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Orientador: Ronei Jesus Poppi Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica Resumo: Este trabalho trata da aplicação de métodos quimiométricos no desenvolvimento de nova metodologia analítica, sem o auxílio de métodos de separação ou pré-concentração, na análise direta de tetraciclina em leite bovino. Para tanto, foram empregados a técnica de espectroscopia no Infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) e os métodos quimiométricos PLS, iPLS e SIMCA. Foram tomadas amostras de leite desnatado, que foram dopadas com quantidades progressivas de Tetraciclina, Clorotetraciclina e Oxitetraciclina, três dos antibióticos da classe das Tetraciclinas mais comumente usados em medicina veterinária e, portanto, com maior risco de contaminação do leite destinado a consumo humano. Tal dopagem ocorreu de forma a produzir amostras contendo cada uma das tetraciclinas citadas e também amostras contendo a combinação binária das mesmas. Para amostras dopadas com um tipo de tetraciclina, obteve-se uma matriz com 40 amostras, e uma matriz com 36 amostras para amostras contendo a combinação binária das três tetraciclinas. A faixa espectral utilizada na obtenção dos espectros foi de 900 a 1800 cm, correspondente à região do Infravermelho Médio. O SIMCA foi empregado na identificação de amostras, classificando-as como pertencentes às matrizes citadas. O grau de acerto na classificação foi de 100%. A partir da identificação das amostras partiu-se para o desenvolvimento do procedimento de quantificação das tetraciclinas em leite utilizando-se o PLS. A faixa de dopagem das amostras foi de 20 a 500 ppb (parte por bilhão), abrangendo uma ampla faixa, inclusive aquela considerada pelas legislações brasileira, americana e união européia, pois inicialmente não se tinha conhecimento do limite de detecção do método. O iPLS foi utilizado para a identificação e seleção da região espectral com melhor correlação com a quantidade de antibiótico presente na amostra. Os resultados obtidos foram promissores considerando a baixa concentração que se pretendia detectar: para faixas de trabalho acima de 100 ppb os erros de previsão obtidos foram, em média, inferiores a 13% e para a faixa abaixo de 100 ppb foram, em média, inferiores a 18%. Dessa forma, o método desenvolvido, apesar de não ser estritamente quantitativo, atende aos objetivos de detecção rápida, sem pré-tratamento das amostras e geração de resíduos, além de permitir a identificação, em uma amostra desconhecida de leite, do resíduo de tetraciclina presente. Abstract: This work treats of the application of chemometrics methods in the development of new analytical methodology, without the aid of separation methods or pre-concentration, in the direct analysis of tetracycline in bovine milk. For this purpose, it was used the Infrared Spectroscopy with transformed of Fourier (FT-IR) and the chemometrics methods PLS, iPLS and SIMCA. Samples of skimmed milk were doped with progressive amounts of Tetracycline, Chlortetracycline and Oxitetracycline, three of the antibiotics of the class of Tetracycline more commonly used in veterinary medicine and, therefore, with larger risk of contamination of the milk destined to human consumption. This procedure was adapted to produce samples containing each one of the mentioned tetracycline and also samples containing the binary combination of the same ones. For samples doped with a tetracycline type, it was obtained a matrix with 40 samples, and a matrix with 36 samples for samples containing the binary combination of the three tetracyclines. The spectral range used for the spectra obtaining was 900 to 1800 cm, corresponding to the Medium Infrared region (MIR - Mid Infrared). The SIMCA method was used in the identification of samples, classifying them as belonging to the mentioned matrix. The success degree in the classification was of 100%. For the identification of the samples, the next step was the development of the procedure of quantification of the tetracyclines in milk using the PLS method. The range of dope of the samples was from 20 to 500 ppb (parts per billion), including a wide range, considered by the Brazilian legislations, American and European Union, because initially there was not knowledge of the limit of detection of the method. The iPLS was used for the identification and selection of the spectral range with better correlation with the amount of presented antibiotic in the sample. The obtained results were promising considering the low concentration that was intended to detect: for concentration above 100 ppb, the errors obtained were, on average, less than 13% and for concentration below 100 ppb were, on average, less than 18%. In that way, the developed method, in spite of not being strictly quantitative, assists to the objectives of fast detection, without pre-treatment of the samples and generation of chemical residues, allowing the identification, in an unknown sample of milk, of the residue of present tetracycline. Mestrado Química Analítica Mestre em Química

Bacteria of Mollicutes Class are associated with intramammary infection and decrease in milk production. This study investigated the occurrence of Mollicutes and elucidated their risk factors in dairy herds from Southeast Brazil. For this, milk samples from 387 lactation cows from Minas Gerais, Rio de Janeiro and São Paulo States were subjected to the polymerase chain reaction (PCR) to detect Mollicutes. Species of Mycoplasma were investigated in Mollicutes positive samples by PCR, including Mycoplasma bovis, M. alkalescens, M. bovigenitalium, M. bovirhinis, M. arginini and A. laidlawii. An epidemiological questionnaire was applied to collect data on possible risk factors, which were assessed using Pearson’s Chi-square test followed by odds ratio (P≤0.05). Mollicutes were reported in 21% (4/19) of the herds and 4% (16/387) of the animals, while 1% (5/387) were positive for M. bovis and 3% (11/387) for M. arginini. All samples were negative to the other agents. Herds with more than 150 animals [OR=3.51 (95% CI 1.11-11.08)], manual milking [OR=9.97 (95% CI 2.80-35.49)] and not-milking animals with mastitis last [OR=6.54 (95% CI 1.92-22.29)] were risk factors. The presence of these conditions may favor intramammary infection by Mollicutes in dairy herds from Southeast Brazil. This is the first report of M. bovis in Rio de Janeiro and M. arginini in the studied states. RESUMO: Bactérias da Classe Mollicutes estão associadas à infecção intramamária e diminuição da produção leiteira. O objetivo deste estudo foi investigar a ocorrência de Mollicutes e elucidar seus fatores de risco em rebanhos leiteiros do sudeste brasileiro. Para isso, amostras de leite de 387 vacas em lactação dos estados de Minas Gerais, Rio de Janeiro e São Paulo foram submetidas à reação em cadeia da polimerase (PCR) para detectar Mollicutes. Espécies de Mycoplasma foram investigadas nas amostras positivas por PCR, incluindo Mycoplasma bovis, M. alkalescens, M. bovigenitalium, M. bovirhinis, M. arginini e A. laidlawii. Foi aplicado um questionário epidemiológico para a coleta de dados sobre possíveis fatores de risco, que foram avaliados pelo teste de Qui-Quadrado de Pearson seguido de odds ratio (P≤0.05). Mollicutes foram detectados em 21% (4/19) dos rebanhos e 4% (16/387) dos animais, enquanto 1% (5/387) destes foram positivos para m. bovis, 3% (11/387) para m. arginini, sendo todas as amostras negativas para os demais agentes. Rebanhos com mais de 150 animais [OR=3,51 (95% IC 1,11-11,08)], ordenha manual [OR=9,97 (95% IC 2,80-35,49)] e ausência de linha de ordenha [OR=6,54 (95% IC 1,92-22,29)] foram considerados fatores de risco. A presença dessas condições pode favorecer a infecção intramamária por Mollicutes em rebanhos leiteiros no sudeste do Brasil. Este é o primeiro relato de M. bovis no Rio de Janeiro e M. arginini nos estados estudados.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Aflatoxin M1 and polychlorinated biphenyls (PCBs) are toxic compounds and carcinogenic to humans. Both have their widespread occurrence through milk in a significant way. Milk is an important source of human exposure to these compounds also due to its expressive consumption worldwide, either in the fluid form or dairy prodtucs, mainly by young and elderly. Organic milk is geting space and preference for many consumers, since its production is standardized and can be certified according to animal welfare, sustainability, non-use of antibiotics, synthetic medicines and homones, for example, with a view to obtaining products without residues. In this study, 84 milk samples were investigated in total, and 63 (75 %) were contaminated with aflatoxin M1 above the limit of detection. No difference was observed between the samples from organic and conventional systems. There was no difference between pasteurized and raw milk samples. None of the samples contained aflatoxin M1 above the maximum level permitted by Brazilian Legislation (0,5 μg/kg for fluid milk). The levels of eleven congeners of polychlorinated biphenyls (PCBs) were evaluated in 60 samples of organic and conventional milk collected in three regions of Brazil. The congeners of four DL-PCBs investigated were not detected in any sample of milk analyzed. The results confirm the occurrence of low contamination by PCBs 153 and 180 in the two production systems, with a significant difference in the mean concentration detected for PCB 153 in conventional milks PCB 153 was present in average concentrations of 0.46 ng g-1 fat in organic milks and 1.12 ng g-1 fat in the conventional samples analyzed. PCB 180 was detected at mean concentrations of 0.12 ng g-1 fat and 0.18 ng g-1 fat in organic and conventional samples, respectively. These detected levels were in line with European legislation (40 ng g-1 for sum of indicator PCBs). PCB 153 was present in average concentrations of 0.46 ng g-1 fat in organic milks and 1.12 ng g-1 fat in the conventional samples investigated. There was no significant difference between the occurrence of PCB 153 and PCB 180 in raw and pasteurized milks. PCB 153 was detected in 50% of the conventional milk samples and in 13.33% of the organic samples analyzed. PCB 180 was detected in 10% of the conventional samples and in 6.66% of the organic milk samples analyzed.The levels detected were in accordance with the european legislation. The estimated daily intake (EDI) of aflatoxin M1 e PCBs through organic and conventional milk consumption was also evaluated. In this study, the EDI-values for aflatoxin M, PCB 153 e PCB 180 did not pose a toxicological risk for the population. However, it is suggested to consider the data obtained, especially in milks from organic production, as an impact factor on organic quality. In this sense, the systematic monitoring can be as a subsidy to the evaluation of the risk involved in the consumption of milk against the contamination by AM1 and POPs of hight toxicity, such as PCBs. To our best knowledge, this is the first report on aflatoxin M1 and PCBs levels in organic milk from Brazil. Aflatoxina M1 e bifenilos policlorados (PCBs) são compostos tóxicos carcinogênicos para humanos e ambos tem sua ocorrência difundida pelo leite de modo significativo. Assim, o leite constitui-se em importante fonte de exposição humana a esses compostos também pelo seu expressivo consumo à nível mundial, seja na forma fluida ou de derivados, principalmente por jovens e idosos. O leite orgânico vem ganhando espaço e preferência por muitos consumidores, uma vez que sua produção está normatizada e pode ser certificada conforme preceitos de bem estar animal, sustentabilidade, não utilização de antibióticos, medicamentos sintéticos e homônios, por exemplo, na perspectiva de obtenção de produtos isentos de resíduos. Neste estudo, um total de 84 amostras de leites foram investigadas em relação à ocorrência de AM1 e 63 (75%) confirmaram-se contaminadas acima do limite de detecção. Não foram observadas diferenças significativas na contaminação entre amostras produzidas em sistemas convencionais e orgânicos. Também não houve diferença significativa na ocorrência de contaminação por AM1 entre leites pasteurizados ou crus analisados. Nenhuma das amostras apresentou contaminação acima dos limites máximos permitidos pela legislação brasileira (0,5 μg/kg para leite fluido). Por sua vez, os níveis de onze congêneres de bifenilos policlorados (PCBs) foram avaliados em 60 amostras de leites convencionais e orgânicos coletados em três regiões do Brasil. Os congêneres de quatro DL-PCBs investigados não foram detectados em nenhuma amostra de leite analisada. Os resultados obtidos confirmaram a ocorrência de baixa contaminação pelos PCBs 153 e 180 nos dois sistemas de produção, havendo diferença significativa na concentração média detectada para o PCB 153 nos leites convencionais. PCB 153 apresentou-se em concentrações médias de 0,46 ng g-1 de gordura nos leites orgânicos e de 1,12 ng g-1 de gordura nas amostras convencionais analisadas. O PCB 180 foi detectado em concentrações médias de 0,12 ng g-1 de gordura e 0,18 ng g-1 de gordura em amostras orgânicas e convencionais, respectivamente. Esses níveis detectados estavam de acordo com o permitido pela legislação europeia (40 ng g-1 para somatório de PCBs indicadores). O PCB 153 foi detectado em 50% das amostras de leite convencionais e em 13,33% das amostras orgânicas analisadas. Já o PCB 180 foi detectado em 10% das amostras convencionais e em 6,66% das amostras de leite orgânico analisadas. Não houve diferença significativa entre a ocorrência do PCB 153 e do PCB 180 em leites crus e pasteurizados. A ingestão diária estimada (IDE) de AM1 e PCBs pelo consumo de leites convencionais e orgânicos do Brasil também foi avaliada. Neste estudo, a ingestão diária estimada de AM1, PCB 153 e PCB 180 pelo consumo de leites convencionais e orgânicos não representam um risco toxicológico para a população. Porém, sugere-se a consideração dos dados obtidos e o monitoramento sistemático como subsídio à avaliação do risco benefício envolvido no consumo de leite frente à contaminação por AM1 e por POPs de expressiva toxicidade, como os PCBs. Este estudo foi o primeiro a reportar níveis de AM1 e PCBs em leites orgânicos do Brasil.

Milk and its derivatives are good substrates for the proliferation of pathogenic and quality-deteriorating microorganisms, demanding rigorous care with milking, processing, and storage. Among the various bacteria that can grow in raw refrigerated milk, Yersinia enterocolitica, is an invasive enteropathogen of humans. This bacterium can cause a number of intestinal and extraintestinal clinical symptoms, ranging from mild gastroenteritis to mesenteric lymphadenitis, similar to appendicitis. To evaluate the prevalence of pathogenic Yersinia enterocolitica in raw milk from bulk milk tanks located in the State of São Paulo, 102 bovine milk samples (one per dairy farm) were evaluated by microbiological analyses, followed by biochemical tests PCR and genetic sequencing. Microbiological testing did not isolate Y. enterocolitica. However, PCR analysis revealed six samples that were positive for Y. enterocolitica (5.9%), confirmed by genetic sequencing. Only the inv gene was detected, which is present in virulent and avirulent Y. enterocolitica strains. There was great difficulty in microbiological isolation due to the difficulty of competitiveness of Y. enterocolitica in a very rich microbiota of raw milk. Although virulence genes known to be present in potentially pathogenic strains of Y. enterocolitica have not been identified, the presence of this pathogen in milk from expansion tanks, identified through PCR and confirmed by genetic sequencing, suggests that Y. enterocolitica may be a risk to public health, especially if milk and its derivatives are consumed without heat treatment. O leite e seus derivados possuem substratos que favorecem o desenvolvimento de micro-organismos patogênicos e deteriorantes, devido a isso, cuidados rigorosos são exigindo durante a ordenha, processamento e seu armazenamento. Dentre os vários grupos de bactérias que podem contaminar o leite refrigerado cru está Yersinia enterocolitica. Esta bactéria pode causar a uma série de sintomas clínicos intestinais e extraintestinais, variando de gastroenterite leve a linfadenite mesentérica, semelhante à apendicite. Para avaliar a prevalência de Y. enterocolitica patogênica no leite cru de tanques de expansão localizados no estado de São Paulo, foram avaliadas 102 amostras de leite bovino, por análises microbiológicas, seguido de provas bioquímicas; a Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) e sequenciamento genético. Não houve o isolamento de Y. enterocolitica pelas provas microbiológicas clássicas. No entanto, a análise de PCR, realizada diretamente do leite, revelou seis (6) amostras positivas para Y. enterocolitica (5,9%), confirmadas por sequenciamento genético. Somente o gene inv, foi detectado, que pode estar presente em cepas virulentas e avirulentas. Houve dificuldade de isolamento microbiológico devido à dificuldade de competitividade da Y. enterocolitica em uma microbiota muito rica do leite cru. Ainda que não tenham sido identificados os genes de virulência que sabidamente estão presentes em cepas de Y. enterocolitica potencialmente patogênicas, a presença desse patógeno no leite dos tanques de expansão, identificadas através da PCR e confirmadas por sequenciamento genético, sugere que Yersinia enterocolitica pode ser um risco potencial para a saúde pública, principalmente se o leite e seus derivados forem consumidos sem tratamento térmico.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Outra Agência Objetivou-se determinar atividade antisséptica do óleo essencial de Lippia origanoides na presença de leite bovino. A composição química do óleo essencial de alecrim pimenta foi determinada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM), sendo detectados 53 compostos, dos quais 16 foram identificados (>0,1% área total). O carvacrol (32,7%), p-cimeno (23%), timilmetil éter, cariofileno (7,98%) e o γ-terpineno (5,40%) foram os componentes mais abundantes. A concentração inibitória mínima para Staphylococcus aureus ATCC 25923 e E. coli ATCC 8739 foi de 60μL/mL, enquanto para Salmonella Choleraesuis ATCC 35640 foi de 90μL/mL. A concentração bactericida mínima foi de 120μL/mL para as três bactérias. Avaliou-se a atividade antisséptica do óleo essencial na concentração de 120μL/mL na presença de leite bovino sobre as mesmas cepas bacterianas. O óleo em estudo apresentou efeito inibitório do crescimento das cepas em diferentes tempos de ação (p0.1% total area). The carvacrol (32.7%), p-cymene (23%), thymil methyl ether (10.03%), caryophyllene (7.98 %) and γ-terpinene (5.40%) were the most abundant components. The minimum inhibitory concentration for Staphylococcus aureus ATCC 25923 and Escherichia coli ATCC 8739 was 60uL/mL, as for this Salmonella Choleraesuis ATCC 35640 was 90uL/mL. The minimum bactericidal concentration was 120μL/mL for all three bacteria. We evaluated the antiseptic activity of the essential oil in the concentration of 120μL/mL in the presence of bovine milk for the same bacterial strains. The oil under study It showed an inhibitory effect of growth of the strains in different action times (p

O setor agroindustrial do leite representa um dos maiores sistemas agroindustriais do mundo. O Brasil é, tradicionalmente, um grande produtor deste nobre alimento e, inclusive de soro lácteo juntamente com a produção de queijo. Objetivou-se avaliar a composição físico-química e microbiológica do leite e dos soros lácteos dos queijos minas frescal e mussarela estocado sob diferentes condições de temperatura. O experimento foi conduzido durante dois períodos distintos do ano de 2013. No leite foram realizadas análises físico-químicas e microbiológicas. Nos soros lácteos, acompanhados por 21 dias de estocagem nas temperaturas de 4±1ºC e 8±1ºC, foram realizadas aferições de pH, determinações da acidez titulável, teor protéico, perfil eletroforético e análises microbiológicas. Os dados foram comparados por meio de intervalos de 95% de confiança, construídos, em cada tempo, a partir da variável t-Student, e as análises realizadas com o software R versão 3.0.3. Os resultados das análises físico-químicas das amostras dos leites analisados indicaram índices em desacordo com a legislação vigente. Na contagem microbiana, tanto o leite como os soros lácteos estudados apresentaram valores de não conformidade com a legislação. Durante todo o período de estocagem, somente o soro do queijo minas frescal, armazenado a 4±1 ºC apresentou conformidade com a legislação para o pH e acidez titulável. Os teores médios de proteína total nos soros dos queijos pesquisados, nas temperaturas de 4±1 ºC e 8±1 ºC apresentaram-se em acordo com a legislação e, independente do tipo de queijo, não apresentaram diferenças significativas de proteínas (p> 0,05), ao longo do período de observação. O perfil eletroforético dos soros lácteos permitiu a observação de uma concentração mais acentuada nas bandas representativas de até o sétimo dia de armazenamento com 09 a 11 proteínas com pesos moleculares entre 14,4 a 116 kDa, em ambos os géis produzidos. Milkagroindustrial sector is one of the largest agribusiness systems in the world. Brazil is traditionally a large producer of this noble food and even whey along with the production of cheese. This study aimed to evaluate the physical, chemical and microbiological composition of milk and milk whey, as well as, fresh and mozzarella cheeses stored under different temperature conditions. The experiment was conducted during two different periods of the year 2013. We carried out physico-chemical and microbiological analyzes in milk, and pH measurements, determination of titratable acidity, protein content, electrophoretic profile and microbiological analyzes in milk whey, after 21 days of storage at temperatures at 4±1 ºC and 8±1 ºC. Data were compared using intervals of 95% confidence, built in each time, from the Student t variable, and the analyzes performed using the R version of 3.0.3 software. The results of physical-chemical analysis of milk samples analyzed indicated rates at odds with current legislation. In microbial count, both milk and milk whey studied presented values of non-compliance with legislation. Throughout the storage period, only the whey of fresh cheese, stored at 4±1 ºC showed compliance with the rules for pH and titratable acidity. The average levels of total protein in the whey of cheeses studied at temperatures of 4±1 ºC and 8±1 ºC were in accordance with the rules and, regardless of the type of cheese, no significant differences in protein (p > 0.05 ), was verified throughout the observation period. The electrophoretic profile of milk whey allows observation of a greater concentration in the bands representing up to the seventh day of storage at 09 th to 11th proteins with molecular weights of between 14.4 to 116 kDa in both gels produced. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

The objective of the present study was to evaluate the reduction in somatic cell count (SCC) and total bacterial count (TBC) in bovine milk to acceptable parameters, using a dietary supplement, in three different dosages. The dietary supplement consisted basically of organic minerals derived from Lithothamnium calcareum (92.5 g/kg), Saccharomyces cerevisiae (2.5 g/kg) and yeast cell walls (5g/kg). Twelve crossbred cows that were more than 60 days postpartum and produced more than 20 Kg of milk/day were used in this research, which was conducted at the experimental farm of the Federal University of Uberlândia (Fazenda Experimental do Glória, Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, Brazil). During the first 75 days, the animals were confined and received feed and silage. During the following 75 days, the animals were received feed and pasture. The 12 cows were divided into four groups of three animals each, the animals of each group receiving 0, 40, 60 or 80g of supplement per day. The supplement was mixed in 4 kg of feed and offered during milking. Milk samples were collected each month, the first one at the beginning of the experiment and the remaining samples every 30 days. These samples were collected at the beginning of the afternoon milking, before the placement of the teat cups, and were kept in containers with bronopol (2-bromo, 2-nitro-1, 3 propanediol). After being collected, the samples were cooled and sent to the Centro de Tecnologia para o Gerenciamento da Pecuária de Leite, at the Clínica do Leite (Esalq-USP). Flow cytometry was used to determine the SCC and flow cytometry PO ANA 010 was used to determine TBC. The average SCC ranged between 1,07 x 105 cells/mL and 2,78 x 105 cells/mL. The average TBC ranged between 4 x 103 CFU/mL and 17 x 103 CFU/mL. No significant changes in SCC and TBC counts were observed, regardless of the dosage used was observed. Este trabalho teve como objetivo avaliar se houve redução nas CCS e CBT do leite de vacas, usando um suplemento dietético, em três diferentes dosagens e constituído basicamente de minerais orgânicos oriundos da Lithothamnium calcareum (92,5g/kg), principalmente cálcio e magnésio, e leveduras de cana-de-açúcar (Saccharomyces cerevisiae) (2,5g/kg) enriquecidas com paredes celulares destas (5g/kg). A pesquisa foi realizada na Fazenda Experimental do Glória da Universidade Federal de Uberlândia, em Uberlândia, MG. Foram utilizadas 12 vacas mestiças leiteiras que estavam com mais de 60 dias pós-parto, com produção leiteira acima de 20 kg/dia. Durante o período da pesquisa cinco meses - todos os animais ficaram 75 dias em confinamento com ração e silagem e 75 dias com ração e pastagem. As 12 vacas foram divididas em quatro grupos de três animais cada um. Dos grupos, três receberam, respectivamente, 40, 60 e 80g/dia/animal de suplemento misturado aos quatro kg diários de ração, oferecidos durante a ordenha. Um grupo foi mantido como controle, sem receber o suplemento. Foram coletadas cinco amostras mensais de leite de cada animal, uma no início do experimento e as outras a cada 30 dias. As amostras de leite foram coletadas no início da ordenha da tarde, antes da colocação das teteiras, em recipientes com preservante bronopol (2-bromo, 2-nitro-1,3 propanediol), foram resfriadas e enviadas para o Centro de Tecnologia para o Gerenciamento da Pecuária de Leite, na Clínica do Leite (Esalq-USP). Através da citometria de fluxo foi determinada a CCS e da Citometria de Fluxo - PO ANA 010 foi determinada a Contagem Bacteriana Total (CBT). As médias de CCS e CBT variaram entre 107 x 1000 e 278 x 1000 células por mL e 4 x 1000 e 17 x 1000 UFC por mL, respectivamente. Não foi observada nenhuma alteração significativa nas CCS e CBT, com nenhuma dosagem utilizada. Mestre em Ciências Veterinárias

INTRODUCTION. Tetracyclines are a large spectrum class of antibiotic, widely used in prevention and treatment of infection in dairy cattle. Though its indiscriminate use and the disrespect to the withdraw period may result residues in milk, which can cause bacteria resistance, allergies, and economic losses to producers of milk and dairy products. Therefore, surveillance and monitoring of the presence of antibiotics in milk are needed to ensure consumer safety and avoid financial losses. For that, several methods have been used, and the high performance liquid chromatography is preferred by presenting analysis speed, selectivity, accuracy and reproducibility. Moreover, laws of several countries have established safe limits of residues in food (LMR). OBJECTIVES. (I) Provide information about the methods used in the determination of tetracyclines in milk reported in the literature. (II) Validate a multiresidue method for the determination of tetracyclines (oxytetracycline, tetracycline, chlortetracycline and doxycycline) in bovine milk by high performance liquid chromatography with UV-VIS detector according to analytical criteria defined by European Commission 2002/657/EC. (III) Investigate the occurrence of tetracyclines residue in bovine pasteurized milk by high performance liquid chromatography detection system with UV/VIS. (IV) Assessment the population exposure to antimicrobial residues in milk commercialized in the State of Parana, Brazil. MATERIAL AND METHODS. A review of analythical methods for determination of tetracyclines reported in the literature was performed. Validation of an extraction method, wherein the milk samples were deproteinated with Mcllvaine buffer and 20% trichloroacetic acid and cleanup carried out in C18 columns. Tetracyclines have been separated into a high efficiency liquid chromatograph with UV/VIS detector set at 365 nm by a gradient composed of oxalic acid 0.01 mol/L, acetonitrile and triethylamine in C8 column. To investigate the occurrence of tetracyclines, 100 samples were collected in the State of Parana, between March/2010 and October/2011, and analyzed by the validated method. To evaluate the exposure to the tetracyclines residue, it was calculated the Estimated Daily Intake (EDI) according to the JECFA. The EDI was compared to the Acceptable Daily Intake (ADI) from 0 to 0.03 mg/kg body weight (bw). RESULTS AND DISCUSSION. The steps for determining antibiotic residues in milk are: extraction, cleanup, identification/quantification and confirmation. The main problem with this analysis due the matrix effect that may interfere with the determination of these residues. Therefore, we have investigated methods of extraction and cleanup witch consist of deproteinization and removal of these components, but that are simple and quick. Thus, many researchers have used to solutions and acidic buffers,and solid phase columns. For identification and quantification, the most used techniques are high performance liquid chromatography and capillary electrophoresis, which show precise results and the confirmation is generally made by mass spectrometry. The validated method in this work presented the limits of detection and quantification from 42.3 to 75.8 and 43.2 to 76.4 µg/kg, respectively. The decision limit (CCα) and detection capability (CCß) varied from 114.2 to 143.7 and 129.3 to 188.7 µg/kg, respectively. Recoveries of tetracyclines in fortified samples were above 82.5%. Of 100 samples analyzed, three were contaminated with values of 121.8 µg/kg for oxytetracycline, 93.5 µg/kg for tetracycline and 134.6 µg/kg for chlortetracycline (61.6 13 µg/kg) and doxycycline (73.0 µg/kg). The median of residues of tetracyclines found in the samples was 42.3 µg/kg and EDI was 0.05 µg/kg bw/day for Brazil, 0.08 µg/kg bw/day for the Southern region and 0.07 µg/kg bw/day for the State of Parana. CONCLUSIONS. Among the analytical techniques for the determination of tetracyclines residue in milk, the most commonly used is the high performance liquid chromatography (HPLC) with ultraviolet detection system (UV) or diode array. Although there are techniques which have good results, but with lower sensitivity such as capillary electrophoresis, but allows a rapid and less polluting analysis. The method validated in this study for determination of tetracyclines in pasteurized bovine milk, according to regulation 2002/657/EC of the European Union, presented linearity, specificity, selectivity, precision and accuracy. Therefore, this method showed efficiency enough for the monitoring of tetracyclines in milk. Results of analysis of the collected samples showed that the occurrence of tetracylines in milk was low (3%), but had samples above the MRL (2%), and the risk to the population to these residues in the milk was regarded as egligible (

O objetivo deste trabalho é apresentar os principais resultados da pesquisa sobre o leite instável não ácido ou LINA. A proporção de amostras de leite com estabilidade térmica, abaixo do mínimo exigido pela indústria brasileira, configura um sério problema, com uma ocorrência mais elevada durante os períodos de carência alimentar. Trata-se de um problema multifatorial, cujos fatores intervenientes são relacionados à execução do teste (concentração do álcool), ao manejo (alimentação, clima, relação homem-animal), ao animal (suscetibilidade ao estresse, potencial produtivo, estádio da lactação, sanidade, problemas digestivos e metabólicos, frações da caseína), entre outros. Existem dúvidas quanto à capacidade do teste do álcool em estimar a estabilidade térmica do leite. A indústria necessita de um teste rápido, de baixo custo e que realmente identifique o leite adequado ao processamento térmico. O manejo correto dos animais, aliado ao uso de parâmetros realistas de execução do teste do álcool, pode contribuir para melhorar a estabilidade do leite. This paper aimed to present the main results about the unstable non acid milk (LINA). The proportion of milk samples with thermal stability below the Brazilian dairy industry standard is a serious problem, with highest occurrence at short food supply periods. It is a multi factorial problem, which causing factors are related to test execution (ethanol concentration used), to management (feeding, climate, human-animal relation), to animal (stress susceptibility, productive potential, lactation stage, sanitary condition, digestive and metabolic disorders), among others. There are doubts to the accuracy and precision of the alcohol test to detect stability problems. Dairy industry needs a fast, low price and easy test, but that can identify milk suitable to thermal processing. An adequate animal's management besides realistic parameters of milk test might contribute to improve milk stability.