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In this study, key parameters of the innate immune system were studied in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of 13 healthy volunteers aged 22 to 32 years before and after vaccination against the yellow fever virus, i.e. YF-17D, during a time window of 14 days. Using a combination of quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) analyses to determine the mRNA expression profiles of DDX58 (RIG-I) itself and of several IFN-inducible genes (ISGs), Western blot analyses to measure expression of RIG-I full length (RIG-I FL), RIG-I splice variant (RIG-I SV), and RIG-I short form (RIG-I SF) proteins, together with fluorescence-activated cell sorting (FACS) analyses to examine alterations in the relative number of key innate immune cells in the circulation, the following results were obtained: qRT-PCR analysis revealed a marked and transient induction of RIG-I mRNA and of the type I ISGs, i.e. IRF7 (IFN regulatory factor 7; IRF7), ISG15 (ISG15 ubiquitin-like modifier; ISG15), MX1 (MX dynamin-like GTPase 1; MX1), and CXCL10 (C-X-C motif ligand 10; IP-10): mRNAs of IRF7, ISG15, MX1, and CXCL10 were markedly and transiently up-regulated on days 3 and 7 after vaccination, while their expression returned to baseline levels on day 14; Western blot analyses revealed that RIG-I FL protein but not its isoforms RIG-I SV or RIG-I SF, were constitutively expressed before vaccination and its expression level was further transiently enhanced during the observation period. Both RIG-I SV and RIG-I SF were induced on day 3 with RIG-I SF peaking on day 7 with a still markedly elevated level on day 14. In contrast to RIG-I, protein expression of melanoma differentiation-associated gene 5 (MDA5) revealed inhibition at day 3 and thereafter though the protein of the virus sensor laboratory of genetics and physiology 2 (LGP2) showed similar kinetics as RIG-I, i.e. induction at days 3 and 7 and return at day 14 to prevaccination levels. These data are the first to demonstrate that RIG-I SF is induced after yellow fever vaccination in vivo. The data are compatible with the hypothesis that both RIG-I SV and RIG-I SF are critical endogenous negative feedback regulators of the type I IFN response to prevent its toxic overexpression. FACS analyses revealed that the relative number of all mononuclear cells in the circulation did not show a significant change within 14 days after vaccination. The relative number of CD14+/CD16- classical monocytes, however, was transiently down-regulated whereas the relative number of CD14+/CD16+ proinflammatory monocytes was significantly up-regulated on day 7. The relative number of all dendritic cells (DCs) remained unchanged during the course of the study. However, CD141+ classical DCs (cDCs; the mouse homologue of CD8+ DCs) were significantly reduced on days 3 and 7. In sharp contrast, CD1c+ cDCs were elevated on day 14 whereas the relative number of plasmacytoid DCs (pDCs) among all DCs was markedly reduced on day 14. Moreover, we observed upregulation of HLA-DR and CD86 of CD14+/CD16- and in CD14+/CD16+ monocytes and of HLA-DR in CD141-/CD1c+ cDCs and of CD86 in CD141+/CD1c- cDCs. In summary, these data reveal that both RIG-I mRNA and RIG-I FL protein are constitutively expressed in young healthy individuals before vaccination with significant transient changes during the observation period after immunization. Moreover, vaccination led to a significant upregulation of RIG-I mRNA and their respective proteins though RIG-I SF remained markedly elevated on day 14. Furthermore, vaccination was associated with significant upregulation of a series of classical ISGs. These data show that yellow fever vaccination in healthy young adults is associated with significant upregulation of ISGs and their cellular constituents in a scenario to ensure strong IFN responses while restricting toxic and overshooting responses at later time points. Although the regulation of RIG-I is arguably complex, the data obtained in this study indicate that RIG-I SV and RIG-I SF may represent hitherto unrecognized physiologically important negative feedback regulators of the type I IFN response. These data open the possibility to test new therapeutic strategies in diseases with aberrant type I IFN responses to either promote or to inhibit expression of RIG-I SF. In dieser Arbeit wurden Schlüsselparameter des Immunsystems in mononukleären Zellen des peripheren Bluts (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) von 13 gesunden Probanden im Alter von 22-32 Jahren vor und nach einer Impfung mit dem Gelbfieberimpfstoff YF-17D innerhalb eines Zeitfensters von 14 Tagen untersucht. Durch eine Kombination von quantitativer Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) und Western Blot Analysen wurde die Expression der Isoformen des Virussensors Retinoic-acid inducible gene RIG-I full length (RIG-I FL); RIG-I splice variant (RIG-I SV) und RIG-I short form (RIG-I SF), der Typ I Interferon (IFN)-induzierbaren Gene (ISGs) IRF7 (IFN regulatory factor 7; IRF7), ISG15 (ISG15 ubiquitin-like modifier; ISG15), MX1 (MX dynamin-like GTPase 1; MX1) und CXCL10 (C-X-C motif ligand 10; IP-10) untersucht. Zusätzlich wurde die Frequenz zentraler zirkulierender Immunzellen des angeborenen Immunsystems mittels Durchflußzytometrie bestimmt. Die mRNA der Typ I IFN ISGs RIG-I, IRF7, ISG15, MX1 und CXCL10 wurden an den Tagen 3 und 7 signifikant induziert und kehrten am Tag 14 zum Ausgangsniveau zurück; vor der Impfung (Tag 0) wurde das RIG-I FL Protein, nicht aber die RIG-I SV oder RIG-I SF Proteine, konstitutiv exprimiert. Am Tag 3 nach der Gelbfieberimpfung zeigte sich ein Anstieg der RIG-I SV und der RIG-I SF Proteine mit einem Gipfel der RIG-I SF am Tag 7 und einem anhaltend signifikant erhöhten Niveau dieser RIG-I Variante am Tag 14. Im Gegensatz zur Regulation von RIG-I zeigte sich bei der Regulation des Virussensors melanoma differentiation-associated gene 5 (MDA5) Proteins eine Inhibition am Tag 3, 7 und 14, während für das Protein des Virussensors laboratory of genetics and physiology 2 (LGP2) eine ähnliche Kinetik wie bei RIG-I beobachtet werden konnte, d.h. eine Aufregulation an den Tagen 3 und 7 und eine Rückkehr zum Ausgangsniveau am Tag. 14. Die Prozentsätze der Monozyten und dendritischen Zellen (DC) innerhalb der PBMCs sowie der unterschiedlichen Monozyten und DC Subpopulationen wurden am Tag 0, 1, 3, 7 und 14 durchflusszytometrisch bestimmt. Zum Zeitpunkt 7 Tage nach der Impfung konnte in Korrelation mit der höchsten Expression der ISGs eine signifikante relative Reduktion der klassischen cluster of differentiation (CD) 14+/CD16- Monozyten und ein signifikanter Anstieg der inflammatorischen CD14+/CD16+ Monozyten nachgewiesen werden. Weiterhin zeigte sich ein signifikanter Abfall der CD141+ cDCs (konventionelle DCs) am Tag 3 und 7, während CD1c+ cDCs am Tag 14 signifkant anstiegen und die plasmazytoiden DCs (pDCs) am Tag 14 deutlich abfielen. Außerdem konnte sowohl eine Aufregulation von HLA-DR als auch von CD86 bei CD14+/CD16- und bei CD14+/CD16+ Monozyten und von HLA-DR bei CD141-/CD1c+ cDCs und von CD86 bei CD141+/CD1c- cDCs nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der Arbeit zeigen, dass RIG-I FL konstitutiv in PBMCs nichtgeimpfter gesunder Probanden exprimiert wird und seine Expression sich während des Beobachtungszeitraums transient erhöht. Die Impfung mit dem Gelbfieberimpfstoff führt zu einer differentiellen Induktion der RIG-I SV und RIG-I SF Proteine, deren erhöhte Expression auch 14 Tage nach der Impfung, also über den Zeitpunkt der höchsten Expression der ISGs hinaus, anhielt. Da weder RIG-I SV noch RIG-I SF RNA Viren binden, sondern die Stimulation des Virussensors RIG-I durch virale RNA kompetitiv inhibieren, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass eine zu starke Typ I IFN Induktion durch die Induktion der endogenen Inhibitoren des RIG-I Signalwegs (RIG-I SV und RIG-I SF) verhindert werden kann. Diese Daten zeigen erstmals, dass RIG-I SF durch die Gelbfieberimpfung in vivo induziert wird und deshalb als negativer Feedbackmediator von RIG-I FL agieren könnte. Durch die Ergebnisse wird die Hypothese unterstützt, dass in der frühen Immunantwort auf die Gelbfieberimpfung die Typ I IFN Antwort durch die Autoregulation des RIG-I Signalwegs kontrolliert wird. Bei Erkrankungen, die mit einer aberranten Regulation von Typ I IFN einhergehen, könnte die Induktion oder Suppression der RIG-I SF eine bisher unerkannte Interventionsmöglichkeit darstellen.

We show here that CD4+ T cell immune responses occur within a probabilistic framework, in which T cell receptor avidity to cognate peptide modulates the likelihood of T cells to divide or differentiate. Wir zeigen hier, dass CD4+ T-Zell-Immunantworten in einem probabilistischen Rahmen stattfinden, in dem die T-Zellrezeptor-Avidität zu einem spezifischen Peptid die Wahrscheinlichkeit moduliert mit der sich eine T-Zelle teilt oder differenziert.

T cells are a major component of the adaptive immune system. They recognize peptide antigens in the context of MHC molecules (pMHC) with their T cell receptor (TCR). The efficiency by which a T cell can react to antigen encounter is dependent on functional and structural factors, especially the physical binding strength of the TCR to the pMHC. Since this parameter could not be precisely determined before, we developed a novel assay system for the measurement of TCR binding strengths that is based on a reversible MHC multimer staining technique. Using this assay system we could show that T cell function is to a large degree dependent on TCR binding strength, and took first steps towards the use of highly functional T cells as therapeutic agents. T-Zellen stellen eine Hauptkomponente des adaptiven Immunsystems dar. Sie erkennen mit ihrem T-Zellrezeptor (TCR) Peptidantigene im Kontext von MHC Molekülen (pMHC). Die Effizienz mit der eine T-Zelle auf Antigenkontakt reagieren kann hängt von funktionellen und strukturellen Faktoren ab, insbesondere von der physikalischen Bindungsstärke zwischen TCR und pMHC. Da dieser Parameter bisher nicht präzise bestimmt werden konnte, haben wir eine neue Messmethode zur Bestimmung der TCR-Bindungsstärke entwickelt, die auf reversibler MHC-Multimerfärbung beruht. Mit Hilfe dieser neuen Methode konnten wir zeigen, dass T-Zellfunktion in hohem Masse von der TCR-Bindungsstärke abhängt und haben erste Schritte hin zu einer Nutzung von hochfunktionellen T-Zellen als Therapeutikum unternommen.

The predominantly on NK cells and CD8+ T cells expressed activating receptor NKG2D binds several structurally diverse ligands, which are poorly expressed on “normal” resting cells, but can become upregulated on tumors and otherwise stressed or infected cells. Until now, only similar redundant stimulatory effects have been described for all NKG2D ligands. With this thesis work we show for the first time that distinct NKG2D ligands (H60 and MICA-8) can also act as strong suppressors on the proliferation of CD8+ and CD4+ T cells independently of NKG2D itself. The inhibition leads to a reversible cell cycle arrest, suggesting a physiologically relevant regulatory function. Our novel findings provide new explanations, how the expression of distinct NKG2D ligands could become a selective advantage for tumor cells. Der vor allem auf NK und CD8+ T-Zellen exprimierte aktivierende Rezeptor NKG2D bindet mehrere strukturell verschiedene Liganden, die nur schwach auf “normalen” ruhenden Zellen exprimiert werden, jedoch auf Tumoren sowie anderweitig gestressten Zellen heraufreguliert werden. Bisher wurden für alle NKG2D Liganden nur ähnliche stimulatorische Effekte beschrieben. Mit dieser Dissertation zeigen wir zum ersten Mal, dass bestimmte NKG2D Liganden (H60 und MICA-8) auch stark supprimierend und unabhängig von NKG2D auf die Proliferation von CD8+ and CD4+ T-Zellen einwirken können. Die Hemmung erfolgt über einen reversiblen Zellzyklusarrest, der eine physiologisch relevante regulatorische Funktion impliziert. Unsere Erkenntnisse liefern neue Erklärungen dafür, wie die Expression bestimmter NKG2D Liganden einen selektiven Vorteil für Tumorzellen darstellen könnte.

Der aktivierende Rezeptor NKG2D erkennt eine Reihe unterschiedlicher Liganden, die zumeist von gestressten Geweben und Tumoren überexprimiert werden. Bislang sind für alle Liganden gleichermaßen immunstimulatorische Effekte auf NK-Zellen und CD8+ T-Zellen beschrieben worden. Das NKG2D Rezeptor-/Liganden-System wurde deswegen als ein Sensorsystem zum Erkennen entstehender Tumoren und zur Aktivierung von Immunantworten interpretiert. In dieser Arbeit sollte die NKG2D-Liganden-Interaktion auf antigen-spezifische CD8+ T-Zellen charakterisiert werden. Dabei konnte erstmalig ein Unterschied zwischen einzelnen Liganden beschrieben werden. So führen die NKG2D-Liganden H60 und MICA im Gegensatz zu den ebenfalls untersuchten Liganden Rae1 und MULT1 zu einem stark suppressiven Effekt auf die T-Zell-Proliferation. Der von H60 und MICA ausgelöste Effekt benötigt IL-10 und wird über einen von NKG2D verschiedenen Rezeptor vermittelt. Diese Befunde könnten erklären, warum in vivo trotz hoher Expression von NKG2D-Liganden z.B. auf Tumoren gelegentlich keine effektiven Immunantworten ausgelöst werden können und stellt dabei einen Zusammenhang mit einer bestimmten Gruppe von NKG2D-Liganden her. The activating receptor NKG2D recognizes a wide range of different ligands, some of which are primarily expressed in "stressed" tissues or on tumor cells. Until now, similar stimulatory effects on natural killer and CD8+ T cells have been described for all NKG2D ligands, and the NKG2D receptor/ligand system has therefore been interpreted as a sensor system involved in tumor immune surveillance and activation of immune responses. The aim of this work was the characterization of the NKG2D receptor/ligand interactions on antigen-specific CD8+ T cells. For the first time differences between distinct ligands could be shown. The NKG2D ligands H60 and MIC class 1 chain-related protein A (MICA) in contrast to other ligands like Rae1 and MULT1 can also mediate strong suppressive effects on T cell proliferation. Responsiveness to H60- and MICA-mediated suppression requires IL-10 and involves a receptor other than NKG2D. These findings might provide explanations for the observation that strong in vivo NKG2D ligand expression, such as that on tumor cells, sometimes fails to support effective immune responses and links this observation to a distinct subgroup of NKG2D ligands.