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INTRODUÇÃO: O carcinoma espinocelular de origem bucal (CEC) apresenta uma alta taxa de mortalidade devido à invasividade das células tumorais. A migração celular, principal evento da invasão e metástase, pode ser regulada tanto por fatores intrínsecos, como adesão e contratilidade celular, quanto extrínsecos, como composição, densidade e remodelagem da matriz extracelular (MEC). OBJETIVO: Avaliar o papel de elementos intrínsecos e extrínsecos sobre o processo invasivo do carcinoma espinocelular de origem bucal. MÉTODOS: Foi realizada imuno-histoquímica para as proteínas: Miosina II (isoformas A, B e C), metaloproteinases de matriz (1, 2, 9 e 14); imunofluorescência as proteínas: e-caderina, n-caderina, FAK, paxilina, vinculina e fibronectina em amostras de CEC oral. Foi realizado ensaio de migração nas seguintes condições: 1 – matriz 2D com o substrato de fibronectina, ou laminina ou matrigel; 2 – matriz 3D com colágeno na presença ou não de fibronectina ou laminina; 3 – matriz 3D com diferentes concentrações de colágeno (0,6; 1,2 e 1,8 mg/ml) + fibronectina na presença ou não de um inibidor de MMP. Foi realizado análise de adesão celular utilizando-se o microscópio TIRF e o microscópio confocal, tanto em matrizes 2D quanto 3D. Foram realizados esferoides celulares para avaliar a contratilidade celular, através do plaqueamento das células em gel de agarose e a utilização de drogas que inibem ou que induzem a contratilidade, bem como a partir de células transfectadas com versões fosfomiméticas para a cadeia leve de miosina. Foi realizado ainda western blotting para proteínas: e-caderina, FAK, vinculina, paxilina, N-caderina, integrinas e as isoformas de miosina II, bem como foi avaliado os níveis de ativação das proteínas da família RhoGTPase, as quais estão envolvidas no controle da migração celular. RESULTADOS: A expressão das MMPs analisadas e das isoformas de miosinas foi maior nas zonas de invasão tumoral, sendo que o CEC oral também apresenta uma maior expressão de proteínas associadas à adesão com a MEC. A migração celular foi afetada pela densidade e a composição da MEC, bem como pela atividade das MMPs. Adicionalmente, a modulação das proteínas de adesão célula-matriz altera a velocidade de migração, a direcionalidade dessa migração e também a forma de migração, mudando de uma migração coletiva para uma migração individual. O aumento na contratilidade células resulta numa dispersão celular enquanto que a diminuição da contratilidade resulta numa melhor adesão célula – célula. CONCLUSÕES: O comportamento das células tumorais pode ser modulado através de fatores extrínsecos como, por exemplo, a alteração no microambiente tumoral, seja ela por mudança no substrato ou na densidade da matriz, e também dos fatores intrínsecos como a alteração nos níveis de miosina. INTRODUCTION: Oral squamous cell carcinoma (OSCC) presents high mortality index due to the invasive phenotype of tumor cells. Cell migration is the main event in cell invasion and metastasis and it can be regulated by intrinsic factor, such as adhesion and cell contractility, and extrinsic factors, such as density and extracellular matrix (EMC) remodeling. OBJECTIVE: Analyze the role of intrinsic and extrinsic factor during the invasive process of oral squamous cell carcinoma. METHODS: We performed immunostaining in OSCC samples for the following proteins: myosin II (isoforms A, B and C), matrix metalloproteinase (1, 2, 9 and 14) e-cadherin, n-cadherin, FAK, paxillin, vinculin and fibronectin. We also performed migration assays with OSCC cell line in the following conditions 1 – 2D matrix with fibronectin or laminin or matrigel; 2 – 3D matrix with collagen in the presence or not of fibronectin or laminin; 3 – 3D matrix with different collagen concentration (0,6; 1,2 e 1,8 mg/ml) with fibronectin in the presence or not of the MMP inhibitor. In order to analyze cell adhesion, it was performed Total Internal Reflectance Fluorescence and Confocal microscopy, in 2D and 3D matrix. To analyze cell contractility, cells were plated in agarose gel in order to produce spheroids, which were treated with drugs that inhibit or induce cell contractility or cells were previously transfected with Myosin Light Chain phosphomimetics mutants. It was also performed western blotting to: e-cadherin, n-cadherin, FAK, paxillin, vinculin and myosin II isoforms, as well as it was analyze the levels in RhoGTPase family, which are involved in cell migration control. RESULTS: The expression to MMPs and myosin II isoforms were higher at invasion zone of the tumor, and the OSCC presented higher expression of proteins associated to adhesion to ECM. Cell migration was affected by the EMC composition and density and by MMP activity. Also, the modulation of cell-matrix adhesion proteins altered migration speed, cell directionality as well as influenced the switch between collective and single cell migration. The increase in cell contractility resulted in cell dispersion while the decrease in cell contractility resulted in a better cell-cell adhesion. CONCLUSIONS: The behavior of cell tumor can be modulate by extrinsic factors, for example, the change in tumor microenvironment, by the change in the EMC substrate or density and by intrinsic factors such as the alteration in myosin levels.

Glicocorticoides e outras drogas imunossupressoras são comumente utilizados para o tratamento de condições inflamatórias, como as Doenças Inflamatórias Intestinais (DIIs). Apesar dos avanços na terapia medicamentosa, a remissão da doença ainda é difícil de ser mantida. Devido às suas propriedades imunomodulatórias, as Células-Tronco Mesenquimais (MSCs – Mesenchymal Stem Cells) têm emergido como reguladoras da resposta imune, e sua viabilidade e propriedades migratórias são essenciais para o sucesso da terapia celular. Entretanto, pouco se conhece sobre os efeitos das drogas convencionalmente utilizadas no tratamento das DIIs no comportamento das MSCs. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a viabilidade, a morfometria nuclear, a polaridade celular, a distribuição da actina-F e da FAK (Focal Adhesion Kinase), e o comportamento migratório das MSCs na presença das drogas Azatioprina (AZA) e Dexametasona (DEXA). As células foram isoladas de membranas coriônicas humanas e caracterizadas pela diferenciação em adipócitos e osteócitos, bem como pela expressão de um painel de marcadores de superfície. As MSCs foram previamente tratadas com AZA ou DEXA por 24h ou 7d nas concentrações de 1μM ou 10μM, respectivamente. Ambas as drogas não afetaram a viabilidade celular analisada por MTT (3-(4,5-dimethyltiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide) e morfometria nuclear. Entretanto, a análise do índice de polaridade resultou em uma morfologia mais alongada após o tratamento com AZA, enquanto células mais arredondadas foram observadas na presença de DEXA. Os filamentos de actina foram marcados por Rodamina-Faloidina e sua análise mostrou que a AZA preservou parcialmente a formação de lamelipódios e aumentou a presença de fibras de estresse ventrais, enquanto que a DEXA inibiu a formação de lamelipódios, evidenciou uma maior presença de fibras de estresse ventrais e diminuiu a estabilidade das protrusões de membrana, observadas em vídeo. Através da análise de microscopia de série temporal, foi observado que as células sob o efeito da AZA por 7d migraram por maiores distâncias e tiveram um aumento em sua velocidade de migração (24,35%; P < 0,05; n = 4), ao passo que a DEXA diminuiu a velocidade migratória em 24h e 7d (-28,69% e -25,37%, respectivamente; P < 0.05; n = 4) e diminuiu a distância alcançada pelas células. Em conclusão, nossos dados sugerem que as drogas AZA e DEXA podem afetar diferentemente a morfologia e o comportamento migratório das MSCs, possivelmente afetando o resultado da terapia celular. O protocolo de migração celular utilizado neste estudo foi estabelecido por nosso grupo de pesquisa, sendo que um artigo científico contendo todas as etapas do protocolo foi escrito para que outros laboratórios possam utilizá-lo de maneira simples e eficaz. Glucocorticoids and other immunosuppressive drugs are commonly used to treat inflammatory disorders, such as Inflammatory Bowel Disease (IBD) and, despite few improvements, the remission of IBD is still difficult to maintain. Due to its immunomodulatory properties, Mesenchymal Stem Cells (MSCs) have emerged as regulators of immune response, and its viability and activation of migratory properties are essential for a successful cell therapy. However, little is known about the effects of immunosuppressant drugs used on IBD treatment on MSCs behavior. In this way, the aim of this study was to evaluate MSCs viability, nuclear morphometry, cell polarity, F-actin and FAK (Focal Adhesion Kinase) distribution and cell migration properties in the presence of the immunosuppressive drugs Azathioprine (AZA) or Dexamethasone (DEX). MSCs were isolated from human chorionic membranes and characterized through adipogenic and osteogenic differentiations, as well as a panel of surface markers. Cells were previously treated with AZA or DEX for 24 hrs or 7 days at 1μM and 10μM, respectively. Both drugs had no effects on cell viability analyzed through MTT (3-(4,5- dimethyltiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) and nuclear morphometry. However, polarity index analysis showed that AZA treatment induced a more elongated cell shape while a greater presence of rounded cells was observed under DEX exposure. F-actin was stained by Rhodamine-Phalloidin and showed that AZA could partially preserve lamellipodia formation and increase the presence of ventral actin stress fibers, while DEX inhibited lamellipodia formation and increased the presence of ventral actin stress fibers while decreasing protrusion stability, observed in video. Through time-lapse microscopy, it was observed that after 7 days of treatment, AZA improved cell the spatial trajectory (ST) and increased migration speed (24.35%, P < 0.05, n = 4) while DEX impaired ST and migration speed after 24 hrs and 7 days treatment (- 28.69% and -25.37%, respectively; P < 0.05, n = 4). In conclusion our data suggests these immunosuppressive drugs can differently affect MSCs morphology and migration capacity, possibly impacting the success of cell therapy. The migration protocol used in this study was successfully established by our group, leading to the writing of a protocol paper to facilitate the usage of this technique by other laboratories in a simple and efficient manner.

O carcinoma espinocelular é uma neoplasia maligna que representa aproximadamente 94% de todas as ocorrências presentes em boca e uma das suas principais características celulares é a migração de suas células para formar metástases. A adesão celular é considerada um dos eventos determinantes da migração celular. Para as células formarem uma estrutura tecidual tridimensional as adesões entre células e entre células e matriz extracelular são de grande importância. As junções de adesão celulares surgem, caracteristicamente, pela interação entre receptores adesivos, vias de sinalização e elementos do citoesqueleto. A proteína E-caderina está presente em adesões entre células no tecido epitelial. A proteína FAK está envolvida na maioria dos eventos relacionados à adesão celular estimulada por integrinas. A Vinculina é uma proteína de adesão que se liga ao citoesqueleto de actinomiosina como uma proteína de adesão focal através das integrinas. Estudos recentes sugerem que há alteração na expressão e atividade de proteínas de adesão em tumores malignos. O objetivo deste trabalho foi descrever o padrão de expressão e de regulação da atividade de proteínas de adesão em amostras de tumores de carcinoma espinocelular. Foram realizadas reações de imunoistoquímica para verificar o padrão de distribuição das proteínas E-caderina, Vimentina e FAK-y397 em amostras de tumores de carcinoma espinocelular oral. Verificou-se a diminuição da expressão de E-caderina e de Vinculina em regiões de adesão célula-célula e em contrapartida constatou-se aumento na marcação citoplasmática de Vinculina bem como na marcação de FAK-y397 em todas as amostras de tumores. Apesar dos avanços, ainda são necessários mais estudos observacionais que averiguem não apenas o grau de expressão dessas proteínas de adesão, mas também o seu nível de regulação. A partir dos resultados deste estudo, pode-se sugerir que o controle do nível de expressão e de atividade da adesão celular podem ser considerados como potenciais alvos para a aplicação de terapias coadjuvantes que visam a diminuir ou impedir a progressão tumoral, bem como o desenvolvimento de metástases. Squamous cell carcinoma is a malignant neoplasm that accounts for approximately 94% of all occurrences present in mouth and one of its main characteristics is the cellular migration of its cells to form metastases. Cell adhesion is considered one of the defining events of cell migration. For a three-dimensional tissue structure, adhesions between cells and between cells and the extracellular matrix is of great importance. Cell adhesion junctions arise characteristically by interaction between adhesive receptors, signaling pathways and cytoskeletal elements. The protein E-cadherin is present in cells in the adhesion between epithelial tissue. The Focal Adhesion Kinase (FAK) protein is involved in most events related to cell adhesion stimulated by integrins. The vinculin is an adhesion protein that binds cytoskeletal protein through integrins activaion. Recent studies suggest that there are alterations in the expression and activity of adhesion proteins in malignant tumors. The aim of this study was to describe the pattern of expression and regulation of the activity of adhesion proteins in tumor samples of squamous cell carcinoma. Immunohistochemical reactions were performed to check the distribution pattern of the protein E-cadherin, vimentin and FAK-y397 in tumor samples of oral squamous cell carcinoma. There was a decrease in the expression of E-cadherin and vinculin in regions of cell-cell adhesion but, on the other hand, it was found to increase in cytoplasmic as well as unscheduled vinculin FAK-y397 in all tumor samples. Despite progress, it is necessary more observational studies that examine not only the degree of expression of these adhesion proteins, but also its level of regulation. From the results of this study it is suggested that the control of the expression level and activity of cell adhesion may be considered as potential targets for application adjuvant therapies that aim to reduce or prevent tumor progression and the development metastases.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Cell migration is a prominent feature in cancer metastasis and the characterization of proteins related to migration is important in order to understand the behavior of tumor cells and their invasiveness during tumor progression. Among the proteins involved in cell migration, isoforms of non-muscle myosin type II play a pivotal role in several events related to cell migration, such as contractility, adhesion and cellular signaling. There are three isoforms of myosin type II that can be expressed in mammalian cells: myosin IIA (MIIA), myosin IIB (MIIB) and myosin IIC (MIIC). However, few studies have been conducted to characterize the expression and distribution patterns in cells of different types of tumors, including oral squamous cell carcinoma. The aim of the study was to analyze the expression and distribution of isoforms of myosin II (A, B and C) in surgical fragments of squamous cell carcinoma. Fragments of surgical specimen were collected from different regions of the tumor: a tumor-free zone, the center of the tumor and the invasion zone. These samples (n = 4) were fixed, crioprotected, cut on criostat, submitted to immunolocalization of MIIA, MIIB and MIIC and analyzed on confocal microscopy. The three isoforms of myosin II were expressed differently and showed distinct distribution in accordance with the region of the tumor sample. MIIA and MIIC were overexpressed at the center zone when compared with the free zone, whereas strong staining revealed MIIB at the zone invasion. Based on these observations, the isoforms of myosin IIC and IIA appeared to be more associated with tumor proliferation while MIIB appeared to be more involved in the invasive behavior of tumor, indicating that the isoforms can participate in different ways regulating the behavior and development of tumor type analyzed. A migração celular é uma característica proeminente na metástase do câncer e a caracterização de proteínas relacionadas com a migração é importante para que se compreenda o comportamento de células tumorais e sua capacidade de invasão durante a progressão tumoral. Entre as proteínas envolvidas na migração celular, as isoformas de miosina não-muscular do tipo II desempenham um papel central em vários eventos relacionados com a migração de células, como a contratilidade, a adesão e a sinalização celular. Existem três isoformas de miosina do tipo II que podem ser expressas em células de mamíferos: miosina IIA (MIIA), miosina IIB (MIIB) e miosina IIC (MIIC). Entretanto, poucos estudos têm sido realizados para caracterizar a sua expressão e padrões de distribuição em células de diferentes tipos de tumores, incluindo carcinoma epidermóide. O objetivo do estudo foi analisar a expressão e distribuição de isoformas de miosina II (A, B e C) em fragmentos de peça cirúrgica de carcinoma epidermóide. Os fragmentos de peça cirúrgica foram coletados a partir de distintas regiões do tumor: a zona livre de tumor, o centro do tumor e a zona de invasão. Estas amostras (n = 4) foram fixadas, crioprotegidas, cortadas em criostato, submetidas à imunolocalização de MIIA, MIIB e MIIC e analisadas em microscopia confocal. As três isoformas de miosina II foram expressas diferentemente e apresentaram distribuição distinta de acordo com a região da amostra de tumor. MIIA e MIIC foram superexpressas na zona central quando comparadas com a zona livre, ao passo que MIIB revelou forte marcação para região de zona de invasão. Com base nas presentes observações, as isoformas de miosina IIA e IIC pareceram estar mais associadas ao evento de proliferação tumoral ao passo que MIIB pareceu mostrar-se mais envolvida com o comportamento invasivo do tumor, indicando que as isoformas podem participar de formas distintas na regulação do comportamento e do desenvolvimento do tipo de tumor analisado.