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Orientador: Eliana Aparecida de Resende Duek Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Mecanica Mestrado Materiais e Processos de Fabricação Mestre em Engenharia Mecânica

A cárie é uma doença infecciosa, transmissível, crônica, multifatorial e de lenta progressão. Ultimamente, há a busca pelo desenvolvimento de tratamentos minimamente invasivos das lesões cariosas com preservação estética. Uma estratégia interessante é o tratamento com Biomateriais e Laserterapia, pois permitiria uma melhor absorção e aproveitamento do Biosilicato® (BS) pelo dente lesionado com intuito de regeneração. Este estudo objetivou a investigação de métodos de aderência de BS ao dente cariado, assim como o desenvolvimento de metodologia para melhor interação do BS com o laser de Nd:YAG. O estudo foi conduzido em 2 fases experimentais. Na primeira, adotou-se o modelo de cárie química em dentina radicular bovina e, após, foi feito o tratamento com as partículas de BS em diferentes veículos de aplicação (água destilada, silicone e gel dental), com posterior avaliação composicional e morfológica, que mostraram a efetividade do tratamento de cárie com o BS veiculado em água destilada. Na segunda fase, a dentina cariada foi tratada com BS, associado ou não à irradiação laser e diferentes fotoabsorvedores, e avaliaram-se a morfologia e temperatura intrapulpar decorrentes dos tratamentos. A irradiação laser após a aplicação do BS, com utilização de carvão como fotoabsorvedor, possibilitou o recobrimento dos túbulos dentinários de forma uniforme, com aspecto de derretimento e recristalização do BS, proveniente do aquecimento promovido pelo laser. Ademais, a temperatura intrapulpar, monitorada durante a etapa de irradiação não apresentou variação superior a 5,6 ºC, que é considerada crítica para a vitalidade da polpa. Em conclusão, o tratamento de BS combinado ao laser de Nd:YAG se mostrou promissor ao tratamento da cárie.

Este projeto tem como objetivo avaliar o desempenho biológico de scaffolds para regeneração óssea preparados por um processo de fabricação aditiva. O Instituto Politécnico de Leiria desenvolveu uma bioextrusora que tem como função produzir este tipo de scaffolds. Os referidos scaffolds são constituídos por uma mistura de policaprolactona e hidroxiapatite, em diferentes percentagens, bem como geometria e porosidade específicas, o que permitirá testar a citotoxicidade e proliferação celulares para vários tipos de células: macrófagos, fibroblastos e células osteogénicas Testaram-se estas estruturas 3D através de ensaios de cultura celular, concretamente com fibroblastos, macrófagos e células osteogénicas realizando igualmente co-culturas dos dois primeiros tipos de células. Os fibroblastos foram desenvolvidos a partir de polpa de dentes imaturos humanos. Após recolha de germes dentários, as células do tecido ósseo foram diferenciadas a partir de células mesenquimatosas da papila dentária, que podem originar odontoblastos/osteoblastos, através de uma técnica bem estabelecida. Utilizaram-se ainda células osteogénicas de uma linha de osteossarcoma (MNNG/HOS). Qualquer um dos tipos de células foi semeado, em mono ou co-cultura, sobre os diferentes scaffolds esterilizados por plasma ou por óxido de etileno. Os germes dentários e os dentes imaturos foram recolhidos em colaboração com a Área de Endodontia do Departamento de Estomatologia, Medicina Dentária e Cirurgia Maxilo- Facial da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra. Os macrófagos peritoneais foram recolhidos a partir de ratos usando uma técnica estabelecida pela equipa, pois têm características idênticas aos macrófagos humanos. A proliferação celular e citotoxicidade foram avaliadas usando o teste de MTT (brometo de 3-(4,5,-dimetiltiazol-2-il)-difenil tetrazólio). Realizaram-se experiências in vivo, num modelo animal (rato Wistar), de acordo com as normas nacionais e internacionais de experimentação animal. Efetuou-se a implantação cirúrgica de alguns tipos de scaffolds esterilizados Das experiências in vitro pôde concluir-se em que os scaffolds de PCL + HA 10% + 300 μm + 90° e PCL + 300 μm + 90° apresentam características favoráveis ao crescimento de fibroblastos, os scaffolds de PCL + HA N 10% + 300 μm + 90° e PCL + HA N 25% +300 μm + 90° apresentam características favoráveis ao crescimento de macrófagos e os scaffolds de PCL + 600 μm + 45° apresenta características favoráveis ao crescimento de fibroblastos e macrófagos em co-cultura. Observou-se nas experiências in vivo que os scaffolds constituídos apenas por PCL apresentam características mais favoráveis à cicatrização e re-estruturação tecidular, seguindo-se a mistura PCL + HA 25% e por fim a mistura PCL + HA a 10%. Pôde ainda concluir-se que,, in vivo, os scaffolds esterilizados por óxido de etileno apresentam melhores resultados que os scaffolds esterilizados por plasma. A Engenharia de Tecidos poderá vir a ganhar bastante com este tipo de scaffolds, uma vez que apresentam várias vantagens relativamente aos métodos convencionais de produção, o que possibilita um alto nível de controlo da sua arquitetura e assegura grande reprodutibilidade. .Palavras-Chave “Scaffold”; “Fabricação aditiva”; “Macrófagos”; “Fibroblastos”; “Osteoblastos”; “Engenharia de Tecidos”.

Doutoramento em Engenharia Biomédica A paradigm shift is taking place from using transplanting tissue and synthetic implants to a tissue engineering approach that aims to regenerate damaged tissues by combining cells from the body with highly porous scaffold biomaterials, which act as templates, guiding the growth of new tissue. The central focus of this thesis was to produce porous glass and glass-ceramic scaffolds that exhibits a bioactive and biocompatible behaviour with specific surface reactivity in synthetic physiological fluids and cell-scaffold interactions, enhanced by composition and thermal treatments applied. Understanding the sintering behaviour and the interaction between the densification and crystallization processes of glass powders was essential for assessing the ideal sintering conditions for obtaining a glass scaffolds for tissue engineering applications. Our main goal was to carry out a comprehensive study of the bioactive glass sintering, identifying the powder size and sintering variables effect, for future design of sintered glass scaffolds with competent microstructures. The developed scaffolds prepared by the salt sintering method using a 3CaO.P2O5 - SiO2 - MgO glass system, with additions of Na2O with a salt, NaCl, exhibit high porosity, interconnectivity, pore size distribution and mechanical strength suitable for bone repair applications. The replacement of 6 % MgO by Na2O in the glass network allowed to tailor the dissolution rate and bioactivity of the glass scaffolds. Regarding the biological assessment, the incorporation of sodium to the composition resulted in an inibition cell response for small periods. Nevertheless it was demonstrated that for 21 days the cells response recovered and are similar for both glass compositions. The in vitro behaviour of the glass scaffolds was tested by introducing scaffolds to simulated body fluid for 21 days. Energy-dispersive Xray spectroscopy and SEM analyses proved the existence of CaP crystals for both compositions. Crystallization forming whitlockite was observed to affect the dissolution behaviour in simulated body fluid. By performing different heat treatments, it was possible to control the bioactivity and biocompatability of the glass scaffolds by means of a controlled crystallization. To recover and tune the bioactivity of the glass-ceramic with 82 % crystalline phase, different methods have been applied including functionalization using 3- aminopropyl-triethoxysilane (APTES). The glass ceramic modified surface exhibited an accelerated crystalline hydroxyapatite layer formation upon immersion in SBF after 21 days while the as prepared glass-ceramic had no detected formation of calcium phosphate up to 5 months. A sufficient mechanical support for bone tissue regeneration that biodegrade later at a tailorable rate was achievable with the glass–ceramic scaffold. Considering the biological assessment, scaffolds demonstrated an inductive effect on the proliferation of cells. The cells showed a normal morphology and high growth rate when compared to standard culture plates. This study opens up new possibilities for using 3CaO.P2O5–SiO2–MgO glass to manufacture various structures, while tailoring their bioactivity by controlling the content of the crystalline phase. Additionally, the in vitro behaviour of these structures suggests the high potential of these materials to be used in the field of tissue regeneration. Na chamada cirurgia reconstrutiva decorre, presentemente uma notável mudança de paradigma em que se tende a passar da utilização de tecidos transplantados e implantes sintéticos, para uma abordagem de engenharia de tecidos que tem como objetivo regenerar tecidos danificados, usando para isso células do corpo e biomateriais porosos, que orientam o crescimento do novo tecido. O foco central desta tese foi a produção de estruturas porosas vitreas ou vitroceramicas, que exibem um comportamento bioativo e biocompativel, com reatividade superficial específica em fluidos fisiológicos sintéticos e interações célula-matriz alteradas pela composição e tratamentos térmicos aplicados. Entender o comportamento de sinterização e da interação entre os processos de densificação e cristalização do vidro foi fundamental para avaliar as condições de sinterização ideais para a obtenção de uma estrutura porosa para aplicações em engenharia de tecidos. Foi realizado um estudo abrangente da sinterização, identificando o efeito da distribuição de tamanho de particula do pó de vidro e das variáveis do ciclo de sinterização na produção de scaffolds de vidro com microestruturas funcionais. As estruturas porosas desenvolvidas, preparadas pelo método de sinterização com sal usando o sistema vitreo 3CaO.P2O5 - SiO2 - MgO, com adições de Na2O e um porogéneo, NaCl, apresentam uma elevada porosidade, interconectividade, distribuição de tamanho de poros e resistência mecânica apropriada para aplicações em estratégias de regeneração óssea. A substituição de 6 % de MgO por Na2O na rede vitrea permitiu adequar a taxa de dissolução e bioactividade dos suportes porosos de vidro. Quanto à avaliação biológica, da incorporação de sódio na composição ocorreu uma inibição da resposta celular para períodos curtos. No entanto, foi demonstrado que, após 21 dias, a resposta celular é semelhante para ambas as composições. O comportamento in vitro dos suportes de vidro foi testado através da introdução destes em fluido corporal simulado (SBF) durante 21 dias. A espectroscopia por energia dispersiva de raios-X e as análises de SEM provaram a existência de precipitados de fosfato de cálcio sobre ambas as composições. A cristalização de whitlockite por ceramização das matrizes vítreas afectou o comportamento de dissolução em SBF. Em consequência dos diferentes tratamentos térmicos efectuados, foi possível produzir diferentes estados de cristalização e alterar a bioactividade e biocompatibilidade dos suportes porosos. Para recuperar e ajustar a bioatividade dos vitrocerâmicos com 82 % de fase cristalina foram aplicados diferentes métodos de modificação superficial incluindo a funcionalização com 3-aminopropil-triethoxysilane (APTES). A superfície do vitrocerâmico modificado exibiu a formação de uma camada de hidroxiapatite cristalina após 21 dias de imersão em SBF, enquanto que no vitrocerâmico base não se detetou a formação de fosfato de cálcio até 5 meses.

Submitted by Barroso Patrícia (barroso.p2010@gmail.com) on 2014-08-10T00:58:16Z No. of bitstreams: 1 RIBEIRO, Iorrana Índira dos Anjos.pdf: 3686467 bytes, checksum: 6611d8a1137ca75d545347904fc65087 (MD5) Made available in DSpace on 2014-08-10T00:58:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RIBEIRO, Iorrana Índira dos Anjos.pdf: 3686467 bytes, checksum: 6611d8a1137ca75d545347904fc65087 (MD5) CNPq Um grande desafio para a medicina e para os pesquisadores da Área de Bioengenharia Tecidual Óssea é desenvolver e aperfeiçoar técnicas e biomateriais que possam devolver a estrutura e funcionalidade do tecido ósseo em caso de perdas ósseas extensas. Dentre os biomateriais utilizados, a hidroxiapatita tem se destacado devido à sua excelente biocompatibilidade, similaridade com a fase mineral do tecido ósseo e interação biológica com os tecidos do sítio de implantação. A associação da hidroxiapatita com polímeros é um caminho promissor, já que este compósito garante diminuição da fragilidade da biocerâmica, estimula a adesão de células e simula a composição química do tecido ósseo. Porém, além da composição, as características físico-químicas do biomaterial, como tamanho e formato, também influenciam diretamente o seu potencial osteogênico. Assim, o objetivo deste estudo foi analisar a biocompatibilidade e o potencial osteogênico de biomateriais à base de hidroxiapatita no reparo ósseo. Para isso, uma amostra de 15 ratos foi utilizada, distribuídos para a composição de 3 grupos, com 5 animais cada, avaliados no ponto biológico de 15 dias de pós-operatório: Grupo GHAalg – defeito preenchido com grânulos de hidroxiapatita associada ao alginato; Grupo EHAalg – defeito preenchido com microesferas de hidroxiapatita associada ao alginato; Grupo Controle – defeito ósseo vazio, sem implantação de biomaterial. No grupo GHAalg, observou-se a deposição de matriz osteoide no centro do defeito, em permeio aos grânulos, e uma discreta inflamação crônica granulomatosa. No grupo EHAalg, notou-se a formação de delgados septos de tecido conjuntivo ao redor das microesferas e em permeio as suas partículas a deposição de um tecido conjuntivo associado à reação inflamatória crônica granulomatosa. No Grupo Controle, a neoformação óssea restringiu-se às bordas ósseas e houve preenchimento de toda extensão do defeito por tecido conjuntivo. Diante disto, concluiu-se que ambos os biomateriais foram biocompatíveis e os GHAalg tiveram comportamento osteogênico superior as EHAalg.

Mestrado em Materiais e Dispositivos Biomédicos O conceito de bioatividade surgiu com a descoberta, no início década de 70, de que algumas composições vítreas (ex.: 45S5 Bioglass®), tinham a capacidade de estabelecer uma ligação direta e estável com os tecidos vivos. Desde então, este grupo de biomateriais tem vindo a receber uma atenção cada vez maior por parte dos investigadores, tendo como motivação principal a busca de novas composições com propriedades mais adequadas para a regeneração óssea do que as composições comercialmente disponíveis. Na presente tese, avaliou-se o desempenho in vivo de duas composições de biovidro do sistema diopsite (CaMgSi2O6) - fluorapatite (Ca5(PO4)3F) - fosfato tricálcico (3CaO•P2O5) aplicados em defeitos ósseos de tamanho não crítico em carneiros, tendo também sido avaliada a biocompatibilidade dos biomateriais através da aplicação subcutânea de placas dos mesmos vidros. O trabalho realizado também incluiu a avaliação dos materiais in vitro, através de estudos de biomineralização em fluido corporal simulado e estudos de degradação. Os biomateriais foram comparados com o biovidro 45S5 Bioglass®, sendo que em termos de bioatividade in vitro, as duas composições investigadas apresentaram um maior potencial bioativo, levando à formação de uma camada superficial de hidroxiapatite carbonatada, em contraste com a formação de calcite na composição comercial, sob condições idênticas. Os testes de degradação in vitro também apresentaram resultados melhores para as duas novas composições, traduzidos por variações de pH e taxas de degradação menores do que os observados no caso do 45S5 Bioglass®. A avaliação in vivo dos implantes subcutâneos permitiu apurar a biocompatibilidade dos biovidros testados, tendo sido considerados ligeiramente irritantes. Os resultados relativos à aplicação dos pós de vidro bioativo nos defeitos ósseos não foram obtidos em tempo útil de modo a poderem ser incluídos na presente tese. Considerando o desempenho in vitro e a biocompatibilidade dos materiais estudados, estes podem apontar-se como materiais promissores para aplicações em engenharia de tecidos, particularmente na regeneração do tecido ósseo. The concept of bioactivity came with the discovery in the early 70s, that some glassy compositions (eg. 45S5 Bioglass ®), had the ability to establish a direct and stable bonding with living tissues. Since then, this group of biomaterials has been receiving increasing attention from researchers, the main motivation being the search for new compositions with bone regeneration properties more suitable than those of commercially available compositions. In this thesis, the in vivo performance of two bioglass compositions in the system diopside (CaMgSi2O6) - fluorapatite (Ca5(PO4)3F) - tricalcium phosphate (3CaO•P2O5) was evaluated through their application in non-critical size bone defects in sheep. Their biocompatibility was also studied through their subcutaneous application of square plates from the same bioglasses. The work also included the evaluation of materials in vitro by biomineralization studies, through the use of simulated body fluid and also degradation tests. The biomaterials were compared with the 45S5 Bioglass® and in terms of in vitro bioactivity, the two investigated compositions showed a higher bioactive potential, leading to the formation of a surface carbonated hydroxyapatite layer in contrast to the calcite layer formed on the surface of the commercial composition immersed under identical conditions. The in vitro degradation tests also showed better results for the two new compositions, reflected by smaller changes in pH and lower weight losses in comparison to 45S5 Bioglass ®. The in vivo evaluation of the subcutaneous implants allowed the determination of the biocompatibility of bioactive glasses tested, with both materials achieving a “slightly irritant” classification. Unfortunately, the results from the application of bioactive glass powders in bone defects were not obtained in time to enable their inclusion in this thesis. Considering the in vitro performance and the biocompatibility of the studied biomaterials, these may be pointed as promising materials for applications in tissue engineering, particularly in bone tissue regeneration.

Mestrado em Materiais e Dispositivos Biomédicos Os vidros bioativos constituem um material apropriado para o preenchimento de defeitos ósseos, como alternativa a enxertos autólogos, uma vez que, quando expostos a fluidos fisiológicos promovem a formação de uma ligação com o tecido ósseo sob a forma de uma camada de hidroxiapatite carbonatada. No presente trabalho caracterizaram-se vidros bioativos sem conteúdo alcalino, cuja composição incide no sistema binário de diópsido (CaMgSi2O6) e fosfato de tricálcio (3CaO·P2O5), em função da sua molhabilidade, carga superficial, perfil de degradação, carácter bioativo em fluido fisiológico simulado e do seu comportamento in vitro em contacto com células estaminais mesenquimais humanas (hMSCs). A medição do ângulo de contacto inicial de água sobre os vidros demonstrou o carácter hidrofílico dos vidros investigados. A determinação do potencial zeta mostrou que a carga superficial dos vidros é negativa, sendo mais negativa na composição Di-70. O estudo da biodegradação dos vidros, efetuado através da sua imersão em Tris-HCl, permitiu concluir que a perda de peso dos vidros foi reduzida. A caraterização in vitro em meio acelular foi efetuada através da imersão dos vidros numa solução de fluido fisiológico simulado (SBF) e verificou-se que estes possuem capacidade de formar uma camada de hidroxiapatite carbonatada à sua superfície após 7 dias, detetável por XRD, FTIR e SEM/EDS, sugerindo que este conjunto de vidros é potencialmente bioativo, e poderá estimular a proliferação e diferenciação celular. A resposta das hMSCs em cultura aos vidros bioativos foi avaliada em termos de atividade metabólica, morfologia, viabilidade, proliferação e diferenciação osteogénica e conclui-se que os biovidros Di-60 e Di-70 poderão constituir um suporte viável para a proliferação e diferenciação de hMSCs. Bioactive glasses are a viable material to fill bone defects, as an alternative to autografts, since they promote the development of a bond with the bone tissue as a hydroxycarbonate apatite layer, when exposed to physiological fluids. The present work aimed at characterizing alkali-free bioactive glasses in the binary system of diopside (CaMgSi2O6)–tricalcium phosphate (3CaO·P2O5) regarding their wettability, surface charge, chemical degradation profile, in vitro bioactivity and in vitro behavior in contact with human mesenchymal stem cells (hMSCs). Contact angle measurements demonstrated the glasses’ hydrophilic character. Zeta potential measurements showed that the glasses’ surface charge was negative, being Di-70 the most negative one. In order to evaluate their biodegradation performance, the glasses were immersed in Tris-HCl and their weight loss was measured, being possible to conclude that the weight loss was minor. The in vitro bioactivity of glasses has been analyzed by their immersion in simulated body fluid (SBF) confirming the presence of a hydroxycarbonate apatite layer on top of the glasses after 7 days by means of XRD, FTIR e SEM/EDS, suggesting that this series of glasses is potentially bioactive and can stimulate cell proliferation and differentiation. hMSCs’ response to these bioactive glasses was evaluated in terms of cell metabolic activity, morphology, viability, proliferation and osteogenic differentiation, being concluded that Di-60 and Di-70 can be a viable support for hMSCs proliferation and differentiation.

Doutoramento em Engenharia Biomédica The main purpose of this thesis was to produce new formulations of PMMA-co- EHA and study its feasibility as being an alternative to traditional PMMA bone cements. Thus, were originally produced several co-polymers of PMMA-co-EHA and its mechanical properties and in vitro behaviour were evaluated. The copolymers were obtained by radical polymerization and several formulations were produced by partial replacement of MMA (up to about 50%) for EHA. Overall, the results suggest that the partial replacement of MMA by EHA decreased the modulus of the materials and, consequently, increased its flexibility. Then, PMMA commercial beads were added to PMMA-co-EHA formulations (to get bone cement) and the general properties of the resulting bone cements were evaluated. In general, the results revealed that the partial replacement of MMA by EHA led to beneficial changes in curing parameters (there was a reduction of the peak temperature and an increase of curing/setting time), in the in vitro behaviour (the water capacity increased) and in the mechanical properties (the bending strength increased) of new cements. The in vitro cellular response of new formulations of PMMA-co-EHA was compared with that of traditional PMMA bone cement. To this end, we tested the cell adhesion and proliferation of osteoblast-like MG63 cells and human cells from bone marrow. The results revealed that both types of cells were able to attach and proliferate in both formulations. The only exception was observed for the formulation prepared with the highest percentage of EHA, where a few cells that adhere failed to proliferate. Moreover, it was found that increasing the amount of EHA in cement led to an increasing inhibition of cell growth, especially during the first week of culture. This was related to increased water uptake capacity by the new formulations and consequent release of some of its toxic components. Finally, PMMA commercial beads were partially replaced by HA particles and the influence of this substitution on the curing parameters, the mechanical properties and in vitro behaviour of the resulting composites was also evaluated. Incorporation of HA into the bone cements induced a number of significant changes in its final properties: 1) decrease the peak temperature; 2) increase of curing time, 3) increasing the value of elastic modulus accompanied by decrease of the strength/tension. This last finding was related to poor interfacial adhesion between the various components of the bone cements and a heterogeneous distribution (possible agglomeration) of HA particles. O principal objectivo desta tese foi produzir novas formulações de PMMA-co- EHA e estudar a sua viabilidade como alternativa aos tradicionais cimentos ósseos de PMMA. Assim sendo, foram inicialmente produzidos vários co-polímeros de PMMA-co- EHA e as suas propriedades mecânicas e comportamento in vitro foram avaliados. Os co-polímeros foram obtidos por polimerização radicalar e diversas formulações foram produzidas por substituição parcial do MMA (até cerca de 50 %) por EHA. Globalmente, os resultados sugerem que a substituição parcial do MMA por EHA diminuiu o módulo de elasticidade dos materiais e, consequentemente, aumentou a sua flexibilidade. Posteriormente, foram adicionados grânulos de PMMA pré-polimerizado (para se obter um cimento ósseo) às várias formulações de PMMA-co-EHA e as propriedades gerais dos cimentos resultante foram avaliadas. De um modo geral, os resultados obtidos revelaram que a substituição parcial do MMA pelo EHA levou a alterações benéficas dos parâmetros de cura (houve uma redução da temperatura máxima de polimerização e um aumento do tempo de cura), do comportamento in vitro (verificou-se um aumento da capaciadade de retenção de água) e das propriedades mecânicas (aumento da capacidade de flexão) dos novos cimentos. A resposta celular in vitro das novas formulações de PMMA-co-EHA foi comparada com a dos cimentos tradicionais. Para o efeito, foram avaliadas a adesão e proliferação celular de células tipo-osteoblastos MG63 e de células humanas provenientes de medula óssea. Os resultados revelaram que os dois tipos de células foram capazes de aderir e proliferar em ambas as formulações. A única excepção foi observada para a formulação preparada com maior percentagem de EHA, onde as poucas células que aderiram não conseguiram proliferar. Para além deste facto, verificou-se que o aumento da quantidade de EHA nos cimentos conduziu a uma crescente inibição do crescimento celular, sobretudo durante a primeira semana de cultura. Este facto foi relacionado com a crescente capacidade de retenção de água por parte das novas formulações e consequente libertação de alguns dos seus componentes tóxicos. Por último, os grânulos de PMMA foram parcialmente substituídos por partículas de HA e a influência desta substituição nos parâmetros de cura, nas propriedades mecânicas e no comportamento in vitro dos compósitos resultantes foi também avaliada. A incorporação de HA nos cimentos induziu uma série de alterações importantes nas suas propriedades finais: 1) diminuição da temperatura máxima de polimerização; 2) aumento significativo do tempo de cura; 3) aumento do valor do módulo elástico acompanhado de uma dimuição da sua força/tensão. Este último resultado foi relacionado com a baixa adesão interfacial entre os vários componentes e com uma distribuição heterogénea (possível aglomeração) das partículas de HA.

Amostras de Ti em forma de discos foram nitretadas em descarga por cátodo oco, visando a sua utilizaçáo na área biomédica. Buscou-se condições que resultasse em superfícies com maior área superficial, de modo a aumentar a molhabilidade da superfície. Esta característica é importante nos mecanismos precursores da osseointegraçáo de implantes dentais. Para isto foi realizado um estudo sistemático de surgimento do efeito do cátodo oco, utilizando diferentes pressões e distâncias entre cátodos. A configuraçáo que apresentou maior estabilidade foi para a distância entre cátodos de 9 mm. Nessas condições as amostras foram nitretadas a pressáo de 2,5 e 1,5 mbar, temperatura entre 400 e 500 0C e tempos entre 1 e 2h. As amostras foram caracterizadas por microscopia ótica e eletrônica, difratometria de raios-X, além de ensaios de rugosidade e molhabilidade. Verificou-se que para temperaturas acima de 500°C, as amostras apresentavam coloraçáo escura e camadas pouco uniformes, com desprendimento durante limpeza com o ultra-som. Os valores da rugosidade de todas amostras tratadas foram superiores aos valores das amostras sem tratamento. A molhabilidade apresentou ótimos resultados ficando muito acima do resultado da amostra sem tratamento, motivando um estudo posterior em implantes Disk shaped samples of titanium were submitted to ionic nitriding by hollow cathode discharge with a view to biomedical applications. The main goal was to obtain good process conditions leading to higher surface contact area and, as a result of which, an increase in the wetabillity of the surface was expected. This is a very important surface feature to be considered during the precursory mechanisms of the osseointegration to dental implants. The experimental parameters ranged from the pressure of 2,5 to 1,5 mBar, temperature from 400 to 600 ºC and exposing time between 1 and 2 hours. The samples were characterized by optical and electronic microscopy, difractometry of X-ray, as well as roughness and wetabillity rehearsal. It could be observed that for temperatures above 500°C, the samples presented dark coloration and non-uniforms layers. Furthermore, these layers proved to be easily detached under ultrasound cleaning procedure. The achieved values for the roughness of the complete set of treated samples were higher when compared with the values obtained from the untreated samples. Owing to this fact, the wetabillity presented optimal results. Once more, these figures were higher than those of the untreated samples, thus encouraging subsequent studies in dental implants

Mestrado em Materiais e Dispositivos Biomédicos Esta dissertação aborda as potencialidades de um novo material cerâmico, o nitreto de silício (Si3N4), revestido com um filme de nanodiamante CVD (Chemical Vapour Deposition), que tem vindo a ser desenvolvido nos laboratórios do Centro de Investigação em Materiais Cerâmicos e Compósitos (CICECO) da Universidade de Aveiro. O novo material é um possível candidato à utilização em próteses articulares, nomeadamente na cabeça de fémur. No presente trabalho estudaram-se, por tomografia computorizada (TC), as propriedades imagiológicas do novo material comparando-as com as propriedades dos materiais comerciais, nomeadamente no que se refere ao eventual aparecimento de artefacto metálico que habitualmente se verifica devido à presença de objectos de elevada densidade (próteses) no corpo em estudo. Foi concebido um equipamento de teste que permitiu a aquisição das imagens de TC das diferentes amostras de cabeças de fémur (comerciais e realizadas em nitreto de silício com e sem revestimento de diamante) e posterior comparação do artefacto produzido nas imagens. As imagens de TC, adquiridas com diferentes protocolos e parâmetros, foram analisadas e caracterizadas em termos qualitativos e quantitativos. Nomeadamente caracterizou-se o erro devido à presença do artefacto metálico utilizando diferentes medidas de erro. Este estudo permitiu demonstrar que o nitreto de silício apresenta propriedades imagiológicas promissoras, dado que, quer do ponto de vista qualitativo quer quantitativo, o artefacto de tipo metálico produzido por este material é reduzido comparativamente com o artefacto produzido pelos materiais actualmente utilizados para este tipo de próteses. This dissertation approaches the potentialities of a new ceramic material, the silicon nitrite (Si3N4), covered with a CVD (Chemical Vapour Deposition) nanodiamond film that is being developed in the Investigation Centre laboratories of Ceramic Materials and Composites (CICECO) in Aveiro University. The silicon nitrite is a possible candidate to be used in articular prosthesis, namely in the head of femur. In the present work have been studied, by computed tomography (CT), the imaging properties of the silicon nitrite, comparing them with the properties of the commercial materials, namely in what refers to the eventual appearance of a metal artefact that is usually verified due to the presence of objects with high density (prosthesis) in the body under study. It have been conceived a test equipment that allowed the acquisition of the CT images of the different samples of head of femur (commercial and made in silicon nitrite with and without diamond covering) and posterior comparison of the artefact produced in the images. The images of CT, acquired with different protocols and parameters, were analyzed and characterized in qualitative and quantitative terms. Namely, the error due to the presence of the metal artifact was characterized through different error measures. This study allowed to show that the silicon nitrite presents promising imaging properties and from the qualitative and quantitative point of view, the metal artifact produced by this material is reduced when compared with the artifact produced by materials actually used for this type of prosthesis.

p. 20-27 Submitted by RI Repositorio (repositorio@ufba.br) on 2011-06-18T11:16:14Z No. of bitstreams: 1 3501.pdf: 181296 bytes, checksum: 033f7c63d53e590e172bee2f8ac92ed5 (MD5) Made available in DSpace on 2011-06-18T11:16:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3501.pdf: 181296 bytes, checksum: 033f7c63d53e590e172bee2f8ac92ed5 (MD5) Previous issue date: 2010 A bioengenharia tecidual é um campo multidisciplinar que aplica os princípios das ciências biológicas e das engenharias para o desenvolvimento de substitutos de órgãos e tecidos que visem à sua regeneração, com consequente melhoria da estética e função. Desta forma, a bioengenharia tecidual encontra-se frente ao desafio fundamental de desenvolver biomateriais e procedimentos que levem à otimização da regeneração. Os biomateriais devem possuir requisitos para sua aplicação clínica, sendo imprescindível a realização de testes in vitro e in vivo para validação de novos biomateriais ou técnicas regenerativas, fundamentais para o avanço da Bioengenharia Tecidual. Este trabalho tem como objetivo apresentar uma revisão da literatura sobre os principais aspectos da bioengenharia tecidual assim como a importância do desenvolvimento dos testes in vivo e in vitro e suas repercussões éticas. Salvador

Tese de doutoramento. Engenharia Biomédica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto, Instituto de Engenharia Biomédica, University of Washington Engineered Biomaterials. 2009

Estágio realizado na Zollern & Comandita / INEGI e orientado pelo Eng.º Rui Jorge Lemos Neto Tese de mestrado integrado. Engenharia Mecânica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2008

Tese de doutoramento. Ciências de Engenharia. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto, Université Victor Segalen Bordeaux 2. 2008

Mestrado em Engenharia Biomédica - Biomateriais Na reparação e regeneração de tecido ósseo torna-se cada vez mais atraente o recurso a suportes porosos temporários capazes de interagir com o organismo, através de respostas específicas que conduzam à formação de novo osso. O presente trabalho teve como objectivo produzir estruturas porosas a partir de composições vítreas, com uma composição que, em trabalhos anteriores, mostrou ter características bioactivas, com reactividade superficial específica em fluidos fisiológicos sintéticos. Os suportes foram obtidos por sinterização de uma mistura de vidro, de composição ponderal 54.89% 3CaO.P2O5 – 24.81%SiO2 – 20.30%MgO com um sal, NaCl, cuja granulometria e quantidade determinam as características da porosidade aberta dos suportes, após lixiviação. Investigaram-se neste trabalho algumas das variáveis de processamento, nomeadamente, a quantidade de sal, mantendo a sua granulometria constante, o valor da pressão de prensagem usada na conformação e a velocidade de aquecimento, temperatura máxima e tempo de patamar, no ciclo de sinterização. Investigou-se, ainda, a possibilidade de reacção entre o sal e o vidro durante a sinterização e o efeito das inclusões de sal na cinética de sinterização da matriz vítrea. A “janela de trabalho” para a sinterização dos compactos da mistura vidro-sal revelou-se estreita em termos de gama de temperaturas e a retracção total severamente limitada. Para estes efeitos contribuíram a reacção entre o sal e o vidro durante o aquecimento, com desenvolvimento de produtos gasosos e desestruturação da superfície das partículas de vidro, a presença das partículas de sal que actuam como inclusões rígidas na matriz vítrea e a cristalização um pouco mais precoce do vidro. O estudo do processamento dos suportes porosos permitiu seleccionar as condições mais adequadas de composição, conformação e sinterização, com base nas características microestruturais dos suportes, nomeadamente a fracção volúmica e a distribuição de tamanhos dos poros abertos, assim como a sua área superficial específica. Os espécimes porosos desenvolvidos com as variáveis de processamento seleccionadas apresentam uma percentagem de porosidade elevada, boa interconectividade, tamanho de poro e resistência mecânica compatíveis com a possibilidade de serem utilizados na reparação de tecido ósseo. Adicionalmente, o comportamento destas estruturas em meio fisiológico acelular e a sua capacidade de induzir a precipitação de fosfatos de cálcio à sua superfície sugeriu o elevado potencial destes materiais no campo da regeneração óssea. ABSTRACT: In the bone repair and regeneration it becomes more and more attractive to use temporary porous supports, or scaffolds, capable of interacting with the living tissues, through adequate responses that lead to the formation of new bone. The main goal of this work was to produce porous glass scaffolds with a composition that, in previous work, exhibited a bioactive behaviour with specific surface reactivity in synthetic physiological fluids. The porous specimens were prepared by sintering a 54.89%3CaO.P2O5 -24.81%SiO2 - 20.30%MgO glass (wt %) with a salt, NaCl, whose particle size and amount determine the characteristics of the scaffolds open porosity, after leaching. In this work some of the process parameters were investigated, namely the amount of salt, for a constant particle size, pressing pressure and sintering rate, maximum temperature and holding time of the thermal cycle. The possibility of reaction between the salt and the glass surface during sintering was evaluated and the effect of salt inclusions on the kinetics of glass sintering was also investigated. The “working window” for the sintering of the glass/salt mixture was seen to be very narrow with respect to the range of temperature and the total shrinkage severely restrained. For these effects several contributions should be taken into account, namely the reaction between the salt and the glass during sintering, with probable gas production and disruption of glass structure on the particles surface, the presence of salt particles that act as rigid inclusions within the glass matrix and the premature crystallization of glass. The study of the porous scaffold processing allowed the selection of the most suitable composition, shaping and sintering conditions based on the microstructural characteristics of the scaffolds, namely the volume fraction and the distribution of open porosity as well as their specific surface area. The developed scaffolds exhibit high porosity, interconnectivity, pore size distribution and mechanical strength suitable for bone repair applications. Additionally, the behaviour of these structures in physiological acelular medium and their capability to induce the precipitation of calcium phosphates on their surface, suggests the high potential of these materials to be used in the field of tissue regeneration.

Mestrado em Engenharia Biométrica - Biomateriais Um dos grandes desafios no campo da engenharia de tecidos é o desenvolvimento de estruturas porosas tridimensionais (scaffolds) que permitam a adesão, a proliferação e a produção de matriz extracelular à taxa a que decorre a degradação do scaffold. Os scaffolds compósitos de matriz polimérica com enchimentos cerâmicos bioactivos têm sido objecto de investigação recente, pois combinam as vantagens destes dois tipos de materiais e mimetizam razoavelmente o osso, que é um compósito natural. Neste trabalho, foram preparados scaffolds compósitos usando o ácido poli (Lláctico) (PLLA) como matriz e um vidro bioactivo (BG) do sistema 3CaO.P2O5- MgO-SiO2 como enchimento inorgânico. O PLLA foi escolhido por ser um polímero sintético biodegradável, biocompatível e também piezoeléctrico à semelhança do osso, propriedade que tem sido apontada como responsável pela regulação do crescimento ósseo. Por sua vez, a composição vítrea seleccionada evidenciou, em estudos anteriores, a capacidade de induzir a precipitação de apatite, responsável pela bioactividade. Os scaffolds foram preparados por separação de fases termicamente induzida (TIPS) de soluções de 5.5% (m/m) PLLA/dioxano/água variando o teor de biovidro de 0 a 50% (m/m), o peso molecular do PLLA e o tempo de separação de fases. A adição crescente de biovidro mostrou influenciar o desenvolvimento da morfologia dos scaffolds, verificando-se o aumento do tamanho de poro com a adição de biovidro. O efeito do biovidro sobre a morfologia dos scaffolds foi relacionado com a solubilidade do vidro, atribuindo-se as variações na cinética de separação de fases às alterações que os iões lixiviados produzem na tensão interfacial entre as fases rica e pobre em polímero. Mostrou-se também que o biovidro actua como um agente nucleante na cristalinidade final da matriz de PLLA. O potencial carácter bioactivo dos scaffolds foi igualmente provado pela formação de uma camada apatítica à sua superfície após imersão em SBF. O efeito da polarização do PLLA sobre a adsorção de proteinas foi investigado. Para isso, foram preparados filmes finos de PLLA com diferentes graus de cristalinidade e usada a microscopia de força piezoeléctrica para manipular os dipolos do PLLA criando zonas polarizadas com diferentes polaridades. Mostrou-se, por microscopia de força atómica em meio líquido, que a adsorção de proteinas é largamente promovida pela polarização. Foi sugerido que a promoção da adsorção de proteinas, devido à polarização, na superfície dos polímeros piezoeléctricos poderia constituir o primeiro mecanismo do fenómeno da indução do crescimento ósseo. ABSTRACT: One of the main challenges in tissue engineering field is the development of three-dimensional scaffolds designed to allow cells to proliferate and secrete their own extracellular matrix while the scaffold gradually degrades. Recently, biopolymer/ceramic composite scaffolds have been investigated because they combine the advantages of these two types of materials and reasonably mimic the bone, which is a natural composite. In the present work, we prepared macroporous composite scaffolds using poly- L-lactic acid (PLLA) as the polymeric matrix and a bioactive glass (BG) from the 3CaO.P2O5-MgO-SiO2 system as the inorganic filler. PLLA was chosen because it is a synthetic biodegradable, biocompatible polymer which is additionally piezoelectric, similarly to bone, a property that has been implicated as responsible for bone growth regulation. The selected glass composition has previously shown the capability to induce apatite precipitation, assumed to be responsible for bioactivity. Composite scaffolds have been developed via a thermally induced phase separation (TIPS) of 5,5 wt% PLLA/dioxane/water solutions varying the BG content (0 to 50wt%), the molecular weight of PLLA and the time of phase separation. The addition of the bioactive glass has shown to act as a porogen increasing in a large extent the pore size of the scaffold. The effect of the glass content on the scaffold morphology was related to the glass surface solubility. The changes in the phase separation kinetics were attributed to the changes produced by the leached ions on the interfacial tension between polymer-rich and polymer-poor phases. The experiments also revealed that bioactive glass acted as a nucleating agent of the PLLA matrix promoting its crystallization. The in vitro bioactive character of the scaffolds was confirmed by the formation of an apatite layer on the surface of the scaffolds after immersion in synthetic plasma. The effect of polarization of PLLA on protein adsorption was also investigated. For this purpose, PLLA thin films with different crystallinity degrees were prepared and piezoresponse force microscopy was used to manipulate dipoles in order to generate polarized areas with different polarities. Observation by atomic force miscroscopy in liquid has shown that protein adsorption is widely promoted by the polarization. It was suggested that the polarization induced enhanced protein adsorption could be the first happening in the bone growth induction phenomenom.

Tese de doutoramento. Ciências da Engenharia. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto, Departamento de Engenharia Cerâmica e do Vidro. Universidade de Aveiro. 2008

Mestrado em Engenharia Biomédica Com este trabalho, pretende-se fazer uma avaliação do uso de poliuretanos em aplicações biomédicas. A extensa diversificação de propriedades permite que se sintetizem materiais biodegradáveis ou bioestáveis. Os biodegradáveispodem ser bastante promissores, contudo existe uma grande controvérsiaquanto à libertação de produtos eventualmente tóxicos no organismo, cinética da degradação e metabolização dos mesmos. Os Poliuretanos bioestáveispodem efectivamente estabelecer ligações com o meio (bioactividade),apresentam por si só boas propriedades mecânicas, permitindo a suaaplicação em locais de carga elevada (substituição óssea). Mesmo assim,pode existir algum grau de degradaçãopassível de ser eliminado com a utilização de antioxidantes. As propriedades mecânicas poderão sermelhoradas substancialmente com a introdução de enchimentos cerâmicos, podendo obter-se umcompósito de alta estabilidade química com propriedades mecânicas próximas das do osso. O trabalho que se segue teve por objectivo produzir compósitos PU/HA obtidospor extrusão. Para tal foram sintetizados poliuretanos de base éster e éter, utilizando o método de pré-polímero, fazendo-se variar o tamanho de cadeia do poliol. Foi adicionado a um dos poli (éter-uretanos) um antioxidante (BHA), com o objectivo de se avaliar qual o seu efeito na protecção da degradação. Para avaliar a resistência à degradação efectuaram-se testes de degradação acelerada em soluções de H2O2 e HNO3, tendo-se observado que os polímeros de base poliéter apresentaram maior resistência à degradação. Para além disso os poli (éster-uretanos) sofreram degradação mais acentuada em HNO3. Verificou-se ainda que,o antioxidante adicionado se difundia para o meio agressor. Foram também efectuados estudos reológicos dos compósitos para se avaliar o efeito da química da matriz e enchimento na extrusão. Os resultados mostraram que o aumento do tamanho de cadeia dos polímeros resulta numaumento da viscosidade complexa. Foi demonstrado que os poli (éter-uretanos) oferecem maior resistência à extrusão que os poli (éster-uretanos). Até 50% (m/m) de enchimento observa-se um efeito lubrificante no compósito, acima deste teor geram-se viscosidades que comprometem a extrusão. As características de resistência à degradação associadas à altahomogeneidade conferida pela extrusãoapontam estes compósitos como materiais promissores para aplicações de longo termo em substituição dotecido ósseo. In this study, we intend to evaluate the use of polyurethanes inbiomedical applications. Their extent of chemical properties allows the synthesis of biodegradable or biostable materials. Biodegradable materials can be verypromising; however there is some controversy regarding the liberation of toxic products, degradation kinetics and elimination of those by the organism. Biostable Polyurethanes can effectively establish connections with the living tissue (bioactivity), and have mechanical properties ideal for applications in load bearing sites (bone substitution). Even so, it is possible that degradationoccurs, eventually eliminated with the use of antioxidants. The mechanical properties can be improved substantially with the introduction of ceramic fillers, resulting in composites of high chemical stability and mechanical propertiesidentical to human bone. This work has the objective of producing compositesof PU/HA obtained by screw-extrusion. Polyurethanes, ester and ether based were synthesised, using the pre-polymer technique, and variable polyol chain lengths. It was added an antioxidant (BHA) to one of the poly (ether-urethanes), regarding the evaluation of the degradation protection given by this material. Materials were kept in accelerated degradation solutions of H2O2 and HNO3. It was found that polyether based polyurethanes, presented less degradationrates. Nevertheless, the poly (ester-urethanes) suffered degradation,more intense in HNO3 solution than H2O2. It was observed that the antioxidantadded was diffused to the environment. There were also performed rheologic studies of the composites to evaluating the effect of the matrix chemistries and filler addition. The results showed that the increasing the size of polymers chain results in an increase of the complex viscosities. It was also shown that poly(ether-urethanes) has higher resistance to extrusion than poly (ester-urethanes). At 50% (m/m) of filler, it was observed a lubricanteffect in the composites, above such contents it was generate viscosities that compromise extrusion. The characteristics of low degradation rates associated to the high homogeneity conferred by the extrusion, aim these compositesas promising materials for long term applications in bone tissue substitution.

Tese de mestrado. Engenharia Biomédica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto, Instituto de Engenharia Biomédica. 2007

Mestrado em Engenharia Biomédica - Biomateriais Os filmes de carbono amorfo tipo diamante (DLC) actuam como lubrificantes sólidos em muitas aplicações de desgaste incluindo os implantes articulares da anca e joelho. Entre estes, os filmes de carbono não-hidrogenado podem ser depositados pela técnica de deposição física em fase vapor (PVD) a baixas temperaturas (

Mestrado em Engenharia Biomédica - Biomateriais O quitosano é um policatião de origem natural que tem vindo a ser investigado como sistema não viral de vectorização de genes devido à sua biocompatibilidade e baixa toxicidade. No entanto, a sua baixa eficiência de transfecção tem dificultado o seu uso generalizado. Num estudo anterior mostrámos que a conjugação de resíduos de imidazol a cadeias de quitosano resulta numa melhoria da eficiência de transfecção do polímero. O principal objectivo deste estudo foi avaliar a aplicação de quitosano modificado com imidazol (CHimi) como vector para entrega de genes em medicina regenerativa, bem como encontrar novas vias para melhorar a eficiência. A expressão genética mediada por CHimi com dois graus de substituição - 13% e 22% das aminas primárias do quitosano - foi avaliada em células 293T (células embrionárias humanas do epitélio do rim) por um período de 8 dias, usando o gene da β-Galactosidase (β-gal) como gene repórter. Os complexos de CHimi-DNA foram preparados numa razão molar de 18 entre aminas primárias e grupos fosfato. As células transfectadas com estes complexos apresentam um pico de actividade da β-gal às 72 horas pós-transfecção, verificando-se a expressão sustentada da proteína repórter durante todo o período de avaliação. Nestas condições a viabilidade celular não é comprometida. Quando se efectua um segundo tratamento das células com complexos à base de CHimi, a actividade de transfecção volta a aumentar, sem haver alterações na viabilidade celular. Verificou-se também que células transfectadas com estes vectores sobrevivem a um ciclo de congelação/descongelação, mantendo uma actividade de transfecção sustentada no tempo. Uma polietilenimina comercial (Escort V) foi usada como referência neste estudo. Apesar de os níveis de transfecção mediados por este vector serem duas ordens de grandeza mais elevados, a viabilidade celular decresce até aos 50% após cada tratamento. De forma a investigar o processo de transfecção mediado por polímeros de CHimi, o tráfego intracelular destes complexos foi estudado por microscopia confocal de varrimento laser. Complexos de CHimi e DNA marcados com fluoróforos foram encontrados no citoplasma celular 2 horas depois da transfecção, sendo detectados até 48 horas pós-transfecção. Estes resultados podem em parte explicar a expressão sustentada de β-gal ao longo do tempo. Os complexos foram detectados no interior do núcleo 4 horas pós-transfecção. O DNA marcado com fluorescência não foi observado na forma livre em nenhum dos momentos analisados, enquanto que CHimi foi detectado num evento único no citoplasma. Num ensaio “cell-free” de transcrição/tradução in vitro não foi detectada a síntese de proteína quando o DNA estava complexado com CHimi, apesar de este ser expresso na ausência do polímero. Este conjunto de resultados sugere que, apesar dos complexos poderem ser encontrados no interior do núcleo rapidamente após a transfecção, a expressão genética parece depender da desintegração do complexo. O CHimi é um potencial candidato a vector para transporte de genes num cenário de regeneração. Este material medeia uma expressão proteica sustentada sem afectar a viabilidade celular. Com este sistema, as células toleram uma segunda adição de complexos, pelo que a administração repetida poderá ser potencialmente usada como estratégia para prolongar o efeito terapêutico de uma proteína de interesse. Em relação aos resultados de tráfego intracelular dos complexos, e considerando o perfil de expressão genética obtido, pode pôr-se a hipótese de que a expressão sustentada do gene resulta de um processo de libertação dependente do tempo. Neste sentido, ajustar a velocidade de degradação dos polímeros de CHimi pode ser usado como estratégia para melhorar o processo de expressão do gene tendo em vista o fim terapêutico pretendido. ABSTRACT: Chitosan is a polycation of natural origin, emerging in the non-viral gene delivery vectors scene due to its biocompability and low cytotoxicity. However, its low transfection efficiency has hampered its wide application so far. We have previously shown that grafting imidazole moieties into the chitosan backbone results in improved transfection efficiency of this polymer. The main goal of this study was to assess the application of imidazole-grafted chitosan (CHimi) as gene delivery vector in a regenerative medicine scenario and to find avenues to further improve its efficiency. Gene expression mediated by CHimi with two degrees of substitution - 13% and 22% of chitosan primary amines - was assessed in 293T cells for periods up to 8 days, using the β-Galactosidase (β-gal) gene as reporter gene. CHimi- DNA complexes were prepared at a primary amine to phosphate groups molar ratio of 18. Cells transfected with the CHimi-based complexes have a peak of β-gal activity 72 hours post-transfection and show a sustained β-gal production for 8 days. During this time period cell viability is not impaired. When a second treatment with CHimi-based complexes is performed, transfection activity increases, without changes on cell viability. Additionally, cells transfected with CHimi-based vectors are able to withstand a freeze/thawing cycle, maintaining a sustained transfection activity. A commercially available polyethylenimine (Escort V) was used as a reference. Though transfection levels are two orders of magnitude higher, cell viability decreases up to 50% after each treatment. In order to investigate the transfection process mediated by CHimi-based vectors a study of the intracellular pathway of the complexes has been performed by confocal laser scanning microscopy. Complexes formed by fluorescently labeled CHimi and DNA were found inside the cell cytoplasm 2 hours after transfection and were detected up to 48 hours post-transfection. These results could explain in part the sustained gene expression over time. Complexes were detected inside cell nucleus since 4 hours post-transfection. Fluorescently labeled DNA in the free form was not observed at any of the time points analyzed. Free CHimi was detected in the cytoplasm in an atypical event. In a cell-free in vitro transcription/translation assay no protein production was detected when DNA was complexed with CHimi, though expressed when using plasmid DNA in the absence of CHimi. Taken together these results suggest that, though CHimi-based complexes can be detected inside cell nucleus promptly after transfection, gene expression is dependent on the complex disassembling. CHimi is a potential candidate vector for gene delivery in a regenerative scenario. This material is able to mediate a sustained protein expression without impairing cell viability. In our system, cells can sustain another addition of the complexes suggesting that repeated administration could be used as a strategy to prolong the therapeutic effect. In view of the trafficking results and considering the gene expression profile, one can hypothesize that the observed sustained transgene expression is a time dependent release process. Thus, tuning the degradation rate of CHimi-based polymers could be a strategy to further improve the overall transgene expression process to fulfill the therapeutic end.

Orientador: Eliana Aparecida de Resende Duek Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Mecanica Resumo: A regeneração tecidual guiada (RTG) é uma técnica utilizada na Periodontia para permitir a neoformação de um novo aparato de inserção periodontal do dente (osso alveolar, ligamento periodontal e cemento). Na Periodontia, a utilização de polímeros biorreabsorvíveis vem ganhando confiabilidade e importância devido a não necessidade de uma segunda intervenção cirúrgica para remover a membrana, porém poucas membranas atendem a todos os critérios da RTG, que são biocompatibilidade, exclusão celular, manutenção do espaço a ser regenerado, integração à atividade tecidual, facilidade de utilização e atividade biológica. Um polímero biorreabsorvível muito estudado é o poli (L-ácido láctico) (PLLA), porém ele é polímero semicristalino muito rígido e com longo período de degradação, contudo ao se adicionar em sua composição um plastificante, o tri-etil-citrato, a membrana resultante seria mais flexível, microporosa e teria seu tempo de degradação reduzido. Esta pesquisa avaliou, através de estudo in vivo, a resposta inflamatória e a manutenção de um espaço vital para a regeneração óssea sob membranas de PLLA/tri-etil-citrato, em três diferentes proporções polímero/plastificante, implantadas na calota craniana de coelhos, analisando, assim, a capacidade destas membranas em se adaptar aos critérios da RTG periodontal. Paralelamente ao estudo in vivo, foram realizados estudos da degradação in vitro, com ensaios mecânicos de tração, de microscopia eletrônica de varredura e de calorimetria diferencial de varredura (DSC). Notou-se que as membranas de concentração PLLA/tri-etil-citrato de 85/15 apresentaram características mais adequadas para a RTG periodontal tanto no estudo in vivo quanto no in vitro Abstract: Guided tissue regeneration (GTR) is a technique used in the periodontal practice to allow the neoformation of a new apparatus of teeth periodontal attachment (alveolar bone, periodontal ligament and cementum). In Periodontology, the use of bioresorbable polymers is gaining trustworthiness and importance due the non required second surgical intervention to remove the membrane, however few membranes fit in all GTR criteria, which are biocompatibility, cellular exclusion, space maintainer, integration to tissue activity, easy usage and biological activity. A bioresorbable polymer very studied is poly(L-lactic acid) (PLLA), however it is a very rigid semicrystalline polymer and with a long degradation period, but by adding in its composition a plasticizer, the tri-ethyl-citrate, the resultant membrane would be more flexible, microporous and would have its degradation time reduced. This research evaluated, through in vivo study, the inflammatory response and the maintenance of a vital space for bone regeneration under PLLA/tri-ethyl-citrate membranes, in three different polymer/plasticizer proportions, implanted in rabbits calvarial bone, analyzing, thus, the capacity of these membranes in adapting to the criteria of periodontal GTR. Simultaneously to this study, it had been carried out studies of in vitro degradation, with mechanical testing, scanning electronic microscopy and differential scanning calorimetry (DSC). It was observed, that the highest concentration membranes PLLA/tri-ethyl-citrate (85/15) showed themselves more adequate characteristics for the periodontal GTR on in vivo study as well on in vitro Mestrado Materiais e Processos de Fabricação Mestre em Engenharia Mecânica

Mestrado em Engenharia Biomédica - Biomateriais O presente trabalho consistiu numa revisão dos estudos efectuados até à data, no que respeita a metodologias in vitro para avaliação da biocompatibilidade de biomateriais, bem como prespectivas futuras. O aumento considerável na sua utilização, torna-os uma área de estudo atractiva, que sendo multidisciplinar, permite diversas abordagens. Sendo a biocompatibilidade a principal característica a mencionar num biomaterial, e das únicas a reunir consenso, foi sob este parâmetro que incidiu a primeira parte do trabalho, isto é, sob as diferentes metodologias in vitro que permitem a sua avaliação. Desta forma, foi analisada bibliografia nacional e internacional, pretendendo-se fazer uma revisão das metodologias que reunissem as melhores características (tendo em atenção aspectos laboratoriais como disponibilidade de material, duração dos ensaios, entre outros). Num segundo ponto pretendeu-se fazer uma abordagem dos biomateriais, usados actualmente em grande escala, mas sob um outro ponto de vista – impacto ambiental. Para isso, recorreu-se à realização de testes de ecotoxicidade, usando duas espécies de microalgas verdes – Pseudokirchnereilla subcapitata (Korshikov) Hindak e Pandorina morum (Müller) Bory. O biomaterial eleito foi a zircónia (ZrO2). Ainda na mesma linha de investigação, e também pela escassez de informação observada durante a pesquisa bibliográfica, pretendeu-se compreender de que forma alterações no pH do meio, podem influenciar o grau de toxicidade. Estatisticamente, procedeu-se à análise dos dados obtidos recorrendo-se à análise de variância (ANOVA) de uma via, tendo sido aplicado o teste de Tukey, sempre que diferenças significativas foram encontradas. Esta análise permitiu verificar diferenças significativas no crescimento das duas algas, quando submetidas a concentrações crescentes do metal zircónio (Zr IV), observando-se ainda diferenças de sensiilidade apresentadas pelas mesmas, tendo Pandorina morum revelado maior sensibilidade. Concluiu-se ainda que variações no pH do meio alteram o grau de toxicidade do composto. ABSTRACT: The present work consisted in a review about the studies, untill today, surrounding the in vitro methodologies to evaluate biocompatibility, as well as future developments. The considerable increases in their utility, turns biomaterials in an interesting area of study, that being multidisciplinary, allows different approaches. Considering biocompatibility as a primordial characteristic in a biomaterial, and one of the only that get consensus among authors, this parameter as been choosen for the first part of the dissertation. According to this, national and international bibliography have been analysed, pretending to combine a set of the more effective methodologies, attending to laboratory aspects (such as material used and time dispense). In a second point, a different approach to biomaterial was consider, their environmental impact. For that, ecotoxicity tests were made, using to different species of green algae - Pseudokirchneriella subcapitata (Korshikov) Hindak and Pandorina morum (Müller) Bory. The biomaterial selected was zirconia (ZrO2). The present study try to understand the influence of pH environmental alterations in the toxicity observed. Data analysis was done using variance analysis (one-way ANOVA), and Tukey test was applied when significant differences were found. Observing the results, significant differences on the growth of the two green algae were found, when submitted to crescent concentrations of zirconium (Zr IV), and it was also observed that they present different sensibilities to Zr (IV), with Pandorina morum showing more sensibility. Besides that, pH alterations influence compound toxicity, with alkaline environment increasing it.

Tese de mestrado. Engenharia Biomédica. 2006. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto

Tese de mestrado. Engenharia Biomédica. 2006. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto, Instituto de Engenharia Biomédica, Faculdade de Medicina. Universidade do Porto

Mestrado em Engenharia Biomédica - Ramo Biomateriais Apesar de o titânio ser um sucesso clínico em aplicações de ortopedia edentária, ainda persistem problemas relacionados com a ligação osso-implante para além das diferenças em termos de propriedades mecânicas, entre o osso e o material de implante, levando a que a reabsorção óssea ocorra. Para fazer frente as estes problemas, têm sido feitas tentativas a nível dodesign do implante de modo a desenvolver materiais com uma superfícieporosa tridimensional osteocondutiva para a regeneração óssea. A utilização de materiais com a estrutura anteriormente descrita permite uma ancoragembiológica para os tecidos circundantes através do crescimento ósseo nointerior dos seus poros. Além disso, o valor do módulo de Young pode serajustado de modo a equiparar o osso trabecular limitando o efeito deblindagem de tensões (“stress shielding”), prevenindo assim a reabsorção óssea na interface do implante. Este tipo de estrutura favorece aosteointegração uma vez que provê espaços de ancoragem para as células ósseas e para o aumento do tecido ósseo e vascular. Para além disto, e parase conseguir um crescimento ósseo mais rápido, através do espaço aberto doporo, e uma estabilização rápida e forte, mesmo sob condições desfavoráveis,recorresse ao revestimento destes materiais com cerâmicos bioactivos, talcomo a hidroxiapatite. Neste trabalho apresenta-se a produção de estruturas porosas de titânio, recorrendo-se ao método de replicação da esponja usando uma suspensão dehidreto de titâniocom as características reológicas adequadas, e revestidascom hidroxiapatite pelo método sol-gel. As estruturas porosas são caracterizadas em termos de microestrutura e propriedades mecânicas. Demodo a avaliar o carácter bioactivo destes materiais realizaram-se ensaios in vitro numa solução simuladora do plasma humano (SBF). Foram aindarealizados ensaios electroquímicos que permitiram avaliar a influência dorevestimento na protecção à corrosão. As estruturas porosas obtidas apresentam uma estrutura tridimensional, com porosidade aberta interligada. A introdução da porosidade faz baixar o valor domódulo de elasticidade reduzindo assim o efeito de blindagem de tensõese consequentemente evitando a reabsorção óssea. Os ensaios in vitromostraram o aparecimento de uma camada de hidroxiaptite nas paredes domaterial. Para além da bioactividade introduzida pelo revestimento aresistência à corrosão é também melhorada. While titanium has been successful as an orthopedic or dental implant material,performance problems still persist related to implant-bone interfacial strength and mechanical modulusmismatch between titanium and tissue. To address these issues, current attempts in implant design have shifted towards thedevelopment of biomaterials incorporating three-dimensional osteoconductiveporous structures for bone regeneration. The advantage of porous materials is their ability to provide biological anchorage for the surrounding bone tissue viathe ingrowth of mineralized tissue into the pore space. Porous structures are anadvantageous alternative because the elastic modulus can be adjusted tomatch that of trabecular bone to limit stress shielding thereby preventing boneresorption at the implant interface. Furthermore, to achieve early and strong stabilization theses structures arecoated with bioactive ceramics, as hydroxyapatite. In the present work, titanium porous structures were produced by replicationsponge method, from TiH2 slurry, and coating with HA by the sol-gel process. The obtained structures were microstructure and mechanical characterized.The in vitro bioactivity was investigated by soaking them in a simulated body fluid (SBF). Electrochemical characterization was also recorded with the aim ofevaluated the coating effect on the corrosion resistance. The structures present a three-dimensionally interconnected porous structure. The porosity adjusts young’s modulus. With the in vitro tests an apatite layer on the porous surface was observed. The corrosion resistance is also improvedwith the coating.

Santos, M.H. Síntese e caracterização de biocompósitos fosfatos de cálcio/colágeno dopados com zinco. Tese (Doutorado em Engenharia Metalúrgica e de Minas, área de concentração Ciência e Engenharia de Materiais) Escola de Engenharia, Universidade Federal de Minas Gerais, 2005. Ainda hoje, um grande desafio é o desenvolvimento de materiais biocompatíveis por processos viáveis economicamente. Neste estudo foram desenvolvidos compósitos fosfatos de cálcio/colágenodopados com zinco para aplicação na regeneração óssea. Hidroxiapatita e hidroxiapatita-fosfato tricálcico foram sintetizados tendo como precursores, hidróxido de cálcio e ácido ortofosfórico. A razão molar Ca/P foi fixada em 1,67 e foram variados parâmetros de síntese, como tratamentos químico e térmico. Também se sintetizou hidroxiapatita e hidroxiapatita/fosfato tricálcico dopados com nitrato de zinco durante a síntese. O colágeno, extraído de pericárdio bovino, foi submetido à digestão enzimática e purificado pela cromatografia de troca iônica. Obteve-se colágeno tipo I puro, COL, que foi dialisado, caracterizado por eletroforese e liofilizado. Compósitos de hidroxiapatita e hidroxiapatita-fosfato tricálcico dopados e não dopados com Zn/COL e hidroxiapatita/COL/Zn foram desenvolvidos, usando a proporção 80%/20% em peso. Todos os materiais foram caracterizados através da análise química elementar, microscopias de luz e eletrônica de varredura, difração de raios-X e espectroscopia de infravermelho. Os compósitos apresentaram características morfológicas e estruturais semelhantes aos seus materiais constituintes. A avaliação biológica dos compósitos in vitro mostrou viabilidade celular, apresentando proliferação e produção de fosfatase alcalina dos osteoblastos. Os biocompósitos desenvolvidos, possivelmente, poderão ser usados na reconstituição do tecido ósseo. Santos, M.H. Synthesis and characterization of calcium phosphates/collagen biocomposites doped with zinc. Thesis (Doctorate in Metallurgical and Mines Engineering, area of concentration Scienceand Engineering of Materials) - School of Engineering, Federal University of Minas Gerais, 2005. Just now, a great challenge is the development of biocompatible materials for economically feasible processes. In this study were developed calcium phosphate/collagen composites doped with zinc for application in bone regeneration. Hydroxyapatite and hydroxyapatite-tricalcium phosphate were synthesized having calcium hydroxide and orthophosphoric acid as precursors. The Ca/P molar ratiowas fixed at 1.67 and were varied synthesis parameters as chemical and heat treatments. Hydroxyapatite and hydroxyapatite--tricalcium phosphate were synthesized and doped with zinc nitrate during the synthesis. The collagen, extracted from bovine pericardium, was submitted to the enzymatic digestion and purified by ion-exchange chromatographic method. High purity grade type I collagen (COL) was obtained, dialyzed, characterized by electrophoresis and lyophilized.Hydroxyapatite and hydroxyapatite-tricalcium phosphate composites were produced with collagen, by sing the ratio 80/20 (CaP/COL, weight%). Also, they were doped with zinc by using Zn(NO3)2 salt.All samples were characterized by chemical analysis, light and scanning electron microscopy, X-ray diffraction and infrared spectroscopy. The composites presented morphologic and structural characteristics similar to their constituent materials. The biological evaluation of the composites in vitro showed cellular viability, presenting proliferation and production of alkaline fosfatase of the osteoblasts. Probably, the developed biocomposites can be used for rebuilding bone tissue in thefuture.

Tese de mestrado. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 1998

Tese de mestrado. Engenharia Biomédica. 2004. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto

Relatório de estágio PRODEP III Estágio realizado no INEB - Instituto de Engenharia Biomédica Relatório de estágio curricular da LEMM 2001/2002

Estágio realizado no INEB - Instituto de Engenharia Biomédica. Laboratório de Biomateriais Relatório do Estágio Curricular da LEMM 1999/2000

Tese de mestr.. Engenharia Biomédica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 1998

Tese de doutoramento. Ciências de Engenharia. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto, Faculdade de Ciências da Saúde. Universidade Fernando Pessoa. 2008

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