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Trichothecenes are terpenoid toxins produced by species in 10 fungal genera, including species of Trichoderma. The trichothecene biosynthetic gene (tri) cluster typically includes the tri5 gene, which encodes a terpene synthase that catalyzes formation of trichodiene, the parent compound of all trichothecenes. The two Trichoderma species, Trichoderma arundinaceum and T. brevicompactum, that have been examined are unique in that tri5 is located outside the tri cluster in a genomic region that does not include other known tri genes. In the current study, analysis of 35 species representing a wide range of the phylogenetic diversity of Trichoderma revealed that 22 species had tri5, but only 13 species had both tri5 and the tri cluster. tri5 was not located in the cluster in any species. Using complementation analysis of a T. arundinaceum tri5 deletion mutant, we demonstrated that some tri5 homologs from species that lack a tri cluster are functional, but others are not. Phylogenetic analyses suggest that Trichoderma tri5 was under positive selection following its divergence from homologs in other fungi but before Trichoderma species began diverging from one another. We propose two models to explain these diverse observations. One model proposes that the location of tri5 outside the tri cluster resulted from loss of tri5 from the cluster in an ancestral species followed by reacquisition via horizontal transfer. The other model proposes that in species that have a functional tri5 but lack the tri cluster, trichodiene production provides a competitive advantage.

P. 1057–1069 Two drivers of global change that affect ecosystem function include wildland fire regimes characterised by frequent, severe fires and increased atmospheric nitrogen (N) deposition. However, their combined effect on the post-fire recovery of Mediterranean forests is still little known. We assessed the interactive effects of two fire severities and N addition on the rate and timing of seed germination of three woody species with different post-fire regeneration strategies in fire-prone forests: Pinus pinaster, an obligate-seeder species, and two facultative-seeder species, Pterospartum tridentatum (high-resprouting and low-seeding ability) and Halimium lasianthum (low-resprouting and high-seeding ability). Seeds were subjected to six combinations of temperature [control (no heat treatment), 60 °C (moderate fire severity) and 120 °C (high fire severity) for 5 min] and N fertilisation (without N and with addition of 4.17 g Nm−2 of solid granules of ammonium nitrate, equivalent to three times the current estimate of airborne N deposition in the study area) under laboratory conditions. We found that N fertilisation had a significant, negative effect on the rate of seed germination of the three species under study. Additionally, we detected no differences in P. pinaster germination among thermal treatments; while both P. tridentatum and H. lasianthum had significantly higher germination rates when submitted to high fire-severity conditions. Moreover, the average time of seed germination increased with N fertilisation for P. pinaster but increased after the thermal treatments for H. lasianthum. These results suggest that increased N availability under intense wildfire regimes may hinder post-fire seed germination, regardless of the species’ regeneration strategy, in fire-prone pine forests. SI

P. 109-114 Germplasm banking is a key technology enabling the ex-situ conservation of wild species. However, cryopreservation protocols must be tested to assure the applicability of the banked material. The objective of this study was defining a range of parameters for the composition of a semen extender for Cantabrian chamois epididymal spermatozoa (post-mortem collection). The freezing extender was based in a TES-Tris-fructose buffer, modifying its composition in three experiments: Osmolality of the buffer (320, 380 or 430 mOsm/kg, 8% glycerol, 15% egg yolk), glycerol (4 or 8%, 430 mOsm/kg, 15% egg yolk), egg yolk (10 or 15%, 430 mOsm/kg, 4% glycerol). Sperm was extended at 100 mill. spermatozoa/ml, cooled at 5 °C and frozen at −20 °C/min. Sperm quality was assessed pre and post-thawing (CASA, HOS test, abnormal forms, cytoplasmic droplets, and viability and acrosomal damage by flow cytometry). Freezability was good overall, with total motility of 65.5% ± 2.4 initial and 55.8% ± 2.4 post-thawing. The extenders affected the post-thaw sperm quality marginally. Whereas osmolalities and glycerol concentrations seemed not to differ, 430 mOsm/kg and 4% glycerol might be preferred. Egg yolk concentrations only differed on sperm velocity (VCL: 84.0 ± 6.7 μm/s in 10% vs. 70.7 ± 6.2 μm/s in 15%, P

The species Chiliadenus glutinosus (L.) Fourr. has a large number of therapeutic uses reported in the traditional Spanish medicine. The growing interest in preserving the ethnopharmacological knowledge related to the botanical diversity existing in Spain and the interest in achieving scientific validation of the therapeutic properties of medicinal species has led to the development of this study. To do it, all the known medicinal uses of Ch. glutinosus in Spain were compiled, then an exhaustive bibliographic research on its chemical composition was carried out, and finally, an in silico validation of the bioactive phytochemicals present in a higher proportion in the essential oil of Ch. glutinosus: camphor, borneol, lucinone, glutinone, quercetin, kutdtriol, and kaempferol; in an attempt to justify the reported traditional uses of the species. It was found that much of the traditional medicinal uses of Ch. glutinosus, along with the biological activity of its phytochemicals, are supported by scientific evidence. The results place this species in a prominent position to initiate possible lines of research to develop new, more effective drugs and improve therapies to treat conditions and diseases that affect the different organic systems of the human being.

In Mediterranean fire-prone ecosystems, plant functional traits and burn severity have decisive roles in post-fire vegetation recovery. These traits may reflect plant fitness to fire regimes in the Mediterranean Basin. The aim of this study was to evaluate the effect of burn severity on post-fire vegetation regeneration through plant functional (physiological and regenerative) traits in two Mediterranean ecosystems: one more humid and colder (Cabrera in Le&oacute, n province, NW Spain), and another characterized by a longer summer drought (G&aacute, tova in Valencia province, SE Spain). A total of 384 and 80 field plots (2 m &times, 2 m) were fixed in Cabrera and G&aacute, tova, respectively. In each burned plot, we quantified burn severity by means of the composite burn index (CBI), differentiating three severity levels (low, moderate, and high), and evaluated post-fire vegetation regeneration one and two years after wildfires. We measured the percentage cover of each species and classified them according to physiological (specific leaf area and N2-fixing capacity) and regenerative traits (reproductive strategy, bud bank location, and heat-stimulated germination). The main results showed that in Cabrera, burn severity had significant effects on vegetation cover independently of plant functional traits. In G&aacute, tova, burn severity effects differed among functional traits. In this site, the cover of plants with low specific leaf area and without heat-stimulation and N2-fixing capacity was negatively related to burn severity. On the contrary, the cover of N2-fixers and species with resprouting ability and heat-stimulated germination rose with increasing burn severity. In general, vegetation cover showed a more pronounced increased over time in the more humid area, mainly under the effect of high severity. The results of this research highlighted the importance of the use of plant functional traits as a driver to understand the response of different ecosystems to current fire regimes, which could be relevant for pre- and post-fire management.

The design and implementation of pre-fire management strategies in heterogeneous landscapes requires the identification of the ecological conditions contributing to the most adverse effects of wildfires. This study evaluates which features of pre-fire vegetation structure, estimated through broadband land surface albedo and Light Detection and Ranging (LiDAR) data fusion, promote high wildfire damage across several fire-prone ecosystems dominated by either shrub (gorse, heath and broom) or tree species (Pyrenean oak and Scots pine). Topography features were also considered since they can assist in the identification of priority areas where vegetation structure needs to be managed. The case study was conducted within the scar of a mixed-severity wildfire that occurred in the Western Mediterranean Basin. Burn severity was estimated using the differenced Normalized Burn Ratio index computed from Sentinel-2 multispectral instrument (MSI) Level 2 A at 10 m of spatial resolution and validated in the field using the Composite Burn Index (CBI). Ordinal regression models were implemented to evaluate high burn severity outcome based on three groups of predictors: topography, pre-fire broadband land surface albedo computed from Sentinel-2 and pre-fire LiDAR metrics. Models were validated both by 10-fold cross-validation and external validation. High burn severity was largely ecosystem-dependent. In oak and pine forest ecosystems, severe damage was promoted by a high canopy volume (model accuracy = 79%) and a low canopy base height (accuracy = 82%), respectively. Land surface albedo, which is directly related to aboveground biomass and vegetation cover, outperformed LiDAR metrics to predict high burn severity in ecosystems with sparse vegetation. This is the case of gorse and broom shrub ecosystems (accuracy of 80% and 77%, respectively). The effect of topography was overwhelmed by that of the vegetation structure portion of the fire triangle behavior, except for heathlands, in which warm and steep slopes played a key role in high burn severity outcome together with horizontal and vertical fuel continuity (accuracy = 71%). The findings of this study support the fusion of LiDAR and satellite albedo data to assist forest managers in the development of ecosystem-specific management actions aimed at reducing wildfire damage and promote ecosystem resilience., This study was financially supported by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness, and the European Regional Development Fund (ERDF), in the framework of the GESFIRE (AGL2013-48189-C2-1-R) and FIRESEVES (AGL2017-86075-C2-1-R) projects; and by the Regional Government of Castilla and León in the framework of the FIRECYL (LE033U14), SEFIRECYL (LE001P17) and WUIFIRECYL (LE005P20) projects. J.M. Fernández-Guisuraga is supported by a predoctoral fellowship from the Spanish Ministry of Education (FPU16/03070).

In recent years, the Mediterranean area has witnessed an increase of both the frequency and severity of large fires, which appears to be intimately associated with climate and land use changes. To measure the impact of wildfires on living organisms, diverse indicators have been proposed. These indicators of fire severity traditionally rely on quantifying the damage caused to the vegetal component of ecosystems. However, the use of bacterial communities as severity indicators has received less attention. Here, we studied the differences between bacterial communities of three different Mediterranean ecosystems, two shrubby and one arboreal, two months after a large wildfire. Two levels of severity were compared to a control unburnt soil. The results showed that greater fire severity triggers a reduction in the diversity of soil bacterial communities. In high-severity fires, this reduction reached 40.6 and 58.6% of the control values for richness and Shannon's diversity, respectively. We also found that the greatest differences between communities could be attributed first to the severity of the fire, and second to the ecosystem from which they originated. Importantly, species of just five families of bacteria: Oxalobacteraceae, Micrococcaceae, Paenibacillaceae, Bacillaceae and Planococcaceae, became dominant in all three ecosystems. The average frequency increase for particular species was 100 times. However, due to random uncontrolled factors, the species that became dominant in each community were not always the same.

Changes in climate and land use are altering fire regimes in many regions across the globe. This work aims to study the influence of wildfire recurrence and burn severity on woody community structure and plant functional traits under different environmental conditions. We selected three study sites along a Mediterranean-Oceanic climatic gradient, where we studied the fire history and burn severity of the last wildfire. Four years after the last wildfire, we established 1776 1-m2 plots where the percentage cover of each woody species was sampled. We calculated (i) structural parameters of the community such as total cover, alpha species richness, evenness and diversity (Shannon diversity index), and (ii) vegetation cover of each functional group (differentiating life forms, eco-physiological traits and regenerative traits). Focusing on community structure, results showed increases in species richness and diversity as wildfire recurrence increased, but this effect was partially counterweighted in the areas affected by high severity. In relation to functional groups, we found that increases in recurrence and severity fostered transition from tree- to shrub-dominated ecosystems. Non-arboreal life form, high specific leaf area, N2-fixing capacity, resprouting ability and heat-stimulated germination were advantageous traits under high recurrences and severities, and low seed mass was advantageous under high recurrence situations. We suggest that the strength of the effects of wildfire recurrence and burn severity on vegetation structure and traits might vary with climate, increasing from Oceanic to Mediterranean conditions. In the Mediterranean site, recurrence and severity were strongly related to traits associated with germination (seed mass and heat-stimulated germination), whereas in the Oceanic site the strongest relationships were found with a resprouting-related trait (bud location). This study identifies changes in vegetation structure and composition in scenarios of high recurrence and severity, and provides useful information on plant traits that could be key in enhancing vegetation resilience. This study was financially supported by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness, the Spanish Ministry of Science, Innovation and Universities, and the European Regional Development Fund (ERDF), in the framework of the GESFIRE (AGL2013-48189-C2-1-R) and FIRESEVES (AGL2017-86075-C2-1-R) projects; and by the Regional Government of Castile and León in the framework of the FIRECYL (LE033U14) and SEFIRECYL (LE001P17) projects. Víctor Fernández-García was supported by a predoctoral fellowship from the Spanish Ministry of Education, Culture and Sports (FPU14/00636). The statistical analysis was carried out by the senior author during a research stay at the School of Forestry, Northern Arizona University (EST17/00170).

P. 167-173 Selecting the optimal sperm population is essential for success with reproductive techniques. Porcicoll (formerly Androcoll-P) is a colloid formulation for selection of high-quality boar spermatozoa by single layer centrifugation (SLC). To date, most studies have been carried out with fresh semen and large volumes. We carried out 2 experiments to test the use of Porcicoll for thawed boar semen in small volumes. In Experiment 1, cryopreserved semen doses were thawed, split in 200-μL aliquots and layered on 1 mL of Porcicoll 70%, 80% or 90%, or buffer without colloid. We assessed sperm recovery (the proportion of the loading dose that appeared in the pellet, %), and the physiology of the selected spermatozoa (flow cytometry: Viability, apoptotic changes, capacitation, mitochondrial activity, intracellular reactive oxygen species). The most suitable proportion was Porcicoll 80%, allowing acceptable sperm recovery (16.9 ± 4.2%, compared to 70% (35.4% ± 3.0, p

148 p. Los objetivos generales de este trabajo han sido: 1. Obtener una información detallada del potencial del excremento de T. molitor como biofertilizante para diversos cultivos, incluyendo una descripción de las capacidades de promoción del crecimiento vegetal de su microbiota y análisis de sus cualidades como biofitofortificante y biopesticida. 2. Obtener información sobre cómo afecta la dieta de T. molitor a las cualidades de su excremento como potencial producto biofertilizante, atendiendo tanto a su composición, como a la ausencia de metales pesados y patógenos, la variación en las comunidades de microorganismos que contiene y como varía su potencial promotor del crecimiento vegetal.

498 p. Streptomyces clavuligerus es un actinomiceto conocido por ser el productor industrial de ácido clavulánico, un potente inhibidor de β-lactamasas que se administra en combinación con antibióticos β-lactámicos para el tratamiento de diversas infecciones, y productor de cefamicina C, un antibiótico β-lactámico empleado como molécula base en la elaboración de cefamicinas semisintéticas. Estos dos compuestos comparten mecanismos comunes de regulación de su biosíntesis. Tras la secuenciación del genoma de S. clavuligerus se ha descubierto que esta bacteria posee un megaplásmido de 1,8 Mb, hecho poco frecuente entre los Streptomyces, prescindible para su viabilidad. La información contenida en la secuencia del megaplásmido, pSCL4, y del cromosoma revela que ambos constituyen un reservorio de genes para la biosíntesis de compuestos bioactivos aún desconocidos. Por ello, en este trabajo se profundiza en la regulación del metabolismo secundario con el fin de poner en valor el potencial de S. clavuligerus en la producción de metabolitos secundarios aún no caracterizados. Para ello se abordaron los siguientes objetivos: la expresión heteróloga de la agrupación génica de la cefamicina C de S. clavuligerus en otras especies de Streptomyces, el análisis transcriptómico diferencial mediante micromatrices entre la cepa silvestre de S. clavuligerus y un mutante delecionado en el gen claR, el análisis transcriptómico diferencial mediante micromatrices entre la cepa silvestre de S. clavuligerus y un mutante carente del megaplásmido pSCL4, y, por último, la activación de compuestos bioactivos en S. clavuligerus mediante la expresión heteróloga del regulador PimM de Streptomyces natalensis.

173 p. Durante las últimas décadas, las consecuencias de las catástrofes naturales unidas a los efectos negativos de la actividad humana se han visto reflejadas en el deterioro de los hábitats naturales así como en la reducción de la variabilidad de las especies que habitan en ellos. Los cursos fluviales son uno de los hábitats más susceptibles, debido principalmente a que desde los comienzos de la civilización, los ríos han sido el foco de asentamiento de las poblaciones humanas. En la provincia de León, la degradación del medio fluvial, la pesca exhaustiva y los brotes epidémicos han diezmado algunas poblaciones de peces, siendo la especie más emblemática y más amenazada la trucha común (Salmo trutta L.). Por ello, se han desarrollado durante años programas de cría en cautividad y repoblación, que han permitido contrarrestar en gran medida estos efectos. Sin embargo, la cría intensiva de trucha común presenta más dificultades que el cultivo de otras especies, debido en parte a que es muy susceptible de padecer enfermedades. La creación de stocks híbridos a partir de machos autóctonos y hembras de procedencia centroeuropea mejoró la productividad en cautividad. Sin embargo, este tipo de cruzamientos provoca introgresión génica de las poblaciones foráneas en el genoma de las poblaciones nativas, provocando la desaparición de caracteres seleccionados, favorables en un determinado hábitat y reduciendo la variabilidad génica de las poblaciones salvajes. La repoblación con stocks obtenidos a partir de las poblaciones nativas, requeriría crear un stock para cada población genéticamente diferenciada, lo que conlleva un gran coste y un riesgo de deriva génica a lo largo de las generaciones

209 p. El objetivo principal de este estudio doctoral es obtener nuevos marcadores polimórficos que permitan ampliar el mapa genético de la lenteja (Lens culinaris Medik.), los análisis genéticos en general y puedan ser empleados como futuras herramientas en los programas de mejoramiento genético. El trabajo desarrolló dos procesos de purificación y cuantificación del ADN a dos muestras de lentejas, uno perteneciente al fondo del Área de Genética de la Universidad de León y otro externo. Se demuestra que la estrecha base genética de la lenteja cultivada hace necesaria una mejor comprensión de las relaciones genéticas entre ésta y el germoplasma silvestre y, con ello, facilitar el uso de la variabilidad presente en especies silvestres dentro de los programas de mejora genética

260 p. El espermatozoide ha pasado de ser considerado un mero portador de la información genética, que empezaría a expresarse en etapas relativamente avanzadas del desarrollo embrionario (transición materna-zigótica), a demostrarse como un protagonista esencial en el desarrollo futuro del embrión, al contener una serie de elementos epigenéticos cruciales para el éxito de la fecundación y el desarrollo temprano. En concreto, el conjunto de proteínas nucleares básicas espermáticas y sus modificaciones postraduccionales, la metilación del ADN, la presencia de ARNs codificantes y no codificantes y la presencia de proteínas de la matriz nuclear constituyen parte de la información epigenética contenida en el espermatozoide, que es transmitida al zigoto durante la fecundación. Tanto la información genética como la epigenética del espermatozoide son sensibles a la agresión de diferentes agentes externos. En particular, no solo es vulnerable el espermatozoide tras la eyaculación, sino que el propio proceso de espermatogénesis constituye una ventana de susceptibilidad genética y epigenética a tener en cuenta. Cualquier alteración que se produzca durante el proceso de formación del espermatozoide maduro puede afectar de diversas formas a las células de la línea germinal, lo que puede alterar la información recibida por el embrión en el momento de la fecundación e incluso transmitirse entre generaciones por vía paterna. Teniendo en cuenta la organización de la cromatina espermática, podrían existir áreas específicas del núcleo del espermatozoide menos protegidas frente al daño genético. Por ello, en el Primer Capítulo de esta Tesis Doctoral se abordó el estudio de la relación entre la susceptibilidad al daño genético y la asociación de la cromatina espermática con diferentes proteínas nucleares. Para ello, se emplearon dos especies de vertebrados como modelo de estudio: trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) y pez cebra (Danio rerio), cuya cromatina espermática presenta un único tipo de proteína nuclear básica: protaminas en trucha e histonas en pez cebra Las muestras seminales fueron sometidas a diferentes tratamientos genotóxicos (irradiación UV, estrés oxidativo generado por H2O2 y criopreservación) y se valoró el daño genético a nivel global – mediante ensayo TUNEL – y a nivel específico en genes concretos localizados en regiones con diferente accesibilidad a la maquinaria de transcripción – mediante una evaluación por qPCR. Además, se determinó la localización en el núcleo espermático de la lesión oxidativa 8-OHdG tras los tratamientos, así como, su posible colocalización con proteínas nucleares mediante inmunocitoquímica. En los dos modelos empleados, la irradiación UV ocasionó el mayor nivel de daño en el ADN y en genes específicos y la lesión oxidativa se distribuyó de manera uniforme por el núcleo espermático. El peróxido de hidrógeno provocó una regionalización de la lesión oxidativa, restringiéndose a la periferia nuclear. Además, no se observó una colocalización total de la lesión oxidativa con las proteínas nucleares estudiadas. Estos resultados nos permitieron concluir que las diferencias de sensibilidad genética observadas no dependen de la presencia de proteínas nucleares básicas. En concreto, la accesibilidad de cada agente genotóxico al núcleo podría ser el mayor responsable en la distribución del daño del ADN espermático. A pesar de que los genes analizados no han podido establecerse como biomarcadores de daño genético global, estos estudios representan un punto de partida para el abordaje de nuevos posibles candidatos y permiten desarrollar técnicas más precisas en la detección del daño. Los resultados de este capítulo constituyen los dos primeros artículos derivados de esta Tesis Doctoral, uno de ellos publicado en la revista PLOS ONE y el otro bajo revisión en la revista Theriogenology. Así mismo, forman parte de un artículo de revisión publicado en la revista Aquaculture (ver ANEXO). El Segundo Capítulo de esta Tesis Doctoral se centra en el papel que puede tener la arquitectura nuclear en la distribución del daño genético en el gameto masculino de mamíferos. Para ello, se evaluó el efecto de los agentes genotóxicos analizados en el primer capítulo sobre muestras seminales humanas. El espermatozoide humano no presenta un solo tipo de proteína nuclear básica, sino que su cromatina se configura en tres dominios principales: ADN unido a histonas (HDNA), ADN unido a protaminas (PDNA) y ADN asociado a proteínas de la matriz nuclear. Las regiones HDNA (nucleosomales) y asociadas a proteínas de la matriz son consideradas las más sensibles a sufrir daño en mamíferos. De nuevo, usando una estrategia similar a la descrita unas líneas más arriba, observamos que la irradiación UV generó el mayor nivel de daño, tanto a nivel global como en genes específicos. El H2O2, además de promover un nivel de daño diferencial entre los genes analizados, provocó la localización de la lesión oxidativa en una región ecuatorial y subacrosómica del espermatozoide. Así mismo, la localización del daño oxidativo no coincidió ni con la de la histona H3 ni con la de una proteína de matriz nuclear, descartando, por tanto, la mayor sensibilidad al daño oxidativo asociada a la presencia de proteínas nucleares básicas o de la matriz nuclear del espermatozoide. La lesión oxidativa se distribuyó siguiendo el mismo patrón que una enzima antioxidante, concluyendo que las características propias de la cabeza del espermatozoide facilitan el acceso de los agentes genotóxicos a los territorios nucleares, promoviendo un nivel de daño diferencial entre ellos. Este estudio cuestiona una de las afirmaciones aceptadas en mamíferos en relación a la mayor sensibilidad a sufrir daño y descarta el uso de genes localizados en las regiones HDNA como biomarcadores de daño oxidativo del ADN. En la actualidad, los resultados de este capítulo se encuentran enviados para su publicación a la revista Asian Journal of Andrology. Dadas las repercusiones que puede tener la alteración de la línea germinal durante la espermatogénesis, en el Tercer Capítulo de esta Tesis Doctoral se exploró el efecto de un disruptor endocrino, ampliamente extendido en el medio ambiente, sobre machos de pez cebra. En particular, se evaluó el efecto genético y epigenético del bisfenol A, usado de manera extensa en la producción de policarbonatos y resinas epoxi, sobre la espermatogénesis, centrando el foco de estudio en las posibles alteraciones de la información epigenética que será aportada al embrión en el momento de la fecundación. Para ello, se expusieron machos adultos de pez cebra durante todo el proceso de espermatogénesis a dosis de bisfenol A ambientalmente relevantes. Los resultados revelaron un descenso del número de espermatocitos, así como, un incremento de la apoptosis en testículo tras la exposición al tóxico. Así mismo, el bisfenol A incrementó la expresión del receptor de estrógenos gper1 y disminuyó la expresión de ccnb1 y sycp3 en testículo, lo que puede representar una alteración de la espermatogénesis y del proceso meiótico. El bisfenol A provocó un incremento de la actividad de las enzimas acetiltransferasas de histonas, así como, una hiperacetilación de histonas e hipermetilación de ADN. Estos resultados nos han permitido hipotetizar que el receptor GPER puede estar mediando los efectos promovidos por el BPA. Además, la exposición a bisfenol A causó un incremento de la fragmentación de la cromatina, una alteración del patrón epigenético y una modificación de los transcritos en los espermatozoides de los machos expuestos, lo que podría desequilibrar la información epigenética recibida por el embrión. Este es el primer estudio que revela un incremento de la acetilación de histonas en células testiculares tras la exposición a bisfenol A y su mantenimiento en las células espermáticas. Así mismo, ha puesto de manifiesto que dosis de bisfenol A, consideradas seguras en el agua de consumo hasta hace relativamente poco, son capaces de modificar el patrón epigenético espermático, lo que puede comprometer el desarrollo de la progenie futura. En la actualidad, estos resultados se encuentran enviados a la revista Environmental International para su revisión.

170 p., XXIII Los objetivos de esta tesis fueron: 1. Desarrollar un modelo de diferenciación endotelial en las células troncales embrionarias murinas E14Tg2¿, realizando un análisis comparativo de varios métodos de diferenciación 2. Determinar la función del gen TP73 en diferenciación endotelial, vasculogénesis y angiogénesis in vitro. 2.1. Analizar el efecto de la inhibición funcional de p73 en la diferenciación endotelial y morfogénesis vascular de las células troncales embrionarias murinas E14Tg2¿. 2.2. Analizar el efecto de la falta de p73 en la biología de las células endoteliales humanas de vena umbilical (HUVEC) 3. Identificar la función de p73 en la vasculogénesis y angiogénesis in vivo. 3.1. Evaluación del efecto de la falta de p73 en el desarrollo de la vasculatura de los embriones knockout Trp73. 3.2. Análisis de la vasculatura de la retina en los ratones knockout Trp73

188 p. La microbiota digestiva tiene un gran impacto en la salud de los animales participando en diversas funciones fisiológicas. En los últimos años, en el ganado porcino han cobrado especial relevancia los problemas digestivos no específicos asociados a las alteraciones de esta microbiota denominadas disbiosis. Por otra parte, el control de las infecciones digestivas en el cerdo se basa, fundamentalmente, en el empleo de antimicrobianos aunque la legislación es cada vez más restrictiva respecto a su uso con fines profilácticos o metafilácticos. Por este motivo es necesario desarrollar nuevas opciones terapéuticas como los cambios en la dieta, ácidos orgánicos, el empleo de extractos vegetales o de pro y prebióticos que modifiquen, restauren o corrijan los desequilibrios de la microbiota intestinal. Sin embargo, antes de aplicar estas nuevas estrategias de control es necesario ampliar el conocimiento sobre la microbiota intestinal y desarrollar herramientas que permitan valorar su composición en condiciones de campo de forma sistemática y eficaz. El objetivo del presente trabajo ha sido el estudio de la microbiota digestiva del cerdo durante las primeras semanas de vida en animales sanos y con problemas digestivos asociados a disbiosis para avanzar en el desarrollo y evaluación de nuevas intervenciones para el control de estos procesos o en la reducción del empleo de antimicrobianos. La técnica elegida para el estudio de la composición y evolución de la microbiota intestinal fue la PCR cuantitativa o PCRc, un método más rápido y económico que la secuenciación masiva del ADN de la microbiota. Se cuantificaron las poblaciones de bacterias totales, bacteroides, lactobacilos, enterobacterias, bifidobacterias y clostridios de los clúster I, IV y XIV en un total de doce estudios experimentales que abarcaron las etapas de lactación, destete, transición y primera mitad de cebo. Además, se desarrolló y optimizó una técnica ELISA para la cuantificación de lactoferrina, un biomarcador de inflamación intestinal, en las heces de los lechones. La comparación de los resultados proporcionados por las PCRc desarrolladas en esta Tesis con los de la secuenciación masiva basada en la amplificación del ARNr 16S, técnica de referencia para el estudio de la microbiota digestiva, demostró una alta correlación entre las estimaciones obtenidas por ambas técnicas. El seguimiento longitudinal de la microbiota de los lechones, desde el nacimiento hasta el periodo de cebo, evidenció un incremento progresivo de bacteroides, una disminución de lactobacilos y enterobacterias, aunque éstas se elevaron ligeramente en el destete, y concentraciones relativamente estables de bifidobacterias y de los tres clúster de clostridios, aunque los clúster IV y XIV presentaron una concentración inferior durante los primeros días de vida. La comparación entre lechones sanos y lechones con signos clínicos compatibles con disbiosis permitió demostrar diferencias significativas. La microbiota de los lechones sanos presentó un número inferior de enterobacterias y mayores concentraciones de lactobacilos y clostridios del clúster IV y XIV. Sin embargo, la concentración de lactoferrina en las heces fue similar en ambos grupos de animales, por lo que no se pudo demostrar la existencia de inflamación intestinal asociada a esta disbiosis. Se observaron escasas diferencias en la composición de la microbiota en lechones con la misma genética y alimentación pero estabulados en granjas con diferente estatus sanitario. Los lechones de las granjas con un estatus alto presentaron una mejor microbiota al nacimiento mientras que los animales de las granjas de estatus sanitario bajo presentaron, a lo largo de todo el seguimiento, una menor diversidad en su microbiota, hecho que ha sido asociado a una mayor receptividad a las infecciones. Finalmente, se evaluaron diferentes intervenciones en la dieta. El empleo de óxido de zinc en lechones destetados redujo las enterobacterias presentes en las heces, disminuyendo, por tanto, el riesgo de diarreas posdestete. La reducción del uso de antibióticos en la dieta tuvo un efecto limitado en la composición bacteriana de la microbiota, destacando tan solo la reducción de la concentración de bacteroides. La adición de ácidos grasos de cadena media se relacionó con un aumento significativo de bacteroides y clostridios del clúster IV y XIV, microorganismos, a su vez, productores de ácidos grasos de cadena corta, mientras que el incremento de la fibra en la dieta mediante la administración de avena no incrementó la riqueza de la microbiota, contrariamente a lo propuesto en otros estudios, y se asoció a una reducción de los clostridios del clúster IV en uno de los estudios.

236 p. Durante la realización de esta Tesis Doctoral, se ha pretendido caracterizar bioquímica y genéticamente la ruta o rutas catabólicas responsables de la degradación bacteriana aeróbica de compuestos de naturaleza esteroidea en la cepa Pseudomonas putida DOC21. Dicha cepa es capaz de asimilar ácidos biliares (ácido desoxicólico, ácido cólico, ácido quenodesoxicólico, ácido litocólico y ácido ursodesoxicólico) y testosterona, entre otras moléculas de naturaleza esteroídica, como únicas fuentes de carbono y energía. Los trabajos desarrollados en las tesis doctorales de los doctores Joaquín Rodríguez Fernández y Estefanía Merino García, desarrolladas en nuestro grupo de investigación, habían expuesto la presencia en esta cepa de estudio de una serie de rutas periféricas conducentes a la obtención de un intermediario común, la AD, a partir del cual se unificaba la ruta degradativa para los compuestos esteroídicos. Durante el transcurso de este estudio se pretendieron caracterizar las etapas conducentes a la eliminación de la cadena lateral unida en posición 17 característica de los ácidos biliares. Empleando herramientas de ingeniería genética, se obtuvieron una serie de mutantes de deleción para determinados genes, estudiando la capacidad metabólica resultante de los mismos. Asimismo, se identificaron algunos de los intermediarios metabólicos que esta cepa genera durante el transcurso de la degradación de diferentes moléculas de carácter esteroideo. De este modo, pudo concluirse que la eliminación de la cadena lateral procede a través de una ruptura aldolítica, lo que exige la participación de dos enzimas con actividad CoA ligásica durante este proceso. La identificación de un compuesto de naturaleza aldehídica DHOPDCA, aislado también durante la degradación de ácido cólico en el caldo de cultivo de la cepa Pseudomonas sp. Chol1, así como la alta similitud de las regiones que codifican las actividades del catabolismo esteroideo en ambas especies soportaban la hipótesis. También fueron identificados varios de los genes y enzimas necesarios para llevar a cabo la oxidación del anillo A, proceso imprescindible para completar el catabolismo de esteroides en P. putida DOC21 Las conclusiones obtenidas en esta Tesis Doctoral, han permitido describir el mecanismo que emplea la cepa Pseudomonas putida DOC21 para llevar a cabo la eliminación de la cadena lateral unida en C17 de los ácidos biliares así como alguna de las reacciones posteriores necesarias para completar el catabolismo de estos y de otros compuestos esteroideos.

639 p. El trabajo presentado tiene como objectivo exponer la distribución altitudinal y horizontal en Colombia (Suramérica) de los coleópteros buceadores de la familia Dytiscidae (Coleoptera: Adephaga), en el contexto de la fuerte capacidad depredadora de estos adéfagos contra los estadios preimaginales de vectores merolimnéticos, sobre todo los dípteros de la famila Culicidae. Es el primer ensayo - en un país tropical seriamente afectado por enfermedades transmitidas por vectores - de delimitar los rangos altitudinales de todas las especies de un grupo taxonómico de macroinvertebrados acuáticos que tienen un papel importante como depredadores de vectores de enfermedades humanas. Los principales resultados del trabajo incluyen: 1. Colombia se convierte el tercer país del Neotropical y el primer país suramericano que cuenta con un tratamiento sistematizado y monográfico a nivel de especies de la familia Dytiscidae. 2. El número de especies conocidas para Colombia pasa de 53 a 159, de las cuales 132 han sido encontrados en el curso del presente estudio. Se re-encontraron 26 (49%) de las 53 especies anteriormente conocidas del país, encontraron 65 especies descritas como nuevas citas para Colombia, detectaron 24 especies nuevas para la ciencia y 17 taxones de incierta identidad. 3. Los brotes recientes más serias de Malaria y Dengue en Colombia se observan en el comienzo de una época La Niña después de una época El Niño fuerte - una situación cuando se forman cuerpos de agua libre de depredadores de culícidos en números extraordinarios. Con base en este resultado quizás se facilita disponer más delante de una nueva herramienta para alertas tempranas en materias de salud pública.

167 p. La obtención de esteroides de forma eficiente y rentable por parte de la industria farmacéutica es de elevada importancia habida cuenta de sus múltiples aplicaciones comerciales, entre las que destacan como antiinflamatorios, inmunosupresores y anticonceptivos. En este trabajo se han estudiado distintas formas de biotransformación de esteroides, como método de síntesis que aprovecha la capacidad de ciertos microorganismos para realizar modificaciones químicas sobre estos compuestos de forma mucho más sencilla y rápida que la tradicional síntesis química, que adolece de ser un procedimiento más laborioso y menos seguro laboral y medioambientalmente puesto que requiere el uso de metales pesados. No obstante, las biotransformaciones, como método de síntesis, todavía tienen mucho potencial que ofrecer ya que habitualmente se llevan a cabo con microorganismos silvestres que no son capaces de obtener los productos finales en un único paso. Por ello, en este estudio planteamos la posibilidad de crear microorganismos recombinantes que posean todos los genes necesarios para la obtención de esteroides interesantes desde el punto de vista farmacético a partir de precursores de bajo coste tales como los fitoesteroles. Concretamente, esta tesis se centra en el estudio del hongo Aspergillus nidulans como organismo receptor y donador de genes involucrados en el metabolismo de esteroides en el que destaca su actividad esteroide 11-alfa-hidroxilasa, relacionada con la obtención de moléculas con propiedades antiinflamatorias. Asimismo, se han empleado otros organismos fúngicos como donadores de genes que incluyen Aspergillus ochraceus, Rhizopus oryzae y Cochliobolus lunatus.

216 p. Efectos de las deposiciones atmosféricas de nitrógeno en el funcionamiento de los brezales de Calluna vulgaris (L.) Hull de la cordillera cantábrica.= Calluna-vulgaris-heathlands located at the southern-most distribution area (Cantabrian Mountains, NW Spain) are currently threatened by global change drivers such as atmospheric nitrogen (N) depositions that affect their functioning, structure and plant species composition. The main aim of the present Doctoral Thesis was to evaluate the effects of different atmospheric N loads in Cantabrian Mountains heathlands at two different life-cycle stages (young- and mature-phase). Field measured bulk inorganic N deposition rates in the Cantabrian Mountains ranged between 2.8 kg N ha-1 yr-1 and 4.6 kg N ha-1 yr-1, with higher N deposition rates during the wet period. The prevailing N chemical form in atmospheric depositions is from oxidized compounds (NOY). The distribution and fate of these airborne N inputs in the Calluna-heathland were traced with 15N isotope. These heathlands were able to retain ∼72% of total N inputs in the short-term (< 1 year). The soil organic horizon immobilized ∼47% of the N inputs. During the second year, ∼95% of N inputs was likely lost by denitrification fluxes during the winter-spring period. Leaching losses were negligible over two years, suggesting that these heathlands were not N saturated. Furthermore, we aimed to evaluate the effects of different levels of experimentally simulated N deposition on the functioning, structure and composition of Cantabrian Calluna-heathlands. The increase in atmospheric N loads resulted in a subsequent increase in soil ammonium (NH4+) with long-term N inputs (10 years); although soil nitrate (NO3-), total N, organic carbon (C), and available phosphorus (P) pools remained unchanged. Besides, Calluna shoot N and P contents and litter N content also increased, which was accordingly reflected in higher N:P ratios. The greatest P demand by Calluna biomass from P-poor soils was supplied by the increase in acid phosphatase enzymatic activity to mineralize organic P, and by the extent of Calluna roots colonized by mycorrhizal fungi to support the higher P uptake. There were no changes in soil microbial biomass C and N contents in response to higher N availability, as well as in urease (N cycle) and β-glucosidase (C cycle) enzymatic activities associated to microbial nutrient demand. The lack of response of several soil properties and microbial nutrient contents could be due to extreme climatic conditions and short period of physiological activity in these montane areas, indicating that montane heathlands are highly resistant to increased N loads. Furthermore, plant community composition and plant species richness remained unchanged in response to enhanced N inputs, likely due to the resistant and resilient mechanisms of heathland dominant vegetation. However, at life-form level, percentage of cover of N-tolerant graminoids and forbs species increased with higher N availability, while the cover of bryophytes and lichens declined. There was a stimulation of Calluna vulgaris vital rates (shoot growth and flowering) in response to short-term N inputs, but the first symptoms of N saturation were observed under long-term N inputs (10 years) through a declined trend in these vital rates. The heathland life-cycle stage conditioned the response to enhanced N loads through stronger N-related effects in young stands compared to mature ones. In Cantabrian heathlands, the N critical load was set in the range of 10-20 kg N ha-1 yr-1 for both young and mature stands, based mainly on changes in Calluna flowering and shoot N content at 14.6 kg N ha-1 yr-1.

273 Los microorganismos del género Streptomyces son actinomicetos, bacterias Gram-positivas, aerobias estrictas y se caracterizan por su capacidad de producir gran cantidad de metabolitos secundarios. Streptomyces clavuligerus produce Inhibidores de beta-lactamasas como el ácido clavulánico, antibióticos beta-lactámicos como la cefamicina C y las clavamas y antibióticos no beta-lactámicos como la holomicina. La genética y la producción de antibióticos en Streptomyces clavuligerus han sido extensamente investigadas debido a su importancia comercial. Los objetivos generales de este trabajo han sido el estudio de la función reguladora de la proteína CcaR sobre las regiones promotoras de las agrupaciones génicas de biosíntesis de ácido clavulánico y cefamicna C; la caracterización de la función reguladora de la proteína atrA de S. clavuligerus en la biosíntesis de ácido clavulánico y cefamicina C y la caracterización del gen que codifica la proteína con actividad tiosulfato sulfurotransferasa de S. clavuligerus y de su función en la producción de holomicina. La síntesis de ácido clavulánico y cefamicina C en Streptomyces clavuligerus es activada por la proteína CcaR, codificada por el gen regulador ccaR de la agrupación de biosíntesis de cefamicina C. CcaR es un regulador específico de la biosíntesis de antibióticos de la familia SARP, como ActII-ORF4 en Streptomyces coelicolor y StrR en Streptomyces griseus. El estudio de la unión de CcaR a diferentes regiones promotoras de las agrupaciones génicas de ácido clavulánico y cefamicina C mediante ensayos de retraso en gel (EMSA), ensayos de protección frente a DNAsa I (“footprinting”) y análisis bioinformáticos han permitido analizar y caracterizar el efecto del regulador CcaR sobre la biosíntesis de estos metabolitos secundarios. La transcripción de reguladores específicos de las rutas de biosíntesis de antibióticos en el género Streptomyces, como ActII-ORF4 en Streptomyces coelicolor y StrR en Streptomyces griseus, es activada por una proteína de la familia TetR denominada AtrA. El gen atrA-cl de S. clavuligerus codifica la proteína reguladora AtrA, ortóloga a los factores transcripcionales AveI de S. avermitilis, AtrA-g de S. griseus y AtrA-c de S. coelicolor. El gen rhlA (rhodanese like protein) de S. clavuligerus, homólogo al gen cysA de Saccharopolispora erythraea, codifica una proteína de la familia de las tiosulfato sulfuro transferasas. La proteína RhlA está sobreexpresada en el mutante S. clavuligerus oppA2::aph respecto a la cepa silvestre S. clavuligerus ATCC 27064, esta observación probablemente implique diferencias en la expresión del gen.

176 p. La tesis trata diversos aspectos relacionados con la migración posnupcial del carricerín cejudo o “Acrocephalus paludícola” dentro de la península ibérica, región clave para las rutas migratorias de muchas aves europeas hacia África. Nos encontramos ante la especie de paseriforme más amenazada de Europa occidental (clasificada como Vulnerable a nivel global) que no utiliza la península para su reproducción sino que habita en los humedales ibéricos durante unas pocas semanas al año durante sus viajes migratorios. El estudio se centra en los humedales de la meseta norte, no presente en estudios anteriores, con registros procedentes en su mayoría de prospecciones específicas y campañas de anillamiento y donde se abordan aspectos como la fenología, parámetros biométricos parámetros de sedimentación, fidelidad interanual al humedal e índice Acrola, así como un aspecto poco estudiado como la existencia de una migración diferencial por clases de edad en la península ibérica. Los resultados obtenidos permiten conocer su estrategia migratoria, poniendo de manifiesto la importancia de la ruta que atraviesa en centro de la Península, y sus lugares y patrones de sedimentación en la meseta Norte, y pueden ser muy útiles para llevar a cabo medidas de conservación y gestión eficaces para esta especie y los hábitats que emplean durante sus movimientos migratorios.

237 p. La presente tesis doctoral estudia el efecto en la cromatina paterna sobre el desarrollo embrionario en la trucha. El primer capítulo, que está constituido por dos trabajos, aborda el estudio de los efecto del daño genotóxico en muestras seminales de trucha (O. mykiss) sobre el desarrollo de la progenie. Se lleva a cabo un análisis masivo de la expresión de genes en larvas obtenidas con semen portador de diferente nivel de daño en su cromatina debido al uso de protocolos de criopreservación no óptimos. Además, la mitad de las progenies fueron incubadas en condiciones estándar, y la otra mitad fueron sometidas a la inhibición de la reparación durante la primera división zigótica. Los resultados revelaron un gran número de genes diferencialmente expresados (DEGs) en las larvas procedentes de embriones cuya reparación zigótica fue inhibida. Estos DEGs estaban fundamentalmente relacionados con las rutas de reparación del ADN, el control del ciclo celular y la apoptosis, revelando un patrón diferente de respuesta al daño en el ADN que las larvas control. Los transcritos implicados en actividad apoptótica mostraban una función antagonista, ya que genes pro-apoptóticos estaban reprimidos y los anti-apoptóticos estaban sobre- expresados a pesar de la inestabilidad genómica provocada en el embrión. Dichos resultados sugerían que las larvas supervivientes eran las que habían adquirido una respuesta de tolerancia al daño genotóxico, provocado a partir de la primera división del embrión. Además, se ha constatado que es esencial un control exhaustivo de la integridad del ADN espermático tras procesos de congelación/descongelación. Así, lesiones en la cromatina espermática causadas por la criopreservación, provocaron diferencias significativas en el perfil transcriptómico de las larvas obtenidas con semen fresco y criopreservado, que afectaban a procesos metabólicos que pueden ser clave para su futuro crecimiento y desarrollo. En el segundo capítulo quisimos determinar si los factores de manejo de reproductores que se aplican en piscifactorías, en concreto la manipulación del periodo natural de puesta, pueden afectar a la maquinaria de reparación del ADN de los ovocitos, y tener un impacto negativo en el desarrollo de la progenie, especialmente cuando el genoma paterno está dañado. Para ello evaluamos el efecto del cambio de fotoperiodo, y por tanto del régimen térmico en el que ocurre la gametogénesis, en la calidad de los gametos de trucha arcoiris (O. mykiss). Mediante una técnica de PCR a tiempo real (qPCR) pudimos confirmar las lesiones promovidas en el semen, así como la disminuida capacidad reparadora de los ovocitos obtenidos en regímenes térmicos inapropiados. Demostramos que, en estadios tempranos de desarrollo, los embriones obtenidos fuera del periodo natural de puesta poseen una intensa capacidad reparadora, pero una reducida capacidad para detener el desarrollo y reparar el daño en el ADN, perfil similar al de los ovocitos de los que proceden. La actividad apoptótica en estas mismas progenies se vio reducida durante la organogénesis, momento clave en el desarrollo normal de los órganos. La tolerancia al daño observada suprimió la inducción de la apoptosis, permitiendo progresar con el desarrollo en condiciones ambientales de estrés, que finalmente promovió una alta tasa de larvas malformadas que llegaron a la eclosión, pero no fueron capaces de sobrevivir a largo plazo

320 p. En el presente trabajo se han abordado las complejas relaciones filogenéticas entre las especies que conforman la tribu Bromeae Dumort. Algunos de estos taxa no han sido, hasta el momento, objeto de otros estudios moleculares y persisten numerosas incógnitas sobre su origen y el tratamiento taxonómico adecuado. El posible origen híbrido de alguno de los linajes más importantes en Bromus, hace que las relaciones entre los taxa sean complejas. Se reconstruyeron los estados ancestrales de 30 caracteres morfológicos, entre ellos los habitualmente empleados en la taxonomía de la tribu (ejem. hábito de las plantas, compresión de las espiguillas, número de nervios de la gluma inferior, etc.), además de la longitud del ETS y el nivel de ploidía. Los análisis bayesianos, de máxima probabilidad y de parsimonia, sugirieron un ancestro común perenne; de espiguillas no comprimidas; un nervio en la gluma inferior; margen del lema plano y el ápice no lacerado; apéndice del ovario truncado; diploide; y sin repeticiones en la región ETS. Por último, se abordó un estudio detallado en la sección Triniusa (Bromus subg. Bromus) mediante el diseño de cebadores y ensayo de la transferibilidad de 14 marcadores a otras especies de la sección. Se estudió la variabilidad molecular en las seis especies que integran la sección. Los métodos de secuenciación de nueva generación y la plataforma MiSeq de la tecnología Illumina fueron utilizados para la secuenciación de los nuevos. Nuestros resultados sugieren un extenso flujo de genes entre los diferentes grupos del Mediterráneo occidental de Bromus lanceolatus, con la excepción de las poblaciones de la Macaronesia, infiriendo que deben segregarse en la especie previamente descrita B. canariensis

364 p. Streptomyces tsukubaensis es el principal productor del inmunosupresor tacrolimus (FK506), policétido macrólido de 23 átomos de carbono que se utiliza en el tratamiento de pacientes con trasplante de órgano y en el tratamiento de enfermedades de la piel como la dermatitis; además, presenta propiedades neuroprotectoras y neuroregenerativas y un potencial uso en cáncer. En esta tesis doctoral se ha abordado la regulación por carbono de la producción de tacrolimus. En presencia de fuentes de carbono fácilmente asimilables se reprimen las funciones para la utilización de fuentes de carbono alternativas. Este fenómeno se denomina represión por catabolito de carbono y también afecta a la producción de antibióticos en el género Streptomyces. Esta tesis doctoral ha permitido profundizar en el conocimiento de la regulación por carbono y por fosfato en S. tsukubaensis. La realización de estudios transcriptómicos ha evidenciado varios genes candidatos para la realización de nuevos experimentos en los campos de la regulación nutricional y de la mejora de la producción de tacrolimus. Además, ha ampliado el conocimiento sobre la regulación molecular de la agrupación de biosíntesis de tacrolimus y sobre la multiplicidad de genes pfkA en el género Streptomyces

335 p. En las últimas décadas, el descubrimiento de nuevas moléculas bioactivas ha disminuido de un modo preocupante, y este hecho unido a la mala praxis que se viene realizando de las mismas ha dado lugar a una falta de arsenal efectivo ante la cada vez mayor aparición de patógenos multirresistentes. Por esta razón, durante este siglo se están multiplicando los esfuerzos en buscar nuevos fármacos usando diferentes tipos de estrategias entre las que destaca la minería genómica. La aplicación de esta técnica unida al abaratamiento y los avances en técnicas de secuenciación de genomas ha permitido encontrar nuevas potencialidades a microorganismos que antaño se creían agotados. Así, mientras antes se consideraba que una cepa concreta podía producir una media de 3-4 compuestos con actividad biológica, ahora se sabe que esa misma cepa tiene información en su genoma para la producción de más de 20-30 compuestos bioactivos. La mayoría de las agrupaciones génicas de metabolitos secundarios están silentes en estas bacterias (no se expresan o lo hacen poco), y mediante su activación se puede lograr la producción de nuevas moléculas. Streptomyces es un género de bacterias cuya principal característica es la capacidad que posee para producir un amplio abanico de metabolitos secundarios. Dentro de este género, se encuentra una especie llamada S. natalensis capaz de producir un macrólido polieno llamado pimaricina que se caracteriza por poseer una actividad antifúngica relevante que ha sido aprovechada por diferentes industrias como la alimentaria, la agrícola o la farmacéutica. El avance en el estudio de los macrólidos polienos ha permitido descubrir que uno de los genes reguladores situados en la agrupación biosintética de la pimaricina, pimM, codifica un regulador PAS-LuxR que actúa como un activador transcripcional de la biosíntesis de este antifúngico, pero algo mucho más trascendental es que este tipo de reguladores no actúan solo como reguladores de sus respectivas agrupaciones génicas, sino que intervienen en multitud de procesos biológicos entre los que destaca la regulación de la biosíntesis de otros metabolitos secundarios. Teniendo en cuenta esta situación previa, se realizó un estudio sobre la activación de agrupaciones génicas durmientes por parte del regulador transcripcional PimM en diferentes cepas del género Streptomyces mediante la expresión heteróloga del vector pCPpimM. De 35 cepas ensayadas, se logró activar la producción de algún metabolito secundario con actividad antibacteriana o antifúngica en diez (S. albus J1074, S. ambofaciens DSM 40053, S. diastatochromogenes DSM 40449, S. durhamensis DSM 40539, S. griseofuscus DSM 40191, S. laurentii DSM 41684, S. leeuwenhoekii DSM 42122, S. longwoodensis DSM 41677, S. tsukubaensis NRRL 18488 y Streptomyces sp. FR-008) lo que supuso un éxito de casi el 29% de las cepas utilizadas. Cuando se procedió a caracterizar estas activaciones, los principales antifúngicos para los que se ha logrado activar su producción han sido antimicinas, candicidina y filipina, mientras que a nivel antibacteriano, se ha localizado una activación de un compuesto bioactivo contra S. aureus subsp. aureus CECT 5190, cepa hospitalaria habitual que presenta resistencia a meticilina. Por otra parte, se obtuvieron mutantes de pimM mediante PCR propensa a errores. De los 20 mutantes obtenidos, siete de ellos consiguieron mejorar las producciones de PimM originales siendo el mejor mutante el que denominamos 321, con producciones específicas de pimaricina 3,3 veces superiores a las obtenidas por el control demostrando que la evolución forzada de reguladores PAS-LuxR es un buen método para mejorar la producción de macrólidos polienos. Además, la realización de estos experimentos ha permitido realizar un estudio funcional de la proteína PimM demostrando que ciertas modificaciones en el dominio PAS son susceptibles de mejorar la producción del antifúngico dado que una de las funciones del dominio PAS es modular la afinidad del dominio HTH por sus dianas en el ADN, mientras que el dominio de unión a ADN LuxR es menos susceptible de ser modificado pues los cambios en el mismo tienen una alta probabilidad de llevar a la proteína a una pérdida de su funcionalidad.

P. 257-271 In the Mediterranean Basin, wildland fires are major drivers of forest ecosystem dynamics. In the current context of global change, these fires are becoming more severe and recurrent because of climatic conditions, land use changes and invasive species. In areas affected by mega-fires (burned area > 10,000 ha), the patterns of regeneration may be heterogeneous due to local variations in fire regime, community composition and environmental features. The goal of this study was to analyze the post-fire structure of both Pinus pinaster Aiton. seedlings population and understory community in a Mediterranean fire-prone ecosystem at short-term by means of high spatial resolution satellite imagery within the perimeter of a full stand replacing mega-fire that burned around 12,000 ha of a Pinus pinaster forest in NW Spain. We established 234 field plots of 2 × 2 meters to cover four recurrence-severity scenarios. In each plot, we sampled 15 vegetation structural variables at both pine seedlings population and understory community levels. From the WorldView-2 satellite imagery, we obtained three sets of spectral variables (reflectance, spectral indices and image textures) that were used as predictors of vegetation recovery in generalized linear models. At population level, the number and cover of pine seedlings were successfully modeled with spectral indices and textural information (normalized root mean square error of 16% and 17%, respectively). At understory community level, woody species cover was correlated with first order textures (normalized root mean square error of 9%). Other understory structure variables (height and richness of woody species, percentage of bare soil, necromass and leaves) were predicted with an error lower than 20%. The predictive capacity of the models was similar for all recurrence-severity scenarios. Our results highlight the usefulness of spectral indices and textural data at high spatial resolution in the analysis of post-fire recovery in large and heterogeneous burnt areas. Given the accuracy and predictive capacity of the models obtained in this study, high spatial resolution satellite imagery together with field data provide useful information in post-fire decision making in fire prone ecosystems. SI

238 p. El hígado es un órgano vital para la destoxificación de sustancias perjudiciales presentes en el organismo. Las agresiones producidas a este órgano por agentes químicos, víricos o quirúrgicos, desencadenan un proceso fisiopatológico complejo que incluye desde una simple esteatosis hepática, pasando por una fibrosis hepática, cirrosis y finalmente pudiendo desarrollar finalmente, en algunos casos, hepatocarcinoma. En la actualidad, millones de personas sufren daño hepático inducido por alcohol, productos químicos e infecciones. Así, enfermedades hepáticas agudas y crónicas siguen siendo uno de los problemas graves de salud a nivel mundial. Las enfermedades inflamatorias crónicas del hígado son factores de riesgo que predisponen al desarrollo de hepatocarcinoma, ya que cualquier agente que dañe de forma crónica y progresiva a los hepatocitos e induzca mitosis, hace al ADN celular más susceptible a alteraciones genéticas. Entre ellas, se pueden citar la esteatohepatitis, la cirrosis alcohólica o la cirrosis inducida por el virus de la hepatitis B o C. Mientras que la esteatosis puede considerarse un proceso benigno, las demás patologías tienen el potencial de causar inflamación hepática crónica y desarrollo de fibrosis, lo que acabaría provocado la insuficiencia del órgano. La fibrosis hepática se considera una respuesta a agresiones externas que tiene como objetivo limitar el daño como medida protectora y reversible del tejido hepático. La destrucción de la arquitectura hepática normal se debe a la aparición de cicatrices fibrosas y a la pérdida de hepatocitos, lo que provoca que el hígado pierda alguna de sus funciones fisiológicas y se pueda producir finalmente insuficiencia hepática. En los últimos años se ha podido comprobar que este estado patológico de acumulación de proteínas de la matriz extracelular, conocido como fibrosis hepática, es un proceso reversible cuando se elimina el estímulo dañino y se aplica un tratamiento terapéutico adecuado. La inflamación, el estrés del retículo endoplasmático y otras vías de señalización relacionadas, como la autofagia, la apoptosis, la vía de los esfingolípidos o incluso los ritmos circadianos, se encuentran entre los mecanismos clave en la regulación de estas alteraciones. Es importante tener en cuenta que, en la mayoría de los casos, las terapias existentes para el tratamiento de enfermedades que cursan con fibrosis hepática son ineficaces. Debido a la gravedad que muchas de estas enfermedades crónicas alcanzan, el trasplante de hígado se considera como única terapia eficaz para muchos pacientes cuando están en etapas avanzadas de la enfermedad y presentan una función hepática descompensada. Mejorar el conocimiento de los mecanismos implicados en la fibrogénesis hepática es crucial para identificar las posibles dianas terapéuticas, así como para establecer terapias alternativas y eficaces que mejoren los tratamientos convencionales aumentando la esperanza de vida de los pacientes. Por todo ello, y basándonos en los numerosos estudios que han indicado que la melatonina tiene un papel hepatoprotector tanto en modelos animales de daño hepático como en modelos celulares, el principal objetivo de esta tesis fue determinar el efecto de la melatonina en un modelo murino de fibrosis hepática inducida por tetracloruro de carbono (CCl4). Por ello, se analizaron las principales vías de señalización implicadas en su desarrollo y, además, se evaluó su efecto en las células estrelladas hepáticas humanas de la línea LX2 con el objetivo de demostrar si los resultados obtenidos podrían ser extrapolables a humanos. La administración de CCl4 indujo daño hepático, así como el desarrollo de fibrosis hepática, demostrado a través del aumento de los marcadores séricos de daño, junto con una expresión aumentada de los principales marcadores de fibrosis. De igual modo, la administración del tóxico provocó un aumento del proceso autofágico y el estrés del retículo endoplasmático, así como una desregulación de la vía de los esfingolípidos y los ritmos circadianos, mecanismos moleculares implicados en la progresión de la fibrogénesis. El tratamiento con melatonina, hormona con probada acción antioxidante, logró regular los efectos provocados por el CCl4, lo que contribuyó a reducir los marcadores de daño y fibrosis, a través de la modulación de las vías moleculares implicadas. Además, se demostró el efecto protector del indol en las células estrelladas hepáticas humanas de la línea LX2, células clave en la progresión de la fibrosis. En resumen, con este estudio se ha pretendido profundizar en el conocimiento de los mecanismos implicados en la fibrogénesis hepática para que, junto con otros estudios similares, se pueda contribuir a la búsqueda de nuevas posibilidades terapéuticas y con ello mejorar la esperanza de vida de los pacientes con enfermedades crónicas hepáticas.

P. 1-15 Knowledge on the relationships between species functional traits and environmental filters is key to understanding the mechanisms underlying the current patterns of biodiversity loss from a multi-taxa perspective. The aim of this study was to identify the main environmental factors driving the functional structure of a terrestrial vertebrate community (mammals, breeding birds, reptiles and amphibians) in a temperate mountain system (the Cantabrian Mountains; NW Spain). Based on the Spanish Inventory of Terrestrial Vertebrate Species, we selected three functional traits (feeding guild, habitat use type and daily activity) and defined, for each trait, a set of functional groups considering vertebrate species with common functional characteristics. The community functional structure was evaluated by means of two functional indexes indicative of functional redundancy (species richness within each functional group) and functional diversity. Ordinary least squares regression and conditional autoregressive models were applied to determine the response of community functional structure to environmental filters (climate, topography, land cover, physiological state of vegetation, landscape heterogeneity and human influence). The results revealed that both functional redundancy and diversity of terrestrial vertebrates were non-randomly distributed across space; rather, they were driven by environmental filters. Climate, topography and human influence were the best predictors of community functional structure. The influence of land cover, physiological state of vegetation and landscape heterogeneity varied among functional groups. The results of this study are useful to identify the general assembly rules of species functional traits and to illustrate the importance of environmental filters in determining functional structure of terrestrial vertebrate communities in mountain systems. SI

There have been a number of studies that described a serial of type of teratology occurring in different diatom taxa and that highlight the relation between metal concentration and diatom deformities, but this subject still remain not deeply understood. The present study refers to the effect of metal pollution on the diatom Achnanthidium minutissimum s.l. by describing a new form of teratology. The samples were collected in a mine area, Rosia Montana, from Romania. We observed that, exposed to environmental stress, the frustule of diatom cells appeared altered in several ways, with abnormal forms occurring in different diatom species that presented deformed valve outlines, modifications of the raphe canal system, irregular striation or mixed teratologies. In a particular sampling location where A. minutissimum s.l. was identified as the dominant species, 20.53% of the individuals presented an unreported type of deformity. This kind of teratology affects the cingulum, the valvocopula more exactly, by becoming markedly undulate.

9 paginas, 3 figuras y 3 tablas., The effects of habitat loss and fragmentation on the genetic structure and variability of wild populations have received wide empirical support and theoretical formalization. By contrast, the effects of habitat quality seem largely underinvestigated, partly due to technical difficulties in properly assessing habitat quality. In this study, we combine geographic information system (GIS)- based habitat-quality modelling with a landscape genetics approach based on mitochondrial DNA markers to evaluate the possible influence of habitat quality on the levels and distribution of genetic diversity in a range of natural populations (n=15) of Otis tarda throughout Spain. Ninety-three percent of the population represented by our countrywide sample lives in good-quality habitats, while 4.5% and 2.5% occur respectively in intermediate and poor habitats. Habitat quality was highly correlated with patch size, population size and population density, indicating the reliability and predictive power of the habitat suitability model. Genetic diversity was significantly correlated with habitat quality, size and density of the population, but not with patch size. Three of a total of 20 existing matrilineages from the species’ current genetic pool are restricted to poorquality habitats. This study therefore highlights the importance of considering both population genetics and habitat quality in a species of high conservation priority., The study was financed by the Dirección General de investigación (projects PB94-0068, PB97-1252, BOS2002-01543 and CGL2008-02567).

Rhodococcus equi is a facultative intracellular pathogen that can survive within macrophages of a wide variety of hosts, including immunosuppressed humans. Current antibiotherapy is often ineffective, and novel therapeutic strategies are urgently needed to tackle infections caused by this pathogen. In this study, we identified three mycoredoxin-encoding genes (mrx) in the genome of R. equi, and we investigated their role in virulence. Importantly, the intracellular survival of a triple mrx-null mutant (Δmrx1Δmrx2Δmrx3) in murine macrophages was fully impaired. However, each mycoredoxin alone could restore the intracellular proliferation rate of R. equi Δmrx1Δmrx2Δmrx3 to wild type levels, suggesting that these proteins could have overlapping functions during host cell infection. Experiments with the reduction-oxidation sensitive green fluorescent protein 2 (roGFP2) biosensor confirmed that R. equi was exposed to redox stress during phagocytosis, and mycoredoxins were involved in preserving the redox homeostasis of the pathogen. Thus, we studied the importance of each mycoredoxin for the resistance of R. equi to different oxidative stressors. Interestingly, all mrx genes did have overlapping roles in the resistance to sodium hypochlorite. In contrast, only mrx1 was essential for the survival against high concentrations of nitric oxide, while mrx3 was not required for the resistance to hydrogen peroxide. Our results suggest that all mycoredoxins have important roles in redox homeostasis, contributing to the pathogenesis of R. equi and, therefore, these proteins may be considered interesting targets for the development of new anti-infectives.

Revista electrónica on line Usage of high-throughput sequencing approaches allow for the generation and characterization of reference transcriptome datasets that support gene-based marker discovery, which in turn can be used to build genetic maps among other purposes. We have obtained a transcriptome assembly including 49,453 genes for the lentil (Lens culinaris Medik.) cultivar Alpo using RNAseq methodology. This transcriptome was used as reference to obtain 6,306 quality polymorphic markers (SNPs and short indels) analyzing genotype data from a RIL population at F7 generation derived from the interspecific cross between L. culinaris cv. Alpo and L. odemensis accession ILWL235. L. odemensis is a wild species included in the secondary gene pool and can be used as a source for gene introgression in lentil breeding programs. Marker data were used to construct the first genetic interspecific map between these two species. This linkage map has been used to precisely identify regions of the CDCRedberry lentil draft genome in which the candidate genes for some qualitative traits (seed coat spotting pattern, flower color, and stem pigmentation) could be located. The genome regions corresponding to a significant single quantitative trait locus (QTL) controlling “time to flowering” located in chromosome 6 and three QTLs regulating seed size and positioned in chromosomes 1 and 5 (two QTLs) were also identified. Significant QTLs for Ascochyta blight resistance in lentil were mapped to chromosome 6 in the genome region or close to it where QTLs for Ascochyta blight resistance have previously been reported. SI

237 p. Las especies del género Campylobacter, a pesar de ser considerados tradicionalmente como patógenos veterinarios clásicos responsables de una diversidad de procesos en animales domésticos, en la actualidad, poseen gran transcendencia e interés tanto en Medicina Humana como en Seguridad Alimentaria, debido su relación, como la primera causa de gastroenteritis bacteriana en el hombre. Los pollos de engorde son el reservorio principal de C. jejuni y el consumo de su carne, altamente contaminada, constituye la principal fuente de los contagios humanos, bien de forma directa o indirectamente a consecuencia de la contaminación cruzada desde otros alimentos o utensilios utilizados en su preparación en la cocina. Por todo ello, para intentar reducir o eliminar el problema, es imprescindible la reducción de la presencia y circulación del agente en la producción primaria. A pesar de los numerosos esfuerzos realizados orientados en la búsqueda de soluciones para el control del patógeno en estos animales, las cifras de aves positivas en matadero siguen siendo muy elevadas y aún no ha sido posible resolver el problema de su control. Evitar la introducción del agente en las manadas sería fundamental para reducir el problema, y en esta línea, conocer el modo en el que se produce la transmisión de C. jejuni a los pollos de engorde resulta por el momento una incógnita necesaria de resolver. En esta Tesis Doctoral se pretende profundizar en el conocimiento global de las características epidemiológicas y de transmisión de C. jejuni en los pollos de engorde. A tal efecto, se llevaron a cabo diversos estudios de detección del microorganismo en explotaciones de la Comunidad Autónoma de Castilla y León, tanto en los animales como en el entorno ambiental. Previamente a los estudios en las explotaciones, debido a que C. jejuni muestra requisitos de crecimiento exigentes y una sensibilidad inusual al estrés ambiental, fue necesario determinar la capacidad de supervivencia de la cepa de referencia en distintos medios y condiciones, con el objeto de poder realizar un adecuado protocolo de muestreo y trabajo. En todos los casos se confirmó que la cepa utilizada pudo sobrevivir en los diferentes medios y condiciones necesarias, el tiempo suficiente para la realización de los estudios in vivo. También se llevaron a cabo numerosas pruebas con distintos medios de cultivo y diferentes técnicas de filtración buscando un procedimiento adecuado, económico y sencillo para el recuento de C. jejuni en placa a partir de heces, no hallándose, al final, ningún método totalmente eficaz para ese propósito, debido, bien a la presencia de contaminantes microbianos que impedían el aislamiento (en el caso del uso de los medios selectivos sin filtro), y por otro, a que se provocaba una reducción considerable del número final de C. jejuni cuando se empleaban filtros, que falseaba el resultado. Con objeto de conocer el momento y las circunstanciasen que se tiene lugar la colonización de las aves con C jejuni, a fin de poder controlar la introducción del microorganismo en las naves, se llevaron a cabo distintos estudios de detección y aislamiento en una explotación de pollos comerciales, para determinar la edad de colonización y la influencia de la estación climática en esta, utilizando distintos procedimientos y protocolos de muestreo. La edad de colonización se estableció aproximadamente en la segunda semana de vida, a partir de un sistema de muestreo que utilizaba calzas absorbentes, sin encontrar diferencias entre las distintas estaciones del año, si bien durante los meses de otoño C. jejuni no se pudo detectar hasta la tercera semana de vida de los animales. En una manada aislada, se determinó la prevalencia de la infección por C jejuni a lo largo de la cría, utilizando hisopos (en cloaca) y a partir del contenido de distintos tramos intestinales (buche, ciego y colon). Se pudo confirmar la presencia de C. jejuni a partir de los 20 días de vida (colonizando ya ciego y colon); además, se observaron altísimas prevalencias en cloaca (83,3% el día 23), en ciego (90% el día 30) y en colon (70% el día 30), que fueron aumentando progresivamente a lo largo de la crianza, hasta llegar a la práctica totalidad de las aves, permitiendo deducir que C. jejuni colonizaría a la práctica totalidad de la manada al cumplirse no más de los dos tercios del periodo de cría. Con el fin de obtener más información sobre los posibles reservorios que pudieran actuar como fuentes de infección o vías de transmisión horizontal, se llevaron a cabo estudios de detección en una explotación de pollos de engorde, analizando para ello diferente tipo de muestras, potenciales fuentes de contagio procedentes del entorno interior y exterior de la nave. La mayor parte de las muestras, exceptuando las muestras de tipo fecal y de materia orgánica, fueron negativas, incluso cuando previamente se había demostrado la presencia del microorganismo en otro tipo de materias como, por ejemplo, en las heces. Dado que la presencia de animales en las inmediaciones de las instalaciones se considera como un factor importante en el aumento de la prevalencia del microorganismo en las granjas de pollos, con la misma finalidad que en el caso anterior, se determinó la presencia de C. jejuni en otros sistemas productivos, así como en otras especies animales (mamíferos y aves) ubicadas en el entorno de aves positivas. En todos los sistemas productivos analizados se observaron prevalencias elevadas del microorganismo. Además de ello, una gran variedad de especies animales de las que estaban en contacto con aves portadoras albergó C. jejuni y se pudo detectar su presencia en heces, lo que permite sospechar que posiblemente puedan actuar como reservorio. No obstante, debe precisarse que, entre las especies animales separadas de las aves portadores del microorganismo no se detectó ningún animal positivo, lo que podría significar que el reservorio principal son las aves de engorde, únicamente. Los estudios de transmisión se completaron con la posibilidad de transmisión del microorganismo de manera vertical, desde las gallinas a los huevos. A este respecto, se llevó a cabo un estudio en el que se analizó la presencia de C. jejuni en distintas partes (superficie, cáscara e interior), en huevos procedentes de gallinas positivas, no detectándose nunca el agente. También se llevó a cabo un estudio de persistencia en huevos inoculados experimentalmente en la superficie comprobándose la escasa capacidad de supervivencia de C. jejuni en la superficie de huevos (sólo persistió 1 hora) así como la incapacidad de éste para colonizar los huevos, ya que no fue capaz de atravesar la cáscara. Finalmente, con el objetivo de establecer qué productos podrían ser útiles para el control ambiental de C. jejuni, se comprobó la eficacia de 16 principios activos y 11 desinfectantes comerciales, utilizándose un método de suspensión con una capa de referencia de C. jejuni en presencia y ausencia de suero, probando la capacidad bactericida de los distintos desinfectantes. Con algunos de los productos que mostraron un nivel elevado de reducción in vitro, se llevó a cabo una prueba adicional con el fin de comprobar si también resultaban activos contra C. jejuni en el ambiente de la granja. El microorganismo fue susceptible a 3 de los 4 principios activos (fenol, cloramina T y formol) y a 3 de los 4 productos comerciales probados (Limoseptic SF®, CR-36 Mural® y Proxitane 15®).

173 El cultivo del olivo es un uso muy importante de la tierra en la región mediterránea, con una muy destacada importancia medioambiental, social y económica (Loumou and Giourga, 2003). Sin embargo, es atacado por diferentes plagas que reducen su rendimiento y, como consecuencia, la calidad del aceite de oliva y los ingresos de los agricultores. Entre otras plagas, la mosca del olivo, Bactrocera oleae (Rossi) (Diptera: Tephritidae), es la de mayor importancia en el mundo donde se cultiva el olivar (Daane and Johnson, 2010). Esta plaga se controla principalmente con plaguicidas sintéticos, cuyos efectos nocivos en el medioambiente y en la salud humana, así como en la biodiversidad y en el uso potencial del control biológico son sobradamente conocidos. Además, las aplicaciones químicas pueden dar lugar al repunte de la población plaga por la reducción de los enemigos naturales o el desarrollo de la resistencia a insecticidas (Soares, Pereira and Bastos, 2004; Hawkes et al., 2005). En los últimos años, B. oleae tiene mayor importancia en la parte norte de Portugal, un lugar donde tradicionalmente el ataque de la mosca ha sido bajo. Este incremento en el nivel de ataque está generando preocupación entre los agricultores. En olivares sostenibles, el control de la mosca se debería conseguir maximizando la acción de sus enemigos naturales. En este contexto, innovar en el conocimiento de aspectos derivados de las interacciones plaga-parasitoide es necesario y deberían ser explorados. Entre el complejo de enemigos naturales, el bracónido Psyttalia concolor (Szépligeti) (Hymenoptera: Braconidae) está considerado como un endoparasitoide de importancia para el control de la mosca del olivo así como de otros tefrítidos de importancia económica (Benelli and Canale, 2013). Además, en laboratorio, P. concolor se cría fácilmente en un huésped alternativo, la mosca de la fruta Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae). Se estudiaron, las interacciones planta-plaga para favorecer el establecimiento del parasitoide en el olivar, así como su capacidad para completar su ciclo de vida. Los parasitoides en fase adulta necesitan recursos florales (polen y néctar) y también melazas para satisfacer sus necesidades energéticas y completar la maduración de su aparato reproductor (Winkler et al., 2006) Por tanto, la conservación o el aumento de poblaciones de P. concolor está estrechamente ligado al mantenimiento de plantas no cultivadas (por ejemplo, márgenes de vegetación o arbustos) dentro o alrededor del olivar. Esto implica el estudio de los efectos de plantas no cultivadas como fuente de energía suplementaria (azúcares, aminoácidos y melazas) en la supervivencia, reproducción y comportamiento de P. concolor, así como la comprensión de cómo contribuyen al mantenimiento del parasitoide en los olivares. La investigación de estas interacciones finalmente suministrarán información valiosa para la implementación de técnicas de control sostenibles. Por tanto, el objetivo de este trabajo será el studio de los diferentes componentes de la interacción P. concolor-mosca del olivo, así como el efecto de las plantas no cultivadas en el desarrollo y comportamiento P. concolor, con el fin de promover el control biológico en los olivares.

334 El objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido la caracterización bioquímica, genética y biotecnológica de la ruta catabólica responsable de la degradación de histamina y, específicamente, de ácido imidazolacético (ImAA) en la bacteria Pseudomonas putida U. La histamina desempeña multitud de funciones fundamentales para nuestro organismo . Esta amina biogénica se encuentra presente en alimentos tales como el pescado, la carne, el queso o las verduras, y en bebidas fermentadas tales como la cerveza y el vino. Debido a sus múltiples funciones y a su importancia, la concentración de histamina en el cuerpo debe controlarse estrictamente. De ahí que su acumulación pueda ser perjudicial para la salud. Además, la variación en las concentraciones de esta amina puede ser la causa de diversas patologías. Por otro lado, el ImAA, intermediario catabólico de esta ruta, posee también actividad biológica ya que es un análogo estructural del ácido 4-aminobutírico (GABA), el principal transmisor químico con efecto inhibidor del cerebro. Este hecho implica que este intermediario esté relacionado con determinados procesos patológicos tales como la aparición de un estado hipnótico similar al sueño, el descenso de la presión arterial e incluso con la participación en enfermedades que afectan a la retina y que conducen a una alteración de la visión. Por lo tanto, conocer la ruta de degradación de estos compuestos podría suponer un gran avance para evitar los problemas de salud derivados de intoxicaciones alimentarias. La descripción de esos genes y enzimas podría facilitar la búsqueda de organismos GRAS (generally recognised as safe) que, potencialmente, podrían ser capaces de eliminar la histamina y el ImAA de la matriz de los alimentos.

P. 533-542 Recently, the number of algological studies in Turkish inland waters has increased remarkably. However, taxonomic and floristic studies on algae in the Euphrates basin are still scarce. This study contributes new information to the knowledge of the Turkish freshwater algal flora. Phytoplankton samples were collected from the Tatar Dam Reservoir in the Euphrates Basin between January 2016 and December 2016. Two taxa were recorded for first time and 14 rare taxa for the freshwater algae of Turkey were identified in this study. The new records belong to the phylum Bacillariophyta, whereas taxa considered as rare belong to the phyla Chlorophyta, Cyanobacteria, Rhodophyta, Charophyta, Euglenophyta, and Bacillariophyta. The morphology and taxonomy of these taxa are briefly described in the paper and original light microscopy illustrations are provided SI

This study was conducted to compare the effects of thermal stress on growth performance and some immunity variables of broiler chickens. Birds were randomly assigned to one of three thermal treatments as follows: cold stress (CS, 12±1 ° C), (b) heat stress (HS, 33±3 ° C) and (c) thermoneutral (TN, 24±2 ° C). Body weight gain (BWG), feed intake (FI), water intake (WI) and feed conversion ratio (FCR) were recorded. In order to evaluate the primary and secondary humoral immune responses, two birds per replicate were intravenously administrated with a suspension of 7% sheep red blood cell (SRBC) at 28 and 35 days. The heat-stressed broiler chickens had lower FI (-14.90%), BWG (-25.71%) and higher FCR (+13.06%) in comparison to broiler chickens reared under TN condition ( p

Producción Científica, We aimed to analyze the relationship between fire regime attributes and the post-fire greenness recovery of fire-prone pine ecosystems over the short (2-year) and medium (5-year) term after a large wildfire, using both a single and a combined fire regime attribute approach. We characterized the spatial (fire size), temporal (number of fires, fire recurrence, and return interval), and magnitude (burn severity of the last fire) fire regime attributes throughout a 40-year period with a long-time series of Landsat imagery and ancillary data. The burn severity of the last fire was measured by the dNBR (difference of the Normalized Burn Ratio) spectral index, and classified according to the ground reference values of the CBI (Composite Burn Index). Post-fire greenness recovery was obtained through the difference of the NDVI (Normalized Difference Vegetation Index) between pre- and post-fire Landsat scenes. The relationship between fire regime attributes (single attributes: fire recurrence, fire return interval, and burn severity; combined attributes: fire recurrence-burn severity and fire return interval-burn severity) and post-fire greenness recovery was evaluated using linear models. The results indicated that all the single and combined attributes significantly affected greenness recovery. The single attribute approach showed that high recurrence, short return interval and low severity situations had the highest vegetation greenness recovery. The combined attribute approach allowed us to identify a wider variety of post-fire greenness recovery situations than the single attribute one. Over the short term, high recurrence as well as short return interval scenarios showed the best post-fire greenness recovery independently of burn severity, while over the medium term, high recurrence combined with low severity was the most recovered scenario. This novel combined attribute approach (temporal plus magnitude) could be of great value to forest managers in the development of post-fire restoration strategies to promote vegetation recovery in fire-prone pine ecosystems in the Mediterranean Basin under complex fire regime scenarios., Ministerio de Economía y Competitividad, y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), en el marco del GESFIRE (AGL2013-48189-C2-1-R) y proyectos FIRESEVES (AGL2017-86075-C2-1-R), Junta de Castilla y León en el marco de los proyectos FIRECYL (LE033U14) y SEFIRECYL (LE001P17), Ministerio de Educación (FPU14/00636)

P. 168-175 Antioxidants may ameliorate the effects of the freeze-thawing stress on cryopreserved spermatozoa. Lycopene is an effective antioxidant yet to be tested for rooster sperm cryopreservation and nanoliposomes, a technology recently applied to sperm cryopreservation, could improve conservation and antioxidant delivery to spermatozoa. Therefore, we evaluated the effect of 0.1, 0.2, and 0.3 mM lycopene and lycopene-loaded nanoliposomes (LnL) on the cryopreservation of rooster sperm in Beltsville extender. Post-thawing evaluation included sperm motility, membrane integrity, abnormal morphology, mitochondria activity, apoptotic status, malondialdehyde (MDA) and antioxidant activities: Glutathione peroxidase (GPx), superoxide dismutase (SOD) and total antioxidant capacity (TAC). Total and progressive motility, membrane integrity and mitochondria activity were higher with 0.2 mM lycopene and LnL (P

The Lidia bovine breed is an important hallmark of the Spanish cattle industry. Bulls are selected based upon aggressiveness and epididymal sperm cryopreservation is the way to obtain and store their genetics. There are not specifically designed protocols yet to perform Lidia bull sperm cryopreservation. The present study aimed to determine if a tris-fructose-citrate-egg yolk (20% v/v; TFY) extender supplemented with 7% glycerol (TFY1) or 3.5% glycerol plus 3.5% dimethylformamide (DMF; TFY2) are suitable media for cryopreservation of epididymal Lidia bull sperm. Moreover, the effect of N-acetylcysteine (NAC), a potent antioxidant, was evaluated. The epididymis were stored at 4°C for 24, 48, 72 or 96 h, and both freezing media were tested as such or supplemented with 1 or 2.5 mM of NAC. Our data demonstrated that post-thaw viability was well maintained (TFY1: 50.8% ± 1.9 at 24 h and 52.4% ± 0.8 at 96 h and TFY2: 52.6% ± 1.6 at 24 h and 56.1% ± 1.8 at 96 h; mean % ± SEM; p>0.05) as also were total and progressive sperm motility, high mitochondrial membrane potential, ROS production, DNA status and acrosomal intactness of Lidia bull sperm up to 96 h of epididymal storage, all extender variations being similar (p>0.05). In conclusion, the use of TFY medium supplemented either with 7% glycerol alone or the combination of 3.5% glycerol and 3.5% DMF were equally safe choices for epididymal Lidia bull sperm cryopreservation, and NAC addition did not significantly improve sperm post-thaw quality.

Computer-aided sperm analysis (CASA) produces a wealth of data that is frequently ignored. The use of multiparametric statistical methods can help explore these datasets, unveiling the subpopulation structure of sperm samples. In this review we analyse the significance of the internal heterogeneity of sperm samples and its relevance. We also provide a brief description of the statistical tools used for extracting sperm subpopulations from the datasets, namely unsupervised clustering (with non-hierarchical, hierarchical and two-step methods) and the most advanced supervised methods, based on machine learning. The former method has allowed exploration of subpopulation patterns in many species, whereas the latter offering further possibilities, especially considering functional studies and the practical use of subpopulation analysis. We also consider novel approaches, such as the use of geometric morphometrics or imaging flow cytometry. Finally, although the data provided by CASA systems provides valuable information on sperm samples by applying clustering analyses, there are several caveats. Protocols for capturing and analysing motility or morphometry should be standardised and adapted to each experiment, and the algorithms should be open in order to allow comparison of results between laboratories. Moreover, we must be aware of new technology that could change the paradigm for studying sperm motility and morphology.

Any physiological mechanism involved in sperm selection and semen improvement has effects on heterogeneous sperm populations. This is mainly due to the fact that sperm populations within a single ejaculate have considerable heterogeneity for many variables, such as motility which is meaningful in terms of understanding how some sperm cells possess fertility advantages as compared with other cells. In the present research, initially there was a multivariate and clustering analysis used to assess sperm motility data from cryopreserved ram semen to identify subpopulations and compare the distribution of these clusters between rams with lesser and greater fertility. There were four classifications made of sperm subpopulations (clusters): CL1 fast/linear/progressive sperm; CL2 fast/non-linear sperm; CL3 very fast/linear sperm with vigorous beating and CL4 slow/non-linear sperm. Rams with greater fertility had a lesser proportion of sperm considered as “hyperactivated” (CL2) and a greater proportion of slow and non-linear sperm (CL4) than sperm of rams with lesser fertility. In addition, the effects were assessed for the capacity of seminal plasma (SP) and interacting SP proteins (iSPP) that were present during different seasons of the year to improve the distribution of sperm within subpopulations of semen from rams with lesser fertility. The iSPP and SP were obtained by artificial vagina (AV) and electroejaculation (EE) during breeding and non-breeding seasons and added to thawed semen. All the aggregates had a significant effect on the distribution of sperm subpopulations and effects differed among seasons of the year and depending on collection method used. Even though, future studies are needed to assess the contribution of each subpopulation on ram sperm fertility, it is important that a multivariate analysis be used to evaluate the effect of a treatment on sperm quality variables. Fil: Ledesma, Alba. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata; Argentina Fil: Zalazar, Lucia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina Fil: Fernández Alegre, Estela. Universidad de León; España Fil: Hozbor, Federico Andrés. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Departamento de Producción Animal; Argentina Fil: Cesari, Andreina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina Fil: Martínez Pastor, Felipe. Universidad de León; España

Sex ratio allocation has important fitness consequences, and theory predicts that parents should adjust offspring sex ratio in cases where the fitness returns of producing male and female offspring vary. The ability of fathers to bias offspring sex ratios has traditionally been dismissed given the expectation of an equal proportion of X- and Y-chromosome-bearing sperm (CBS) in ejaculates due to segregation of sex chromosomes at meiosis. This expectation has been recently refuted. Here we used Peromyscus leucopus to demonstrate that sex ratio is explained by an exclusive effect of the father, and suggest a likely mechanism by which male-driven sex-ratio bias is attained. We identified a male sperm morphological marker that is associated with the mechanism leading to sex ratio bias; differences among males in the sperm nucleus area (a proxy for the sex chromosome that the sperm contains) explain 22% variation in litter sex ratio. We further show the role played by the sperm nucleus area as a mediator in the relationship between individual genetic variation and sex-ratio bias. Fathers with high levels of genetic variation had ejaculates with a higher proportion of sperm with small nuclei area. This, in turn, led to siring a higher proportion of sons (25% increase in sons per 0.1 decrease in the inbreeding coefficient). Our results reveal a plausible mechanism underlying unexplored male-driven sex-ratio biases. We also discuss why this pattern of paternal bias can be adaptive. This research puts to rest the idea that father contribution to sex ratio variation should be disregarded in vertebrates, and will stimulate research on evolutionary constraints to sex ratios—for example, whether fathers and mothers have divergent, coinciding, or neutral sex allocation interests. Finally, these results offer a potential explanation for those intriguing cases in which there are sex ratio biases, such as in humans., A.F.M. was supported by a MEC/Fulbright fellowship (FU2005-0893), a travel grant from the Ministry of Education and Science, a Marie Curie fellowship (PIEF-GA-2008-220322) and an ERC grant (249872). F.M.-P. was supported by the Juan de la Cierva program (Spanish Ministry of Education and Science), Ramon y Cajal program (RYC-2008-02560, MICINN) and two travel grants from the University of Castilla-La Mancha (Spain). F.G.-G. was supported by the Ramon y Cajal program, the Spanish Severo Ochoa Program (SEV-2012-0262) and by grant no. CGL2016-76173-P (co-funded by the European Regional Development Fund) from the Spanish Ministry of Economy.

319 p. La histamina es una de las aminas biogénicas más importantes, tanto por su acumulación en los alimentos como por la variedad de efectos nocivos que provoca en el organismo. En esta Tesis Doctoral, se ha llevado a cabo la caracterización genética y bioquímica de la ruta responsable de la transformación de histamina en ácido imidazolacético en Pseudomonas putida U, identificándose los diferentes genes que codifican las funciones responsables de esta transformación. Estos 11 genes se clasifican en tres clusters catabólicos distintos: - El cluster hin es responsable del transporte de histamina, de su desaminación y de su posterior oxidación. Entre las proteínas codificadas por esta agrupación genética se encuentran: un transportador de histamina (HinA); un transaminasa dependiente de piruvato (HinC); una aldehído deshidrogenasa (HinD) que participa en el proceso de oxidación del aldehído generado tras las desaminación de la histamina, y una proteína reguladora (HinB) que actúa como activador de la expresión de las proteínas mencionadas. Se ha logrado clonar y expresar en un plásmido (pK18::mob), este cluster hin, dotando de este modo a las bacterias transformadas con esta construcción de la capacidad necesaria para convertir la histamina en ácido imidazolacético. - El cluster dad es responsable de dos funciones: por una parte, permite regenerar el piruvato requerido como aceptor del grupo amino en la reacción de transaminación, y, además, participa en un sistema de transferencia de electrones en el que el aceptor final es una citocromo c oxidasa. Además, participa en el catabolismo de cadaverina. Está formado por 3 genes que codifican las siguientes proteínas catabólicas: una alanina racemasa (DadX) que transforma la L-alanina formada por la aminotransferasa (HinC) en D-alanina, y una D-aminoácido deshidrogenasa (DadA) dependiente de FAD (se reduce a FADH2 que se acopla a una cadena de transporte electrónico) responsable de la desaminación de esta D-alanina. - El cluster cox está formado por 4 genes: coxB, coxA, coxC y cox11, que codifican las 3 subunidades y la proteína de unión del complejo citocromo c oxidasa de tipo aa3. Esta proteína es la responsable de la transferencia de electrones al oxígeno, formando parte de la cadena de transporte que genera la energía requerida para la incorporación de histamina. Todos estos resultados permiten diseñar herramientas biotecnológicas que pueden ser aplicadas para la eliminación o reducción de la histamina presente en diferentes fuentes, como algunos de los recombinantes obtenidos en esta Tesis Doctoral. Además, el conocimiento genético y bioquímico de esta ruta permitirá la selección de cepas capaces de degradar la histamina y su utilización como cultivos starters (cultivos iniciadores), así como el diseño de nuevos agentes terapéuticos. Adicionalmente, mediante Ingeniería Metabólica, hemos logrado establecer una nueva ruta útil para la degradación del aminoácido L-histidina mediante la participación del gen que codifica la histidin descarboxilasa (hdc) de Enterobacter aerogenes. Una aplicación interesante sería la confluencia en un mismo microorganismo de los genes del cluster hin1 (hinEABCD), de los genes necesarios para degradar el ácido imidazolacético y el gen hdc, que permitiría catabolizar toda la L-histidina a través del intermediario histamina, y así, elaborar alimentos con bajo contenido en este aminoácido y en sus derivados.

P. 459-467 This study was designed to investigate the effects of feeding‐protected conjugated linoleic acid (CLA) on the semen production and sperm freezability in Holstein bulls. Twelve bulls were randomly assigned to two groups (n = 6 per group). Bulls received the normal diet (control group) or the normal diet top‐dressed with 50 g of CLA (treated group) for 10 weeks. The control group received 40 g/day calcium soap of fatty acid. Fresh and post‐thaw semen quality was assessed on ejaculates collected at the 0, 4, 6, 8 and 10 week of supplementation. Semen evaluations including sperm concentration, motion characteristics (subjective and computer‐assisted), viability (Eosin–Nigrosin), membrane integrity (hypo‐osmotic swelling test) and abnormality were conducted. Semen volume, sperm concentration and total sperm output were not affected by dietary treatment (p > .05). The proportion of spermatozoa with abnormal morphology in fresh semen significantly increased (p < .05) in the CLA‐fed group compared to control group. Also, in CLA‐fed group, the proportion of post‐thaw spermatozoa with abnormal morphology at week 10 of trial was significantly higher in CLA than control group (p < .05). Progressive motility tended to be increased in the CLA‐fed group, although dietary supplementation did not affect other CASA parameters or viability in fresh and frozen‐thawed sperm. In this study, CLA supplementation had little positive effect on fresh or post‐thaw sperm quality of Holstein bulls. SI

401 p. Se presenta el elenco de hemípteros acuáticos epicontinentales (Nepomorpha y Gerromorpha) conocidos del archipiélago canario (España) a partir de los registros contenidos en 43 publicaciones y procedentes de capturas inéditas. En las islas Canarias están catalogadas 15 especies y subespecies, de las cuales 2 especies y una subespecie son endemismos canarios. En los últimos años, se ha observado una marcada ralentización en el incremento de especies registradas, lo que se puede interpretar como una aproximación importante hacia el número máximo de especies que puede albergar el archipiélago canario. Por tanto, este estudio ha tenido por objetivo actualizar la distribución inter e intrainsular de las especies y subespecies registradas en las islas Canarias, aportando nuevos datos corológicos para 9 de ellas. Para cada taxón, se anexan mapas de distribución U.T.M. 1 x 1 km actualizados incluyendo y cartografiándose todos los datos corológicos previos así como los procedentes de las capturas inéditas en cada territorio insular. Del mismo modo, se aportan breves reseñas a la biología y hábitat de cada taxón. Finalmente, se exponen y discuten determinados aspectos faunísticos, biogeográficos y ecológicos

126 p. Los cultivos de trigo regados mantuvieron mayores abundancias a lo largo de todo el periodo de estudio, debido a la mayor disponibilidad de agua durante los meses más secos, junto con una mayor aplicación de nitrógeno en los campos de cultivo que parece causar que las plantas de regadío sean más vigorosas. Estas condiciones permiten más recursos y de mejor calidad frente a los herbívoros durante el período más seco. Los depredadores (Coccinellidae y Syrphidae) y parasitoides (Aphidiinae) siguieron la tendencia en abundancia de sus presas, de acuerdo a una dinámica depredador-presa. Durante la realización de las identificaciones en los estudios anteriores se observó que una parte importante del tiempo de investigación se utilizaba en la identificación, de manera que se decidió evaluar el uso de taxones sustitutos con los datos de las muestras recogidas en el año 2007, con el objetivo de reducir el tiempo de identificación de las muestras. Los resultados indican que el uso de taxones superiores, particularmente la riqueza de géneros (Aphididae, Aphidiinae, Coccinellidae, Formicidae, Heteroptera y Syrphidae) puede ser un método útil para valorar de forma rápida y barata la biodiversidad de artrópodos en paisajes agrícolas

Ecosystems adapted to low nitrogen (N) conditions such as Calluna-heathlands are especially sensitive to enhanced atmospheric N deposition that affects many aspects of ecosystem functioning like nutrient cycling, soil properties and plant-microbial-enzyme relationships. We investigated the effects of five levels of experimentally-simulated N deposition rates (i.e., N fertilization treatments: 0, 10, 20 and 50kgNha-1yr-1 for 3years, and 56kgNha-1yr-1 for 10years) on: plant, litter, microbial biomass and soil nutrient contents, soil extracellular enzymatic activities, and plant root ericoid mycorrhizal colonization. The study was conducted in marginal montane Calluna-heathlands at different developmental stages resulting from management (young/building-phase and mature-phase). Our findings revealed that many soil properties did not show a statistically significant response to the experimental addition of N, including: total N, organic carbon (C), C:N ratio, extractable N-NO3-, available phosphorus (P), urease and β-glucosidase enzyme activities, and microbial biomass C and N. Our results also evidenced a considerable positive impact of chronic (10-year) high-N loading on soil extractable N-NH4+, acid phosphatase enzyme activity, Calluna root mycorrhizal colonization by ericoid fungi, Calluna shoot N and P contents, and litter N content and N:P ratio. The age of heathland vegetation influenced the effects of N addition on ericoid mycorrhizal colonization, resulting in higher colonized roots in young heathlands at the control, low and medium N-input rates; and in mature ones at the high and chronically high N rates. Also, young heathlands exhibited greater soil extractable N-NO3-, available P, microbial biomass N, Calluna shoot N and P contents, and litter N content, compared to mature ones. Our results highlighted that accounting for the N-input load and duration, as well as the developmental stage of the vegetation, is important for assessing the effects of added N, particularly at the heathlands' southern distribution limit. Ecosystems adapted to low nitrogen (N) conditions such as Calluna-heathlands are especially sensitive to enhanced atmospheric N deposition that affects many aspects of ecosystem functioning like nutrient cycling, soil properties and plant-microbial-enzyme relationships. We investigated the effects of five levels of experimentally-simulated N deposition rates (i.e., N fertilization treatments: 0, 10, 20 and 50 kg N ha− 1 yr− 1 for 3 years, and 56 kg N ha− 1 yr− 1 for 10 years) on: plant, litter, microbial biomass and soil nutrient contents, soil extracellular enzymatic activities, and plant root ericoid mycorrhizal colonization. The study was conducted in marginal montane Calluna-heathlands at different developmental stages resulting from management (young/building-phase and mature-phase). Our findings revealed that many soil properties did not show a statistically significant response to the experimental addition of N, including: total N, organic carbon (C), C:N ratio, extractable N-NO3 −, available phosphorus (P), urease and β-glucosidase enzyme activities, and microbial biomass C and N. Our results also evidenced a considerable positive impact of chronic (10-year) high-N loading on soil extractable N-NH4 +, acid phosphatase enzyme activity, Calluna root mycorrhizal colonization by ericoid fungi, Calluna shoot N and P contents, and litter N content and N:P ratio. The age of heathland vegetation influenced the effects of N addition on ericoid mycorrhizal colonization, resulting in higher colonized roots in young heathlands at the control, low and medium N-input rates; and in mature ones at the high and chronically high N rates. Also, young heathlands exhibited greater soil extractable N-NO3 −, available P, microbial biomass N, Calluna shoot N and P contents, and litter N content, compared to mature ones. Our results highlighted that accounting for the N-input load and duration, as well as the developmental stage of the vegetation, is important for assessing the effects of added N, particularly at the heathlands' southern distribution limit.

345 p. El género Streptomyces desataca por su metabolismo secundario. Más de la mitad de los metabolitos secundarios bioactivos se han aislado a partir de este género (Hopwood, 2007). El metabolismo secundario en Streptomyces se reprime por altas concentraciones de fosfato en el medio (Martín et al., 2017). Sin embargo, no se conocen los mecanismos que relacionan la respuesta a la concentración de fosfato con la producción de metabolitos secundarios. Los objetivos de este trabajo fueron identificar ARN reguladores (ARNp) que se expresen en un medio con limitación de fosfato y sean el “eslabón perdido” entre la escasez de fosfato y el metabolismo secundario; profundizar en la función reguladora del sistema PhoR-PhoP y los miembros del regulón pho; y caracterizar la respuesta al exceso de fosfato. Estos objetivos se abordaron con análisis transcriptómicos, la secuenciación diferencial del transcriptoma (dRNA seq) y tres series transcriptómicas con micromatrices personalizadas