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Fil: Storani, Alem. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. La biomasa lignocelulósica representa una excelente fuente para la producción de biocombustibles y bioproductos de manera ecológica y sustentable, pero sus características estructurales hacen que sea recalcitrante a la degradación. Sin embargo, diversas enzimas son capaces de llevar a cabo este proceso a partir de la complementariedad de su actividad. En este trabajo de Tesis se caracterizaron bioquímica y estructuralmente enzimas involucradas en la degradación de la lignocelulosa pertenecientes a Ruminococcus albus 8. Específicamente, la caracterización de RalCel5G evidenció un modo de acción de endoglucanasa procesiva. El empleo de esta enzima en simultaneo con la celobiohidrolasa RalCel48A evidenció un efecto sinérgico en la degradación de la celulosa. Por su parte, en la caracterización de la xilanasa GH10 (RalXyn10A) se detectó un dominio N-terminal particular, asociado la regulación redox de la actividad enzimática y a la interacción con sustratos. La aplicación de esta hemicelulasa en combinación con RalCel5G y RalCel48A mostró un incremento sustancial en la capacidad de hidrólisis de sustratos lignocelulósicos complejos. Finalmente, las glicosil fosforilasas RalCBP y RalCDP, mostraron elevada actividad con monosacáridos y oligosacáridos, respectivamente. La eficiencia de cada una de ellas fue mejorada a partir de la eliminación del dominio N-terminal o la fusión de un CBM, respectivamente. Los avances logrados en el conocimiento de estas enzimas y sobre los mecanismos de acción e interacciones con los diferentes sustratos, facilitan el desarrollo de diversas aplicaciones biotecnológicas tales como la producción de biocombustibles, biopolímeros y/u otros materiales. Lignocellulosic biomass represents an excellent source for the production of biofuels and bioproducts in an ecological and sustainable manner, but its structural characteristics make it recalcitrant to degradation. However, various enzymes are capable of carrying out this process based on the complementarity of their activity. In this Thesis work, enzymes involved in the degradation of lignocellulose belonging to Ruminococcus albus 8 were biochemically and structurally characterized. Specifically, the characterization of RalCel5G revealed a processive endoglucanase mode of action. The employment of this enzyme simultaneously with the cellobiohydrolase RalCel48A showed a synergistic effect on the degradation of cellulose. During the characterization of xylanase GH10 (RalXyn10A) a particular N-terminal domain was detected, associated with the redox regulation of the enzymatic activity and the interaction with substrates. The application of this hemicellulase in combination with RalCel5G and RalCel48A showed a substantial increase in the hydrolytic capacity of complex lignocellulosic substrates. Finally, the glycosyl phosphorylases RalCBP and RalCDP showed high activity with monosaccharides and oligosaccharides, respectively. The efficiency of each one was improved from the elimination of the N-terminal domain or the fusion of a CBM, respectively. The advances achieved in the knowledge of these enzymes and the action mechanism and interactions with the different substrates, facilitate the development of various biotechnological applications such as the production of biofuels, biopolymers and/or other materials. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas Universidad Nacional del Litoral

[ES] La creciente concienciación por parte de la sociedad sobre el problema que supone seguir contaminando el planeta al ritmo actual, ha aumentado la importancia de buscar alternativas sostenibles a los combustibles tradicionales. El bioetanol es uno de los biocombustibles más relevantes ya que se considera una alternativa limpia y renovable a la gasolina. El proceso de producción de bioetanol se basa en la fermentación de azúcares. En este caso, el foco se pone en bioetanol de segunda generación, el fabricado a partir de azúcares provenientes de biomasa lignocelulósica. Debido a la estructura compleja de la biomasa lignocelulósica, se debe aplicar un pretratamiento antes de la etapa de hidrólisis enzimática en la que se obtienen los azúcares a fermentar. Sin embargo, debido a las condiciones de altas temperaturas y presión durante la etapa de pretratamiento, se forman inhibidores que disminuyen el rendimiento de producción de azúcar y en consecuencia de bioetanol. En este trabajo se pretende estudiar la eficiencia del uso de la lacasa como detoxificante, con el fin de eliminar dichos inhibidores, para que la producción de bioetanol de segunda generación sea económicamente viable., [EN] Increasing awareness by society on the problem posed by contamination of our planet at the current rate, has increased the importance of looking for alternatives to traditional fuels. Bioethanol is today one of the most relevant biofuels, as it is considered a clean and renewable alternative to gasoline. The process of bioethanol production is based on the fermentation of sugars. In this case, the focus is put on second generation bioethanol, whose source of sugars comes from lignocellulosic biomass. Due to the complex 3D structure of lignocellulosic biomass, a pretreatment is needed before the enzymatic hydrolysis step in which the sugars to be fermented are obtained. However, due to the high temperature and pressure to which biomass is exposed during pretreatment, inhibitors are formed which lower the yield of sugar and in consequence the yield of bioethanol. This thesis aims to study the effect of laccase as a detoxification method, with the goal of eliminating such inhibitors as to make the production of second generation bioethanol economically viable.

[ES] La revalorización de residuos es un tema que va ganando importancia cada día, ya que la concienciación sobre el medio ambiente y las leyes más restrictivas respecto a la gestión de residuos van en aumento. Por ello, en este trabajo se intenta realizar la revalorización de tres residuos en concreto, el alga Poseidonia, típica de las playas del mediterráneo, la paja de arroz, un residuo generado en la recolección del arroz y algodón reciclado. La revalorización se trata de la conversión de estos residuos en nanocelulosa, la cual también está tomando importancia debido a sus propiedades mecánicas, su biocompatibilidad y sostenibilidad, a través de un método más sostenible, el tratamiento enzimático utilizando celulasa. Además, ese tratamiento se realiza con celulasa suelta e inmovilizada en nanopartículas de hierro, lo cual permite su recuperación y reutilización, mejorando la eficiencia del proceso y reduciendo el alto coste de la enzima. Previamente al tratamiento enzimático se debe realizar un pretratamiento con NaOH y NaClO2 al alga y a la paja de arroz para mejorar la eficacia de la hidrólisis enzimática, y al algodón únicamente se le realiza un descrudado. Para la caracterización de los materiales resultantes del tratamiento, se realizaron análisis de DLS, FTIR y FESEM. Los ensayos se realizaron sobre los materiales, tras el pretratamiento para determinar si el pretratamiento había sido eficaz, a los materiales tratados con dos concentraciones diferentes de enzima, con el objetivo de determinar si se había obtenido nanocelulosa y de que tamaño, y a las fases de la inmovilización con el fin de determinar si se había realizado correctamente. Los resultados obtenidos del FTIR y el FESEM permiten concluir que los pretratamientos cumplían su función, limpiando y disgregando los materiales, mejorando así la eficacia del tratamiento enzimático. La obtención de la nanocelulosa se consiguió cuando la cantidad de enzima era mayor. Es destacable que se obtuvieron nanopartículas de celulosa cuando la enzima estaba suelta y films de azúcares cuando la enzima estaba inmovilizada y a concentraciones elevadas, es decir, la presencia del hierro actúa como catalizador derivando en degradación excesiva. También se consiguió demostrar que la inmovilización de la enzima era correcta gracias al DLS. Sin embargo, no se consiguió obtener, con el procedimiento empleado rendimientos de nanocelulosa., [EN] The reconversion of waste is an issue that is gaining importance every day, since awareness about the environment and the most restrictive laws regarding waste management are increasing. Therefore, this work attempts to revalue three specific wastes, Poseidonia algae, typical of Mediterranean beaches, rice straw, a waste generated while rice harvesting, and recycled cotton. Specifically, these residues are going to be converted into nanocellulose, which is also gaining importance due to its mechanical properties, biocompatibility, and sustainability, through a more sustainable method, an enzymatic treatment using cellulase. In addition, this treatment is carried out with cellulase alone and immobilized in iron nanoparticles, which allows its recovery and reuse, improving the efficiency of the process and reducing the high cost of the enzyme. Prior to the enzymatic treatment, a pretreatment with NaOH and NaClO2 should be carried out on the algae and rice straw to improve the effectiveness of the enzymatic hydrolysis, and cotton is only going to be cleaned. For the treatment resulting materials characterization DLS, FTIR and FESEM analyses were performed. The essays were performed on the pre-treated materials to determine whether the pretreatment had been effective, on the materials treated with two different concentrations of enzyme, with the aim of determining whether nanocellulose had been obtained and its size, and on the immobilization phases in order to determine if it had been carried out correctly. The results obtained from the FTIR and the FESEM allow to conclude that pretreatments fulfilled their function, cleaning and disintegrating the materials, thus improving the efficiency of the enzymatic treatment. The nanocellulose obtention was achieved when the amount of enzyme was greater. It should be noted that cellulose nanoparticles were obtained when the enzyme was alone and sugar films when the enzyme was immobilized and in high concentrations, which means that iron presence acts as a catalyst producing excessive degradation. It was also possible to demonstrate that the immobilization of the enzyme was correct thanks to DLS. However, nanocellulose yields were not achieved with the followed procedure.

It was isolated bacteria strains from three different types of samples: fresh water, in situ baits and ex situ enrichment. Serial dilutions were prepared and culture was carried at 50 °C using a Basal-Saline medium. Isolated strains were screened for endoglucanase and xylanase activities with qualitative (Congo Red) and quantitative (DNS) methods. Molecular 16S rDNA sequencing analysis was performed for taxonomic identification. It was isolated 31 strains of which 14 showed hydrolytic activities and belonged to Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis species. Moreover, the strain B. subtilis DCH4 showed the highest endoglucanase activity at 45°C and pH 5, and xylanase activity at 55°C and pH 6. Then, DCH4 was cultivated by submerged fermentation with two different media supplemented with sugar cane bagasse, wheat straw, or quinoa stalk to evaluate its saccharification capability. Likewise, it was screening its xylanase and cellulase genes employing specific primers; the amplicons obtained were sequenced, and analyzed. It was found that, enzymatic extracts of DCH4 prepared with cane bagasse or quinoa stalk media achieved the highest endoglucanase and xylanase activities. According to molecular analysis of genes involved in the hydrolytic process, the endoglucanase and xylanase activities exhibited by DCH4 could be attributed to a bifunctional cellulase conformed by endo-beta-1,4-glucanase (GH5) joined to cellulose binding domain 3 (CBM3), and an endo-1,4-beta-xylanase (GH11), respectively. Further transcriptomic experiments would be considered to accomplish optimization strategies for biofuel production from lignocellulosic biomass., Se aislaron cepas de bacterias provenientes de tres tipos de muestras: agua fresca, cebos enriquecidos in situ y ex situ. Se prepararon diluciones seriadas y el cultivo fue a 50 °C usando un medio Salino-Basal. Las cepas aisladas fueron tamizadas para las actividades endoglucanasa y xilanasa con métodos cualitativos (Rojo Congo) y cuantitativos (DNS). Se usó el análisis molecular 16S rDNA para la identificación taxonómica. Se aislaron 31 cepas, de las cuales 14 mostraron actividades hidrolíticas y pertenecían a Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis. Además, B. subtilis DCH4 mostró la mayor actividad endoglucanasa a 45 °C y pH 5, y xilanasa a 55 °C y pH 6. Entonces, DCH4 se cultivó por fermentación sumergida con dos medios diferentes suplementado con bagazo de caña de azúcar, paja de trigo o tallo de quinua para evaluar su capacidad de sacarificación. También, se exploraron los genes de xilanasa y celulasa mediante cebadores específicos; los amplicones obtenidos fueron secuenciados y analizados. Se encontró que los extractos enzimáticos de DCH4 preparados con bagazo de caña o tallos de quinua mostraron las actividades endoglucanasa y xilanasa más elevadas. De acuerdo a los análisis moleculares de los genes involucrados en el proceso hidrolítico, las actividades de endoglunacasa y xilanasa exhibidas por DCH4 podrían atribuirse a una celulasa bifuncional conformada por una endo-beta-1,4-glucanasa (GH5) unida al dominio celulosa 3 (CBM3), y una endo-1,4-beta-xilanasa (GH11), respectivamente. Posteriores experimentos transcriptómicos podrían ser considerados para lograr estrategias de optimización para la producción de biocombustibles a partir de biomasa lignocelulósica.

Pleurotus spp. are fungi capable of degrading lignocellulose material due to the excretion of enzymes with different industrial applications. This study aimed to investigate the influence of culture media on the production of mycelial biomass and the activity of laccase, cellulases, and xylanase of Pleurotus spp. Pleurotus citrinopileatus U16-23, P. djamor U16-20, U16-25, and U16-28, P. eryngii U16-30, P. ostreatus U16-22, and P. pulmonarius U16-21 were grown for 12 days at 28 ºC in malt extract medium (EM-20 g L-1), defined medium (MD glucose 10 g L-1 and yeast extract 2 g L-1), or in sugarcane bagasse (BC) medium equal to MD, but replacing glucose with bagasse (50 g L-1). The greatest growth occurred in the medium EM and P. djamor U16-25 was the strain that generated the greatest biomass (7.5 ± 0.1 g L-1). Most strains showed higher laccase activity in the MD medium and the greatests activities were P. djamor U16-25 (22243 ± 745 U L-1), and P. pulmonarius (20924 ± 46 U L-1). P. citrinopileatus and P. djamor U16-25 did not produce cellulases, but P. djamor U16-20 and P. eryngii produced the greatest cellulase activities in EM and MD media. All strains produced xylanase, and the highest activities were observed in the EM medium and P. djamor U16-28 (67154 ± 1597 U L-1) was the best producer. Pleurotus djamor U16-25 excelled as a producer of laccase and cellulase-free xylanase, revealing the potential for application in the paper and cellulose industry. Pleurotus spp. son hongos capaces de degradar la lignocelulosa debido a la excreción de enzimas con diferentes aplicaciones industriales. Este estudio tuvo como objetivo investigar la influencia de los medios de cultivo en la producción de biomasa micelial y la actividad de lacasa, celulasas y xilanasa de Pleurotus spp. Pleurotus citrinopileatus U16-23, P. djamor U16-20, U16-25 y U16-28, P. eryngii U16-30, P. ostreatus U16-22 y P. pulmonarius U16-21 se cultivaron durante 12 días a 28 ºC en medio extracto de malta (EM-20 g L-1), medio definido (MD glucosa 10 g L-1 y extracto de levadura 2 g L-1), o en medio de bagazo de caña de azúcar (BC) igual a MD, pero en sustitución de glucosa con bagazo (50 g L-1). El mayor crecimiento se presentó en el medio EM y P. djamor U16-25 fue la cepa que generó mayor biomasa (7.5 ± 0.1 g L-1). La mayoría de las cepas mostraron mayor actividad lacasa en el medio MD y las mayores actividades fueron P. djamor U16-25 (22243 ± 745 U L-1) y P. pulmonarius (20924 ± 46 U L-1). P. citrinopileatus y P. djamor U16-25 no produjeron celulasas, pero P. djamor U16-20 y P. eryngii produjeron las mayores actividades de celulasa en los medios EM y MD. Todas las cepas produjeron xilanasa, y las mayores actividades se observaron en el medio EM y P. djamor U16-28 (67154 ± 1597 U L-1) fue el mejor productor. Pleurotus djamor U16-25 se destacó como productor de de lacasa y xilanasa libre de celulasa, revelando el potencial de aplicación en la industria del papel y la celulosa. Pleurotus spp. são fungos capazes de degradar a lignocelulose graças à excreção de enzimas com diferentes aplicações industriais. O objetivo deste estudo foi avaliar a influência dos meios de cultivo na produção de biomassa micelial e na atividade de lacase, celulases e xilanase de Pleurotus spp. Pleurotus citrinopileatus U16-23, P. djamor U16-20, U16-25 e U16-28, P. eryngii U16-30, P. ostreatus U16-22 e P. pulmonarius U16-21 foram cultivados por 12 dias a 28 ºC em meio extrato de malte (EM-20 g L-1), meio definido (MD glicose 10 g L-1 e extrato de levedura 2 g L-1), ou em meio bagaço de cana-de-açúcar (BC) igual ao MD, mas substituindo glicose por bagaço (50 g L-1). O maior crescimento ocorreu no meio EM e P. djamor U16-25 a cepa que gerou mais biomassa (7,5 ± 0,1 g L-1). A maioria das cepas apresentou maior atividade de lacase no meio MD e as atividades maiores foram de P. djamor U16-25 (22243 ± 745 U L-1) e P. pulmonarius (20924 ± 46 U L-1). P. citrinopileatus e P. djamor U16-25 não produziram celulases, mas P. djamor U16-20 e P. eryngii produziram as maiores atividades de celulase nos meios EM e MD. Todas as cepas produziram xilanase em e as maiores atividades foram observadas no meio EM e P. djamor U16-28 (67154 ± 1597 U L-1) foi o maior produtor. Pleurotus djamor U16-25 se destacou como produtor de lacase e de xilanase livre de celulase revelando potencial para aplicação na indústria de papel e celulose.

El objetivo fue determinar el efecto de la aplicación de la enzima Celulasa fúngica en las cáscaras de plátano de seda (Musa paradisiaca) para la obtención de jarabe glucosado. Se estudió la hidrólisis enzimática de las cáscaras de plátano de seda al 30 % (p/v) a una temperatura constante de 50 °C. Las variables independientes para controlar fueron la Concentración de la enzima Celulasa fúngica (0,5 %, 1 % y 1,5 % p/v) y el Tiempo de hidrolisis (18, 24 y 30 horas). Las variables dependientes fueron el porcentaje de Azúcar Reductor y el porcentaje de Equivalente de Dextrosa (D.E.) de las muestras hidrolizadas enzimáticamente. El diseño experimental fue completamente al azar con modelo factorial 32. Se obtuvo jarabes glucosados a partir de cáscaras de plátano de seda por la hidrólisis enzimática de la Celulasa fúngica. Los mayores porcentajes de Azúcar Reductor y de Equivalente de Dextrosa se presentaron en la Concentración de Celulasa al 1,5 % (p/v) durante un Tiempo de hidrolisis de 30 horas con valores promedio de 15,5 % de porcentaje de Azúcar Reductor y de 30,9 % de porcentaje de Equivalente de Dextrosa. En la hidrólisis enzimática con Celulasa fúngica al 1,5 % (p/v) y 30 horas se obtuvo un producto de mayor valor agregado, se definieron las condiciones de operación y las etapas del proceso que deberían ser adaptadas para la producción de jarabe glucosado a partir de cáscaras de plátano (Musa paradisiaca). The objective was to determine the effect of the application of the fungal cellulase enzyme on the silk banana peels (Musa paradisiaca) to obtain glucosed syrup. The enzymatic hydrolysis of banana shells at 30% (w / v) was studied at a constant temperature of 50 ° C. The independent variables to be controlled were the concentration of the fungal cellulase enzyme (0.5%, 1% and 1.5% w / v) and the hydrolysis time (18, 24 and 30 hours). The dependent variables were the percentage of Reducer Sugar and the percentage of Dextrose Equivalent (D.E.) of the enzymatically hydrolysed samples. The experimental design was completely randomized with factorial model 32. Glucosed syrups were obtained from silk plantain hulls by the enzymatic hydrolysis of the fungal cellulase. The highest percentages of Reducer Sugar and Dextrose Equivalent were presented in the Cellulase Concentration at 1.5% (w / v) during a hydrolysis time of 30 hours with average values ​​of 15.5% of reducing sugar percentage and 30.9% of percentage of Dextrose Equivalent. In the enzymatic hydrolysis with fungal cellulase at 1.5% (w / v) and 30 hours a higher value-added product was obtained, the operating conditions and the process steps were defined that should be adapted for the production of glucosed syrup from of banana peels (Musa paradisiaca).

Pythium oligandrum is one of the non-pathogenic microorganisms of Pythium species which found its use as biological control agent. The main modes of action of this oomycete lie in inducing the plant immunity and in mycoparasitism of pathogenic fungi and fungus-like organisms. The oomycete attacks the pathogens by secretion of hydrolytic enzymes into the environment. In the first part of this bachelor's thesis, activity of hydrolytic enzymes endo-1,3-β-glucanase, cellulase, chitinase and proteases was observed in a commercial product based on Pythium oligandrum, called Polyversum-Biogarden. It was conclu- ded that the direct hydrolysis of phytopathogens is probably not the main mechanism of this product because the activity of glycosidases increased only after six hour-long incubation of the Polyversum-Biogarden in water and the proteolytic activity was not detected. In the second part of the bachelor's thesis, properties of proteases secreted by orga- nism Pythium oligandrum were studied. The highest proteolytic activity was observed at pH 6,5. Ovomucoid acted as an inhibitor of secreted proteases. The stability of pro- teases was lowered by SDS, detergents present in liquid soaps and by a solution of a solid soap or NaOH. Only the highest concentrations of urea lowered the activity of proteases....

[Resumen]: La pared celular vegetal es una estructura compleja que participa en muchas funciones esenciales para las plantas. Una de ellas es el control del crecimiento celular por parte de la pared primaria. Las enzimas endo-1,4-β-glucanasas actúan sobre diversos polisacáridos de pared y existen evidencias de que podrían ser importantes para el crecimiento vegetal. En este estudio se caracterizaron siete endoglucanasas de Arabidopsis thaliana (GH9B1, GH9B2, GH9B7, GH9B8, GH9B13, GH9C2 y GH9C3), escogidas por presentar una alta coexpresión con celulasas de la pared primaria. La expresión del gen reportero GUS unido a sus promotores se asoció a tejidos en desarrollo y zonas de abscisión de órganos. La sobreexpresión de GH9B1 aceleró la floración. Para la sobreexpresión de GH9C2 no se detectó un fenotipo, y lo mismo sucedió con el mutante triple gh9b1 gh9b2 gh9b13. Otro mutante triple, gh9b7 gh9b8 gh9c2, produjo plantas un poco más pequeñas, fenotipo que se exageró en el mutante cuádruple gh9b7 gh9b8 gh9c2 gh9c3. Estos resultados indican que algunas de las endoglucanasas estudiadas podrían tener un papel importante en el desarrollo y que es posible que exista redundancia genética entre GH9C3 y una o varias de las otras enzimas analizadas en el mutante cuádruple. [Resumo]: A parede celular vexetal é unha estrutura complexa que participa en moitas funcións esenciais para as plantas. Unha delas é o control do crecemento celular pola parede primaria. As enzimas endo-1,4-beta-glucanasas actúan sobre diversos polisacáridos de parede, e existen evidencias de que poderían ser importantes para o crecemento vexetal. Neste estudo caracterizáronse sete endoglucanasas de Arabidopsis thaliana (GH9B1, GH9B2, GH9B7, GH9B8, GH9B13, GH9C2 y GH9C3), escollidas por presentar unha alta coexpresión con celulosa sintasas da parede primaria. A expresión do xene reporteiro GUS unido aos seus promotores asociouse con tecidos en desenvolvemento e zonas de abscisión. A sobreexpresión de GH9B1 acelerou a floración. Para a sobreexpresión de GH9C2 non se detectou ningún fenotipo, de igual forma que no mutante triplo gh9b1 gh9b2 gh9b13. Outro mutante triplo, gh9b7 gh9b8 gh9c2, produzo plantas un pouco máis pequenas, fenotipo que se esaxerou no mutante cuádruplo gh9b7 gh9b8 gh9c2 gh9c3. Estes resultados indican que varias das endoglucanasas estudiadas poderían xogar roles importantes no desenvolvemento de Arabidopsis, e que é probable que exista redundancia xénica entre GH9C3 e algunha ou varias das outras enzimas analizadas no mutante cuádruplo. [Abstract]: The plant cell wall is a very complex structure that takes part in many essential functions for plants. One of them is the regulation of primary growth. The endo-1,4-β-glucanases have activity against a variety of wall polysaccharides and there is evidence of their importance for plant growth. In this study, seven endoglucanases from Arabidopsis thaliana (GH9B1, GH9B2, GH9B7, GH9B8, GH9B13, GH9C2 y GH9C3), chosen because of their high levels of co-expression with cellulose synthases of the primary wall, were characterized. Expression of the reporter gene GUS coupled to their promoters was associated with young, developing tissues and with abscission zones. GH9B1 overexpression accelerated flowering. No phenotype was observed for GH9C2 overexpression nor in the triple mutant gh9b1 gh9b2 gh9b13. Another triple mutant, gh9b7 gh9b8 gh9c2, produced slightly smaller plants, and this phenotype was augmented in the quadruple mutant gh9b7 gh9b8 gh9c2 gh9c3. These results show that some of the studied endoglucanases may play an important role in the development of Arabidopsis, and it is likely that genetic redundancy exists between GH9C3 and one or several of the other enzymes analyzed in the quadruple mutant. Traballo fin de mestrado (UDC.CIE). Biotecnoloxía avanzada. Curso 2018/2019

The Brazilian savanna, known as the Cerrado, is a biome with a high degree of endemism, with the potential to house many microorganisms suitable for biotechnological exploitation, especially fungi. The Cerrado soil, which is usually acidic, is a favorable environment for the growth of fungi capable of degrading lignocellulosic materials. The aim of the present study was to isolate cellulolytic filamentous fungi native to the Cerrado. Samples of soil and leaf litter were collected in three points of Cerrado State Park, located in the South of Brazil, during the rainy season in September 2014. Samples were stored in sterile plastic bags, transported at room temperature and kept at 4 ºC for three days. Filamentous fungi were isolated by successive inoculations in PDA (maintained at 30 ºC). Cellulase activity was tested in CMC (carboxymethyl cellulose) medium and lipase activity was assessed in medium containing phenol red and tween 20 (incubated at 37 °C), and in medium supplemented with Rhodamine B (kept at 30 °C). We isolated a total of 28 strains, 25 produced cellulase, detected with lugol in strains grown in CMC medium. The isolates were identified morphologically (color, form of growth) and by sequencing of the 18S rRNA region, with both techniques producing congruent results. One strain of Colletotrichum boninense and one strain of Trichoderma sp., both isolated from soil samples, presented the highest cellulolytic activity. All strains exhibited lipolytic activity, with enzyme production and activity influenced by temperature. The present study revealed new strains of known filamentous fungi that can be applied in biomass degradation. These strains are suitable for optimization of culture conditions, which could lead to the economic feasibility of the process. Rev. Biol. Trop. 66(1): 237-245. Epub 2018 March 01. Resumen La sabana brasileña conocida como Cerrado, es un bioma con alto grado de endemismo con el potencial de albergar muchos microorganismos de alto interés biotecnológico. Los hongos producen muchas enzimas que se aplican ampliamente en procesos industriales. El suelo del Cerrado, que suele ser ácido, es un ambiente favorable para el crecimiento de hongos capaces de degradar materiales lignocelulósicos. El objetivo del presente estudio fue aislar los hongos celulolíticos filamentosos nativos del Cerrado. Muestras de suelo y de hojarasca fueron recolectadas en el Parque Estatal del Cerrado, ubicado en el sur de Brasil. De 28 cepas aisladas, 25 produjeron celulasa que fue detectada con lugol. Las cepas fueron cultivadas en medio CMC (carboximetilcelulosa). Los aislados fueron identificados morfológicamente (color, forma de crecimiento) y por secuenciación de la región 18S rRNA, produciendo resultados congruentes. Una cepa de Colletotrichum boninense y una cepa de Trichoderma sp., ambas aisladas de muestras de suelo, presentaron la mayor actividad celulolítica. Todas las cepas mostraron actividad lipolítica, la producción y la actividad se vieron influidos por la temperatura. El presente estudio revela nuevas cepas de hongos filamentosos conocidos con potencial de aplicación en la degradación de la biomasa, sin embargo, la optimización de las condiciones de cultivo es necesaria para lograr la viabilidad económica.

RESUMEN : La explotación comercial del cacao, genera un volumen de residuos que puede utilizarse para la obtención de compuestos antioxidantes, entre otros usos. La cascarilla de cacao (tegu-mento), contiene un 23,3±0,4 mg GAE g-1, bajo la metodología estándar de extracción de polifenoles totales. Éste residuo fue seleccionado para desarrollar un protocolo de extracción asistido por enzimas, donde se evaluó celulasa, pectinasa y una mezcla de ambas enzimas en diferentes concentraciones (25-75 U mL-1). Otras variables como concentración de sustrato, pH y tiempo de reacción fueron evaluadas, mediante un diseño central compuesto. La celulasa en una concentración de 75 U mL-1, un pH de 6,6; una concentración de cascarilla de 185 g L-1 y un tiempo de reacción de 100 min, fueron las condiciones óptimas para obtener un extracto rico en polifenoles totales de 1,88 mg GAE mL-1, el cual fue validado posteriormente, obteniéndose una concentración de 1,527±0,013 mg GAE mL-1. ABSTRACT : Commercial exploitation of cocoa generates a volume of waste material that can be used to obtain antioxidant compounds, among others; Cocoa husk (tegument) contains 23.3±0.4 mg GAE g-1 under the standard methodology of total polyphenol extraction. This residue was selected to develop an extraction protocol assisted by enzymes, where cellulase, pectinase, and a mixture of both enzymes at different concentrations (25-75 U mL-1) were evaluated. Other variables such as substrate concentration, pH and reaction time were assessed by using a central composite design. The cellulase in a concentration of 75 U mL-1, pH 6.6, a husk concentration of 185 g L-1 and a reaction time of 100 min, were the optimal conditions to obtain an extract rich in polyphenols of 1.88 mg GAE mL-1, which was subsequently validated giving a concentration of 1.527±0.013 mg GAE mL-1. COL0066991

La interacción macroinvertebrados-microorganismos-biomasa vegetal es un eje fundamental en el ciclaje del carbono. En algunos agroecosistemasresultan abundantesresiduos de cosecha que frecuentemente son incinerados, como sucede en la caña de azúcar en Colombia. Se estudió la transformación de residuos de cosecha a través de la interacción entre ensamblajes de poblaciones de larvas de escarabajos y poblaciones de microorganismospropiciadas por los mencionados macroinvertebrados, considerando la cantidad consumida y evaluando la actividad de β-glucosidasa resultante en el suelo. De ésta, se registraron diferencias significativas en los tratamientos aplicados, evidenciándose que son precisamentedos especies selectas de Oryctini(Coleoptera: Scarabaeoidea), históricamente catalogados como plagas, las que a través de su interacción sinérgica con la microbiota edáfica, propician altos niveles de actividad de ß-glucosidasa. Los resultados indican que el escarabajo rinoceronte, Podischnusagenor Oliver, además de ser el mayor consumidor de residuos de cosecha, aporta positivamente al cultivo de la caña de azúcar, toda vez que no se le restrinja el acceso a material que satisfaga sus requerimientos alimentarios. El escarabajo torito, StrategusaloeusLinné, en asocio con P. agenor presentó un comportamiento similar. In soils, the macro invertebrate-microorganism-biomass interaction is a fundamental axis for carbon cycling. Sugarcane is a major biomass-producing, abundant crop residues are left on the field. These crop residues are frequently burned before harvesting in Colombia. This work studied the sugar cane residues transformation by scarab larvae and microorganisms interactions, taking account of the β-glucosidase activity. The crop residues consumption by population assemblages of three Dynastinae scarab species was evaluated. Significative differences in β-glucosidase activity were found betweenthe population assemblages and respecting the control treatment. It was shown that precisely two Oryctini (Coleoptera: Scarabaeoidea) species, historically regarded as pests, are the ones whichthrough their synergic interaction with the edaphic microbiota, led to high ß-glucosidaselevels in soils. Results indicate that the rhinoceros beetle Podischnusagenor Oliver is the major litter consumer and positively contributes to sugar cane crops, as far as its feeding requirements are not restricted by pre-harvest burning.StrategusaloeusLinné, in association with P. agenor displayed a similar behaving. A interação macroinvertebrados-microorganismos-biomassa vegetal é um eixo fundamental na ciclagem do carbono. Em alguns agroecosistemas se geram abundantes resíduos de colheita, que freqüentemente são incinerados, como é o caso da cana de açúcar na Colômbia. Examinou-se a transformação dos resíduos de colheita mediante a interação entre ensambladuras de poblações de larvas de besouros e poblações de microorganismos, as quais são propiciadas pelos citados macroinvertebrados, para considerar a quantidade consumida e avaliar a atividade da β-glucosidase que fica no solo. Registraram-se diferenças significativas da atividade da β-glucosidase nos tratamentos aplicados. Evidenciou-se que precisamente são duas espécies seitas de Oryctini (Coleoptera: Scarabaeoidea), historicamente catalogadas como plagas, as quais propiciam altos níveis da atividade da ß-glucosidase mediante sua interação sinérgica com a microbiota edáfica. Os resultados indicam que o besouro rinoceronte, Podischnusagenor Oliver, além de ser o maior consumidor dos resíduos de colheita, tem faces positivas no cultivo da cana de açúcar, toda vez que não se limiteseuaceso ao material que satisfaça seus requerimentos alimentícios.StrategusaloeusLinné em asociação com P. Agenor presenteou um comportamento similar.

El objetivo de este estudio fue estandarizar un método enzimático para medir la digestibilidad de forrajes empleando la enzima celulasa proveniente del hongo Penicillium funiculosum y compararlo con el método de digestibilidad in vitro de Tilley y Terry (1963). Para la estandarización de la técnica se utilizó como sustrato forrajes de digestibilidad in vitro conocida: alfalfa y paja de avena; y para la comparación entre métodos se utilizó forrajes de diferente calidad provenientes de varias zonas del Perú. La concentración óptima enzima-sustrato hallada fue de 200 y 250 mg, respectivamente. Los valores de digestibilidad del método enzimático fueron estadísticamente menores que los del método in vitro, y el coeficiente de correlación fue de 0.987 (p, The objective of this study was to standardize the enzymatic procedure for estimating the digestibility of forages using the fungal cellulase Penicillium funiculosum, and its comparison with the Tilley and Terry (1963) in vitro digestibility method. The wellknown in vitro digestibility of alfalfa and oat straw were used for the standardization of the technique. Different quality forages from various locations of Peru were used for the comparison between methods. The best enzyme-substrate concentrations were 200 and 250 mg respectively. Both methods were statistically different, being the enzymatic digestibility values lower than the in vitro method ones. The correlation coefficient between methods was 0.987 (p

La celulosa es el principal constituyente de la biomasa y en términos de producción anual, uno de los polímeros más importantes sobre la tierra. Sin embargo, su degradación es difícil debido a la estructura misma de la celulosa y a su asociación con otros polímeros como la lignina y la hemicelulosa (O'Sullivan 1997, Lynd 2002, Mansfield y Meder, 2003). En Colombia la agroindustria de la palma de aceite genera grandes volúmenes de biomasa, entre las cuales la tusa es el principal residuo sólido producto de la extracción de aceite a partir de los racimos de frutos frescos cosechados. Así, en 2008 se disponía de alrededor de 496.225 ton de tusa (García, Cárdenas y Yáñez 2009) y su uso como acondicionador del suelo no es muy atractivo debido al alto costo del transporte en campo y a su difícil degradación. Una alternativa para el aprovechamiento de la tusa, que genera valor agregado a la cadena de producción, es la transformación de la celulosa a azúcares más simples, los cuales pueden ser fermentados para producir alcohol (Alam, y otros 2009). Dicha transformación se inicia con la hidrólisis de la celulosa mediante el uso de métodos químicos o biológicos. Los métodos químicos implican el uso de ácidos o bases fuertes en grandes cantidades que de ser liberados al ambiente causaría una gran contaminación ambiental. En contraste, los métodos biológicos ofrecen una alternativa al usar microorganismos capaces de producir celulasas las cuales son enzimas que hidrolizan la celulosa hasta obtener moléculas más simples como la glucosa. Se han reportado microorganismos con actividad celulítica in vitro sobre tusa como los hongos Aspergillus niger (Prasertsan y otros, 1997), Trichoderma reeseii (Rodríguez y Piñeros, 2007), Chaetomium spp. (Umikalsom, y otros 1997). Sin embargo, es necesario identificar nuevos microorganismos con altos niveles de actividad celulolítica en Colombia

690 p., Esta Tesis introduce en primer lugar, las características de las enzimas -naturaleza, mecanismo, correcta manipulación, etc.- y sus usos en procesos de restauración de obras de arte. En segundo lugar, esta investigación incluye un estudio del papel -historia, composición, fabricación, degradación y restauración-. Posteriormente, se explican los materiales y métodos para llevar a cabo la investigación sobre consolidación celulósica con enzimas: papeles, sustancias, instrumentación cámaras climáticas, CCD, microscopio electrónico, etc.-, preparación de probetas y aplicación de un nuevo método para conocer la degradación de materiales celulósicos. Y para finalizar, las dos últimas partes de la investigación describen el desarrollo de un método de consolidación de celulosa del papel, a partir de la síntesis de la celulosa con una enzima hidrolítica: la celulasa. Ésta actúa como una sintetasa, consolidando el papel envejecido de forma natural o artificial, cuando es mezclada en una solución disolvente orgánico en un tampón, en la relación (4:1) en presencia de un sustrato (ß-celobiosa fluorada). Para mejorar el tratamiento se añadió un gel con los reactivos necesarios, se tuvo máximo cuidado en las condiciones de trabajo temperatura, pH- y se estudió el protocolo más adecuado para no afectar a papeles con diferentes técnicas pictóricas. Los resultados fueron positivos y se consiguió la consolidación del papel sin afectar la capa pictórica.

Existe un gran interés por el uso de enzimas lignocelulolíticas en varias industrias, y en la biodegradación de biomasa para la producción de biocombustibles y otras aplicaciones. Entre las fuentes microbianas de enzimas, Aspergillus niger es uno de los microorganismos más utilizados en la producción de enzimas industriales, debido a sus niveles altos de secreción de proteína y a su condición GRAS (generally regarded as safe). El objetivo del presente estudio fue evaluar la influencia de la concentración de inóculo en la morfología y producción de celulasas y xilanasas con A. niger en cultivo sumergido. Para ello, fueron inoculados matraces de 250 mL con 40 mL de medio con 3% (v/v) de una suspensión de 104 o 108 esporas por mililitro e incubados a 28 ºC y 175 rpm durante 120 horas. Se utilizaron 10 g*L-1 de lactosa como fuente de carbono. En cada caso se determinó la cantidad de biomasa, la proteína extracelular soluble, lactosa residual, actividad celulasa total y xilanasa cada 24 horas. Aunque no hubo un efecto notorio en la morfología de crecimiento, salvo en el color y el diámetro de pellets obtenidos, sí se afectó la µmax (0,06 y 0,03 h-1 para 104 y 108 esporas*mL-1, respectivamente) y la concentración máxima de biomasa. Además, mientras que las productividades volumétricas de celulasa (GFPA) (8,2 y 8,0 UI.*L-1*h-1 para 104 y 108 esporas*mL-1, respectivamente) fueron similares para ambos inóculos, la productividad de xilanasa (GXIL) fue mayor para el inóculo más concentrado (29,7 y 33,4 UI¨*L-1*h-1 para 104 y 108 esporas*mL-1, respectivamente). Los resultados indican que la productividad de celulasas y xilanasas está estrechamente relacionada con la concentración de inóculo. There is a great interest for the use of lignocellulolytic enzymes in several industries and in biomass degradation for production of biofuels and other applications. Among the microbial sources of enzymes, Aspergillus niger is one of the most used microorganisms in the production of industrial enzymes due to its high levels of protein secretion and its GRAS (generally regarded as safe) condition. The aim of the present study was to evaluate the influence of A. niger inoculum concentration in the morphology and production of cellulases and xylanases in submerged cultures. For this, 250 mL flasks containing 40 mL culture medium were inoculated with a 3% (v/v) of either 104 or 108 spores per milliliter suspension and incubated at 28 º C and 175 rpm during 120 hours. Lactose (10 g*L-1) was used as the carbon source. In each case, the amount of biomass, the extracellular soluble protein, residual lactose, total celullase activity and xylanase activity were determined every 24 hours. Even thought there was not a notorious effect on the growth morphology, except in color and diameter of pellets; µmax was affected (0.06 and 0.03 h-1 for 104 and 108 spores*mL-1, respectively) as well as maximum biomass concentration. In addition, while the volumetric productivity of cellulase (8.2 and 8.0 UI*L-1*h-1 for 104 and 108 spores*mL-1, respectively) were similar for both inocula, the productivity of xylanase was greater for the more concentrated inoculum (29.7 and 33.4 UI*L-1*h-1 for 104 and 108 spores*mL-1, respectively).The results show that cellulase and xylanase productivities are closely related to the inoculum concentration.

Título en inglés: Influence of inoculum concentration on the cellulase and xylanase production by Aspergillus niger Resumen Existe un gran interés por el uso de enzimas lignocelulolíticas en varias industrias, y en la biodegradación de biomasa para la producción de biocombustibles y otras aplicaciones. Entre las fuentes microbianas de enzimas, Aspergillus niger es uno de los microorganismos más utilizados en la producción de enzimas industriales, debido a sus niveles altos de secreción de proteína y a su condición GRAS (generally regarded as safe). El objetivo del presente estudio fue evaluar la influencia de la concentración de inóculo en la morfología y producción de celulasas y xilanasas con A. niger en cultivo sumergido. Para ello, fueron inoculados matraces de 250 mL con 40 mL de medio con 3% (v/v) de una suspensión de 104 o 108 esporas por mililitro e incubados a 28 ºC y 175 rpm durante 120 horas. Se utilizaron 10 g*L-1 de lactosa como fuente de carbono. En cada caso se determinó la cantidad de biomasa, la proteína extracelular soluble, lactosa residual, actividad celulasa total y xilanasa cada 24 horas. Aunque no hubo un efecto notorio en la morfología de crecimiento, salvo en el color y el diámetro de pellets obtenidos, sí se afectó la µmax (0,06 y 0,03 h-1 para 104 y 108 esporas*mL-1, respectivamente) y la concentración máxima de biomasa. Además, mientras que las productividades volumétricas de celulasa (ΓFPA) (8,2 y 8,0 UI.*L-1*h-1 para 104 y 108 esporas*mL-1, respectivamente) fueron similares para ambos inóculos, la productividad de xilanasa (ΓXIL) fue mayor para el inóculo más concentrado (29,7 y 33,4 UI¨*L-1*h-1 para 104 y 108 esporas*mL-1, respectivamente). Los resultados indican que la productividad de celulasas y xilanasas está estrechamente relacionada con la concentración de inóculo. Palabras clave: celulasa; xilanasa; cultivo sumergido; morfología; Aspergillus niger. Abstract There is a great interest for the use of lignocellulolytic enzymes in several industries and in biomass degradation for production of biofuels and other applications. Among the microbial sources of enzymes, Aspergillus niger is one of the most used microorganisms in the production of industrial enzymes due to its high levels of protein secretion and its GRAS (generally regarded as safe) condition. The aim of the present study was to evaluate the influence of A. niger inoculum concentration in the morphology and production of cellulases and xylanases in submerged cultures. For this, 250 mL flasks containing 40 mL culture medium were inoculated with a 3% (v/v) of either 104 or 108 spores per milliliter suspension and incubated at 28 º C and 175 rpm during 120 hours. Lactose (10 g*L-1) was used as the carbon source. In each case, the amount of biomass, the extracellular soluble protein, residual lactose, total celullase activity and xylanase activity were determined every 24 hours. Even thought there was not a notorious effect on the growth morphology, except in color and diameter of pellets; µmax was affected (0.06 and 0.03 h-1 for 104 and 108 spores*mL-1, respectively) as well as maximum biomass concentration. In addition, while the volumetric productivity of cellulase (8.2 and 8.0 UI*L-1*h-1 for 104 and 108 spores*mL-1, respectively) were similar for both inocula, the productivity of xylanase was greater for the more concentrated inoculum (29.7 and 33.4 UI*L-1*h-1 for 104 and 108 spores*mL-1, respectively).The results show that cellulase and xylanase productivities are closely related to the inoculum concentration. Key words: Cellulase; xylanase; submerged culture; morphology; Aspergillus niger.

Se midió el efecto de la adición de una pectinasa y una celulasa comerciales sobre la digestibilidad in vitro de la materia orgánica de dos variedades de frijol común (Phaseolus vulgaris L.), una negra (Brunca) y una roja (Chirripó). Se mantuvieron condiciones fijas de pH (entre 6,3 y 6,4), tiempo (60 min) y temperatura (40° C) y se ensayaron tres concentraciones de cada enzima: 0,25%, 0,50% y 1,0% m/m. Los incrementos en la digestibilidad in vitro del frijol negro fueron 6,9%; 9,5% y 12,3% (p0,05) en la aceptación general de los frijoles tratados enzimáticamente (negro o rojo) y los frijoles sin tratar. Effect of pectinase and cellulase addition on in vitro digestibility of common bean (Phaseolus vulgaris). Effect of commercial pectinase and cellulase addition on in vitro digestibility of two common bean (Phaseolus vulgaris) varieties, black (Brunca) and red (Chirripó), was measured. Constant conditions of pH (6,3-6,4), time (60 min), and temperature (40°C) were held, and three enzyme concentrations were tested: 0,25%, 0,5% and 1,0% m/m. In vitro digestibility increases for black beans were 6,9%; 9,5% and 12,3% (p0,05) in general acceptance of enzyme treated beans (black or red) or nontreated beans was noted.

The effect of Bokashi (B, a fermented compost), slow-release fertilizers (SRFs) and their combined application on mycorrhizal colonization (MC), soil invertase, cellulase, acid (AcP) and alkaline (AlP) phosphatases activities and maize (Zea mays L.) yield was investigated in terrace (TS) and valley (VS) soils in Oaxaca, Mexico. A complete randomized design, seven fertilizer treatments and four replications were used: unamended control (C); conventional fertilization (90-46-00 NPK) (CF); B; SRF1 (Multigro 6®, 21-14-10 NPK); SRF2 (Multigro 3®, 24-05-14 NPK); B+SRF1; B+SRF2. Highest root colonization percentage: CF in VS, and SRF2 in TS. Highest extraradical mycelium length: B, B+SRF1, CF in VS, and B+SRF1 in TS. In both soils, B increased the spore number. Highest AcP activity: B, SRF2 in VS, and B+SRF1, B+SRF2 in TS. Highest AlP activity: B+SRF1, CF in VS, and C in TS. Highest invertase activity: B+SRF1, SRF2, CF in VS, and B in TS. Grain yield only increased with B in VS. The significant interaction soil type × fertilizer treatment for the majority of the biological soil properties analyzed suggests that MC and soil enzyme activity response to fertilization was influenced by soil type. Bokashi, alone or combined with SRFs improves biological soil fertility in maize fields. Se determinó el efecto de bocashi (B, compost fermentado) y fertilizantes de liberación lenta (SRFs) sobre la colonización micorrízica (MC), la actividad de invertasa, celulasa, fosfatasa ácida (AcP) y alcalina (AlP) y el rendimiento de maíz en suelos de terraza (TS) y valle (VS) en Oaxaca, México. Se utilizó un diseño completamente al azar con siete tratamientos y cuatro repeticiones: control (C) sin fertilización; fertilización convencional (CF) (90-46-00 NPK); B; SRF1 (Multigro 6®, 21-14- 10 NPK); SRF2 (Multigro 3®, 24-05-14 NPK); B+SRF1; B+SRF2. El porcentaje más alto de colonización micorrízica fue con CF en VS, y con SRF2 en TS. La mayor longitud de micelio extraradical se registró con B, B+SRF1 y CF en VS, y con B+SRF1 en TS. En ambos suelos, B incrementó el número de esporas. La actividad más alta de AcP fue con B y SRF2 en VS, y con B+SRF1 y B+SRF2 en TS. La actividad más alta de AlP se detectó con B+SRF1 y CF en VS y con C en TS. La actividad más alta de invertasa se encontró con B+SRF1, SRF2 y CF en VS y con B en TS. El rendimiento de grano incrementó solamente con B en VS. La interacción significativa tipo de suelo × tratamiento de fertilización, para la mayoría de las propiedades biológicas analizadas, sugiere que la respuesta de la colonización micorrízica y de la actividad enzimática a la fertilización, estuvo determinada por el tipo de suelo. Bocashi sola o combinada con SRFs puede mejorar la fertilidad biológica del suelo en cultivos de maíz. Fil: Bautista-Cruz, Angélica. Instituto Politécnico Nacional (Oaxaca, México) Fil: Cruz Domínguez, Gricel. Instituto Politécnico Nacional (Oaxaca, México) Fil: Rodríguez Mendoza, María de las Nieves. Fil: Pérez Pacheco, Rafael. Instituto Politécnico Nacional (Oaxaca, México) Fil: Robles, Celerino. Instituto Politécnico Nacional (Oaxaca, México)