Search

Rho GTPases play a key role in various membrane trafficking processes. RhoU is an atypical small Rho GTPase related to Rac/Cdc42 which possesses unique N- and C-terminal domains that regulate its function and its subcellular localization. RhoU localized at the plasma membrane, on endosomes and in cell adhesion structures where it governs cell signalling, differentiation and migration. However, despite its endomembrane localization, RhoU function in vesicular trafficking has been unexplored. Here, we identified intersectins (ITSNs) as new binding partners for RhoU and showed that the second PxxP motif at the N-terminus of RhoU mediated interactions with SH3 domains of ITSNs. To evaluate the function of RhoU and ITSNs in vesicular trafficking, we used fluorescent transferrin as a cargo for uptake experiments. We showed that silencing of either RhoU or ITSN2, but not ITSN1 increased transferrin accumulation in early endosomes resulting from defect in fast vesicle recycling. Concomitantly, RhoU and ITSN2 colocalized to a subset of Rab4-positive vesicles suggesting that RhoU-ITSN2 interaction may occur on fast recycling endosomes to regulate the fate of vesicular cargos.

Aim. To investigate an effect of the Focal adhesion kinase 1 (FAK1) expression on the level of tyrosine phosphorylation of an adaptor protein SHB and to find functional consequences of this posttranslational modification. Methods. Recombinant DNA construction, protein expression and purification, human cell transfection, western blot. Results. The expression of FAK1 induces the massive tyrosine phosphorylation of SHB adaptor and enhances its interaction in vitro with SH2 domains of a range of the signaling proteins such as PI3K, ABL, CRK and PLCG1. Additionally we have found that Epstein-Barr virus protein LMP2A can partially mimic the FAK1-mediated effect strongly elevating the efficiency and SHB interaction with the mentioned above proteins. While the expression of individual proteins elevated SHB phosphorylation level, the co-expression of LMP2A and FAK1 did not display a synergetic effect. Conclusions. FAK1 as well as LMP2A induce the SHB tyrosine phosphorylation and enhance its interaction with a set of the signaling proteins. Мета. Дослідити ефект надексперсії кінази фокальної адгезії (FAK1) на рівнь фосфорилювання залишків тирозину адапторного білка SHB та знайти функціональне значення цієї посттрансляційної модифікації. Методи. Конструювання рекомбінантних ДНК, експресія та очистка рекомбінантних білків, трасфекція клітинних ліній, вестерн блот. Результати. Надексперсія FAK1 в клітинах лінії 293 викликає масивне фосфорилювання залишків тирозину адапторного білка SHB та значно підсилює його взаємодію in vitro з SH2-доменами низки сигнальних білків, таких як PI3K, ABL, CRK та PLCg1. Крім того, білок LMP2A вірусу Епштейна-Барр може посилювати in vitro зв’язування SHB з вищезазначеними білками, так само, як і FAK1. Тоді як надекспресія окремих білків FAK1 та LMP2A підвищувала рівні фосфорилювання SHB, їх ко-експерсія не мала синергічного ефекту. Висновки. Експресія FAK1 та LMP2A індукує фосфорилювання залишків тирозину адапторного білка SHB та підсилює його взаємодію з SH2-доменами низки сигнальних білків. Цель. Исследовать эффект суперэкспрессии киназы фокальной адгезии (FAK1) на уровень фосфорилирования остатков тирозина адаптерного белка SHB и найти функциональное значение этой посттрансляционной модификации. Методы. Конструирование рекомбинантных ДНК, экспрессия и очистка рекомбинантных белков, трансфекция клеточных линий, вестерн блот. Результаты. Суперэксперссия FAK1 в клетках линии 293 приводит к многократному повышению уровней фосфорилирования остатков тирозина адаптерного белка SHB, что в свою очередь приводит к усилению взаимодейсвия с SH2-доменами ряда сигнальных белков, таких как PI3K, ABL, CRK та PLCg1. Кроме того, белок LMP2A вируса Эпштейна-Барр может усиливать in vitro взаимодействие SHB с указанными белками, аналогично FAK1. Тогда как суперэкспрессия отдельных белков FAK1 та LMP2A приводила к интенсификации фосфорилирования SHB, их ко-экспрессия не обладала синергическим эффектом. Выводы. Экспрессия FAK1 и LMP2A индуцирует фософрилирование остатков тирозина адаптерного белка SHB и усиливает его взаимодействие с SH2-доменами ряда сигнальных белков.

At present, the role of ubiquitination of cargoes internalized from the plasma membrane is better understood than the consequences of ubiquitination of proteins comprising the endocytic machinery. Here, we show that the E3 ubiquitin ligase AIP4/ITCH contributes to the differential ubiquitination of isoforms of the endocytic scaffold protein intersectin1 (ITSN1). The major isoform ITSN1-s is monoubiquitinated, whereas the minor one, ITSN1-22a undergoes a combination of mono- and oligoubiquitination. The monoubiquitination is required for ITSN1-s stability, whereas the oligoubiquitination of ITSN1-22a causes its proteasomal degradation. This explains the observed low abundance of the minor isoform in cells. Thus, different modes of ubiquitination regulated by AIP4 have opposite effects on ITSN1 isoform stability.

ITSN1 is a scaffold protein involved in endocytosis, signal transduction and cytoskeleton regulation. It has been previously shown that ITSN1 undergoes Ca2+/calmodulin-dependent phosphorylation in vitro. Aim. We intend to identify these phosphorylation sites. Methods. In vitro kinase reaction; liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC/MS/MS). Results. We identified five sites of Ca2+/calmodulin-dependent phosphorylation in the recombinant fragments of ITSN1. Conclusions. We have shown that the ITSN1 coiled-coil region (CCR) and the interdomain linkers between EH2 and CCR, SH3A and SH3B, SH3B and SH3C domains were phosphorylated in a Ca2+/calmodulin-dependent manner in vitro.

ITSN1 is an endocytic scaffold protein implicated in synaptic functioning. Ca2+ is known to be important for endo- cytosis in both pre- and post-synaptic terminals. ITSN1 contains two EH (Eps15 homology) domains which possess putative Ca2+-binding EF-hand motifs. Aim. To test the effect of Ca2+ on the EH domain binding properties. Methods. His-tag pulldown, Western blotting. Results. Addition of 1.5 mM Ca2+ does not affect the binding of the ITSN1 EH domains to the C-terminal fragment of the endocytic protein Epsin 1. Conclusions. The data obtained indicate that Ca2+ has no effect on the binding properties of the ITSN1 EH domains.

Phosphorylation of endocytic adaptor ITSN2 that enabled its interaction with the SH2 domains of signaling proteins was recently reported. The aim of this study was to determine whether tissue-specific ITSN2 phosphorylation and subsequent recognition by phosphotyrosine-binding domains could occur in mouse tissues. Methods. In silico prediction of interaction motifs, expression of recombinant proteins in bacterial system, GST pull-down analysis, immunoblotting. Results. Analysis of phosphoproteomic data demonstrated tyrosine phosphorylation of mouse ITSN2 homologue, Ese2 protein. Scansite service was used to predict binding motifs for the SH2 domains of Fyn, Abl1, PLCg1 and PI3KR1 within Ese2. Comparison of ITSN2 and Ese2 sequences showed conservation of predicted interaction motifs between human and mouse. GST-fused SH2 domains of Fyn, Abl1, PLCg1 and PI3KR1 were obtained and used as phosphorylation «sensors» of tyrosine-based motifs within Ese2 molecule. Binding of Ese2 to the SH2 domains of Fyn and PLCg1 was observed in brain, lung and heart whereas SH2 domains of Abl1 and PI3KR1 interacted with Ese2 in lung and heart only. Conclusions. Differential Ese2/ SH2 interactions in tissues suggest that tissue-specific tyrosine phosphorylation might regulate specific binding of the Ese2 adaptor to the signaling molecules. Нещодавно виявлено фосфорилювання адаптора ендоцитозу ITSN2, що забезпечує впізнавання цього білка SH2-доменами білків, залучених до передачі мітогенного сигналу. Метою цієї роботи було перевірити, чи має взаємодія ITSN2 з SH2-вмісними біл- ками тканиноспецифічний характер. Методи. Передбачення мотивів взаємодії in silico, експресія білків у бактерійній системі та культурі клітин ссавців, преципітація з використанням білків, злитих з GST. Результати. Дані фосфопротеомних досліджень свідчать про фосфорилювання тирозинових залишків гомолога ITSN2 миші, білка Ese2. За допомогою сервісу Scansite у складі Ese2 передбачено мотиви взаємодії з доменами SH2 білків Fyn, Abl1, PLCg1 і PI3KR1. Порівняння послідовностей інтерсектинів людини та миші показало консервативність передбачених мотивів. Отримано злиті з GST домени SH2 білків Fyn, Abl1, PLCg1 і PI3KR1, які використано для преципітації білка Ese2 з лізатів мозку, легень і серця миші. Зв’язування Ese2 з доменами SH2 білків Fyn і PLCg1 спостерігали в усіх досліджуваних тканинах, тоді як домени SH2 білків Abl1 і PI3KR1 упізнавали Ese2 лише в легенях та серці. Висновки. Диференційне впізнавання Ese2/SH2 у тканинах дозволяє припустити, що тканиноспецифічне фосфорилювання регулює специфічне зв’язування адапторного білка Ese2 із сигнальними молекулами. Недавно показано фосфорилирование адаптора эндоцитоза ITSN2, опосредующее узнавание этого белка SH2-доменами белков, вовлеченных в передачу митогенного сигнала. Целью этой работы было проверить, имеет ли взаимодействие ITSN2 с SH2- содержащими белками тканеспецифический характер. Методы. Предсказание мотивов взаимодействия in silico, экспрессия белков в бактериальной системе и культуре клеток млекопитающих, преципитация с использованием белков, слитых с GST. Результаты. Данные фосфопротеомных исследований свидетельствуют о фосфорилировании тирозиновых остатков гомолога ITSN2 мыши, белка Ese2. При помощи сервиса Scansite в составе Ese2 предсказано мотивы взаимодействия с доменами SH2 белков Fyn, Abl1, PLCg1 и PI3KR1. Сравнение последовательностей интерсектинов человека и мыши показало консервативность предсказанных мотивов. Получены слитые с GST домены SH2 белков Fyn, Abl1, PLCg1 и PI3KR1, использованных для преципитации белка Ese2 из лизатов головного мозга, легких и сердца мыши. Связывание Ese2 с доменами SH2 белков Fyn и PLCg1 наблюдали во всех исследованных тканях, тогда как домены SH2 белков Abl1 и PI3KR1 узнавали Ese2 только в тканях легких и сердца. Выводы. Дифференциальное узнавание Ese2/SH2 в тканях позволяет предположить, что тканеспецифическое фосфорилирование опосредует специфическое связывание адаптерного белка Ese2 с сиг- нальными молекулами.

Aim. Previously Latent membrane protein 2A (LMP2A) of Epstein-Barr virus was found to be ubiquitylated by CBL ubiquitin ligase but no direct interaction of LMP2A with CBL was reported. We aimed to explore this interaction and study a possibility of adaptor protein involvement. Taking into consideration that both LMP2A and CBL were shown to interact with endocytic adaptor protein intersectin 1 (ITSN1), we assumed that the latter could serve as a scaffold for LMP2A/CBL complex. Methods. We used an immunofluorescence and coimmuno- precipitation approaches to test a mutual complex formation of ITSN1, CBL and LMP2A proteins. Results. LMP2A coimmunoprecipitated with CBL while LMP2A did not interact with CBL G306E mutant harboring inactive phosphotyrosine-binding domain. We observed a triple colocalization of ITSN1, CBL and LMP2A signals in MCF-7 cells as well as coprecipitation of all mentioned proteins. Overexpression of ITSN1 did not affect the efficiency of complex formation of LMP2A with CBL. Moreover, LMP2A mutant unable to interact with ITSN1 was readily precipitated with CBL. Conclusions. LMP2A can be engaged in the complex together with endocytic adaptor ITSN1 and ubiquitin ligase CBL. We show that PTB domain of CBL is responsible for interaction with LMP2A. ITSN1 is not required for LMP2A recruiting to CBL. Відомо, що мембранний білок латентної фази 2А вірусу Епштейна-Барр убіквітинілюється убіквітин-лігазою CBL, хоча прямої взаємодії цих двох білків не виявлено. Наша мета полягала у дослідженні взаємодії LMP2A і CBL та вивченні можливості участі в цьому комплексі білкового адаптера. Беручи до уваги, що обидва зазначених білки взаємодіють з ендоцитозним адаптерним білком ITSN1, ми припустили, що останній може слугувати платформою для утворення комплексу LMP2A/CBL. Методи. Імунофлуоресцентний аналіз та коімунопреципітацію застосовано для дослідження можливості формування комплексу між ITSN1, CBL і LMP2A. Результати. Коімунопреципітація LMP2A і CBL свідчить про утворення комплексу цими білками, причому мутантна форма CBL, яка не здатна зв’язувати фосфотирозинові залишки, не взаємодіє з LMP2A. Ми спостерігали потрійну колокалізацію ITSN1, CBL і LMP2A у клітинах лінії MCF-7, а також коімунопреципітацію всіх зазначених білків. Надекспресія ITSN1 не впливає на ефективність коімунопреципітації LMP2A з CBL. Більш того, мутантний варіант LMP2A, не здатний зв’язуватися із ITSN1, ефективно взаємодіє з CBL. Висновки. LMP2A може входити до комплексу ендоцитозного адаптерного білка ITSN1 та убіквітин-лігази CBL. Участь ITSN1 не є необхідною для формування комплексу між LMP2A і CBL. Показано, що РТВ-домен убіквітин-лігази CBL відповідає за зв’язування з LMP2A. Известно, что мембранный белок латентной фазы 2А вируса Эпштейна-Барр убиквитинилируется убиквитин-лигазой CBL, однако прямого взаимодействия этих белков ранее обнаружено не было. Наша цель состояла в исследовании взаимодействия CBL и LMP2A, а также в изучении возможности участия в этом комплексе белкового адаптера. Принимая во внимание, что оба упомянутых белка взаимодействуют с эндоцитозным адаптерным белком ITSN1, мы предположили, что последний может служить платформой для образования комплекса LMP2A/CBL. Методы. Иммунофлуоресцентный анализ и коиммунопреципитацию использовали для изучения возможности образования комплекса с участием ITSN1, CBL и LMP2A. Результаты. Коиммунопреципитация CBL и LMP2A свидетельствует об образовании комплекса этими белками, причем мутантная форма CBL, лишенная способности связывать фосфотирозиновые остатки, не взаимодействует с LMP2A. Мы детектировали тройную колокализацию ITSN1, CBL и LMP2A в клетках линии MCF-7, а также ко-иммунопреципитацию вышеупомянутых белков. Суперэкспрессия ITSN1 не влияет на эффективность копреципитации CBL и LMP2A. Более того, мутантный вариант LMP2A, дефектный по связыванию с ITSN1, эффективно взаимодействовал с CBL. Выводы. LMP2A может включаться в комплекс эндоцитозного адаптера ITSN1 и убиквитин-лигазы CBL. Участие ITSN1 не является обязательным для образования комплекса LMP2A/CBL. Показано, что РТВ-домен убиквитин-лигазы CBL отвечает за связывание с LMP2A.

Intersectin 1 (ITSN1) is an adaptor protein involved in membrane trafficking and cell signaling. Long and short isoforms of ITSN1 (ITSN1-L and ITSN1-S) are produced by alternative splicing. The aim of our study was to investigate whether ITSN1-L and ITSN1-S could interact in mammalian cells. Methods. During this study we employed immunoprecipitation and confocal microscopy. Results. We have shown that endogenous ITSN1-S coprecipitates with overexpressed ITSN1-L in PC12, 293 and 293T cells. Long and short isoforms of ITSN1 also colocalize in 293T cells. Conclusions. ITSN1-L and ITSN1-S form complexes in mammalian cells. Keywords: ITSN1, alternatively spliced isoforms, adaptor/scaffold proteins. Інтерсетин 1 (ITSN1) – адатоний білок, залучений до мембранного транспорту та передачі клітинних сигналів. Довга і коротка ізоформи ITSN1 (ITSN1-L і ITSN1-S) утворюються в результаті альтернативного сплайсингу. Метою роботи було встановити, чи можуть ITSN1-L і ITSN1-S взаємодіяти в клітинах ссавців. Методи. Використано методи імунопреципітації та конфокальної мікроскопії. Результати. Показано, що ендогенний ITSN1- S копреципітується з надекспресованим ITSN1-L у клітинах PC12, 293 і 293T. Довга і коротка ізоформи ITSN1 також колокалізуються у клітинах 293T. Висновки. ITSN1-L і ITSN1-S формують комплекси в клітинах ссавців. Ключові слова: ITSN1, альтернативно сплайсовані ізоформи, адапторні білки. Интерсектин 1 (ITSN1) – адапторный белок, участвующий в мембранном транспорте и передаче клеточных сигналов. Длинная и короткая изоформы ITSN1 (ITSN1-L и ITSN1-S) образуются вследствие альтернативного сплайсинга. Целью исследования было выяснить, могут ли ITSN1-L и ITSN1-S взаимодействовать в клетках млекопитающих. Методы. Использованы методы иммунопреципитации и конфокальной микроскопии. Результаты. Показано, что эндогенный ITSN1-S копреципитируется со сверхэкпрессированным ITSN1-L в клетках PC12, 293 и 293T. Длинная и короткая изоформы ITSN1 так же колокализуются в клетках 293T. Выводы. ITSN1-L и ITSN1-S формируют комплексы в клетках млекопитающих. Ключевые слова: ITSN1, альтернативно сплайсированные изоформы, адапторные белки.

Латентный мембранный белок 2А вируса Эпштейна-Барр является ключевым регулятором латентной фазы вирусной инфек- ции. Цель. Идентифицировать белки, способные связываться с пролин-обогащенными мотивами LMP2A. Методы. Анализ in silico при помощи программного обеспечения Scansite позволил предсказать взаимодействие амфифизина 1 (Amph1) и LMP2A. Использованы стандартные методы молекулярного клонирования, сайт-направленный мутагенез и тест на взаимодействие in vitro для последующего изучения структурных основ взаимодействия комплекса LMP2A/Amph1. Фракцию экзосом получали при помощи последовательных центрифугирований. Результаты. Показано, что изоформа LMP2A, но не LMP2АDNT взаимодействует с доменом SH3 Amph1. Выявленное взаимодействие опосредуется тремя разными пролин-обогащенными мотивами, расположенными в N-концевом участке LMP2A. Все три мотиваявляются взаимозаменяемыми, так как присутствия хотя бы одного из них оказывается достаточно для реализации связывания LMP2A с Amph1. Нами продемонстрировано связывание Amph1 и родственного ему Amph2 с LMP2A при помощи ко-иммунопреципитации эндогенных комплексов. Мутант LMP2A по пролиновым мотивам не взаимодействовал с Amph1, что привело к исчезновению его из фракции экзосом. Выводы. Латентный мембранный белок 2А вируса Эпштейна-Барр образует комплексы с эндоцитозными адаптерными белками Amph1 и Amph2. Идентифицированные новые партнеры LMP2A могут влиять на его внутриклеточный трафик и секрецию. Ключевые слова: вирус Эпштейна-Барр, LMP2A, амфифизин, экзосомы. Латентний мембранний білок 2А (LMP2A) вірусу Епштейна-Барр є важливим регулятором латентної фази вірусної інфекції. Мета. Ідентифікувати білки, які взаємодіють з пролін-збагаченими мотивами LMP2A. Методи. Аналіз in silico за допомогою програмного забезпечення Scansite дозволив передбачити можливість взаємодії амфіфізину 1 (Amph1) і LMP2A. Використано загально прийняті техніки молекулярного клонування, сайт-спрямований мутагенез і тест на взаємодію in vitro для подальшого дослідження структурних основ взаємодії комплексу LMP2A/Amph1. Фракцію екзосом отримано за допомогою послідовних центрифугувань. Результати. Показано, що ізоформа LMP2A, але не LMP2А DNT взаємодіє з доменом SH3 амфіфізину 1. Виявлена взаємодія опосередковується трьома різними пролін-збагаченими мотивами, розташованими в N-кінцевій ділянці LMP2A. Всі три мотиви є взаємозамінними, оскільки присутність хоча б одного з них є достатньою для реалізації зв’язування LMP2A з Amph1. Нами продемонстровано взаємодію Amph1 і високоспорідненого з ним Amph2 з LMP2A за допомогою ко-імунопреципітації ендогенних комплексів. Мутант LMP2A за проліновими мотивами не взаємодіяв з Amph1, що спричиняло зникнення його з фракції екзосом. Висновки. Латентний мембранний білок 2А вірусу Епштейна-Барр утворює комплекси з ендоцитозними адаптерними білками Amph1 і Amph2. Ідентифіковані нові партнери LMP2A можуть впливати на його внутрішньоклітинний трафік та секрецію. Ключові слова: вірус Эпштейна-Барра, LMP2A, амфіфізин, екзосоми. Latent membrane protein 2A (LMP2A) of Epstein-Barr virusisimplicated in the regulation of viral latency. The aim of the current study was to identify proteins interacting with proline-rich motifs of LMP2A. Methods. In silico prediction with Scansite allowed to recognize amphiphysin 1 (Amph1) as a binding partner of LMP2A. Molecular cloning techniques, site-directed mutagenesis, in vitro binding assay made it possible to study the interaction interface of Amph1/LMP2A complex. Sequential centrifugation steps were used to isolate an exosomal fraction. Results. LMP2A but not LMP2DNT mutant has been found to bind the SH3 domain of Amph1 via three distinct proline-rich motifs located in the N-terminal tail. All three motifs seem to be interchangeable as the presence of at least one of them was sufficient to mediate LMP2A/Amph1 interaction. Furthermore, the binding of LMP2A to Amph1 and related protein amphiphysin 2 was demonstrated by co-immunoprecipitation of endogenous complexes. We have found that inability of LMP2A mutant to bind Amph1 leads to the vanishing of the viral protein from the exosomal fraction. Conclusions. The latent membrane protein 2A of Epstein-Barr virus forms complexes with endocytic adaptor proteins Amph1 and Amph2. Described interaction might be involved in the regulation of intracellular traffic and secretion of LMP2A. Keywords: EBV, LMP2A, Amphiphysin, exosomes.

Aim. Previously we have identified a novel isoform of endocytic adaptor protein ITSN1 designated as ITSN1- 22a. Western blot revealed two immunoreactive bands of 120 and 250 kDa that corresponded to ITSN1-22a. The goal of this study was to investigate the possibility of dimer formation by the novel isoform. Methods. Dimerization ability of ITSN1-22a was tested by immunoprecipitation and subsequent Western blot analysis. To specify the region responsible for dimerization, site-directed mutagenesis and truncation analysis were carried out. Inhibition of endocytosis by potassium depletion and EGF stimulation of HEK293 were performed. Results. We have found that ITSN1-22a forms dimers in HEK293 cells. The dimerization of ITSN1-22a was mediated by C-terminal domain. We showed that cysteines C1016 and C1019 were involved in homodimerization. Inhibition of clathrin-mediated endocytosis and mitogen stimulation did not affect ITSN1-22a dimer formation. Conclusions. ITSN1-22a is the only one known ITSN1 isoform, which is capable to form homodimers via disulphide bonds. This could be important for the formation of protein complexes containing ITSN1 molecules. Keywords: intersectin 1, isoform, homodimer. Мета. Раніше нами ідентифіковано нову ізоформу адаптерного білка ITSN1, названу ITSN1-22a. Вестерн-блот аналіз виявив наявність двох імунореактивних смуг 120 і 250 кДа, що відповідають ITSN1-22a. Мета цієї роботи полягала у вивченні здатності нової ізоформи формувати димери. Методи. Імунопреципітацію і Вестерн-блот аналіз використано для дослідження здатності ізоформи до димеризації. Ідентифікацію ділянки, що відповідає за формування димерів, здійснювали за допомогою сайтспрямованого мутагенезу та делеційного аналізу. Інгібування ендоцитозу індукували дефіцитом іонів калію. Для мітогенної стимуляції клітин HEK293 застосовано епідермальний фактор росту. Результати. Нами виявлено, що надекспресована в клітинах НЕК293 ізоформа ITSN1-22a формує димери. Димеризація обумовлена специфічним для цієї ізоформи С-кінцевим доменом. Нами показано, що цистеїни С1016 і С1019 залучені до процесу гомодимеризації. Інгібування клатрин-опосередкованого ендоцитозу та стимуляція клітин мітогеном не впливають на формування димерів ізоформою ITSN1-22a. Висновки. ITSN1-22a – це єдина відома на сьогодні ізоформа ITSN1, здатна утворювати гомодимери за допомогою дисульфідних зв’язків, що може бути важливим для формування ITSN1-вмісних білкових комплексів. Ключові слова: інтерсектин 1, ізоформа, гомодимер. Цель. Ранее мы идентифицировали новую изоформу адаптерного эндоцитозного белка ITSN1, названную ITSN1-22a. Вестерн-блот анализ выявил наличие двух иммунореактивных полос 120 и 250 кДа, соответствующих ITSN1-22a. Цель этой работы состояла в изучении возможности формирования димеров изоформой ITSN1-22a. Методы. Иммунопреципитация и Вестерн-блот анализ использованы для исследования возможности димеризации изоформы. Идентификацию участка, отвечающего за димеризацию, осуществляли с помощью сайт-направленного мутагенеза и делеционного анализа. Ингибирование эндоцитоза индуцировали дефицитом ионов калия. Для митогенной стимуляции клеток применен эпидермальный фактор роста. Результаты. Нами обнаружено, что сверхэкспрессированная в клетках НЕК293 изоформа ITSN1-22a формирует димеры. Димеризация изоформы обусловлена ее специфическим С-концевым доменом. Нами показано, что цистеины С1016 и С1019 вовлечены в процесс гомодимеризации. Ингибирование клатрин-опосредованного эндоцитоза и митогенная стимуляция клеток не влияют на формирование димеров изоформой ITSN1-22a. Выводы. ITSN1-22a – это единственная на сегодня изоформа ITSN1, способная образовывать гомодимеры посредством дисульфидных связей, что может быть важно для формирования ITSN1-содержащих белковых комплексов. Ключевые слова: интерсектин 1, изоформа, гомодимер.

ITSN1 is an endocytic scaffold protein with a prominent function in synaptic transmission. It is known that Ca signaling is crucial for the regulation of synaptic proteins functioning. Aim. Checking the possibility of Ca/calmodulin-dependent phosphorylation of ITSN1. Methods. Affinity chromatography, in vitro kinase reaction, Western blotting, gel staining with fluorescent stains. Results. We show that the fraction of calmodulin-binding proteins is able to phosphorylate the recombinant fragments encoding the coiled-coil region and the SH3 domain-containing region of ITSN1 in the presence of Ca ions and calmodulin. Conclusions. The coiled-coil region and the SH3 domain-containing region of ITSN1 undergo Ca/calmodulin-dependent phosphorylation in vitro, suggesting a possible regulation of ITSN1 by Ca signaling. ITSN1 – це ендоцитозний адапторний білок, що виконує значущі функції у синаптичному передаванні нервового імпульсу. Відомо, що кальцієва сигналізація є ключовим елементом регуляції функціонування синаптичних білків. Мета. Дослідити можливість кальцій/кальмодулін-залежного фосфорилювання ITSN1. Методи. Афінна хроматографія, кіназна реакція in vitro, Вестерн блот-гібридизація, фарбування гелів флуоресцентними барвниками. Результати. Показано, що фракція кальмодулін-зв’язувальних білків здатна фосфорилювати рекомбінантні надспіралізовану та SH3 домен-вмісну ділянки ITSN1 in vitro за присутності іонів кальцію і кальмодуліну. Висновки. Надспіралізована та SH3 домен-вмісна ділянки ITSN1 підлягають кальцій/кальмодулін-залежному фосфорилюванню in vitro, що дозволяє припустити існування регуляції ITSN1 кальцієвою сигнальною системою. ITSN1 –это эндоцитозный адапторный белок, выполняющий значительные функции в синаптической передаче нервного импульса. Известно, что кальциевая сигнализация является ключевым элементом регуляции функционирования синаптических белков. Цель. Исследовать возможность кальций/кальмодулин-зависимого фосфорилирования ITSN1. Методы. Аффинная хроматография, киназная реакция in vitro, Вестерн блот-гибридизация, окрашивание белков флуоресцентными красителями. Результаты. Показано, что фракция кальмодулин-связывающих белков способна фосфорилировать рекомбинантные суперспирализованный и SH3 домен-содержащий участки ITSN1 in vitro в присутствии ионов кальция и кальмодулина. Выводы. Cуперспирализованный и SH3 домен-содержащий участки ITSN1 подлежат кальций/кальмодулин-зависимому фосфорилированию in vitro, что позволяет предположить существование регуляции ITSN1 кальциевой сигнальной системой.

Giant nuclear transcripts, and in particular the RNAs of the globin gene domains which are much larger than their canonical pre-mRNAs, have been an enigma for many years. We show here that in avian erythroblastosis virus (AEV)-transformed chicken erythroleukaemic cells, where globin gene expression is abortive, the whole domain of α-globin genes is transcribed for about 33 kb in the globin direction and that this RNA is part of the nuclear matrix. Northern blot hybridisation with strand-specific riboprobes, recognising genes and intergenic sequences, and RT-PCR with downstream primers, show that the continuous full domain transcript (FDT) starts in the vicinity of a putative LCR and includes all the genes as well as known regulatory sites, the replication origin, and the DNA loop anchorage region in the upstream area. Absent in chicken fibroblasts, the globin FDT overlaps the major part of the ggPRX housekeeping gene that is transcribed in the opposite direction. RT-PCR and in situ hybridisation with genic and extra-genic globin probes demonstrated that the globin FDT is a component of the nuclear matrix. We suggest that the globin FDTs keep the domain in an active state, and the globin RNAs on the processing pathway are a component of the nuclear matrix. They may take part in the dynamic nuclear architecture when productively processed, or turn over slowly when globins are not synthesised. © 2004 Wiley-Liss, Inc.

Latent Membrane Protein 2A (LMP2A) is an Epstein–Barr virus-encoded protein that is important for the maintenance of latent infection. Its activity affects cellular differentiation, migration, proliferation and B cell survival. LMP2A resembles a constitutively activated B cell antigen receptor and exploits host kinases to activate a set of downstream signaling pathways. In the current study we demonstrate the interaction of LMP2A with intersectin 1 (ITSN1), a key endocytic adaptor protein. This interaction occurs via both the N- and C-tails of LMP2A and is mediated by the SH3 domains of ITSN1. Additionally, we identified the Shb adaptor and the Syk kinase as novel binding ligands of ITSN1. The Shb adaptor interacts simultaneously with the phosphorylated tyrosines of LMP2A and the SH3 domains of ITSN1 and mediates indirect interaction of ITSN1 to LMP2A. Syk kinase promotes phosphorylation of both ITSN1 and Shb adaptors in LMP2A-expressing cells. In contrast to ITSN1, Shb phosphorylation depends additionally on Lyn kinase activity. Considering that Shb and ITSN1 are implicated in various receptor tyrosine kinase signaling, our results indicate that LMP2A can affect a number of signaling pathways by regulating the phosphorylation of the ITSN1 and Shb adaptors.

Передача митогенного сигнала от RTK (рецепторных тирозиновых киназ) тесно связана с эндоцитозом, регулирующим ее точность. Интерсектин 1 (ITSN1) – эволюционно-консервативный адапторный белок, вовлеченный в самые ранние стадии клатринопосредованного эндоцитоза, а также в злокачественную трансформацию в случае его сверхэкспрессии. Цель. Поиск белков, способных обеспечивать связь ITSN1 с процессом передачи сигнала от RTK. Методы. Предсказание мотивов взаимодействия in silico, экспрессия белков в бактериальной системе и в культуре клеток млекопитающих, иммунопреципитация, преципитация белков, слитых с GST, иммунофлуоресцентный анализ. Результаты. С применением сервиса «Scansite» предсказано связывание домена SH3A ITSN1 с SPRY2. Для экспериментального подтверждения этого взаимодействия GST-слитые домены ITSN1 получены и очищены из клеток Escherichia coli. Используя преципитацию белков, слитых с GST, установлено, что домены SH3A, N-SH3A (нейрон-специфический вариант), SH3C и SH3E способны преципитировать SPRY2-Flag из лизата клеток. Данные иммунофлуоресцентного анализа и коиммунопреципитации свидетельствуют о частичной колокализации белков Omni-ITSN1 и Flag-SPRY2 и формирование ими комплекса in vivo. Выводы. Полученные данные подтверждают ассоциацию эндоцитозного адапторного белка ITSN1 с сигнальным белком SPRY2 in vivo. Ключевые слова: интерсектин 1, передача митогенного сигнала, SPRY2, домен SH3. Передача мітогенного сигналу від рецепторних тирозинкіназ (RTK) у клітині тісно пов’язана з ендоцитозом, який регулює точність такої передачі. Інтерсектин 1 (ITSN1) – це еволюційно консервативний адапторний білок, що бере участь у найбільш ранніх етапах клатрин-опосередкованого ендоцитозу та залучений до процесу злоякісної трансформації за умов надекспресії. Мета. Пошук білків, які можуть забезпечити зв’язок ITSN1 із процесом передачі сигналу від RTK. Методи. Передбачення мотивів взаємодії in silico, експресія білків у бактерійній системі та культурі клітин ссавців, імунопреципітація, преципітація білків, злитих з GST, імунофлуоресцентні дослідження. Результати. За допомогою сервісу «Scansite» передбачено зв’язування домену SH3A ITSN1 із SPRY2. Для експериментального підтвердження цієї взаємодії злиті з GST SH3-домени ITSN1 отримано і очищено з бактерій Escherichia coli. Використовуючи преципітацію білків, злитих з GST, встановлено, що домени SH3A, N-SH3A (нейрон-специфічний варіант), SH3C і SH3E ITSN1 здатні преципітувати Flag-SPRY2 з лізату клітин. Дані імунофлуоресцентного аналізу та коімунопреципітації свідчать про часткову колокалізацію білків Omni-ITSN1 і Flag-SPRY2 та формування ними комплексу in vivo. Висновки. Отримані дані підтверджують асоціацію ендоцитозного адапторного білка ITSN1 із сигнальним білком SPRY2 in vivo. Ключові слова: інтерсектин 1, передача мітогенного сигналу, SPRY2, домен SH3.

Intersectin 1 (ITSN1) is a multifunctional adaptor protein which is involved in endocytosis, exocytosis and cellular signaling and it is also associated with such pathologies as Down syndrome and Alzheimer’s disease. The aim of this study was to identify new ITSN1 protein partners which are implicated in membrane trafficking. Methods. In silico analysis by Scansite online resource had identified a GTPase activating protein oligophrenin 1 (OPHN1) as a potential partner of ITSN1 SH3A domain. GST pull-down and immunoprecipitation were used to prove complex formation between ITSN1 and OPHN1. Subcellular protein localization was determined by immunofluorescence and confocal microscopy. Results. We have shown that brain-specific and ubiquitously expressed SH3A domain isoforms of ITSN1 interact with OPHN1. ITSN1 and OPHN1 form complexes in both resting and stimulated to exocytosis PC12 cell line. Conclusions. GTPase activating protein OPHN1 and adaptor protein ITSN1 interact in PC12 cell line independently of exocytosis stimulation.

SH3 domains function as protein-protein interaction modules in assembly of signalling and endocytic protein complexes. Here we report investigations of the mechanism of regulation of the binding properties of the SH3 domains of intersectin (ITSN1) and Src kinase by alternative splicing. Comparative sequence analysis of ITSN1 and Src genes revealed the conservation of alternatively spliced microexons affecting the structure of the SH3 domains in vertebrates. We show that neuron-specific ITSN1 transcripts containing the microexon 20 that encodes five amino acid residues within the SH3A domain are expressed in zebrafish from the earliest stages of the development of the nervous system. Models of alternative isoforms of the ITSN1 SH3A domain revealed that the insertion encoded by the microexon is located at the beginning of the n-Src loop of this domain causing a shift of negatively charged amino acids towards the interaction interface. Mutational analysis confirmed the importance of translocation of these negatively charged amino acids for interaction with dynamin 1. We also identified a residue within the microexon-encoded insert in the SH3 domain of brain-specific variant of Src that abolishes interaction of the domain with dynamin 1. Thus microexons provide a mechanism for the control of tissue-specific interactions of ITSN1 and Src with their partners.

Intersectin 1 (ITSN1) is an adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis, apoptosis, signal transduction and cytoskeleton organization. Here, we show that ITSN1 forms a complex with adaptor protein Ruk/CIN85, implicated in downregulation of receptor tyrosine kinases. The interaction is mediated by the SH3A domain of ITSN1 and the third or fourth proline-rich blocks of Ruk/CIN85, and does not depend on epidermal growth factor stimulation, suggesting a constitutive association of ITSN1 with Ruk/CIN85. Moreover, both proteins colocalize in MCF-7 cells with their common binding partner, the ubiquitin ligase c-Cbl. The possible biological role of the interaction between ITSN1 and Ruk/CIN85 is discussed.

The localization of HIV-1 proviruses in compositional DNA fractions from 27 AIDS patients during the chronic phase of the disease with depletion of CD4+ and different levels of viremia showed the following. (1) At low viremia, proviruses are predominantly localized in the GC-richest isochores, which are characterized by an open chromatin structure; this result mimics findings on HIV-1 integration in early infected cells in culture. (2) At higher viremia, an increased distribution of proviruses in GC-poor isochores (which match the GC poorness of HIV-1) was found; this suggests a selection of cells in which the ‘isopycnic’ localization leads to a higher expression of proviruses and, in turn, to higher viremia. (3) At the highest viremia, integrations in GC-rich isochores are often predominant again, but generally not at the same level as in (1); this may be the consequence of new integrations from the extremely abundant RNA copies.

An electron microscopic investigation of a DNA product synthesized on the pre-mRNA template using AMV reverse transcriptase in the absence of actinomycin D revealed linear single-stranded and double-stranded molecules, and, also, double-stranded branched as well as 'lasso'-like and circular structures. Models for the formation of such DNA structures are proposed.

The reverse transcription of pre-mRNA isolated from rat liver or mouse Ehrlich ascites carcinoma cells with the aid of hot phenol fractionation technique is described. Pre-mRNA isolated at 85 degrees C is a more active template than the 65 degree C fraction. The addition of oligo(dT) as a primer strongly stimulated the template activity of the 65 degree C fraction. The size of product corresponds to a sedimentation value of 7 S as measured in alkaline sucrose gradient and is essentially less than the size of template.