S. equi SeM protein is considered the most promising antigen to protect against the disease, this research aimed to produce and evaluate as antigen for vaccines and for ELISA, a recombinant S. equi SeM protein (rSeM). rSeM was produced by cloning and expression in Escherichia coli and purified by affinity chromatography. To test its immunogenicity isogenic female Balb-c mice 4-6 weeks-old were randomly divided and inoculated with 1 / 20th of the estimated dose of the vaccine for horses by the SC route, on days 0 and 21 of the experiment. One group was vaccinated with 250mL (12 mg mL-1) of rSeM without adjuvant, another with 300mL of vaccine containing 12 mg mL-1 of rSeM plus 20% of aluminiun hydroxide, two other groups were vaccinated with two commercial bacterins against Strangles, other two groups were vaccinated with the same commercial vaccines containing 12 mg mL-1 of rSeM and the remaining group was inoculated with a bacterin produced with a field strain. The control group was inoculated the same dose of sterile saline. Blood samples were collected from the retro-orbital venous plexus on days 0, 21, 42. The antibodies were titrated by ELISA using rSeM as antigen. rSeM was immunogenic for mice with a protection index of 100%. For the standardization of an ELISA, groups of 20 negative, vaccinated and positive animals were used. Using as Cut-off the mean plus two SD of the Optical Densities of the negatives, the test showed 100% sensitivity and specificity. A Adenite Eqüina é uma enfermidade contagiosa do trato respiratório superior dos eqüídeos causada por Streptococcus equi subesp. equi. Animais portadores assintomáticos responsáveis pela permanência da infecção nos rebanhos só podem ser detectados por métodos microbiológicos ou sorológicos e as vacinas utilizadas no controle da doença induzem níveis de proteção geralmente não superiores a 50 %. Considerando que a proteína SeM de S. equi é o antígeno mais promissor na proteção contra a doença, este trabalho objetivou produzir a proteína SeM recombinante de S. equi, visando sua utilização como antígeno em vacinas e em ELISA. Proteína SeM recombinante (rSeM) foi produzida mediante a clonagem e expressão em Escherichia coli e purificada por cromatografia de afinidade. Para testar sua capacidade imunogênica, vacinas elaboradas com rSeM foram aplicadas a camundongos. Fêmeas Balb/c isogênicas com 4-6 semanas foram divididas aleatoriamente e inoculadas por via SC com 1/20 da dose vacinal estimada para cavalos, nos dias 0 e 21 do experimento. Um grupo foi vacinado com 250 mL (12 mg mL-1) de proteína recombinante sem adjuvante, outro com 300 mL de vacina contendo 12 mg mL-1 rSeM adicionada de 20% de hidróxido de alumínio, outros dois grupos com duas bacterinas comerciais contra Adenite Eqüina; dois grupos com as vacinas comerciais, acrescidas de 12 mg mL-1 de rSeM e o grupo restante com uma bacterina contendo cepas de campo. O grupo controle foi inoculado com o mesmo volume de solução salina estéril. Coletou-se sangue por punção do plexo venoso retro-ocular nos dias 0, 21 e 42. Os anticorpos foram titulados por ELISA utilizando a proteína rSeM como antígeno. A rSeM foi imunogênica em camundongos com índices de proteção de 100%. Para a padronização de um ELISA, utilizaram-se grupos de 20 soros equinos de animais negativos, vacinados e positivos. Utilizando um ponto de corte de média das densidades ópticas dos soros negativos acrescidos de dois desvios padrão, o teste teve 100% de sensibilidade e especificidade.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Com o objetivo de definir o perfil epidemiológico da infecção pelos Vírus linfotrópico de células T humanas (HTLV-1 e HTLV-2), na população de doadores de sangue inaptos, da Fundação HEMOPA, na cidade de Belém do Pará, analisaram-se 113 fichas, em relação a fatores de risco associados à transmissão destes retrovírus, entre portadores e não portadores dos HTLV. Observou-se infecção em 76% (n=50) dos doadores inaptos pelo HTLV-1 e em 24% (n=16) pelo HTLV-2; 62% (n=70) dos portadores eram do sexo masculino e 38% (n=43) do sexo feminino, havendo uma maior tendência da infecção por indivíduos deste sexo (p=0,007). Os fatores de risco que exibiram resultados significativos foram: ter recebido transfusão sangüínea (p=0,0003), mais especificamente para HTLV-2 (p=0,02); ter sido amamentado por ama de leite (p=0,006), mais especificamente para HTLV-1 (p=0,04); ter sido submetido à cirurgia (p=0,01), discriminadamente para HTLV-1 (p=0,03) e HTLV-2 (p=0,04); compartilhar lâmina/barbeador (p=0,02), mais especificamente para HTLV-1 (p=0,02); não usar preservativo nas relações sexuais (p=0,0003), discriminadamente para HTLV-1 (p=0,001) e HTLV-2 (p=0,002). Apesar das diversas etapas existentes no processo de triagem de doadores de sangue, cujo objetivo é eliminar potenciais candidatos portadores de doenças transmissíveis pelo sangue, em especial as de curso crônico e assintomático, existem vieses que impossibilitam um processo isento de falhas. In order to define the epidemiological profile of the Human T-cell Lymphotropic Virus (HTLV-1 and HTLV-2) among inapt blood donors population, at the HEMOPA Foundation, in Belém, state of Pará, we analyzed 113 epidemiological forms, related with risk factors associated with these retrovirus transmission, among carriers and noncarriers of HTLV. We observed that 76% (n=50) of the inapt blood donors were infected by HTLV-1 and 24% (n=16) by HTLV-2; 62% (n=70) of the carriers were male and 38% (n=43) were female, with a tendency of infection in this gender (p=0,007). The risk factors which exhibited significant results were: have received blood transfusion (p=0,0003), more specifically to HTLV-2 (p=0,02); have been breastfeeding from non-mother (p=0,006), more specifically to HTLV-1 (p=0,04); have been submitted to surgery (p=0,01), discriminately to HTLV-1 (p=0,03) and HTLV-2 (p=0,04); share blades/shavers (p=0,02), more specifically to HTLV-1 (p=0,02); do not use condoms during sexual intercourse (p=0,0003), discriminately to HTLV-1 (p=0,001) and HTLV-2 (p=0,002). Despite of the diverse stages existing in the process of selection of blood donors, which the main objective is to eliminate potentials candidates carrying transmissible blood diseases, in special of chronic and asymptomatic course, exist bias that disable an exempt process of fails.

A distribuição geográfica da infecção pelo Vírus Linfotrópico de Células T HTLV 1/2 humanas 1 e 2 é ampla, porém existem áreas de maior endemicidade e também particularidades de acordo com o tipo de HTLV. O HTLV-1 apresenta maior soroprevalência no sudoeste do Japão, no Caribe, na América Central, nas diferentes regiões da América do Sul e nas porções centrais e ocidentais da África e Melanésia. Enquanto o HTLV-2 parece acometer grupos populacionais distintos, como as populações nativas de indígenas das Américas do Norte, Central e Sul, pigmeus da África Central, mongóis na Ásia e também usuários de drogas injetáveis. O trabalho realizado teve como objetivo descrever a epidemiologia molecular do HTLV em três populações distintas do estado do Amapá, que foram: pacientes HIV/AIDS infectado, população afro-descendente e finalmente indivíduos atendidos no Laboratório Central de Saúde Pública do Amapá (LACEN-AP), encaminhados para diagnóstico de HTLV. As amostras foram avaliadas para a presença do vírus por métodos sorológicos (ELISA e Western blot) e moleculares (amplificação gênica e caracterização de segmentos das regiões pX e env pela análise de polimorfismo de fragmentos de restrição por ação de endonuclease. Os resultados obtidos nas diferentes populações foram na população de indivíduos infectados pelo HIV/AIDS, todas as amostras foram negativas, na população afro-descendente, apenas uma amostra apresentou positividade na sorologia pelo método de ELISA, porém foi negativa no Western blot e quando submetida ao método molecular, não houve amplificação. No entanto, entre os indivíduos encaminhados para diagnóstico de HTLV, 06 (seis) amostras foram positivas, e dessas, 05 (cinco) foram confirmadas por Western blot e pelo método molecular. O resultado molecular demonstrou a presença de HTLV-1. The geographical distribution of the infection by human T-cell lymphotropic virus 1/2 – HTLV 1 / 2 is extensive, nevertheless, there are areas that are more endemic and have more particularities depending on the HTLV type. The HTLV 1 shows a bigger occurrence in south west of Japan, Caribbean, Central America, in different regions of South America and in parts of Central, as well as in western Africa, while HTLV-2, seems to assault distinct groups of people, such as Indians native people from North, Central and South America, Pigmies from Central Africa, Mongols in Asia as well as in infecting drug users. The present work had as objective describing HTLV molecular epidemiology, in three different populations the State of Amapá, they are: HIV/IDS positive patients, Afro-descenig population and individuals assisted of Public Health Center Laboratory of Amapá – LACEN-AP, directed for diagnosis of HTLV. The samples were tested for the presence of virus using serological (ELISA and Western blot) and molecular assays (gene amplification and restriction fragment length polymorphism from pX and env for the analysis of polimorfismo o restriction fragments for endonuclease action. The obtained results in different populations are In the population of HIV infected people, all the samples were negative; in the Afro-desceding population, only one sample was positive confirmed by serological test (ELISA), but negative according to western blot test and submitted to the molecular analysis, there wast not amplification. However, among samples of individuals directed for diagnosis of HTLV, 06 (six) were positive, 5(five) out of 6/them were confirmed by western blot test. The molecular result demonstrated the presence of HTLV-1.