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Fil: Storani, Alem. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. La biomasa lignocelulósica representa una excelente fuente para la producción de biocombustibles y bioproductos de manera ecológica y sustentable, pero sus características estructurales hacen que sea recalcitrante a la degradación. Sin embargo, diversas enzimas son capaces de llevar a cabo este proceso a partir de la complementariedad de su actividad. En este trabajo de Tesis se caracterizaron bioquímica y estructuralmente enzimas involucradas en la degradación de la lignocelulosa pertenecientes a Ruminococcus albus 8. Específicamente, la caracterización de RalCel5G evidenció un modo de acción de endoglucanasa procesiva. El empleo de esta enzima en simultaneo con la celobiohidrolasa RalCel48A evidenció un efecto sinérgico en la degradación de la celulosa. Por su parte, en la caracterización de la xilanasa GH10 (RalXyn10A) se detectó un dominio N-terminal particular, asociado la regulación redox de la actividad enzimática y a la interacción con sustratos. La aplicación de esta hemicelulasa en combinación con RalCel5G y RalCel48A mostró un incremento sustancial en la capacidad de hidrólisis de sustratos lignocelulósicos complejos. Finalmente, las glicosil fosforilasas RalCBP y RalCDP, mostraron elevada actividad con monosacáridos y oligosacáridos, respectivamente. La eficiencia de cada una de ellas fue mejorada a partir de la eliminación del dominio N-terminal o la fusión de un CBM, respectivamente. Los avances logrados en el conocimiento de estas enzimas y sobre los mecanismos de acción e interacciones con los diferentes sustratos, facilitan el desarrollo de diversas aplicaciones biotecnológicas tales como la producción de biocombustibles, biopolímeros y/u otros materiales. Lignocellulosic biomass represents an excellent source for the production of biofuels and bioproducts in an ecological and sustainable manner, but its structural characteristics make it recalcitrant to degradation. However, various enzymes are capable of carrying out this process based on the complementarity of their activity. In this Thesis work, enzymes involved in the degradation of lignocellulose belonging to Ruminococcus albus 8 were biochemically and structurally characterized. Specifically, the characterization of RalCel5G revealed a processive endoglucanase mode of action. The employment of this enzyme simultaneously with the cellobiohydrolase RalCel48A showed a synergistic effect on the degradation of cellulose. During the characterization of xylanase GH10 (RalXyn10A) a particular N-terminal domain was detected, associated with the redox regulation of the enzymatic activity and the interaction with substrates. The application of this hemicellulase in combination with RalCel5G and RalCel48A showed a substantial increase in the hydrolytic capacity of complex lignocellulosic substrates. Finally, the glycosyl phosphorylases RalCBP and RalCDP showed high activity with monosaccharides and oligosaccharides, respectively. The efficiency of each one was improved from the elimination of the N-terminal domain or the fusion of a CBM, respectively. The advances achieved in the knowledge of these enzymes and the action mechanism and interactions with the different substrates, facilitate the development of various biotechnological applications such as the production of biofuels, biopolymers and/or other materials. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas Universidad Nacional del Litoral

[ES] La creciente concienciación por parte de la sociedad sobre el problema que supone seguir contaminando el planeta al ritmo actual, ha aumentado la importancia de buscar alternativas sostenibles a los combustibles tradicionales. El bioetanol es uno de los biocombustibles más relevantes ya que se considera una alternativa limpia y renovable a la gasolina. El proceso de producción de bioetanol se basa en la fermentación de azúcares. En este caso, el foco se pone en bioetanol de segunda generación, el fabricado a partir de azúcares provenientes de biomasa lignocelulósica. Debido a la estructura compleja de la biomasa lignocelulósica, se debe aplicar un pretratamiento antes de la etapa de hidrólisis enzimática en la que se obtienen los azúcares a fermentar. Sin embargo, debido a las condiciones de altas temperaturas y presión durante la etapa de pretratamiento, se forman inhibidores que disminuyen el rendimiento de producción de azúcar y en consecuencia de bioetanol. En este trabajo se pretende estudiar la eficiencia del uso de la lacasa como detoxificante, con el fin de eliminar dichos inhibidores, para que la producción de bioetanol de segunda generación sea económicamente viable., [EN] Increasing awareness by society on the problem posed by contamination of our planet at the current rate, has increased the importance of looking for alternatives to traditional fuels. Bioethanol is today one of the most relevant biofuels, as it is considered a clean and renewable alternative to gasoline. The process of bioethanol production is based on the fermentation of sugars. In this case, the focus is put on second generation bioethanol, whose source of sugars comes from lignocellulosic biomass. Due to the complex 3D structure of lignocellulosic biomass, a pretreatment is needed before the enzymatic hydrolysis step in which the sugars to be fermented are obtained. However, due to the high temperature and pressure to which biomass is exposed during pretreatment, inhibitors are formed which lower the yield of sugar and in consequence the yield of bioethanol. This thesis aims to study the effect of laccase as a detoxification method, with the goal of eliminating such inhibitors as to make the production of second generation bioethanol economically viable.

[ES] La revalorización de residuos es un tema que va ganando importancia cada día, ya que la concienciación sobre el medio ambiente y las leyes más restrictivas respecto a la gestión de residuos van en aumento. Por ello, en este trabajo se intenta realizar la revalorización de tres residuos en concreto, el alga Poseidonia, típica de las playas del mediterráneo, la paja de arroz, un residuo generado en la recolección del arroz y algodón reciclado. La revalorización se trata de la conversión de estos residuos en nanocelulosa, la cual también está tomando importancia debido a sus propiedades mecánicas, su biocompatibilidad y sostenibilidad, a través de un método más sostenible, el tratamiento enzimático utilizando celulasa. Además, ese tratamiento se realiza con celulasa suelta e inmovilizada en nanopartículas de hierro, lo cual permite su recuperación y reutilización, mejorando la eficiencia del proceso y reduciendo el alto coste de la enzima. Previamente al tratamiento enzimático se debe realizar un pretratamiento con NaOH y NaClO2 al alga y a la paja de arroz para mejorar la eficacia de la hidrólisis enzimática, y al algodón únicamente se le realiza un descrudado. Para la caracterización de los materiales resultantes del tratamiento, se realizaron análisis de DLS, FTIR y FESEM. Los ensayos se realizaron sobre los materiales, tras el pretratamiento para determinar si el pretratamiento había sido eficaz, a los materiales tratados con dos concentraciones diferentes de enzima, con el objetivo de determinar si se había obtenido nanocelulosa y de que tamaño, y a las fases de la inmovilización con el fin de determinar si se había realizado correctamente. Los resultados obtenidos del FTIR y el FESEM permiten concluir que los pretratamientos cumplían su función, limpiando y disgregando los materiales, mejorando así la eficacia del tratamiento enzimático. La obtención de la nanocelulosa se consiguió cuando la cantidad de enzima era mayor. Es destacable que se obtuvieron nanopartículas de celulosa cuando la enzima estaba suelta y films de azúcares cuando la enzima estaba inmovilizada y a concentraciones elevadas, es decir, la presencia del hierro actúa como catalizador derivando en degradación excesiva. También se consiguió demostrar que la inmovilización de la enzima era correcta gracias al DLS. Sin embargo, no se consiguió obtener, con el procedimiento empleado rendimientos de nanocelulosa., [EN] The reconversion of waste is an issue that is gaining importance every day, since awareness about the environment and the most restrictive laws regarding waste management are increasing. Therefore, this work attempts to revalue three specific wastes, Poseidonia algae, typical of Mediterranean beaches, rice straw, a waste generated while rice harvesting, and recycled cotton. Specifically, these residues are going to be converted into nanocellulose, which is also gaining importance due to its mechanical properties, biocompatibility, and sustainability, through a more sustainable method, an enzymatic treatment using cellulase. In addition, this treatment is carried out with cellulase alone and immobilized in iron nanoparticles, which allows its recovery and reuse, improving the efficiency of the process and reducing the high cost of the enzyme. Prior to the enzymatic treatment, a pretreatment with NaOH and NaClO2 should be carried out on the algae and rice straw to improve the effectiveness of the enzymatic hydrolysis, and cotton is only going to be cleaned. For the treatment resulting materials characterization DLS, FTIR and FESEM analyses were performed. The essays were performed on the pre-treated materials to determine whether the pretreatment had been effective, on the materials treated with two different concentrations of enzyme, with the aim of determining whether nanocellulose had been obtained and its size, and on the immobilization phases in order to determine if it had been carried out correctly. The results obtained from the FTIR and the FESEM allow to conclude that pretreatments fulfilled their function, cleaning and disintegrating the materials, thus improving the efficiency of the enzymatic treatment. The nanocellulose obtention was achieved when the amount of enzyme was greater. It should be noted that cellulose nanoparticles were obtained when the enzyme was alone and sugar films when the enzyme was immobilized and in high concentrations, which means that iron presence acts as a catalyst producing excessive degradation. It was also possible to demonstrate that the immobilization of the enzyme was correct thanks to DLS. However, nanocellulose yields were not achieved with the followed procedure.

The Brazilian savanna, known as the Cerrado, is a biome with a high degree of endemism, with the potential to house many microorganisms suitable for biotechnological exploitation, especially fungi. The Cerrado soil, which is usually acidic, is a favorable environment for the growth of fungi capable of degrading lignocellulosic materials. The aim of the present study was to isolate cellulolytic filamentous fungi native to the Cerrado. Samples of soil and leaf litter were collected in three points of Cerrado State Park, located in the South of Brazil, during the rainy season in September 2014. Samples were stored in sterile plastic bags, transported at room temperature and kept at 4 ºC for three days. Filamentous fungi were isolated by successive inoculations in PDA (maintained at 30 ºC). Cellulase activity was tested in CMC (carboxymethyl cellulose) medium and lipase activity was assessed in medium containing phenol red and tween 20 (incubated at 37 °C), and in medium supplemented with Rhodamine B (kept at 30 °C). We isolated a total of 28 strains, 25 produced cellulase, detected with lugol in strains grown in CMC medium. The isolates were identified morphologically (color, form of growth) and by sequencing of the 18S rRNA region, with both techniques producing congruent results. One strain of Colletotrichum boninense and one strain of Trichoderma sp., both isolated from soil samples, presented the highest cellulolytic activity. All strains exhibited lipolytic activity, with enzyme production and activity influenced by temperature. The present study revealed new strains of known filamentous fungi that can be applied in biomass degradation. These strains are suitable for optimization of culture conditions, which could lead to the economic feasibility of the process. Rev. Biol. Trop. 66(1): 237-245. Epub 2018 March 01. Resumen La sabana brasileña conocida como Cerrado, es un bioma con alto grado de endemismo con el potencial de albergar muchos microorganismos de alto interés biotecnológico. Los hongos producen muchas enzimas que se aplican ampliamente en procesos industriales. El suelo del Cerrado, que suele ser ácido, es un ambiente favorable para el crecimiento de hongos capaces de degradar materiales lignocelulósicos. El objetivo del presente estudio fue aislar los hongos celulolíticos filamentosos nativos del Cerrado. Muestras de suelo y de hojarasca fueron recolectadas en el Parque Estatal del Cerrado, ubicado en el sur de Brasil. De 28 cepas aisladas, 25 produjeron celulasa que fue detectada con lugol. Las cepas fueron cultivadas en medio CMC (carboximetilcelulosa). Los aislados fueron identificados morfológicamente (color, forma de crecimiento) y por secuenciación de la región 18S rRNA, produciendo resultados congruentes. Una cepa de Colletotrichum boninense y una cepa de Trichoderma sp., ambas aisladas de muestras de suelo, presentaron la mayor actividad celulolítica. Todas las cepas mostraron actividad lipolítica, la producción y la actividad se vieron influidos por la temperatura. El presente estudio revela nuevas cepas de hongos filamentosos conocidos con potencial de aplicación en la degradación de la biomasa, sin embargo, la optimización de las condiciones de cultivo es necesaria para lograr la viabilidad económica.

La disposición indiscriminada de residuos sólidos urbanos continúa generando problemas ambientales en varios países. El objetivo de esta investigación fue desarrollar un inóculo de hongos celulolíticos y evaluar su efectividad en el compostaje de residuos orgánicos. El estudio incluyó muestras de suelo de bosques y de fincas productoras de cereales y de composteras. De cada muestra, se prepararon diluciones hasta 10-4. De cada dilución, se inocularon tubos que contenían medio mineral líquido y una tira de papel filtro. De las tiras de papel que indicaron presencia de microorganismos, se realizaron subcultivos, primero en medio papa dextrosa agar y, luego, en medio sólido mineral, con celulosa, como fuente de C. Los aislamientos obtenidos fueron evaluados por su capacidad celulolítica y los que mostraron mayor capacidad probados por su compatibilidad para crecimiento. Del total de 39 aislamientos, 32, se identificaron como Penicillium sp.; tres, como Trichoderma sp.; uno, como Mucor sp.; uno, como Chaetomium sp.; uno, como Verticillium sp. y, uno, como Trichurus sp. Los aislamientos difirieron en su capacidad celulolítica, 10 aislamientos no mostraron halo de hidrólisis y, en los 29 restantes, la amplitud del halo varió entre 0,10 y 0,7cm. Con base en la capacidad celulolítica y compatibilidad el inóculo fue conformado con los aislamientos 21 (Trichoderma sp.) y 62 y 66 (Penicillium sp.). La inoculación con los hongos celulolíticos seleccionados o con los microorganismos de los productos comerciales EM® y Agroplux® no produjo efectos en el proceso de compostaje, que se diferencien significativamente de los producidos naturalmente por los microorganismos nativos. The indiscriminate disposal of urban solid waste continues generating environmental problems in various countries. The objective of this research was to develop a fungal cellulolytic inoculum and evaluate its effectiveness in the composting of organic solid residues. The study included soil samples from native forests and cereal producing farms and of compost piles. From each sample a serial dilution until 10-4 was prepared. From each dilution test tubes containing liquid mineral medium and a strip of filter paper were inoculated. From the filter paper strips which showed zones of degradation the microorganisms were streaked, first on potato dextrose agar medium and then on mineral agar medium, supplemented with cellulose as a source of C. The isolates obtained were evaluated for their cellulolytic capacity and those which showed greater capacity were tested for their compatibility for growth. Of the total of 39 isolates, 32 were identified as Penicillium sp., 3 as Trichoderma sp., 1 as Mucor sp., 1 as Chaetomium sp., 1 as Verticillium sp., and 1 as Trichurus sp. The isolates differed in their cellulolytic capacity, 10 did not show a halo of hydrolysis and in the other 29 the amplitude of the halo varied between 0,1 and 0,7cm. Based on the cellulolytic capacity and compatibility the inoculum was generated with the isolates 21 (Trichoderma sp.) and 62 and 66 (Penicillium sp.). The inoculation with the selected cellulolytic fungal isolates or with the EM® and Agroplux® microorganisms did not produce effects significantly different to those which are naturally produced by the native microorganisms in the composting process.

690 p., Esta Tesis introduce en primer lugar, las características de las enzimas -naturaleza, mecanismo, correcta manipulación, etc.- y sus usos en procesos de restauración de obras de arte. En segundo lugar, esta investigación incluye un estudio del papel -historia, composición, fabricación, degradación y restauración-. Posteriormente, se explican los materiales y métodos para llevar a cabo la investigación sobre consolidación celulósica con enzimas: papeles, sustancias, instrumentación cámaras climáticas, CCD, microscopio electrónico, etc.-, preparación de probetas y aplicación de un nuevo método para conocer la degradación de materiales celulósicos. Y para finalizar, las dos últimas partes de la investigación describen el desarrollo de un método de consolidación de celulosa del papel, a partir de la síntesis de la celulosa con una enzima hidrolítica: la celulasa. Ésta actúa como una sintetasa, consolidando el papel envejecido de forma natural o artificial, cuando es mezclada en una solución disolvente orgánico en un tampón, en la relación (4:1) en presencia de un sustrato (ß-celobiosa fluorada). Para mejorar el tratamiento se añadió un gel con los reactivos necesarios, se tuvo máximo cuidado en las condiciones de trabajo temperatura, pH- y se estudió el protocolo más adecuado para no afectar a papeles con diferentes técnicas pictóricas. Los resultados fueron positivos y se consiguió la consolidación del papel sin afectar la capa pictórica.

The objective of the study was to compare the efficiency of the in situ, in vitro and enzymatic (cellulose) techniques in estimating the digestibility of forage with different nutritional quality in sheep. Samples of three qualities of forage were collected: high (rye grass of 2-4 weeks), medium (rye grass of 8 weeks and alfalfa hay), and low (oat straw). The samples were dried, grounded and passed through 1 mm sieve for the in vitro and cellulose technique and 3 mm sieve for the in situ technique. The in vitro digestibility of dry matter (IVDDM), in situ digestibility of dry matter (ISDDM), and cellulose digestibility of dry matter (CDDM) were determined. Three adult rams with ruminal fistula and fed with a diet based on alfalfa hay and corn stalk. A complete randomized 4 x 3 experimental design (4 quality forages and 3 techniques) was used. The ISDDM was higher (p, Se comparó los resultados de las técnicas in vitro, in situ y enzimática (celulasa) para estimar la digestibilidad de forrajes de diferente calidad nutritiva en ovinos. Se colectó muestras de forraje de tres calidades: alta (rye grass de 2-4 semanas), media (rye grass de 8 semanas y heno de alfalfa) y baja (paja de avena). Las muestras fueron secadas, molidas y pasaron por tamiz de 1 mm para la técnica in vitro y celulasa y 3 mm para la técnica in situ. Se determinó la digestibilidad in vitro de la materia seca (DIVMS), digestibilidad in situ de la materia seca (DISMS) y digestibilidad a la celulasa de la materia seca (DCMS). Se emplearon tres ovinos con fístula ruminal y alimentados con maíz forrajero y heno de alfalfa. Se usó un diseño experimental con arreglo factorial de 4 x 3 (4 calidades de forraje y 3 técnicas). La DISMS fue superior (p