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O objetivo do presente trabalho foi utilizar métodos bacteriológicos e moleculares para a identificação do Mycobacteriumbovis em lesões observadas em carcaças de bovinos durante a inspeção post mortem de rotina em matadouros-frigoríficos com serviço de inspeção oficial. Foram acompanhados o abate e a inspeção de 825.394 bovinos, sadios, ao exame antemortem pelo serviço de inspeção oficial em 10 matadouros-frigoríficos do estado da Bahia, entre abril de 2009 e abril de 2012. Cento e oitenta bovinos apresentaram lesões sugestivas de tuberculose e outras linfadenites, as quais foram avaliadas quanto à presença de Mycobacterium bovis por exame bacteriológico e pela PCR multiplex. A maioria das lesões estava localizada em linfonodos do trato respiratório e 71% eram provenientes de bovinos machos com até 32 meses de idade. No isolamento bacteriano, 13,9% (25/180) das amostras apresentavam colônias pequenas, de superfície granular e de coloração creme-amareladas, em meio de cultura Stonebrink-Leslie, e o crescimento médio foi de 34 dias. Todos os esfregaços dos isolados evidenciaram BAAR, e, pela PCR multiplex, 56% (14/25) dos isolados foram identificados como M. bovis. A associação entre exame post mortem, bacteriológico e PCR multiplex permitiu a identificação do agente de forma rápida e em regiões com status sanitário de baixa prevalência, demonstrando ser importante para a detecção dos focos de tuberculose bovina e o auxílio nos programas de controle e erradicação da tuberculose. The aim of the present study was to perform bacteriological and molecular methods for identification of Mycobacterium bovis in lesions derived from bovine carcasses detected during routine post-mortem examination in officially inspected slaughterhouses. We checked the slaughter and inspection of 825,394 bovines, health upon ante-mortem examination, by the official service in 10 slaughterhouses of Bahia state from April, 2009 to April 2012. Lesions suggestive of tuberculosis were collected from 180 bovines and further evaluated by bacteriology and multiplex PCR. The majority of lesions were located in the respiratory tract lymph nodes and 71% were from male bovines up to 32 months old. 13.9% of samples presented small, granular and creamy-yellowish colonies after being cultured in Stonebrink-Leslie with an average growth time of 34 days. All smears from the isolated samples were Acid Fast Bacilli (AFB) and among them 56% were identified by mPCR as M. bovis. Thus, the association between post-mortem examination, culture and multiplex PCR allowed the bacillus identification in a reduced time and in regions of low prevalence, pointing out its importance for bovine tuberculosis detection and as a supportive tool for the tuberculosis control and eradication program.