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Orientadora: Profa. Dra. Lia Sumie Nakao Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 23/09/2020 Inclui referências: p.79-87 Resumo: A migração e a proliferação de células musculares lisas vasculares (VSMC) possuem importante papel na hiperplasia da camada íntima arterial em resposta a estímulos patológicos, como a restenose, que consiste na reobstrução do lúmen do vaso sanguíneo após a técnica da angioplastia por cateter balão. Estudos vêm associando a regulação de processos migratórios e proliferativos celulares com moléculas oxidantes, estabelecendo espécies reativas de oxigênio (ROS) como importantes sinalizadores nesse processo. Tiol proteínas estão cada vez mais evidentes na sinalização redox, inclusive a proteína QSOX1 (quiescina sulfidril oxidase), uma tiol oxidase dependente de FAD (flavina adenina dinucleotídeo) que catalisa a oxidação de di(tióis) à dissulfeto, com a redução concomitante do oxigênio molecular (O2) à peróxido de hidrogênio (H2O2). Recentemente, nosso grupo demonstrou que a QSOX1 extracelular está envolvida na proliferação e na migração de VSMC. Desta forma, o objetivo do trabalho foi melhor compreender os mecanismos pelos quais a proteína QSOX1 extracelular está envolvida nos processos de migração e proliferação em VSMC. O modelo experimental consistiu basicamente em VSMC primárias, mas em alguns ensaios foram utilizadas linhagens de células vasculares. Foram utilizadas construções da isoforma curta da proteína QSOX1: wild type (mQSOX) e a mutante inativa (C452SQSOX). A atividade sulfidril oxidase foi determinada pela formação de peróxido de hidrogênio. Os ensaios de migração foram realizados pelos métodos de scratch ou transwell e os ensaios de proliferação por cristal violeta, ambos na presença das proteínas recombinantes e de inibidores e/ou ativadores da produção de ROS. Ensaios de western blotting foram realizados para investigar a via de sinalização envolvida na migração em VSMC induzida pela QSOX1. Nossos resultados mostraram que a proteína QSOX1 recombinante extracelular estimula a migração em VSMC através de processos que envolvem aumento da produção de ROS. A presença do H2O2 resultante da atividade sulfidril oxidase e a presença do complexo enzimático NADPH oxidase (especificamente NOX1) mostraram-se importantes no processo migratório induzido pela QSOX1. A ausência da QSOX1 endógena inibe a motilidade de células musculares lisas. Além disso, a atividade desta enzima mostrou estar associada à regulação da via SSH1-cofilina, indicando ser a proteína QSOX1 uma reguladora redox que contribui para reorganização do citoesqueleto de actina durante o movimento celular. Foi também demonstrado que em concentrações mais altas e um tempo maior de exposição a proteína QSOX1 recombinante extracelular induz proliferação de VSMC. Este processo também foi dependente de ROS, especificamente com a formação de ânion superóxido (O2 o-). Em resumo, nossos dados indicam o envolvimento da QSOX1 recombinante extracelular na sinalização dos processos de migração de proliferação de VSMC mediados por NOX1. Palavras-chave: Migração. Proliferação. QSOX1. ROS. NOX1. Abstract: Vascular smooth muscle cell (VSMC) migration and proliferation plays an important role in arterial intima layer hyperplasia in pathological responses, like restenosis, which consists in reobstruction of the blood vessel lumen after the balloon catheter angioplasty technique. Studies have been associating the regulation of cell migratory and proliferative processes with oxidizing molecules, establishing reactive oxygen species (ROS) as relevant messengers in these events. Thiol proteins are increasingly evident in redox signaling, including QSOX1 protein (quiescin sulfhydryl oxidase), FAD (adenine dinucleotide flavin) - dependent thiol oxidase that catalyzes the oxidation of di (thiols) to disulfide, concomitant reduction of molecular oxygen (O2) to hydrogen peroxide (H2O2). Our group recently demonstrated that extracellular QSOX1 is involved in VSMC proliferation and migration. Thus, the purpose of the study was to better understand the mechanisms by which extracellular QSOX1 protein is involved in the migration and proliferation processes in VSMC. The experimental model consisted of primary VSMC, but in some trials vascular cell line were used. Constructs of the short protein isoform QSOX1: wild type (mQSOX) and the inactive mutant (C452SQSOX) were used. Sulfhydryl oxidase activity was determined by the formation of hydrogen peroxide. Migration assays were performed by scratch or transwell methods and proliferation assays by crystal violet, both in the presence of recombinant proteins and ROS production inhibitors and/or activators. Western blotting assays were performed to investigate the signaling pathway involved in QSOX1-induced VSMC migration. Our results showed that extracellular recombinant QSOX1 protein stimulates migration in VSMC through processes involving increased ROS production. The presence of H2O2 resulting from sulfhydryl oxidase activity and the presence of the enzyme complex NAPH oxidase (specifically NOX1) proved to be important in the QSOX1 induced migration process. The absence of endogenous QSOX1 inhibits smooth muscle cell motility. In addition, the activity of this enzyme has been shown to be associated with regulation of the SSH1-cofillin pathway, indicating that QSOX1 protein is a redox regulator that contributes to actin cytoskeleton reorganization during cell movement. It has also been shown that at higher concentrations and longer exposure time to extracellular recombinant QSOX1 protein induces VSMC proliferation. This process was also ROS dependente, specifically through the formation of superoxide (O2 o-). In summary, our data indicate the involvement of extracellular recombinant QSOX1 in signaling NOX1-mediated VSMC proliferation migration processes. Key-words: Migration. Proliferation. QSOX1. ROS. NOX1

Orientador: Prof. Dr. Edvaldo da Silva Trindade Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 29/06/2020 Inclui referências: p. 133-157 Resumo: Desde 1990, câncer é uma das três maiores causas de mortes da população mundial, com expectativa de diagnóstico de mais de 625 mil novos casos no ano de 2020 no Brasil. O melanoma é o tipo mais agressivo de câncer de pele, e em estágios avançados os tratamentos disponíveis são apenas paliativos, não funcionam para todos os pacientes a geram diversos efeitos colaterais. O uso de compostos de origem natural para o tratamento de diferentes patologias é amplamente descrito na literatura. Um relevante grupo desse tipo de compostos são os polissacarídeos com efeitos medicinais, os quais são amplamente descritos em cogumelos, plantas, animais, bactérias e algas. Entre suas diversas funcionalidades biológicas são descritas atividades antitumorais através de inibição do crescimento tumoral ou da angiogênese, indução de apoptose, aumento de imunocompetência com alterações em subpopulações de células imunológicas e diminuição da progressão metastática. Dentro de nosso grupo de pesquisa, estudos com esse tipo de compostos já apresentaram resultados promissores, tanto em modelos in vitro como in vivo. Entre esses destaca-se uma homogalactana sulfatada extraída da alga Codium isthmocladum, composto aqui denominado de CI. O presente trabalho buscou identificar atividades antitumorais desse polissacarídeo e explorar como estas são induzidas, empregando diferentes modelos de melanoma murino in vivo e in vitro. CI reduziu a progressão do tumor sólido induzido pela linhagem B16-F10, bem como diminuiu a formação de tumores primários nos pulmões de camundongos submetidos ao modelo de metástase experimental, sem causar efeitos colaterais detectáveis. A atividade antitumoral do polissacarídeo CI foi induzida por modulações das dinâmicas de invasão, glicosilação e adesão das células B16-F10, bem como por imunomodulação, aumentando a quantidade de monócitos/macrófagos no baço dos camundongos, estimulando um perfil próinflamatório nestas células caracterizado pela produção de MCP-1 e TNF e aumentando a capacidade de killing de células NK. Ao empregar outra linhagem altamente metastática - células de câncer de mama humano MDA-MB-231 - evidenciou-se novamente uma diminuição da progressão metastática in vivo, reforçando a característica promissora do composto aqui estudado. Os resultados descritos neste trabalho são relatos inéditos na literatura de uma homogalactana obtida de alga verde com atividade antitumoral em modelos de melanoma murino in vivo, aumentando desta forma o conhecimento da atividade de polissacarídeos de fontes naturais e revelando um composto promissor a ser farmacologicamente estudado. Palavras-chave: Câncer. Melanoma. Polissacarídeo. Metástase. Imunomodulação. Abstract: Since 1990, cancer has been one of the three biggest causes of death in the world population, with the expectation of more than 625 thousand new cases in 2020 in Brazil. Melanoma is the most aggressive type of skin cancer, and in advanced stages the treatments available are only palliative, not effective for all patients and generate several side effects. The use of compounds of natural origin for the treatment of different pathologies is widely described in the literature. A relevant group of these molecules are polysaccharides with medicinal activities, which are widely described in mushrooms, plants, animals, bacteria and algae. Among its diverse biological functionalities, antitumor activities are described through inhibition of tumor growth, inhibition of angiogenesis, induction of apoptosis, increased immunocompetence with related changes in immune cells subpopulations and decreased metastatic progression. Within our research group, studies with this type of compounds have already shown promising results, both in vitro and in vivo models. Among these stands out a sulfated homogalactan extracted from the algae Codium isthmocladum, a compound here denominated CI. The present work sought to identify antitumor activities of this polysaccharide and to explore how these effects are induced, using different in vivo and in vitro melanoma murine models. CI reduced B16-F10 solid tumor progression, as well as decreased the formation of primary tumors in the lungs of mice submitted to the experimental metastasis model, without causing detectable side effects. The antitumor activity of the polysaccharide CI was induced by modulations of invasion, glycosylation and adhesion dynamics of B16-F10 cells, as well as by immunomodulation, increasing the number of monocytes/macrophages in mice's spleen, stimulating a pro-inflammatory profile in these cells characterized by MCP-1 and TNF production and increasing NK cell killing capacity. When using another highly metastatic cell line - MDA-MB-231 human breast cancer - a decrease in metastatic progression in vivo was again observed, another promising activity of CI. The results described here are the first report in the literature of a homogalactan obtained from green algae with antitumor activity in murine melanoma models in vivo, thus increasing the knowledge of polysaccharide activity from natural sources and revealing a promising compound to be pharmacologically studied. Keywords: Cancer. Melanoma. Polysaccharide. Metastasis. Immunomodulation.

Orientador: Prof. Dr. Ciro Alberto de Oliveira Ribeiro Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 30/03/2016 Inclui referências: p. 75-80 Resumo: Nas últimas décadas o crescimento industrial vem gerando uma maior demanda na produção de novos polímeros. A grande maioria desses compostos possui origem petrogênica e são inflamáveis. Para atender a demanda de prevenção de incêndio prevista nas normas internacionais de segurança, os retardantes de chamas têm sido desenvolvidos para reduzir a possibilidade de combustão destes materiais. Dos 209 congêneres disponíveis em Éteres Difenilpolibromados, o Decabromodifenil Éter (BDE-209) foi o único que não foi banido da maioria dos países onde é produzido. Este composto é encontrado em diversos ambientes, inclusive os aquáticos em grandes concentrações associados à biota, podendo, portanto, devido às suas propriedades lipofílicas ser bioacumulado no tecido adiposo de vertebrados. O Tribromofenol (TBF) é um metabólito gerado a partir dos Éteres Difenilpolibromados que também é utilizado como pesticida e retardantes de chama em madeira, no entanto, seus efeitos tóxicos são pouco conhecidos. Tendo em vista esse panorama, o objetivo desse trabalho foi avaliar a toxicidade do BDE-209 e TBF em Oreochromis niloticus com o uso de biomarcadores (histopatológicos e bioquímicos) após exposição oral. Foram montados três experimentos: (i) piloto, no qual foi testada duas doses de 5ng.g-1 administradas via oral a cada 5 dias, durante dez dias de experimento; (ii) agudo, no qual foram testadas doses de 0,5, 5 e 50 ng.g-1 com coletas a partir de 24, 48, 72 e 96 horas de exposição; (iii) subcrônica, onde foram utilizadas as mesmas doses do experimento agudo onde estas foram administradas com intervalo de 10 dias totalizando 10 doses. Foram utilizados quinze indivíduos por grupo experimental. Após a exposição os animais foram mortos pós-anestesia e coletadas amostras de fígado (histopatologia e bioquímica) e músculo, e o cérebro (neurotoxicidade). Os resultados não detectaram diferença significativa nos índices morfométricos em todos os experimentos. Nas análises bioquímicas, não foi observado alterações bioquímicas entre os grupos do experimento piloto, enquanto que no experimento agudo foi verificado diferenças na atividade da GST e danos a macromoléculas, assim como no experimento subcrônico. Nas análises histopatológicas, foi observado diferença no índice de lesão apenas no experimento agudo. Apesar disso, algumas lesões no fígado em todos os experimentos foram descritas bem como danos ultraestruturais em hepatócitos em indivíduos do experimento subcrônico. O BDE mostrou-se neurotóxico na análise da atividade da acetilcolinesterase em ambos, experimento agudo e subcrônico. Os resultados indicam ainda alteração do sistema antioxidante nos ensaios agudos e subcrônica de ambos os compostos testados, sendo mais acentuada uma ativação do mecanismo no ensaio subcrônica Estes dados dão suporte aos resultados das análises histopatológicas e ultraestruturais, uma vez que foram descritos danos tanto pela microscopia de luz como eletrônica de transmissão. A perturbação observada na atividade da enzima acetilcolinesterase não é suficiente para uma avaliação neurotóxica definitiva, mais estudos são necessários. Esse trabalho utilizou um desenho experimental ainda inédito com peixes e os resultados acrescentam dados à literatura quanto aos efeitos relacionado com a exposição, e indicam fortemente a necessidade de rever as políticas de uso dos retardantes de chamas como os testados neste trabalho. Palavras chave: Decabromodifenil Éter; Tribromofenol; Oreochromis niloticus; biomarcadores, efeito agudo, efeito subcrônica; exposição trófica. Abstract: In last decades, the industrial growth has generated an increased demand in the production of new polymers. Most of these compounds have petrogenic origin and are flammable. To attend the demand for fire prevention provided for in international safety standards the flame-retardants have been developed to reduce the possibility of combustion these materials. Of the 209 congeners available Ethers Difenilpolibrominated the Decabromodiphenyl ether (BDE-209) was the only one who has not been banned in most countries where it is produced. This compound is found in many environments including water in large concentrations associated with the biota, and may be, due to their lipophilic properties, bioaccumulation be in adipose tissue in vertebrates. The tribromophenol (TBF) is a metabolite generated from ethers diphenylpolibrominated that is also used as a pesticide and flame-retardants for wood, however, their toxic effects are notfully understood. Due this situation, the aim this study is to evaluate the toxicity of BDE-209 and TBF animal species of fish Oreochromis niloticusthrough biomarkers (histopathological and biochemical) after oral exposure. Three experiments were set up, in which a pilot was tested two doses of 5 ng / g administered every 5 days, ten days of experiment. An acute at doses of 0.5, 5 and 50 ng / g with sampling every 24, 48, 72 and 96 hours. And finally a sub-chronic, using doses of 0.5, 5 and 50 ng / g every 10 days for 10 contaminations. Animals were sacrificed after anesthesia and liver collected (histopathology and biochemical), brain and muscle (cholinesterase). No significant differences were detected in the morphometric indices in all experiments. In the biochemical analysis was not observed biochemical changes in the pilot experiment, however, it was observed differences in GST activity in the acute experiment and damage to macromolecules, as well as sub-chronic experiment. In the histopathological analysis, a difference in injury rates only in the acute experiment was observed. Nevertheless, lesions were observed in liver in all experiments, and ultrastructuralliver damage listed in the sub-chronic experiment. In the analysis of acetylcholinesterase activity, there was a statistical difference for the BDE in acute and sub-chronic experiment. As the results can be seen a difference in the antioxidant system behavior in acute and sub-chronic tests. In experiment sub chronic note a marked oxidative stress in both pollutants, confirming that the histopathologic analysis, one time were found damage seen in both light microscopy, as in transmission. In the nervous system, have a disturbance in the enzyme acetylcholinesterase activity, but more parameters need to be evaluated to confirm a possible neurotoxicity. This study has unprecedented experimental design and shows the need to review the use of flame-retardants policies, adding the data in the literature about damage that these products can cause. Key words: Decabromodiphenyl ether; Tribromophenol; Oreochromis niloticus: biomarkers, acute effects; sub-chronic effects, trophic exposure.

Orientador: Hernandes Faustino de Carvalho Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os genes da alfa (HBA) e beta-globina (HBB) estão organizados em clusters situados em diferentes cromossomos e eles são comumente estudados em células eritróides, onde sua expressão é estequiométrica e a regulação gênica é finamente regulada. Na literatura há descrição de expressão de hemoglobinas em diversos outros tecidos, sendo que alguns desses trabalhos esbarram na questão da regulação gênica ou da funcionalidade das proteínas. Trabalhos anteriores de nosso laboratório identificaram a expressão de hemoglobinas na próstata ventral de roedores adultos castrados ou submetidos à dieta normolipídica baseada em banha de porco. Além disso, dados da literatura demonstraram atividade do promotor proximal da HBG humana em células p63+ da próstata de ratos e em algumas linhagens humanas de próstata. A partir desses dados, foi de nosso interesse estudar em quais condições os genes das hemoglobinas são expressos na próstata e verificar se sua regulação gênica é similar àquela encontrada em células eritróides. E, como a expressão de hemoglobinas parece estar correlacionada com um estado de indiferenciação de células epiteliais, também decidimos verificar se há correlação entre a expressão desses genes e a progressão tumoral de próstata. Para isso, caracterizamos a expressão de hemoglobinas e a localização subcelular das proteínas em linhagens celulares de próstata humana normais ou tumorais, cultivadas em 2D ou 3D, e tratadas com andrógenos. Também utilizamos a próstata de camundongos submetidos a diferentes estímulos androgênicos, obtidos através de castração e/ou reposição hormonal, e de animais idosos. Concluímos que células epiteliais normais da próstata apresentam maior expressão de hemoglobinas do que as células tumorais e que a sinalização de diidrotestosterona (DHT) não altera a expressão de hemoglobinas in vitro ou in vivo. A linhagem RWPE1 apresenta expressão basal de HBA2, HBA1 (cluster alfa) e HBE (cluster beta). Há aumento da expressão de HBA com o cultivo tridimensional dessa linhagem, acompanhado de alteração na localização subcelular da proteína correspondente em algumas células. As hemoglobinas embriônicas são as únicas do cluster ? expressas, tanto in vivo (Hbb-by na próstata de camundongos idosos) como in vitro (mRNA e proteína da HBE em RWPE1). A expressão de hemoglobinas na próstata não é regulada de maneira similar à de eritrócitos. As flutuações de expressão encontradas na linhagem RWPE1 também não são explicadas por fatores intrínsecos do tecido prostático (estímulo por DHT ou expressão de p63) nem por outros mecanismos (sinalização da matriz extracelular ou hipóxia), embora o gene HBA tenha expressão aumentada no cultivo 3D. Abstract: HBA and HBB genes cluster in different chromosomes. They are commonly expressed in cells from the erythroid compartment in a stoichiometric manner. Thus, their expression in this compartment is tightly regulated by a series of widely known factors. Nevertheless, there are several papers reporting haemoglobin expression in other tissues, some of them pointing to the gene regulation behind the expression and/or haemoglobin functionality in these foreign tissues. Interestingly, previous studies from our laboratory have found haemoglobin expression in rodent prostate cells: in castrated rats and in mice fed with normolipidic diets based on pork fat (lard). Additionally, published articles have described activity of the human HBG promoter in mice p63+ prostate cells and in human prostate cell lines. Thus, we intended to study the conditions in which haemoglobins are expressed in the prostate, as well as whether the gene regulation mechanisms are similar to that found in erythroid cells. Because haemoglobin expression in the prostate seems correlated with an undifferentiated state of the epithelial cells, we have also studied a possible link between haemoglobin expression and tumour progression. Therefore, we have characterized haemoglobin expression and subcelular localization in normal and tumour human epithelial prostate cell lines cultured bi- and three-dimensionally, and treated with androgens. We have also studied the effect of different concentrations of androgens in mice prostate, using castration and/or hormonal readministration, as well as the effects of aging, on haemoglobin expression. We concluded that normal epithelial prostate cell lines have higher haemoglobin expression when compared to tumour cells, and that dihydrotestosterone (DHT) signalling does not alter haemoglobin expression in vitro or in vivo. RWPE1 cell line expresses HBA2, HBA1 (alpha cluster) and HBE (beta cluster), and expression of HBA increases when cells are tridimensionally cultured. Moreover, HBA subcelular localization changes in some of the spheroid’s cells. Embryonic haemoglobins are the only ones from the ? cluster that are expressed, both in vivo (Hbb-by in aged mice prostate) and in vitro (HBE in RWPE1 cell line). Haemoglobin expression in prostate cells is not regulated in the same manner as in erythrocytes. Changes in haemoglobin expression found in the RWPE1 cell line also cannot be explained by DHT stimuli or p63 expression, which are specific features of prostate cells, nor by other mechanisms, such as extracellular matrix signalling or hypoxia, even though HBA is found overexpressed in the three-dimensional culture. Doutorado Biologia Celular Doutora em Biologia Celular e Estrutural FAPESP 2016/06543-4

Orientador: Prof. Dr. Silvio Marques Zanata Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 20/03/2020 Inclui referências: p. 113-121 Resumo: ADAM (A Disintegrin and Metalloprotease) é uma família de proteínas transmembranas envolvidas em funções biológicas tais como: liberação de fatores de crescimento e citocinas, desenvolvimento da musculatura e fertilização. No sistema nervoso as ADAMs parecem ter papéis importantes no desenvolvimento, regulando proliferação, migração, diferenciação e sobrevivência de vários tipos celulares, bem como a regulação do crescimento axonal e mielinização. Para estudar a internalização de ADAM23, foi utilizado um ensaio de biotinilação de proteínas de superfície celular de neuroblastomas transientemente transfectados com ADAM23. Foi observado que ADAM23 foi constitutivamente internalizada e esteve relativamente estável em quantidade na membrana plasmática por 72h após o início da internalização. Após o início da internalização, ADAM23 co-localizou com ambos endossomos precoce e de reciclagem, parecendo ser rapidamente transportada de volta para a membrana pela via do Rab4 ou mais lentamente pela via do Rab11. A partir do ensaio com a marcação com anti-ADAM23, a ADAM23 pareceu ser rapidamente (menos de 1 h) e continuamente reciclada, considerando a rápida reciclagem vista através de Rab4. A reciclagem de ADAM23 através de ambos os endossomos de reciclagem rápida (Rab4) e lenta (Rab11) pode ter a ver com duração e estabilidade da quantidade de proteína ADAM23 na superfície celular. Além disso, foi vista co-localização da ADAM23 com endossomo precoce (EEA1) e com endossomo intermediário (Rab5). Foi observada também co-localização da ADAM23 com fagossomo Rab7 o pré-cursor da via lisossomal. Considerando o papel da ADAM23 no câncer e em doenças neurológicas como epilepsia, o potencial da sua atividade na membrana plasmática, especialmente interagindo com integrinas, LGIs e PrPc, sua localização na superfície celular, sua internalização e reciclagem provavelmente são mecanismos bem controlados. A regulação da expressão de ADAM23 na membrana, o processo de endocitose e a reciclagem da ADAM23 podem estar relacionados à severidade dessas condições clínicas e ser potenciais alvos terapêuticos. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo a descrição da via de internalização da ADAM23 e seu tráfego intracelular. Palavras-chave: ADAM23. Desintegrina metaloprotease. Endocitose. Internalização. Endossomo. Reciclagem. Degradação. Estabilidade. Abstract: ADAM (A Disintegrin and Metalloprotease) is a family of transmembrane proteins involved in a variety of biological functions such as: growth factors and cytokines secretion, muscular tissue development and fertilization. In nervous system, many ADAMs seem to have important roles during development, regulating proliferation, migration, differentiation and survival of various cell types, in addition to axonal growth and mielinization regulation. In order to study ADAM23 internalization, it was performed a biotynilation assay of plasma membrane proteins in transiently ADAM23 transfected neuroblastomas. It was observed that ADAM23 was constitutively internalized and that this protein quantity was relatively stable in plasma membrane 72h after the beginning of internalization. After the initiation of internalization, ADAM23 co-localized with both early and recycling endosomes, suggesting that ADAM23 might be quickly transported back to plasma membrana through Rab4 endosome or more slowly through endosome Rab11 pathway. Through anti-ADAM23 labeling assay, ADAM23 seemed to be rapidly (less than 1 hour) and continuously recycled, considering its co-localization with Rab4. ADAM23 recycling through rapid (Rab4) and slow (Rab11) recycling pathways might be related to ADAM23 duration and stability at cell surface. In addition, it was observed ADAM23 colocalization with early endosome (EEA1) and with intermediate endosome (Rab5). Interestingly, it was also seen ADAM23 colocalization with Rab7 phagosome, the lysosomal pathway precursor. Regarding ADAM23 role in cancer and in neurological diseases such as epilepsy, its potential of activity in plasma membrane, specially interacting with integrins, LGIs and PrPc, its location at cell surface, its internalization and recycling are probably wellcontrolled mechanisms. The regulation of ADAM23 expression at plasma membrane, the endocytosis process and recycling of ADAM23 might be related to clinical severity and be potential therapeutic targets. In this matter, the present work had as an objective the description of the internalization pathway and intracellular traffic of ADAM23. Keywords: ADAM23. Disintegrin Metalloprotease. Endocytosis. Internalization. Endosome. Recycling. Degradation.

255 p. El análisis de una genoteca de Streptomyces clavuligerus, previamente construida, empleando una sonda homóloga al gen hlmA (acetiltransferasa) permitió localizar la agrupación génica de holomicina y, posteriormente, aislar la agrupación de biosíntesis de holomicina completa que consta de 13 marcos de lectura (genes). Los experimentos de transcriptómica realizados en este trabajo demostraron que los genes hlm fueron claramente sobre expresados en las cepas productoras de holmicina en comparación con la cepa silvestre S. clavuligerus ATCC 27064.

260 p. El espermatozoide ha pasado de ser considerado un mero portador de la información genética, que empezaría a expresarse en etapas relativamente avanzadas del desarrollo embrionario (transición materna-zigótica), a demostrarse como un protagonista esencial en el desarrollo futuro del embrión, al contener una serie de elementos epigenéticos cruciales para el éxito de la fecundación y el desarrollo temprano. En concreto, el conjunto de proteínas nucleares básicas espermáticas y sus modificaciones postraduccionales, la metilación del ADN, la presencia de ARNs codificantes y no codificantes y la presencia de proteínas de la matriz nuclear constituyen parte de la información epigenética contenida en el espermatozoide, que es transmitida al zigoto durante la fecundación. Tanto la información genética como la epigenética del espermatozoide son sensibles a la agresión de diferentes agentes externos. En particular, no solo es vulnerable el espermatozoide tras la eyaculación, sino que el propio proceso de espermatogénesis constituye una ventana de susceptibilidad genética y epigenética a tener en cuenta. Cualquier alteración que se produzca durante el proceso de formación del espermatozoide maduro puede afectar de diversas formas a las células de la línea germinal, lo que puede alterar la información recibida por el embrión en el momento de la fecundación e incluso transmitirse entre generaciones por vía paterna. Teniendo en cuenta la organización de la cromatina espermática, podrían existir áreas específicas del núcleo del espermatozoide menos protegidas frente al daño genético. Por ello, en el Primer Capítulo de esta Tesis Doctoral se abordó el estudio de la relación entre la susceptibilidad al daño genético y la asociación de la cromatina espermática con diferentes proteínas nucleares. Para ello, se emplearon dos especies de vertebrados como modelo de estudio: trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) y pez cebra (Danio rerio), cuya cromatina espermática presenta un único tipo de proteína nuclear básica: protaminas en trucha e histonas en pez cebra Las muestras seminales fueron sometidas a diferentes tratamientos genotóxicos (irradiación UV, estrés oxidativo generado por H2O2 y criopreservación) y se valoró el daño genético a nivel global – mediante ensayo TUNEL – y a nivel específico en genes concretos localizados en regiones con diferente accesibilidad a la maquinaria de transcripción – mediante una evaluación por qPCR. Además, se determinó la localización en el núcleo espermático de la lesión oxidativa 8-OHdG tras los tratamientos, así como, su posible colocalización con proteínas nucleares mediante inmunocitoquímica. En los dos modelos empleados, la irradiación UV ocasionó el mayor nivel de daño en el ADN y en genes específicos y la lesión oxidativa se distribuyó de manera uniforme por el núcleo espermático. El peróxido de hidrógeno provocó una regionalización de la lesión oxidativa, restringiéndose a la periferia nuclear. Además, no se observó una colocalización total de la lesión oxidativa con las proteínas nucleares estudiadas. Estos resultados nos permitieron concluir que las diferencias de sensibilidad genética observadas no dependen de la presencia de proteínas nucleares básicas. En concreto, la accesibilidad de cada agente genotóxico al núcleo podría ser el mayor responsable en la distribución del daño del ADN espermático. A pesar de que los genes analizados no han podido establecerse como biomarcadores de daño genético global, estos estudios representan un punto de partida para el abordaje de nuevos posibles candidatos y permiten desarrollar técnicas más precisas en la detección del daño. Los resultados de este capítulo constituyen los dos primeros artículos derivados de esta Tesis Doctoral, uno de ellos publicado en la revista PLOS ONE y el otro bajo revisión en la revista Theriogenology. Así mismo, forman parte de un artículo de revisión publicado en la revista Aquaculture (ver ANEXO). El Segundo Capítulo de esta Tesis Doctoral se centra en el papel que puede tener la arquitectura nuclear en la distribución del daño genético en el gameto masculino de mamíferos. Para ello, se evaluó el efecto de los agentes genotóxicos analizados en el primer capítulo sobre muestras seminales humanas. El espermatozoide humano no presenta un solo tipo de proteína nuclear básica, sino que su cromatina se configura en tres dominios principales: ADN unido a histonas (HDNA), ADN unido a protaminas (PDNA) y ADN asociado a proteínas de la matriz nuclear. Las regiones HDNA (nucleosomales) y asociadas a proteínas de la matriz son consideradas las más sensibles a sufrir daño en mamíferos. De nuevo, usando una estrategia similar a la descrita unas líneas más arriba, observamos que la irradiación UV generó el mayor nivel de daño, tanto a nivel global como en genes específicos. El H2O2, además de promover un nivel de daño diferencial entre los genes analizados, provocó la localización de la lesión oxidativa en una región ecuatorial y subacrosómica del espermatozoide. Así mismo, la localización del daño oxidativo no coincidió ni con la de la histona H3 ni con la de una proteína de matriz nuclear, descartando, por tanto, la mayor sensibilidad al daño oxidativo asociada a la presencia de proteínas nucleares básicas o de la matriz nuclear del espermatozoide. La lesión oxidativa se distribuyó siguiendo el mismo patrón que una enzima antioxidante, concluyendo que las características propias de la cabeza del espermatozoide facilitan el acceso de los agentes genotóxicos a los territorios nucleares, promoviendo un nivel de daño diferencial entre ellos. Este estudio cuestiona una de las afirmaciones aceptadas en mamíferos en relación a la mayor sensibilidad a sufrir daño y descarta el uso de genes localizados en las regiones HDNA como biomarcadores de daño oxidativo del ADN. En la actualidad, los resultados de este capítulo se encuentran enviados para su publicación a la revista Asian Journal of Andrology. Dadas las repercusiones que puede tener la alteración de la línea germinal durante la espermatogénesis, en el Tercer Capítulo de esta Tesis Doctoral se exploró el efecto de un disruptor endocrino, ampliamente extendido en el medio ambiente, sobre machos de pez cebra. En particular, se evaluó el efecto genético y epigenético del bisfenol A, usado de manera extensa en la producción de policarbonatos y resinas epoxi, sobre la espermatogénesis, centrando el foco de estudio en las posibles alteraciones de la información epigenética que será aportada al embrión en el momento de la fecundación. Para ello, se expusieron machos adultos de pez cebra durante todo el proceso de espermatogénesis a dosis de bisfenol A ambientalmente relevantes. Los resultados revelaron un descenso del número de espermatocitos, así como, un incremento de la apoptosis en testículo tras la exposición al tóxico. Así mismo, el bisfenol A incrementó la expresión del receptor de estrógenos gper1 y disminuyó la expresión de ccnb1 y sycp3 en testículo, lo que puede representar una alteración de la espermatogénesis y del proceso meiótico. El bisfenol A provocó un incremento de la actividad de las enzimas acetiltransferasas de histonas, así como, una hiperacetilación de histonas e hipermetilación de ADN. Estos resultados nos han permitido hipotetizar que el receptor GPER puede estar mediando los efectos promovidos por el BPA. Además, la exposición a bisfenol A causó un incremento de la fragmentación de la cromatina, una alteración del patrón epigenético y una modificación de los transcritos en los espermatozoides de los machos expuestos, lo que podría desequilibrar la información epigenética recibida por el embrión. Este es el primer estudio que revela un incremento de la acetilación de histonas en células testiculares tras la exposición a bisfenol A y su mantenimiento en las células espermáticas. Así mismo, ha puesto de manifiesto que dosis de bisfenol A, consideradas seguras en el agua de consumo hasta hace relativamente poco, son capaces de modificar el patrón epigenético espermático, lo que puede comprometer el desarrollo de la progenie futura. En la actualidad, estos resultados se encuentran enviados a la revista Environmental International para su revisión.

170 p., XXIII Los objetivos de esta tesis fueron: 1. Desarrollar un modelo de diferenciación endotelial en las células troncales embrionarias murinas E14Tg2¿, realizando un análisis comparativo de varios métodos de diferenciación 2. Determinar la función del gen TP73 en diferenciación endotelial, vasculogénesis y angiogénesis in vitro. 2.1. Analizar el efecto de la inhibición funcional de p73 en la diferenciación endotelial y morfogénesis vascular de las células troncales embrionarias murinas E14Tg2¿. 2.2. Analizar el efecto de la falta de p73 en la biología de las células endoteliales humanas de vena umbilical (HUVEC) 3. Identificar la función de p73 en la vasculogénesis y angiogénesis in vivo. 3.1. Evaluación del efecto de la falta de p73 en el desarrollo de la vasculatura de los embriones knockout Trp73. 3.2. Análisis de la vasculatura de la retina en los ratones knockout Trp73

163 p. La Polaridad Cellular Planar (PCP) describe la orientación coordinada de las células en el plano del tejido y es una característica fundamental de los tejidos epiteliales. En las células multiciliadas, la orientación individual y coordinada de los cilios es esencial para el correcto funcionamiento de las mismas. En el cerebro del ratón, donde los ventrículos están tapizados por células multiciliadas denominadas células ependimarias, los fallos en la formación de los cilios y/o en el establecimiento de la PCP da lugar a una pérdida de función de los cilios e hidrocefalia. Las células ependimarias presentan dos tipos de polaridad, la polaridad translacional (tPCP) y la polaridad rotacional (rPCP), que son fundamentales para el movimiento coordinado de los cilios. Ambas se establecen durante el periodo perinatal, cuando las células de la glía radial (RGCs) monociliadas se transforman en células ependimarias multiciliadas (ECs). La regulación de la tPCP en células ependimarias es llevado a cabo, al menos en parte, por la activación de la miosina no muscular II (NMII), una proteína de unión a actina que es esencial para el control de la adhesión celular y la arquitectura tisular. La activación de NMII mediante la kinasa MLCK (myosin light chain kinase) es esencial para el establecimiento de la polaridad translacional en las células ependimarias. La regulación de la rPCP se lleva a cabo mediante la localización asimétrica de las proteínas pertenecientes a la vía de señalización PCP, que se mueven de manera diferencial dentro de la célula para establecer asimetrías moleculares. Esta asimetría se traducirá en cambios en el citoesqueleteto celular que orientará los cilios para su movimiento coordinado. El factor de transcripción p73, que pertenece a la familia de factores de transcripción p53, es un importante regulador del desarrollo del Sistema Nervioso Central y es necesario para el establecimiento de la arquitectura del nicho neurogénico que se localiza en la pared lateral de los ventrículos. En esta tesis doctoral se ha llevado a cabo el estudio del papel de p73 en el desarrollo de las células ependimarias, la formación de los cilios y su organización en la membrana apical.

Orientador : Profª. Drª. Olga Meiri Chaim Coorientador : Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 15/03/2016 Inclui referências : f. 93-113 Área de concentração Resumo: As aranhas-marrons são aracnídeos peçonhentos que pertencem ao gênero Loxosceles. No Estado do Paraná, a espécie Loxosceles intermedia é a mais frequente e, devido ao grande número de acidentes que causa, possui importância médica. O veneno dessas aranhas é uma mistura cristalina de proteínas e peptídeos de baixa massa molecular (5-40 kDa), sendo que as enzimas são as mais estudadas, tais como as fosfolipases-D, metaloproteases e hialuronidases. O transcriptoma da glândula de veneno confirmou a existência de diferentes classes de toxinas e revelou a predominância de transcritos para diversas toxinas potencialmente inseticidas (56%) pertencentes a família das notinas, as quais foram pouco estudadas até o momento. Peptídeos inseticidas já foram descritos para o veneno de L. intermedia onde três peptídeos, LiTx 1, LiTx 2 e LiTx 3, foram purificados do veneno e mostraram atividade inseticida sobre larvas de mariposa, Spodoptera frugiperda. O presente trabalho visou o estudo de toxinas inseticidas da família das notinas presentes no veneno de L. intermedia. A toxina do tipo notina que foi foco inicial do trabalho, apresenta 52% de identidade aminoacídica com uma toxina inibidora de canal de sódio de insetos encontrada na aranha Macrothele gigas. A partir da biblioteca de cDNA do transcriptoma, a U2-SCRTX-Lit2, foi clonada e expressa heterologamente em Escherichia coli e Pichia pastoris. Mesmo a toxina sendo expressa em condições solúveis ela não apresentou atividade biológica quando testada. Foram também expressas em E. coli e testadas outras três toxinas (U2-SCRTX-Lit1b, U1-SCRTX-Lit1a e U1-SCRTX-Lit1b) potencialmente inseticidas presentes no veneno de L. intermedia, essas foram purificadas e tiveram sua atividade biológica testada em moscas. Todas as três toxinas apresentaram atividade inseticida e baixa atividade sobre canais iônicos de mamíferos. Também foi possível determinar a estrutura da U2-SCRTX-Lit1b por RMN, onde obteve-se a primeira estrutura resolvida de toxina da família ICK com cinco pontes dissulfeto. Os dados gerados reforçam a ideia de aplicação biotecnológica de toxinas de aranha. A caracterização de toxinas inseticidas presentes no veneno de L. intermedia contribui com a expansão do conhecimento sobre o veneno de aranha marrom e além disso com a ideia de desenvolver um agente bioinseticida, que pode apresentar baixa toxicidade para mamíferos. Abstract: Brown spiders are venomous animals which belong to Loxosceles genus. At Paraná state, Loxosceles intermedia is the most abundant specie, and it is medically important due to great number of envenomation it causes. L. intermedia venom is a cristal clear mixture of proteins and peptides of low molecular weight (5-40 kDa), and the most studied ones are the enzimes, as phospholipases-D, metalloprateases and hyaluronidases. The venom gland transcriptome confirmed the existence of several toxins classes where the predominant transcripts were for potentially insecticidal toxins (56%) belonging to knottin family, under studied up to date. Insecticidal peptides already were described for L. intermedia venom where three peptides, LiTx 1, LiTx 2 and LiTx 3, were purified from whole venom and show insecticidal activity against moth larvae (Spodoptera litutra). Our aim was the insecticidal toxins from knottin family from L. intermedia venom. A knottin toxin was the first subject of our work, it has 52% of amino acidic identity with a sodium channel inhibitor toxin from Macrothele gigas spider. From a cDNA library the U2-SCRTX-Lit2 were cloned and recombinant expressed in Escherichia coli and Pichia pastoris. We were able to express it in a soluble way, but the toxin didn't show biological activity when tested. We also express in E. coli and test three other insecticidal toxins (U2-SCRTX-Lit1b, U1-SCRTX-Lit1a e U1-SCRTX-Lit1b) from L. intermedia venom, with activity over sheep blowflies. All three toxins are insecticidal and has low activity over mammal ion channels. We also were able to solve the molecular structure of U2-SCRTX-Lit1b by NMR spectroscopy, and it's the first structure with five disulphide bonds from knottin family solved. The data reinforce the biotechnological application for spider toxins. The characterization of insecticidal toxins from L. intermedia venom contributes to increase the knowledge about brown spider venom and with the aim of develop a new bioinsecticide agent that can have low toxicity for mammals.

Orientador: Prof. Dr. Alejandro Correa Dominguez Coorientador: Prof. Dr. Marco Augusto Stimamiglio Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 21/10/2019 Inclui referências: p. 106-119 Resumo: Doenças de válvula cardíaca (DCV) ou valvopatias são termos utilizados para designar tipos diferentes de problemas que podem afetar a funcionalidade de qualquer uma das quatro válvulas do coração. A principal forma de tratamento para portadores de DVC é a cirurgia de substituição valvar, um procedimento no qual são aplicados substitutos valvares como as próteses biológicas. A descelularização, técnica para remoção do conteúdo celular tecidual e retenção da estrutura da matriz extracelular (MEC), é uma das estratégias para o desenvolvimento de próteses viáveis, não imunogênicas e funcionais. Neste trabalho, válvulas cardíacas pulmonares porcinas foram descelularizadas utilizando uma solução de 0,1% SDS e 0,02% EDTA (grupo VPD-S) ou através da utilização desta mesma solução seguida de exposição à solução hipertônica e incubação com 20 U/mL de Benzonase (grupo VPD-B). Após os tratamentos, a eficiência de descelularização de cada protocolo foi avaliada por meio da extração e quantificação de DNA residual dos tecidos. Além disso, a MEC valvar foi caracterizada e avaliada quanto ao seu potencial citotóxico, imunogênico e de biocompatibilidade com células humanas. Posteriormente, vesículas extracelulares derivadas de explante cardíaco (hH-EVs) foram caracterizadas fisicamente, tiveram seu conteúdo proteico analisado por espectrometria de massa (MS) e foram avaliadas quanto (1) a sua capacidade de influenciar a adesão, migração, proliferação e angiogênese de células endoteliais (HUVEC) e de células-tronco mesenquimais (CTMs); e (2) de favorecer a recelularização de válvulas descelularizadas. Nossos resultados mostraram que os enxertos do grupo VPD-S apresentaram aproximadamente 40% menos DNA no conduto e no músculo valvar, e não alteraram a quantidade de DNA das cúspides em comparação ao controle nativo, ao passo que nos enxertos do grupo VPD-B a remoção do DNA das válvulas foi superior a 93%. Entretanto, nesse último grupo, maiores alterações na MEC valvar foram verificadas. Nenhum dos enxertos foi citotóxico ou capaz de induzir a proliferação de células imunes in vitro. Em ensaios de biocompatibilidade in vitro, tecidos VPD-S co-cultivados com CTMs apresentaram recelularização significativamente maior que VPD-B após 7 e 15 dias. Entretanto, a recelularização com células intersticiais de válvula cardíaca (VIC) foi semelhante em ambos os grupos. Quanto às hH-EVs, a análise por MS identificou um total de 1248 proteínas e a análise de ontologia gênica (GO) revelou proteínas envolvidas em processos como, regulação da morte celular e a resposta à cicatrização. Além disso, hH-EVs foram capazes de estimular a migração e diminuir a adesão de CTMs, além de induzir a proliferação e a angiogênese in vitro de HUVEC. Quando testadas em modelo de co-cultivo, as hH-EVs aumentaram significativamente a recelularização de válvulas descelularizadas com CTMs após 3 e 7 dias. Em resumo, esse conjunto de dados demonstra que os protocolos de descelularização resultaram em próteses valvares não tóxicas, com quantidades reduzidas de DNA e receptivas a recelularização com células humanas. Além disso, os dados obtidos confirmam que as hH-EVs são capazes de modular processos celulares e são úteis para aplicação em engenharia de tecidos. Palavras-chave: Válvula cardíaca 1. Descelularização 2. Vesículas extracelulares 3. Abstract: Heart valve diseases (HVD) comprise different types of problems that may affect the functionality of the heart valves. The main treatment for patients with HDV is valve replacement surgery, a procedure in which valve substitutes, such as biological prostheses, are applied. Decellularization, a technique for removing cell content from a tissue while maintain the extracellular matrix (ECM) structure, is one of the strategies for the development of viable, non-immunogenic and functional prostheses. In this work, porcine pulmonary heart valves were decellularized using a 0.1% SDS and 0.02% EDTA solution (VPD-S group) or using the same solution followed by exposure to hypertonic solution and incubation with 20 U/mL of Benzonase (VPD-B group). After the treatments, the decellularization efficiency of each protocol was evaluated by DNA extraction and quantification. The decellularized ECMs were characterized and analyzed to determine their cytotoxicity, immunogenicity and biocompatibility with human cells. Subsequently, heart explantderived extracellular vesicles (hH-EVs) were physically characterized and the protein content in these particles was evaluated by mass spectrometry (MS). The potential of hH-EVs to (1) induce proliferation, adhesion, angiogenesis and wound healing in mesenchymal stem-cells (MSC) and endothelial cells (HUVEC), as well as, the potential to (2) improve the recellularization of decellularized valves was investigated in vitro. Our results showed that the VPD-S group grafts presented 40% less DNA in conduit and muscle of valve in comparison to the native control. On the other hand, the procedure used in VPD-B group led to DNA reduction greater than 93%. However, in VPD-B valves major changes in ECM structure were observed. Also, both grafts produced were non-cytotoxic and were unable to induce proliferation of immune cells in vitro. In vitro biocompatibility assays showed that VPD-S tissues cocultured with MSCs presented significantly greater recellularization than VPD-B after 7 and 15 days. However, recellularization with valve interstitial cells (VIC) was similar between groups. For hH-EVs, MS analysis identified a total of 1248 proteins and the gene ontology (GO) analysis revealed proteins involved in processes such as cell death regulation and wound healing response. In addition, hH-EVs were able to induce proliferation and angiogenesis in HUVEC, improve wound healing and reduce MSC adhesion. Last, we showed that hH-EVs were able to significantly promote MSC recellularization of decellularized valves after 3 and 7 days. In summary, our data demonstrates that decellularization protocols generated porcine valve prostheses with reduced amounts of DNA, non-cytotoxic and able to be recellularized with human cells. In addition, the data confirm the potential of hH-EVs to modulate cellular processes and for tissue engineering applying. Keywords: Heart valve 1. Decellularization 2. Extracellular vesicles 3.

Orientadora: Profa. Dra. Lucélia Donatti Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 23/08/2019 Inclui referências Resumo: Peixes antárticos são altamente adaptados a viver em ambientes térmicamente frios e estáveis sendo, portanto, vulneráveis aos aumentos de temperatura relatados no oceano e continente Antártico. Diante de agentes estressores os organismos podem contar com sua plasticidade fenotípica que pode lhe conferir uma capacidade de aclimatação. Um dos fatores que influencia a resposta ao estresse é a magnitude do agente estressor que quanto menor, potencialmente possibilita maiores ajustes de plasticidade. O presente trabalho verificou o efeito da temperatura de aclimatação nos níveis de parâmetros enzimáticos e não enzimáticos dos metabolismos energético de carboidratos e oxidativo e de defesas antioxidantes nos tecidos renal, branquial, hepático e encefálico.Também analisou parametros plasmáticos e enzimas osmo-reguladoras em rim e branquias de Nothotenia rossii, submetidos à mudança gradual de temperatura de 0,5 ° C / dia, até que as temperaturas de 2, 4, 6 e 8 °C fossem atingidas. Quanto ao metabolismo de carboidratos sob o efeito da taxa de aclimatação de 0,5?C / dia o tecido branquial apresentou um aumento da atividade da fosfofrutoquinase (PFK) em todas as temperaturas experimentais e o renal da malato desidrogenase (MDH) (2°C), glucose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) (2°C) e glicogênio fosforilase (GP) (6°C). No fígado houve aumento na concentração de lactato (6°C) e, no encéfalo, aumento da atividade da GP (6°C). O metabolismo energético de carboidratos em N. rossii apresentou-se vulnerável à temperatura em interação com o tempo e, dentre os órgãos, o rim sofreu influencia isolada da temperatura. O metabolismo energético para mitigar o estresse térmico nessa espécie, nessas condições experimentais, possivelmente ativa as vias da glicólise, gliconeogênese e glicogenólise. Quanto aos níveis de parâmetros plasmáticos, osmorregulatórios e do metabolismo oxidativo e de defesas antioxidantes, em N. rossii, o tecido branquial apresentou aumento da atividade da glutationa-Stransferase (GST) (2°C) e o renal da H??-ATPase (2°C). No plasma houve diminuição da concentração de proteínas totais e globulinas em todas as temperaturas experimentais. No fígado houve aumento constante na concentração de MDA como indicativo de lipoperoxidação em todas as temperaturas experimentais e da glutationa reduzida (GSH) em 2°C, possivelmente relacionadas. Essas respostas podem ser em decorrência da alteração de pH ou ainda à uma prejudicada síntese protéica hepática. Nos órgão analisados de N. rossii o metabolismo oxidativo e de defesas antioxidantes não se apresentou vulnerável ao fator temperatura isoladamente à exceção do fígado provavelmtne por sua vulnerabilidade à lipoperoxidação. As alterações demonstram que o aumento gradual de temperatura pode causar respostas opostas ao modelo de choque térmico. Em ambos os metabolismos as respostas foram tecido específicas e indicam a presença de plasticidade térmica e tentativa de regulação para mitigar o estresse térmico em N. rossii. Palavras-chave: Peixes antárticos. Notothenidae. Temperatura. Aquecimento. Metabolismo. Biomarcadores. Abstract: Antarctic fish are highly adapted to live in thermally cold and stable environments and are therefore vulnerable to reported temperature increases in the Antarctic ocean and continent. Faced with stressors, organisms can count on their phenotypic plasticity that can give them a high capacity for acclimatization. One of the factors influencing stress response is the magnitude of the stressor which, the smaller, potentially enables greater plasticity adjustments. The present study verified the effect of the acclimatization temperature on the enzymatic and non-enzymatic parameter levels of carbohydrate and oxidative energy metabolism and antioxidant defenses in renal, gill, hepatic and encephalic tissues. and gills of Nothotenia rossii, subjected to a gradual temperature change of 0.5 ° C / day, until the temperatures of 2, 4, 6 and 8 ° C were reached. Regarding carbohydrate metabolism under the acclimatization rate of 0.5?C / day, the gill tissue presented increased phosphofrutokinase (PFK) activity at all experimental temperatures and renal malate dehydrogenase (MDH) (2 ° C), glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) (2 ° C) and glycogen phosphorylase (GP) (6 ° C). In the liver there was an increase in lactate concentration (6 ° C) and in the brain an increase in GP activity (6 ° C). The energy metabolism of carbohydrates in N. rossii was vulnerable to temperature in interaction with time and, among the organs, the kidney was isolated influence of temperature. Energy metabolism to mitigate heat stress in this species, under these experimental conditions, possibly activates the pathways of glycolysis, gluconeogenesis and glycogenolysis. Regarding the levels of plasma, osmoregulatory parameters and oxidative metabolism and antioxidant defenses, in N. rossii, the gill tissue presented increased glutathione-S-transferase (GST) activity (2 ° C) and renal H??- ATPase (2 ° C). In plasma there was a decrease in total protein and globulin concentration at all experimental temperatures. In the liver there was a steady increase in MDA concentration as indicative of lipoperoxidation at all experimental temperatures and reduced glutathione (GSH) at 2 ° C, possibly related. These responses may be due to pH change or impaired hepatic protein synthesis. In the N. rossii organs analyzed, oxidative metabolism and antioxidant defenses were not vulnerable to temperature alone, except for the liver probably due to its vulnerability to lipoperoxidation. The changes demonstrate that gradual temperature rise can cause opposite responses to the thermal shock model. In both metabolism the responses were tissue specific and indicate the presence of thermal plasticity and attempted regulation to mitigate heat stress in N. rossii. Keywords: Antarctic fish. Notothenidae. Temperature. Warming. Metabolism. Biomarkers.

Orientador: Dr. Bruno Dallagiovanna Coorientadora: Dra. Fabiola Barbieri Holetz Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 19/12/2019 Inclui referências Resumo: Nas células eucarióticas, os mRNAs podem estar compartimentalizados em ribonucleoproteínas mensageiras (mRNPs) que são classificadas em função da presença de proteínas específicas e do destino dos mRNAs nas células. Dentre essas estruturas estão os complexos de iniciação da tradução e os grânulos de mRNPs. Os complexos de iniciação da tradução são formados pelas proteínas eIFs (eukaryotic initiation factors) dos quais destaca-se o complexo eIF4F, formado por eIF4A, eIF4E e eIF4G. eIF4E interage diretamente com o cap do mRNA e presume-se que a formação de eIF4F é, em grande parte, regulada pela disponibilidade de eIF4E. Dentre os grânulos de mRNPs mais estudados estão os Processing bodies (P-bodies) e os grânulos de estresse (GE). De forma geral, os GE são definidos pela presença de alguns fatores de iniciação da tradução enquanto os P-bodies são definidos pela presença de componentes da maquinaria de degradação. Estudos em eucariotos têm revelado que os complexos de início de tradução podem interagir com os grânulos e trocar diferentes ribonucleoproteínas mensageiras. Esta interação sugere um ciclo citoplasmático dinâmico com o intercâmbio de mRNAs entre tradução, GE e P-bodies. Dessa forma, o presente trabalho teve por objetivo estudar a regulação da expressão gênica do Trypanosoma cruzi em nível pós-transcricional, iniciado o estudo dos seis homólogos do fator de iniciação da tradução EIF4E (EIF4E1-EIF4E6) de T. cruzi, buscando identificar os parceiros funcionais de cada fator. Paralelamente, caracterizamos os mRNAs totais no citoplasma, os mRNAs associados aos complexos ribonucleoproteicos que contém as proteínas TcXRNA e TcDHH1 e os mRNAs associados aos polissomos nas formas epimastigotas em crescimento exponencial e nas formas epimastigotas submetidas a estresse nutricional. Através deste trabalho foi possível verificar que o T. cruzi, assim como os demais tripanossomatídeos, apresenta uma grande multiplicidade de homólogos para os fatores de início de tradução que compõe o complexo eIF4F. A fim de identificar as interações que ocorrem entre estes fatores, realizamos ensaios de duplo-híbrido, imunoprecipitação e co-imunolocalização e identificamos três novas interações que ainda não foram relatadas em nenhum outro tripanossomatídeo, EIF4E3:PABP1, EIF4E3:PABP2 e EIF4E5:EIF4G5. Os fatores TcEIF4E5 e TcEIF4G5 co-localizam em parasitas epimastigotas, principalmente na periferia do núcleo. Além disso, reforçamos a ideia de que o controle da expressão gênica em tripanossomatídeos ocorre predominantemente em nível pós-transcricional, pois ao comparar o transcriptoma de epimastigotas e epimastigotas sob estresse nutricional não foram identificadas diferenças significativas na expressão de genes em nível de mRNA. Verificamos também que ocorre a redução da tradução quando o parasita é submetido ao estresse nutricional, indicando que o parasita pode modular a expressão de seus genes em nível traducional. O sequenciamento dos mRNAs associados a complexos contendo as proteínas TcXRNA e TcDHH1 mostrou que essas proteínas interagem com diferentes mRNAs, e que ambas as proteínas associam-se tanto à mRNAs que também estão presentes em complexos polissimais, quanto mRNAs que podem estar traducionalmente reprimidos. Dessa maneira, esses dados sugerem que essas proteínas possam participar de complexos ribonucleoproteicos distintos os quais são importantes para regulação da expressão gênica de T. cruzi. Os resultados obtidos neste trabalho, abrem novas perspectivas para o entendimento da função de cada complexo de início de tradução eIF4F-like no ciclo do mRNA em T. cruzi. Além disso, todos esses dados, reforçam a importância da regulação da expressão gênica em nível de tradução, e fornece novas evidências a respeito da dinâmica dos mRNAs e da disponibilidade dos EIF4Es neste organismo. Palavras-chaves: ciclo de mRNA; tradução; eIF4E; P-bodies; grânulos de estresse. Abstract: In eukaryotic cells, mRNAs can be compartmentalized into messenger ribonucleoproteins (mRNPs) that are classified according to the presence of specific proteins and the fate of mRNAs in cells. Among these structures are translation initiation complexes and mRNP granules. The translation initiation complexes are formed by the eIFs proteins (eukaryotic initiation factors) of which the eIF4F complex, formed by eIF4A, eIF4E and eIF4G stands out. eIF4E interacts directly with the mRNA cap and it is assumed that the formation of eIF4F is largely regulated by the availability of eIF4E. Among the most studied mRNP granules are Processing bodies (P-bodies) and stress granules (GE). In general, GE are defined by the presence of some translation initiation factors while P-bodies are defined by the presence of components of the degradation machinery. Studies in eukaryotes have revealed that translation initiation complexes can interact with granules and exchange different messenger ribonucleoproteins. This interaction suggests a dynamic cytoplasmic cycle with the exchange of mRNAs between translation, GE and P-bodies. Thus, the present study aimed to study the regulation of the gene expression of Trypanosoma cruzi at the post-transcriptional level, beginning the study of the six homologues of the translation initiation factor EIF4E (EIF4E1-EIF4E6) of T. cruzi, seeking to identify the functional partners of each factor. In parallel, we characterize the total mRNAs in the cytoplasm, the mRNAs associated with the ribonucleoprotein complexes that contain the TcXRNA and TcDHH1 proteins and the mRNAs associated with the polysomes in exponentially growing epimastigotes and epimastigote forms subjected to nutritional stress. Through this work it was possible to verify that T. cruzi, like the other trypanosomatids, has a large multiplicity of homologues for the translation initiation factors that make up the eIF4F complex. In order to identify the interactions that occur between these factors, we performed two-hybrid, immunoprecipitation and co-immunolocation assays and identified three new interactions that have not yet been reported in any other trypanosomatids, EIF4E3: PABP1, EIF4E3: PABP2 and EIF4E5: EIF4G5. The factors TcEIF4E5 and TcEIF4G5 co-localize in epimastigote parasites, mainly in the periphery of the nucleus. In addition, we reinforce the idea that the control of gene expression in trypanosomatids occurs predominantly at the post-transcriptional level, since when comparing the transcriptome of epimastigotes and epimastigotes under nutritional stress, no significant differences were found in the expression of genes at the mRNA level. We also found that there is a reduction in translation when the parasite is subjected to nutritional stress, indicating that the parasite can modulate the expression of its genes at the translational level. The sequencing of mRNAs associated with complexes containing the TcXRNA and TcDHH1 proteins showed that these proteins interact with different mRNAs, and that both proteins are associated with both mRNAs that are also present in polysimal complexes, and mRNAs that may be translationally repressed. Thus, these data suggest that these proteins may participate in different ribonucleoprotein complexes, which are important for the regulation of T. cruzi gene expression. The results obtained in this work open new perspectives for the understanding of the function of each complex of eIF4F-like translation initiation in the mRNA cycle in T. cruzi. In addition, all of these data reinforce the importance of regulating gene expression at the translation level, and provide new evidence regarding the dynamics of mRNAs and the availability of EIF4Es in this organism. Keywords: mRNA cycle; Translation; eIF4E; P-bodies; stress granules.

Orientadora : Cláudia Nunes dos Santos Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 2006 Inclui bibliografia

Orientador : Prof. Dr. Marco Antonio Ferreira Randi Co-orientador : Prof. Dr. Nicholas Simon Foulkes Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 26/02/2018 Inclui referências Resumo: Todos os seres vivos possuem um sistema marcador de tempo que é sincronizável com o ambiente onde vivem. À vista disso, uma estreita ligação entre o ritmo circadiano e processos fisiológicos relacionados à produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e de enzimas antioxidantes é relatada em diversos organismos. Por sua vez, o sulfato de cobre (CuSO4) é um composto conhecidamente pró-oxidante e amplamente utilizado em aquicultura como agente terapêutico em peixes. Ele é frequentemente utilizado em concentrações que chegam a ser de sete até cem vezes maiores do que as encontradas em ambientes com influência de atividades antrópicas. Apesar de muitos estudos terem demonstrado o potencial tóxico do sulfato de cobre em diversos organismos aquáticos, a investigação das consequências da exposição a esse metal, e consequente promoção de estresse oxidativo, no ritmo circadiano ainda não foi examinada. Nesta tese, foi avaliado o efeito e possíveis mecanismos moleculares envolvidos na resposta celular das defesas antioxidantes e de proteínas chaves envolvidas na marcação da ritmicidade circadiana em peixes Danio rerio e na linhagem celular derivada de embriões da mesma espécie (PAC-2) expostos ao CuSO4. No primeiro capítulo, estudos bioquímicos e de expressão gênica, juntamente com análises químicas indicaram que a exposição hídrica ao CuSO4 interferiu com a coordenação entre as enzimas SOD e CAT e perturbou a oscilação diária de proteínas de controle do relógio. Ainda, evidências concretas sobre a existência de ritmicidade na expressão e atividade de SOD e CAT foram encontradas. Estes resultados indicaram que a sincronização do organismo com o ambiente pode ser prejudicada devido à exposição aguda ao sulfato de cobre. Desta forma, o segundo capítulo foi conduzido de modo a explorar de maneira mais aprofundada as bases moleculares do cross-talk entre o cobre, as enzimas antioxidantes SOD e CAT e o relógio circadiano. Com a utilização de técnicas de clonagem molecular, transfecções e quantificação de expressão gênica, os resultados obtidos apoiam fortemente uma relação entre exposição aguda ao Cu, ativação da defesa antioxidante e distúrbios na expressão de genes envolvidos no controle do relógio circadiano através da ativação da via de sinalização da MAPK em células PAC-2. Além disso, também foi demonstrado que a transcrição da SOD pode ser regulada tanto em resposta ao estresse oxidativo como também associada ao relógio circadiano. De maneira geral, este estudo fornece as primeiras informações a respeito da interação toxicológica entre exposição ao Cu e desregulação do mecanismo de controle do relógio circadiano em organismos aquáticos. Palavras chave: zebrafish, sulfato de cobre, defesa antioxidante, ritmicidade circadiano Abstract: All living beings present a time-marking system that can synchronize with the environment where they live. A close link between the circadian rhythm and physiological processes related to the production of reactive oxygen species (ROS) and antioxidant enzymes is reported in several organisms. Copper sulfate (CuSO4), in turn, is a compound known as pro-oxidant and widely used in aquaculture as a therapeutic agent in fish. It is frequently applied in concentrations between seven to one hundred times greater than as found in environments with influence of anthropic activities. Although many studies have demonstrated the toxic potential of copper ions in various aquatic organisms, an investigation of the consequences of CuSO4 exposure, consequent promotion of oxidative stress, and the circadian rhythm has not yet been examined. In this thesis, we evaluated the effect and possible molecular mechanisms involved in the cellular response of antioxidant defenses and key proteins involved in circadian rhythm in Danio rerio and in the cell line, PAC-2, derived from embryos of the same species, exposed to CuSO4. In the first chapter, biochemical and gene expression studies along with chemical analyzes indicated that exposure to CuSO4 interfered with the coordination between SOD and CAT enzymes and disrupted the daily oscillation of circadian rhythm control proteins. Moreover, concrete evidence on the existence of rhythmicity in the expression and activity of SOD and CAT were found. These results indicated that a synchronization of the organism with the environment may be impaired due to acute exposure to Cu. In this way, the second chapter was conducted in order to explore the molecular bases of the cross-talk between copper, SOD and CAT antioxidant enzymes and the circadian clock. With the use of molecular cloning techniques, transfections and gene expression, the results obtained support a relationship between Cu exposure, activation of the antioxidant defense and disorders in the expression of circadian clock control genes through the activation of the MAPK pathway in PAC-2. It has also been shown that the transcription of SOD can be regulated both as a response to oxidative stress and also associated with the circadian clock. In general, this study provides the first information about the toxicological interaction between Cu exposure and deregulation of the circadian clock control mechanism in aquatic organisms. Key words: zebrafish, copper sulfate, antioxidant defense, circadian rhythm

Orientador: Nilson Ivo Tonin Zanchin Coorientadora: Beatriz Gomes Guimarães Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 21/02/2018 Inclui referências: p.91-101 Resumo: Diversos são os mecanismos envolvidos no desenvolvimento tumoral, dentre eles desregulação de vias de sinalização através de receptores e seus ligantes. Sabe-se, por exemplo, a importância do receptor do fator de crescimento epidermal (EGFR) no desenvolvimento de alguns tipos de tumores, incluindo os pulmonares. No entanto, não se sabe se seus ligantes estão envolvidos ou não na dinâmica tumoral devido à falta de métodos precisos o suficiente para distingui-los e quantifica-los. Nesse contexto, anticorpos têm diversas aplicações, dentre elas a detecção de biomoléculas. No entanto, para que os mesmos sejam usados no desenvolvimento tecnológico eles devem passar em critérios de qualidade para precisão, exatidão, linearidade, limite de detecção e limite de quantificação, especificidade, reprodutibilidade, estabilidade e recuperação adequadas. A maturação de anticorpos é uma estratégia promissora para otimizar a especificidade e sensibilidade. Outra estratégia é a seleção de fragmentos de anticorpos de domínio único (sdAfs), os quais se diferenciam de anticorpos clássicos e seus derivados por sua facilidade de produção e maior estabilidade. Temos como objetivo desenvolver um fragmento de anticorpo do tipo Fab através da maturação de anticorpos anti-EGF e de construir uma biblioteca sintética para ser utilizada no sistema de duplo-híbrido de levedura. Estes fragmentos serão utilizados para avaliar as interações dos mesmos com os membros da família do fator de crescimento epidermal (EGF). Dois anticorpos adquiridos comercialmente sem restrição de uso foram sequenciados por espectrometria de massas. Sequencias completas de aminoácidos foram obtidas, cuja qualidade foi avaliada com base numa combinação de parâmetros tais como qualidade da fragmentação dos peptídeos, cobertura, conservação, dentre outros. As sequencias de aminoácidos obtidas foram avaliadas através de métodos computacionais, incluindo modelagem molecular por homologia e docking para verificar a confiabilidade do sequenciamento. As sequencias de aminoácidos obtidas por espectrometria de massas foram também usadas para se obter genes sintéticos otimizados para expressão em leveduras. Estes genes foram subclonados em vetores de expressão de Komagataella phapphi (anteriormente denominada Pichai pastoris) e Saccharomyces cerevisiae. Diferentes condições de expressão foram testadas, no entanto, devido à instabilidade genômica, a dinamicidade do sistema e as diversas variáveis que afetam a produção de proteínas recombinantes, não foi possível o isolamento dos fragmentos de anticorpos a partir da expressão em nestas leveduras. Já a biblioteca sintética foi desenhada utilizando-se uma sequência molde para as porções estruturais conservadas, enquanto a região determinante de complementariedade (CDR) 3 foi definida levando-se em conta a frequência de cada aminoácido em cada posição da CDR3 de fragmentos já sequenciados. Desenhou-se um esquema de construção para aumentar a probabilidade de inclusão na biblioteca de resíduos mais propensos a fazer ligações específicas. Já as outras duas CDRs foram construídas utilizando-se de estratégia baseada em código binário de tirosina e serina, além de aminoácidos altamente conservados dentro das CDRs. Sendo assim, nesse trabalho foi possível estabelecer o duplo-híbrido de levedura, assim como desenvolver a biblioteca sintética de sdAf in-silico. Concomitantemente, foram sequenciados com sucesso dois anticorpos comerciais e adquiridos genes sintéticos. Estes foram subclonados para vetores de leveduras, entretanto, não foi possível a produção dos Fabs nos sistemas e condições realizadas até o momento. Palavras-chave: sdAf, Fab, Komagatella phaffii, biblioteca sintética Abstract: Several mechanisms are are responsible for tumor development, including deregulation of signaling pathways through receptors and their ligands. It is known, for example, the importance of the epidermal growth factor receptor (EGFR) in the development of some types of tumors, including in lung cancer. However, it is not known whether their ligands are involved in tumor dynamics because precise methods to distinguish and quantify them are not currently available. For applications such as detection of biomoleculas, antibodies are of particular interest. However, in order for an antibody to be suitable for technological development, it must pass a set of quality criteria concerning precision, accuracy, linearity, limit of detection and limit of quantification, specificity, reproducibility, stability and adequate recovery. Maturation is a promising strategy to optimize antibody specificity and sensitivity. Another strategy is the selection of fragments of single domain antibodies (sdAfs), which differ from classical antibodies and their derivatives by their ease of production and greater stability. We aim to develop a Fab-like antibody fragment by maturation of anti-EGF antibodies and to construct a synthetic library for use in the yeast two-hybrid system. These fragments will be used to assess their interactions with members of the epidermal growth factor (EGF) family. Two commercially purchased antibodies purchased without utilization restriction were sequenced by mass spectrometry. The quality of the sequences was evaluated based on a combination of parameters such as quality of peptide fragmentation, coverage, conservation, among others. The amino acid sequences were evaluated using computational methods, including homology modeling and molecular docking. The amino acid sequences were also used to obtain synthetic genes optimized for yeast expression. They were subcloned in expression vectors for Komagataella phapphi (previously named Pichai pastoris) and Saccharomyces cerevisiae. Various expression assays were performed using different culture conditions. However, due to genomic instability, system dynamics and the various variables affecting the production of recombinant proteins, it was not possible to isolate the antibody fragments. The synthetic library was designed using a template sequence for the conserved structural portions, while the complementarity-determining region (CDR) 3 was defined by taking into account the frequency of each amino acid at each CDR3 position of already sequenced fragments. A construction scheme was designed to increase the likelihood of inclusion in the library of residues more likely to make specific binding. The other two CDRs were constructed using strategy based on binary code of tyrosine and serine, in addition to highly conserved amino acids within the CDRs. Thus, in this work it was possible to establish the yeast two-hybrid system, as well as to develop the synthetic sdAf in silico library. Concomitantly, two commercial antibodies were successfully sequenced and synthetic genes were purchased. These were subcloned into yeast vectors, however, it was not possible to produce the Fabs in the systems and conditions performed so far. Key words: sdAf, Fab, Komagatella phaffii, synthetic library

Orientador: Prof. Dr. Ciro Alberto de Oliveira Ribeiro Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 17/08/2018 Inclui referências Resumo: O 2,4,6-Tribromophenol (TBF) pertencente a classe dos polibromados retardantes de chama (BFRs) é um poluente emergente amplamente empregado na produção de plástico, na indústria textil, em produtos de eletrodomésticos e eletroquímicos, móveis e veículos automotores. O mais preocupante é que o TBF vem sendo detectado em diferentes compartimentos ambientais despertando o interesse na investigação em avaliar o risco de exposição a organismos e para populações humanas, visto que é classificado como tóxico, persistente, bioacumulável e seus efeitos ambientais e para a saúde humana são inconclusivos. O objetivo geral deste trabalho foi o de avaliar o efeito da exposição hídrica e trófica do 2,4,6-Tribromofenol (TBF) em peixes teleósteos. No Capítulo I, optamos em produzir uma ferramenta molecular, na investigação de desreguladores endócrinos estrogênicos, um soro policlonal, para a imunodetecção da vitelogenina, através da expressão heteróloga de fragmentos conservados da molécula. No Capítulo II foi aplicado múltiplos biomarcadores para avaliação do efeito subcrônico de 70 dias de exposição oral às doses de 5 e 50 ng.g-1 de TBF em machos e fêmeas da espécie O. niloticus. Para avaliar o efeito do TBF nos estágios iniciais de desenvolvimento, Capítulo III, foi realizado um ensaio agudo de exposição hídrica de 0,3 e 3 µg.L-1 de TBF, onde foi analisado a sobrevivência, eclosão, malformações morfológicas e a dinâmica populacional ao longo do tempo pela aplicação de um modelo matemático computacional. A reatividade dos anticorpos séricos policlonais anti-recombinante (vtg1) foi mais eficiente do que a observada anticorpos anti-R. Quelen (nativo) nas reações cruzadas de vtgs endógenas de peixes. A expressão heteróloga de proteínas e os respectivos anticorpos gerados são ferramentas promissoras para serem empregados em ensaios de biomonitoramento e avaliação da qualidade da água. A exposição ao TBF mostra efeito hepatotóxico e potencial neurotóxico e de desregulador endócrino para a espécie de O. niloticus após exposição oral e subcrônica. Os resultados mostraram que o TBF é embriotóxico para a espécie R. quelen e representa um risco para a população, diminuindo sua densidade, após exposição, em cenários definidos e aplicados em modelagem matemática elaborada por Brito et al. (2017). Os resultados apresentados com o presente estudo não são totalmente conclusivos, mas apresentam informações que complementam estudos existentes na literatura favorecendo uma melhor compreensão do risco de exposição dessa molécula para a biota e populações humanas. Palavras-chave: 2,4,6-Tribromofenol, Vitelogenina, Embriotóxico, Proteína Recombinante, Anticorpos e Desregulação Endócrina. Abstract: 2,4,6-Tribromophenol (TBP) belonging to the class of flame retardant polybromates (FRBs) is an emerging pollutant widely used in the production of plastics, textiles, household and electrochemical products, furniture and motor vehicles. What is most worrying is that TBP has been detected in different environmental compartments, raising the interest in research in assessing the risk of exposure to organisms and human populations, since it is classified as toxic, persistent, bioaccumulable and its environmental and health effects are inconclusive. The general objective of this study was to evaluate the effect of water and trophic exposure of 2,4,6-tribromophenol (TBP) on fish. In Chapter I, we chose to produce a molecular tool in the investigation of estrogenic endocrine disrupters, a polyclonal serum, for the immunodetection of vitellogenin through the heterologous expression of conserved fragments of the molecule. In Chapter II, multiple biomarkers were used to evaluate the subchronic effect of 70 days of oral exposure in O. niloticus males and females at 5 and 50 ng.g -1 TBP. To evaluate the effect of TBP in the early stages of development, Chapter III, an acute water exposure test of 0.3 and 3 ?g.L-1 of TBP was performed, where the survival, hatching, morphological malformations and dynamics over time by the application of a computational mathematical model. The reactivity of the anti-recombinant polyclonal serum antibodies (vtg1) was more efficient than the observed anti-R. quelen antibodies for cross-reactions of endogenous fish vtgs. The heterologous expression of proteins and the respective antibodies generated are promising tools to be used in biomonitoring and water quality assessment trials. Exposure to TBP shows hepatotoxic effect and neurotoxic potential and endocrine disruptor for O. niloticus species after oral and subchronic exposure. The results showed that TBP is embryotoxic for the R. quelen species and represents a risk to the population, decreasing its density, after exposure, in defined scenarios and applied in mathematical modeling elaborated by Brito et al. (2017). The results presented with the present study are not conclusive but present information complements studies in the literature toward a better understanding of the risk of exposure of this molecule to biota and human populations. Keywords: 2,4,6-Tribromophenol, Vitellogenin, Embryotoxic, Recombinant Protein, Antibodies and Endocrine Disruptor.

Orientador: Prof. Dr. Marco Antonio Ferreira Randi Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 12/03/2018 Inclui referências Resumo: Enquanto as aulas expositivas têm assegurado seu lugar de destaque nas práticas docentes, metodologias diferenciadas são utilizadas de maneira tímida em sala de aula, geralmente como estratégias complementares. Representações não linguísticas e jogos cooperativos são alternativas que podem promover o protagonismo e a participação ativa dos(as) estudantes, melhorando o processo de ensino e aprendizagem. Para avaliar o potencial didático dessas estratégias, aulas de Biologia Celular foram aplicadas a estudantes do 1º ano do ensino médio em escolas públicas no Estado do Paraná. As turmas foram organizadas em grupos que participaram de aulas expositivas, onde os(as) professores(as) utilizaram a exposição oral ilustrada como metodologia de ensino; representações não linguísticas (RNL), que envolveu a construção de um modelo tridimensional e a confecção de um cartaz bidimensional; ou aprendizagem cooperativa, realizada através de aventuras de RolePlaying Game (RPG). O conhecimento dos temas abordados foi avaliado antes das aulas, e em curto e médio prazos, posteriores às aulas. Nas avaliações por questões (objetivas e de respostas discursivas), os(as) estudantes obtiveram resultados semelhantes no desempenho de médio prazo, independente da metodologia de aprendizagem. Contudo, na avaliação por mapas conceituais, os melhores resultados foram alcançados pelos(as) estudantes que participaram das metodologias ativas, indicando um aprendizado mais efetivo e significativo. O perfil de inteligências múltiplas dos(as) estudantes foi traçado, a partir da Teoria das de Howard Gardner, mas não houve correlação entre o tipo de inteligência e a performance em cada grupo experimental. Também foi realizada uma análise do perfil de professores(as) de Biologia através da aplicação de questionário e entrevista semiestruturada. Apesar de constituírem um grupo jovem, porém experiente, suas aulas priorizam práticas pedagógicas consideradas tradicionais. Diversificar as estratégias de ensino, estimulando a participação ativa dos(as) estudantes, pode contribuir para um aprendizado mais efetivo e significativo. Palavras-chave: Ensino e aprendizagem da Biologia Celular. Técnicas de Ensino. Representações não linguísticas. Aprendizagem cooperativa. Perfil de professores(as) de Biologia Celular. Abstract: Lectures have indeed been established as a prominent role in teaching practices. However, differentiated methodologies are being used in a reluctant way in the classroom. Non-linguistic representations and cooperative games are alternatives that can promote involvement and active participation of the students, facilitating the teaching/learning process. In order to evaluate the teaching potential of these strategies, lessons on Cell Biology were applied to students of the 1st year of high school of public schools in the state of Paraná, Brazil. Classes were organized in groups that participated in: a) lectures, in which the teachers used illustrated oral exposure as the selected teaching methodology, b) non-linguistic representations (NLR), which involved the construction of a three-dimensional model and the making of a two-dimensional poster or c) co-operative learning, carried out through adventures of Role-Playing Game (RPG). The students were evaluated before classes, and in a short and medium-term period after the classes. The evaluations were conducted through questions and conceptual maps, with the best results being achieved by students who participated in the NLR and RPG groups, which indicates a more effective and meaningful learning. The profile of multiple intelligences of the students was traced, from Howard Gardner's theory, but there was no correlation between intelligence type and performance in each experimental group. The profiles of Biology teachers, who are currently teaching in public schools of the State of Paraná, were analyzed in order to obtain an overview of the practices that are developed routinely in schools and classrooms. The teachers answered a survey and participated in semi-structured interviews, in order to analyze their professional profile and the teaching methodologies they apply. Although they constitute a young but experienced group, their classes focus on pedagogical practices that are considered traditional, in contradiction to several more modern teaching techniques, which could contribute to a more active participation of the students. Key-words: Cell biology education. Teaching and learning methodologies. Non-linguistic representations. Collaborative games; Cell biology education. Teachers’ profile.

Orientadora: Profa. Dra. Lucélia Donatti Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 02/03/2018 Inclui referências Resumo: Peixes antárticos são altamente estenotérmicos apresentando adaptações fisiológicas que permitem a sobrevivência nas águas frias e estáveis (-1,8 a +3ºC) do oceano Antártico. A temperatura é um fator abiótico que afeta os organismos ectotérmicos devido a sua influência nas reações enzimáticas e na estabilidade das macromoléculas. Por isso, ao considerar as tendências de aquecimento na região da Península Antártica questionamentos são levantados a respeito da flexibilidade e dos mecanismos fisiológicos desencadeados para a restauração da homeostase em organismos antárticos submetidos ao estresse térmico. Dessa forma, esta tese teve como objetivo verificar os efeitos fisiológicos do estresse térmico (8ºC), de longo (90 dias) e curto (2 a 144 horas) prazo, em nototenídeos antárticos presentes na Baía do Almirantado, Ilha Rei George, Península Antártica. Ao analisar os efeitos do estresse térmico de longo prazo em N. rossii, constata-se que, apesar de não haver a alteração do fator de condição, há indícios de aumento da demanda energética na temperatura de 8ºC. Entre as alterações, observou-se a hiperglicemia, a redução do índice hepatossomático, a mobilização do estoque lipídico nos tecidos hepático e muscular, o aumento da atividade da citrato sintase no fígado, o aumento do potencial gliconeogênico no fígado, rim, brânquia, coração e músculo, bem como aumento do potencial anaeróbico em todos os tecidos (excetuando-se as brânquias). A não modulação ou ainda a redução dos níveis de atividade da superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa-S-tranferase (GST) indicam que os níveis presentes são suficientes para condição de 8ºC e 90 dias. Nos experimentos de curto prazo, observou-se que no tecido renal de N. rossii, os níveis de atividade das enzimas glicolíticas e da via do ácido cítrico foram modulados nas primeiras 12h em 8ºC. Enquanto, N. coriiceps apresentou valores semelhantes aos do controle a partir de 6h de experimento. Acredita-se que a manutenção do metabolismo de carboidratos no rim de N. coriiceps ocorreu devido ao consumo das reservas de glicogênio renais. Em N. rossii, a redução dos níveis de atividade da CAT, GST, glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase (GR) nas primeiras horas de estresse térmico possivelmente contribuíram para o aumento da LPO em 72h. Já em N. coriiceps, não se observaram danos lipídicos nem proteicos. Através das análises plasmáticas constatou-se o aumento do cortisol em N. coriiceps expostas ao aumento térmico, o que desencadeou respostas secundárias a fim de subsidiar o aumento da demanda energética. Como a hiperglicemia em 6, 12 e 72h, a redução dos níveis de proteína total em 6 e 144h e de triglicerídeos em 144h. Ainda em N. coriiceps, observou-se o aumento da atividade da SOD e da CAT plasmáticas. Em N. rossii, não se verificou o efeito clássico de resposta primária ao estresse, contudo a hiperglicemia transiente nos tempos de 6 e 12h possivelmente ocorreu pelo efeito das catecolaminas. Diante dos resultados obtidos nesta tese verificamos que as respostas observadas são tempo-, tecido- e espécie-dependentes. Sendo N. coriiceps um potencial bioindicador da Baía do Almirantado, por ser mais sensível fisiologicamente ao estresse térmico do que N. rossii. Palavras-chave: Peixes antárticos. Notothenidae. Temperatura. Aquecimento. Metabolismo. Biomarcadores. Abstract: Antarctic fish are highly estenothermic exhibiting physiological adaptations that allow survival in the cold and stable waters (-1.8 to + 3ºC) of the Antarctic Ocean. Temperature is an abiotic factor that affects ectothermal organisms due to its influence on the enzymatic reactions and the stability of the macromolecules. Therefore, when considering warming trends in the region of the Antarctic Peninsula, questions are raised regarding the flexibility and physiological mechanisms triggered for the restoration of homeostasis in Antarctic organisms subjected to thermal stress. The objective of this thesis was to verify the physiological effects of thermal stress (8ºC), in short (2 to 144 hours) and long (90 days) term, in Antarctic nototeniids present in Almirantado Bay, King George Island, Antarctic Peninsula. Among the effects of longterm thermal stress on N. rossii, it was observe that, although there is no change in the condition factor, there is evidence of an increase in energy demand at 8ºC. Which are demonstrated by hyperglycemia, hepatosomatic index reduction, mobilization of lipid stores in the hepatic and muscular tissues, increased activity of citrate synthase in the liver, increased gluconeogenic potential in the liver, kidney, gill, heart and muscle, as well as increased anaerobic potential in all tissues (except gills). Unchanged or reduced activity levels of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione-s-transferase (GST) indicate that the levels present are possibly sufficient at 8ºC and 90 days. In the short-term experiments, it was observed that in the renal tissue of N. rossii, the activity levels of the glycolytic enzymes and the citric acid pathway were modulated in the first 12 hours at 8ºC. While N. coriiceps presented values similar to those of the control from 6h of experiment. It is believed that the maintenance of carbohydrate metabolism in the N. coriiceps kidney occurred due to the consumption of renal glycogen stores. Reduction of CAT, GST, glutathione peroxidase (GPx) and glutathione redutase (GR) activity levels in the first hours of thermal stress possibly contributed to an increase in LPO in 72h-group of N. rossii. In N. coriiceps, no lipid or protein damage was observed. Plasma analyzes revealed cortisol increase in N. coriiceps exposed to thermal increase, which triggered secondary responses in order to subsidized the increase in energy demand. As hyperglycemia at 6, 12 and 72h, reduction of total protein levels in 6 and 144h and of triglycerides in 144h. In N. coriiceps, increased activity of plasma SOD and CAT was observed. In N. rossii, the classic effect of the primary response to stress was not found, however, transient hyperglycemia at 6 and 12h was possibly due to the release of catecholamines. In view of the results obtained in this thesis we verified that the observed responses are time-, tissue- and species-dependent. N. coriiceps is a potential bioindicator of Admiralty Bay for being more physiologically sensitive to thermal stress than N. rossii. Keywords: Antarctic fish. Notothenidae. Temperature. Warming. Metabolism. Biomarkers.

Orientadora: Profª Drª. Célia Regina Cavichiolo Franco Coorientador: Prof. Dr. Edvaldo da Silva Trindade Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 05/04/2016 Inclui referências: p.88-98 Resumo: Nas três últimas décadas, o câncer vem alterando o perfil epidemiológico do país. Este evento caracteriza-se pelo aumento dos agravos e da mortalidade provenientes de doenças não transmissíveis, pelo aumento da expectativa de vida com números cada vez maiores de idosos em detrimento ao número de jovens, e por uma predominância da morbidade em relação à mortalidade, gerando grandes impactos no sistema de saúde e na economia. Apesar do conhecimento de que a luz Ultra Violeta é o principal fator ambiental relacionado ao câncer do tipo melanoma, modelo de estudo do presente estudo, os mecanismos pelos quais este deflagra a doença, bem como os componentes genéticos associados a esta patologia, não estão totalmente esclarecidos. A ciência busca compostos naturais para a cura de inúmeras doenças, e as pesquisas científicas têm sido intensificadas com o objetivo de investigar a ação farmacológica de diferentes produtos naturais, os quais tenham papel promissor no tratamento do câncer. Nosso objetivo é avaliar o potencial biológico de uma galactana sulfatada extraída da alga verde Codium Isthmocladum (CI), e de uma heteroramnana extraída da alga verde Gayralia brasiliensis (GB), em diferentes concentrações e tempos de tratamento, empregando ensaios in vitro com células das linhagem B16-F10 e RAW 264.7, melanoma e macrófago murino, respectivamente. Polissacarídeos com efeitos medicinais já foram e ainda são amplamente encontrados e descritos em fungos (majoritariamente em cogumelos), plantas, algas, animais e bactérias, sendo que a atividade desses compostos está intimamente associada a sua estrutura química, como composição monossacarídica, peso molecular e modificação de grupos funcionais. Entre suas diversas funcionalidades biológicas, são descritas atividades antitumorais através de inibição do crescimento tumoral, inibição de angiogênese, indução de apoptose, aumento de imunocompetência, diminuição de capacidade metastática e desencadeamento da perda de viabilidade celular. A galactana aqui estudada demonstrou diminuir a viabilidade celular (detectada pelo método de vermelho neutro) da linhagem em estudo no período de exposição de 72h em todas as concentrações testadas (1, 10, 100 e 1000ug/mL), não gerando comprometimento da atividade mitocondrial (ensaio de MTT) nas mesmas condições. Nos mesmos ensaios e condições de tratamento, a heteroramnana em estudo demonstrou comprometer a viabilidade celular e a atividade mitocondrial da linhagem B16-F10 nos três tempos testados (24, 48 e 72h) em pelo menos uma das concentrações. Ambos os polissacarídeos diminuíram a proliferação celular em 48h de tratamento. Com estes resultados, as concentrações de 10 e 100ug/mL e o tempo de tratamento de 72h foram escolhidos para o prosseguimento dos experimentos. Nestes parâmetros de tratamento, os polissacarídeos não comprometeram o potencial de membrana mitocondrial, além de não gerar arrasto do ciclo celular. A análise da morfologia celular em microscopia eletrônica de varredura apresentou alterações nas células tratadas com ambos os compostos. O ensaio de migração celular demonstra um promissor comprometimento dessa mecânica quando a linhagem B16-F10 foi exposta ao polissacarídeo GB. Entre as possíveis explicações para essa modulação, a marcação do receptor CD44 diminuiu de forma estatisticamente significativa frente ao tratamento com o polissacarídeo GB. Ambos os compostos aumentaram a marcação de CD54 e a produção de espécies reativas de oxigênio em macrófagos, o que pode indicar diferenciação dessas células na ativação clássica M1. Assim, esses polissacarídeos apresentaram resultados promissores frente as linhagem em estudo, porém outros experimentos in vitro e in vivo devem ser realizados para se identificar as biomoléculas envolvidas, bem como rotas e vias que possam estar sendo moduladas frente aos tratamentos com esses compostos. PALAVRAS CHAVE: melanoma, polissacarídeos, Codium isthmocladum,Gayralia brasiliensis, B16-F10, RAW 267.4, algas verdes. Abstract: In the last three decades, cancer is changing the epidemiological profile of the country. This event is characterized by the increase in diseases and mortality from non-communicable diseases, increased life expectancy with increasing numbers of elderly people over the number of young people, and a predominance of morbidity in relation to mortality, generating major impact on the health system and the economy. Despite the knowledge that UV light is the main environmental factor related to cancer of the melanoma type, model of this study, the mechanisms by which this triggers the disease and the genetic components associated with this disease are not fully understood. Science seeks natural compounds for curing numerous diseases and scientific research has been intensified in order to investigate the pharmacological action of different natural products, which have promising role in treating cancer. Our goal was to assess the biological potential of an extracted sulphated galactan from the green alga Codium Isthmocladum, and an extracted heteroramnana from the green alga Gayralia brasiliensis, both at different concentrations and treatment times (exposure), using in vitro assays with murine melanoma cells B16-F10 lineage and RAW 264.7 macrophage lineage. Polysaccharides with medicinal effects are widely found and described in fungi (mainly in mushrooms), plants, algae, animals and bacteria, where the activity of these compounds is closely related to its chemical structure, such as monosaccharide composition, molecular weight and modification of functional groups. Among its various biological functions, antitumor activity are described by inhibiting tumor growth, inhibiting angiogenesis, induction of apoptosis, increased immunocompetence, decreased metastatic capacity and outbreak of loss of cell viability. The galactan studied here shown to decrease cell viability (detected by the neutral red method) of the lineage under study at 72h exposure period in all tested concentrations (1, 10, 100 and 1000?g/ml),and not genetare impairment of mitochondrial activity (MTT assay) in the same conditions. In the same tests and conditions of treatment, the heteroheteroramnana under study demonstrated compromising cell viability and mitochondrial activity of B16-F10 line in the three times tested (24, 48 and 72h) in at least one of the concentrations. Both polysaccharides decreased cell proliferation at 48 hours of treatment. With these results, the concentrations of 10 and 100?g/mL and 72h treatment time were chosen for further experiments. In these treatment parameters, polysaccharides did not affect the mitochondrial membrane potential, as well as not to generate cell cycle arrest. The analysis of cell morphology in scanning electron microscopy showed changes in cells treated with both compounds. The cell migration assay demonstrates a promising commitment of this mechanic when the B16-F10 lineage was exposed to the polysaccharide GB. Among the possible explanations for this modulation, the immunostaining of the CD44 receptor statistically significantly decreased toward the treatment with the polysaccharide GB. Both compounds increased the immunostaining of CD54 and production of reactive oxygen species in macrophages, which may indicate differentiation of cells in classical activation (M1). Thus, these polysaccharides have shown promising results against the lineages under study, but other experiments in vitro and in vivo should be conducted to identify the biomolecules involved , as well as routes and signaling pathways that may be being modulated by the treatments with these compounds. KEYWORDS : melanoma, polysaccharides , Codium isthmocladum , Gayralia brasiliensis , B16 -F10 , RAW 267.4, green algae.

Orientadora: Profª. Drª. Claudia Feijó Ortolani-Machado Coorientador: Prof. Dr. Edvaldo da Silva Trindade Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 28/03/2018 Inclui referências: p.106-122 Resumo: A crista neural (CN) é uma população celular originada durante a neurulação. Estas células apresentam pluripotencialidade, originando vários tipos celulares, além de alta capacidade migratória e proliferativa. Muitos compostos podem interferir nessas células, ocasionando distúrbios migratórios e malformações no organismo em desenvolvimento. O chumbo é o metal tóxico mais comum no ambiente, sendo considerado um potente teratógeno. Até o momento não existem estudos sobre o efeito deste contaminante ao longo do tempo nas estruturas cefálicas em desenvolvimento de embriões de ave, sua biodisponibilidade e efeito sobre as células da CN. Assim, no presente trabalho esses parâmetros foram avaliados, buscando identificar o efeito do chumbo sobre o padrão migratório das células da CN cefálica. A exposição foi realizada injetando-se, na câmara de ar do ovo, solução de nitrato de Pb na concentração de 0,025 ?g.ml-1, ou solução fisiológica no controle, previamente à incubação. Os ovos foram incubados a 38°C por 1 a 4 dias, sendo a viabilidade dos embriões determinada após a abertura. A análise anatômica foi realizada utilizando-se estereomicroscópio e o padrão normal definido conforme descrito por Hamburger e Hamilton (1951). A presença do chumbo foi analisada empregando-se o marcador fluorescente Leadmium-Green e sua deposição nas células da região cefálica avaliada através de autometalografia. A quantificação do metal foi realizada por análise química com ICP-MS. O padrão migratório das células da CN foi avaliado com imunomarcador (anti-HNK-1), nos estádios 8-18HH para acompanhar a delaminação e migração dessas células. Os embriões expostos ao chumbo apresentaram um aumento crescente de mortalidade e na ocorrência de malformações. Das alterações encontradas destacam-se malformação na região cefálica e presença de pontos hemorrágicos. A marcação positiva para Leadmium-Green foi observada apenas nos embriões expostos, confirmando a presença do chumbo. Nas células ao nível dos rombômeros o metal foi localizado no citoplasma, núcleo ou em ambos. Não foi observado um padrão na deposição, porém foram encontrados acúmulos celulares anormais na luz do tubo neural, sendo que algumas células nestes acúmulos apresentavam marcação sutil para Pb e foram positivas para anti-HNK1, indicando serem células da CN. A quantificação química mostrou que apenas 25% do chumbo inserido na câmara de ar está presente nos embriões. Mesmo em concentrações baixas a exposição ao chumbo é seguida por anomalias de distribuição das células da CN em diversos níveis cefálicos. A localização ectópica dessas células no lúmen do tubo neural, os padrões teciduais e a alteração na rota migratória é condizente com as alterações cumulativas descritas na literatura, como fenótipos corporais aberrantes e anormalidades morfofuncionais. Assim, a correlação entre as alterações relatadas indica que o chumbo altera o padrão migratório das células da CN e o embrião exposto tem alta probabilidade de apresentar malformações e futuramente déficits funcionais nas regiões cranio-faciais. Palavras-chave: Gallus gallus. Metal pesado. Biodisponibilidade. Embriotoxicologia. Abstract: The neural crest (CN) is a cell population originated during neurulation. These cells present pluripotentiality, originating sundry cell types, besides high migratory and proliferative capacity. Numerous compounds may interfere with these cells, modifying formation or migration, thus inducing disorders and malformations in the developing organism. Lead (Pb) is the most common toxic metal in the environment, being considered a powerful teratogen. To date there are no studies on the effect of this contaminant on developing cephalic structures of avian embryos over time, their bioavailability and effect on CN cells. Thus, in the present work these parameters were evaluated, seeking to identify the effect of lead on the migratory pattern of cephalic CN cells. The exposure was performed by injecting, into the egg air chamber, Pb nitrate solution at the concentration of 0,025 ?g.ml-1, or physiological solution in the control, prior to incubation. The eggs were incubated at 38°C for 1 to 4 days, with embryo viability being determined after opening. Anatomical analysis was performed under stereomicroscope and the normal pattern defined as described by Hamburger and Hamilton (1951). The presence of lead was analyzed using the Leadmium-Green fluorescent marker and its deposition in cephalic region cells evaluated by autometalography. Metal quantification was performed by chemical analysis with ICP-MS. The migratory pattern of CN cells was assessed with immunoreactor (anti-HNK-1) at 8-18HH stages to monitor delamination and migration of these cells. Embryos exposed to lead presented an increasing mortality and malformations occurrence. The alterations found were mainly malformations in the cephalic region and the presence of hemorrhagic points. Positive labeling for Leadmium-Green was observed only in exposed embryos, confirming the presence of lead. In cells at the level of the rhombomers the metal was located in the cytoplasm, nucleus or both. No deposition pattern was found, but abnormal cell clusters were observed in the lumen of the neural tube, and some cells in these clusters had subtle labeling for Pb and were anti-HNK1 positive, indicating that they were CN cells. The chemical quantification revealed that only 25% of the lead injected into the air chamber is present in the embryos. Even at low concentrations lead exposure is followed by abnormalities on distribution of CN cells at various cephalic levels. The ectopic location of these cells in the neural tube lumen, tissue patterns, and alteration in the migratory route is consistent with the cumulative changes described in the literature, such as aberrant body phenotypes and morphofunctional abnormalities. Thus, the correlation between the reported changes indicates that lead alters the migratory pattern of CN cells and the exposed embryo has a high probability of presenting malformations and future functional deficits in craniofacial regions. Keywords: Gallus gallus. Heavy metal. Bioavailability. Embryotoxicology.

Orientador: Prof. Dr. Nilson Ivo Tonin Zanchin Coorientadora: Profa. Dra. Flávia Raquel Gonçalves Carneiro Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 28/03/2018 Inclui referências: p.103-106 Resumo: A osteopontina é uma glicoproteína fosforilada secretada, para a qual são atribuídas funções na biomineralização, reabsorção óssea e no sistema imune. Seu mecanismo de ação é mediado por receptores de membrana celular, incluindo integrinas e CD44. Desregulação de osteopontina tem sido associada a processos patológicos como doenças autoimunes e progressão de tumores. Como seu nível de expressão encontra-se aumentado em uma variedade de cânceres, a osteopontina pode servir como um biomarcador nestas condições, podendo ser também um alvo para terapia. Dentre as ferramentas bioquímicas que podem ser usadas tanto para detecção como para inibir a ação da osteopontina estão os anticorpos. Para aplicações biotecnológicas e biomédicas podem ser usados fragmentos de anticorpos contendo apenas a parte de ligação ao antígeno, como é o caso da fração de ligação ao antígeno (Fab) e dos fragmentos de cadeia única da fração variável (scFv). O presente trabalho tem como objetivo a produção de três fragmentos de anticorpos recombinantes do tipo scFv (denominados 14-8, 14-9 e 14-10) e de dois fragmentos do tipo Fab (14-8 e 14-10) para detecção e inibição da osteopontina. Genes sintéticos que codificam scFv e Fab otimizados para expressão em Escherichia coli e em Pichia pastoris, respectivamente, foram adquiridos pela empresa GenScript. Foram realizados testes de expressão dos fragmentos de anticorpos do tipo Fab em Pichia pastoris. O fragmento do tipo Fab 14-10 foi obtido em baixos níveis, enquanto que para o Fab 14-8 não houve expressão. Foram realizados testes de expressão dos fragmentos de anticorpos do tipo scFv em Escherichia coli com subsequente purificação parcial. A osteopontina em fusão com EGFP, e em fusão com GST também foram expressas em E. coli. Todas as proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade. O rendimento dos scFvs foi relativamente baixo (0,5 mg/L de cultura) mas suficiente para sua caracterização subsequente. Os anticorpos do tipo scFv foram testados em ensaios de Western blot e de termoforese em microescala para determinação se estes apresentam a capacidade de reconhecer a osteopontina. Através dos ensaios de Western blot foi possível observar que apenas o scFv 14-8 conseguiu detectar a osteopontina, enquanto que no ensaio de termoforese em microescala, a qual é uma técnica mais sensível, todos os fragmentos do tipo scFv conseguiram detectar a osteopontina. Foi estimada a constante de dissociação para os fragmentos de anticorpos do tipo scFv 14-8 e 14-10, sendo estas de 75,8 nM e 364,7 nM, respectivamente. Com base nos valores de kd resultantes obtidos, podemos concluir que os fragmentos de anticorpos do tipo scFv apresentam as especificações necessárias para testar o seu uso na detecção e inibição da osteopontina. Palavras-chave: Osteopontina. scFv. Fab. Expressão de proteínas recombinantes. Pichia pastoris. Abstract: Osteopontin is a secreted phosphorylated glycoprotein, which acts in biomineralization, bone resorption and in the immune system. Its mechanism of action is mediated by cell membrane receptors, including integrins and CD44. Osteopontin disfunction has been associated with pathological processes such as autoimmune diseases and tumor progression. The expression level of osteopontin is increased in a variety of cancers, indicating that it can serve as a biomarker of cancer and possibly also be a target for therapy. Among the biochemical tools that can be used for detection and inhibition of osteopontin are the antibodies. Modified antibodies with only the functional site of antigen binding, such as antigen-binding fragments (Fab) and single chain fragment variable (scFv) can be used for biomedical and biotechnological applications. The objective of this work is the production of three scFv fragments (14-8, 14-9 e 14-10) and two Fab fragments (14-8 and 14-10) for the detection and inhibition of osteopontin. Fab and scFv synthetic genes optimized for Pichia pastoris and Escherichia coli expression, respectively, were acquired from GenScript. Expression of Fab fragments was performed in Pichia pastoris. However, only one of the Fab (14-10) was obtained at low levels, while the other was not expressed. The scFv fragments were expressed in E. coli and partially purified by affinity chromatography. Osteopontin in fusion with EGFP and with GST were also expressed in E. coli. All recombinant proteins were purified using affinity chromatography. The yield of the scFv fragments was relatively low (~0,5 mg/L of culture) but sufficient for subsequent characterization. Interaction of osteopontin with antibody fragments was tested by Western blot and by microscale thermophoresis. Only one scFv antibody (14-8) was shown to detect osteopontin by Western blot. However, using microscale thermophoresis, which is a far more sensitive method, osteopontin was detected by all three scFv antibodies. The estimated dissociation constant for the scFv 14-8 and scFv 14-10 antibody fragments was 75,8 nM and 364,7 nM, respectively. These kd values are in the acceptable range to test their potential to detect and inhibit osteopontin. Key-words: Osteopontin. scFv. Fab. Expression of recombinant proteins. Pichia pastoris.

Orientador: Prof. Dr. Ciro Alberto de Oliveira Ribeiro Coorientador: Dr. Alexandre Dias Tavares Costa Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 23/02/2018 Inclui referências Resumo: Este trabalho reúne dados sobre a avaliação de baixos níveis de exposição da toxina microcistina-LR (MC-LR) e do pesticida piriproxifem (Py) em peixes juvenis ou em estágios iniciais de desenvolvimento. É apresentada também uma avaliação para o desenvolvimento de um sistema para a detecção de MC-LR. No primeiro capítulo são apresentados e discutidos os resultados dos efeitos isolados de ambas as moléculas através de experimento subcrônico (60 dias) sobre a tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus). No Capítulo II, os resultados referem-se aos estudos dos efeitos de misturas entre os dois compostos sobre os estágios iniciais de desenvolvimento em jundiá Rhamdia quelen, com exposição até 96 h pós-fertilização dos ovos, seguido da aplicação de um modelo matemático para previsão da densidade populacional em longo prazo. No capítulo III são apresentadas algumas estratégias para o desenvolvimento de um sistema biossensor para a detecção de MC-LR, com a utilização de aptâmeros em técnicas com microplaca e ensaios eletroquímicos - voltametria cíclica (CV) e espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS). O trabalho desenvolvido é justificado pela crescente ocorrência de microcistinas em reservatórios e mananciais, e pelo uso recente do piriproxifem no controle do vetor Aedes aegypti, transmissor de algumas enfermidades como a Dengue, Chikungunya, Zika virus e potencialmente da Febre Amarela. No Capítulo I, após exposição trófica a 6 aplicações de microcistina-LR (MC-LR) (extrato algal ou padrão comercial) (0.04, 0.4 e 4 ?g.kg-1.dia-1) ou exposição hídrica ao piriproxifem (0,3 e 2 ?g.L-1), os resultados indicaram que os animais nessas concentrações não são afetados quanto ao seu padrão geral de saúde. No entanto, quando expostos ao extrato algal foi detectado um aumento significativo na expressão da proteína vitelogenina (vtg) em machos e uma variação menor nos níveis de atividade da acetilcolinesterase no músculo, nos animais expostos à maior dose do padrão da MC-LR. No Capítulo II foi avaliada a exposição isolada e conjunta sobre os estágios iniciais do desenvolvimento de R. quelen expostos ao extrato algal (1, 10 e 100 ?g.L-1) e piriproxifem (0,10 a 2,44 ?g.L-1). Os resultados indicaram redução da taxa de sobrevivência e deformidades para os grupos de 10 ?g.L-1 de MC-LR e 0,10 ?g.L-1 de Py bem como para algumas das combinações consideradas. Houve ainda previsão de redução populacional através do modelo matemático destacando efeitos de sinergismo e antagonismo com as misturas. Finalmente, no Capítulo III, os testes em microplacas não se mostraram viáveis (baixa fluorescência e formato sanduíche inadequado para a detecção da MC-LR) e nos testes eletroquímicos, após vários ajustes nos protocolos e uma alteração na constituição dos dispositivos, os resultados se mostraram promissores, mas estudos posteriores são necessários com o intuito de confirmar esses resultados. Em conjunto, os dados apresentados nesse estudo foram evidentes ao destacar que os efeitos em níveis baixos de exposição à MC-LR e piriproxifem dependem do estágio do ciclo de vida da espécie. O protótipo de sistema de detecção ainda precisa ser aprimorado e validado, mas promete ser um biossensor sensível e específico, barato, reciclável e com potencial de ser aplicado em campo. Palavras-Chave: Microcistina-LR. Piriproxifem. Desregulação Endócrina. Biomarcadores. Biossensor. Oreochromus niloticus. Rhamdia quelen. Abstract: This work assembles data on the evaluation of low levels of exposure of microcystin-LR toxin (MC-LR) and pesticide pyriproxyfen (Py) in juvenile fish or in early stages of development. An evaluation is also presented for the development of a system for the detection of MC-LR. In the first chapter the results of the isolated effects of both molecules through subchronic experiment (60 days) on Nile tilapia (Oreochromis niloticus) are presented and discussed. In Chapter II, the results refer to the studies of the effects of mixtures between the two compounds on the initial stages of development in jundiá Rhamdia quelen, with exposure up to 96 h after fertilization of the eggs, followed by the application of a mathematical model for prediction population density in the long term. In chapter III some strategies for the development of a biosensor system for the detection of MC-LR are presented, with the use of aptamers in techniques with microplate and electrochemical tests - cyclic voltammetry (CV) and electrochemical impedance spectroscopy (EIS). The work developed is justified by the increasing occurrence of microcystins in reservoirs and springs, and by the recent use of pyriproxyfen in the control of the Aedes aegypti vector, which transmits some diseases such as Dengue, Chikungunya, Zika virus and potentially Yellow Fever. In Chapter I, after trophic exposure to 6 applications of microcystin-LR (MC-LR) (algal extract or commercial standard) (0.04, 0.4 and 4 ?g kg-1dia-1) or water exposure to pyriproxyfen (0.3 and 2 ?g L-1), the results indicated that animals at these concentrations are unaffected as to their overall health pattern. However, when exposed to algal extract, a significant increase in vitelogenin (vtg) protein expression was detected in males and a lower variation in the levels of acetylcholinesterase activity in the muscle, in the animals exposed to the higher dose of the MC-LR standard. In Chapter II, the isolated and joint exposure on the initial stages of development of R. quelen exposed to the algal extract (1, 10 and 100 ?g L-1) and pyriproxyfen (0.10 to 2.44 ?g L-1). The results indicated reduction of survival rate and deformities for the 10 ?g.L-1 MC-LR and 0.10 ?g L-1 groups of Py as well as for some of the combinations considered. There was also prediction of population reduction through the mathematical model highlighting effects of synergism and antagonism with the mixtures. Finally, in Chapter III, the microplate tests were not viable (low fluorescence and inadequate sandwich format for the detection of MC-LR) and in the electrochemical tests, after several adjustments in the protocols and a change in the constitution of the devices, the results were showed promising, but further studies are needed to confirm these results. Taken together, the data presented in this study were evident in highlighting that the effects on low levels of exposure to MC-LR and pyriproxyfen depend on the stage of the life cycle of the species. The prototype detection system still needs to be improved and validated, but it promises to be a sensitive, specific, inexpensive, recyclable biosensor with the potential to be applied in the field. Keywords: Microcystin-LR. Pyriproxyfen. Endocrine Disruption. Biomarkers. Biosensor. Oreochromus niloticus, Rhamdia quelen.

350 p. En la presente tesis doctoral se utilizan técnicas de biología molecular y celular para analizar el impacto de distintos factores antropogénicos que afectan a la calidad del espermatozoide y se exploran vías para la mejora de la misma y para la selección de subpoblaciones espermáticas óptimas. Los factores de estudio están vinculados principalmente a dos áreas de conocimiento: la biotecnología de la reproducción humana y la producción animal.

Orientadora : Profª. Drª. Lucélia Donatti Coorientador : Prof. Dr. Edson Rodrigues Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 20/02/2017 Inclui referências : p. 139-169 Resumo: O gastrópode antártico Nacella concinna habita a zona entremarés da Antártica, uma região naturalmente instável, que apresenta flutuações termo-salinas diárias, além de ser vulnerável à ação de contaminantes de origem antrópica, como o despejo de efluentes de esgoto de estações científicas e navios. Somado a isso, os organismos que habitam essa região precisam lidar com os níveis naturalmente elevados de metais pesados. Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo avaliar as respostas fisiológicas de N. concinna à variações termo-salinas de curto prazo, bem como verificar o efeito do esgoto da Estação Antártica Comandante Ferraz (EACF) sobre o metabolismo energético, nitrogenado e defesa antioxidante desse molusco. Também objetivamos avaliar o efeito direto de metais pesados sobre a atividade da arginase branquial e do pé muscular de N. concinna, bem como a distribuição tecidual e subcelular dessa enzima. Os bioensaios de temperatura e salinidade, ao longo do tempo, mostraram que o aquecimento e hipossalinidade modulam a defesa antioxidante, basicamente os níveis de SOD e G6PDH, de forma tecido-específica. No estresse hipossalino e térmico de curta duração, a defesa antioxidante glandular de N. concinna foi eficaz em prevenir lesões oxidativas em lipídeos e proteínas. O aquecimento é capaz de modular positivamente o metabolismo anaeróbio do pé muscular desse gastrópode. Contudo, nas brânquias, enquanto o aquecimento não modulou as enzimas do metabolismo energético, a hipossalinidade induziu resposta metabólica aeróbica. O estresse hipossalino elevou os níveis de AST e GDH no pé muscular, sugerindo a participação dessas enzimas na regulação osmótica desse tecido. Também foram observadas interações entre temperatura, salinidade e tempo, capazes de modular os níveis das enzimas analisadas nos três tecidos. Os níveis de ARG cerca de duas vezes superiores aos de ODH no pé muscular de N. concinna sugere a participação de ARG no catabolismo de L-arginina, durante a decomposição do "tampão energético" fosfo-Larginina. Apesar de ser considerado um bom biomonitor, a complexidade das respostas metabólicas de N. concinna, frente ao aquecimento e hipossalinidade, sugerem cautela na utilização dessas respostas como biomarcadores de mudanças naturais e antrópicas. Em relação ao efeito do esgoto, a indução de SOD, GST e CAT na glândula digestiva foi eficaz em prevenir danos oxidativos em lipídeos, mas não em proteínas na diluição de esgoto a 0,05% (v/v). A exposição ao esgoto foi capaz de elevar o potencial gerador de ATP aeróbio e anaeróbio das brânquias. Já no pé muscular o esgoto modulou positivamente a PFK, enzima reguladora da via glicolítica. Os estudos com metais pesados mostraram que as arginases branquial e do pé muscular de N. concinna apresentam características cinéticas distintas quanto ao KM e ação de cátions de metais pesados. Tanto a arginase branquial como a do pé muscular estão localizadas prioritariamente na fração citosólica dos tecidos. Também ficou evidente que as arginases das brânquias e do pé muscular são resistentes à inibição por cobre, o que sugere uma adaptação metabólica desse gastrópode, que pode ter contribuído para a ocupação de nichos naturalmente ricos em metais pesados. Palavras-chave: Nacella concinna. Antártica. Temperatura. Salinidade. Esgoto. Metais. Abstract: The antarctic gastropod Nacella concinna inhabits the intertidal zone of Antarctica, a naturally unstable region that exhibits daily thermo-saline fluctuations, besides being vulnerable to the action of contaminants of anthropic origin, such as the discharge of sewage effluents from scientific stations and ships. In addition, organisms living in this region must deal with naturally high levels of heavy metals. In this context, the present study aimed to evaluate the physiological responses of N. concinna to shortterm thermo-saline variations, as well as to verify the effect of the Anarctic Station Comandante Ferraz (EACF) sewage on energy and nitrogen metabolism and antioxidant defense of this mollusk. We also aimed to evaluate the direct effect of heavy metals on the activity of the branchial and foot muscle arginase of N. concinna, as well as the tissue and subcellular distribution of this enzyme. Temperature and salinity bioassays, over time, have shown that heating and hyposalinity modulate the antioxidant defense, basically the levels of SOD and G6PDH, in a tissue-specific way. In short-term hyposaline and thermal stress, the antioxidant glandular defense of N. concinna was effective in preventing oxidative lesions in lipids and proteins. Heating is able to positively modulate the anaerobic metabolism of the foot muscle of this gastropod. However, in the gills, while heating did not modulate the enzymes of energy metabolism, hyposalinity induced an aerobic metabolic response. Hyposaline stress increased AST and GDH levels in the foot muscle, suggesting the participation of these enzymes in the osmotic regulation of this tissue. It was also observed interactions between temperature, salinity and time capable of modulating the levels of the enzymes analyzed in the three tissues. ARG levels about twice higher than that of ODH in the foot muscle of N. concinna suggest the participation of ARG in L-arginine catabolism during the decomposition of the phospho-L-arginine "energy buffer". In spite of being considered a good biomonitor, the complexity of N. concinna metabolic responses to heating and hyposalinity suggests caution in the use of these responses as biomarkers of natural and anthropogenic changes. Regarding the effect of the sewage, the induction of SOD, GST and CAT in the digestive gland was effective in preventing oxidative damage in lipids, but not in proteins in the dilution of 0.05% (v/v) of sewage. Exposure to the sewage was able to raise the aerobic and anaerobic ATP generating potential of the gills. In the foot muscle, the sewage positively modulated PFK, a glycolytic pathway regulating enzyme. Studies with heavy metals have shown that the branchial and foot muscle arginases of N. concinna have different kinetic characteristics regarding KM and action of heavy metal cations. Both the branchial and foot muscle arginases are located primarily in the cytosolic fraction of the tissues. It was also evident that the arginases of the gills and of the foot muscle are resistant to inhibition by copper, suggesting a metabolic adaptation of this gastropod, which may have contributed to the occupation of niches naturally rich in heavy metals. Keywords: Nacella concinna. Antarctica. Temperature. Salinity. Sewage. Metals.

Orientador :Prof. Dr. Francisco Filipak Neto Coorientador : Prof. Dr. Frank Kjeldsen Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 28/03/2017 Inclui referências Resumo: Devido a intensa produção e incorporação de AgNP em produtos para consumo, espera-se que estas sejam, direta ou indiretamente, liberadas em ambiente naturais, o que representa uma via de exposição em potencial não apenas para a biota, mas também para humanos. Apesar de muitos estudos terem demonstrado o potencial tóxico de AgNP em células e organismos, a co-exposição com contaminantes onipresentes na natureza, como metais, pode induzir efeitos que não podem ser previstos a partir daqueles gerados por exposições isoladas. Nesta tese, as interações toxicológicas entre AgNP e Cd/Hg foram investigadas em células HepG2. No primeiro capítulo, ensaios bioquímicos, microscopia confocal e quantificação intracelular de metais indicaram que as co-exposições resultam em interações toxicológicas, sendo a associação de AgNP+Cd mais tóxica do que AgNP+Hg. Aumentos nos níveis de EROs citosólicas e mitocondrial foram observados após 2-4 h de exposição a AgNP+ Cd/Hg, porém esse efeito foi parcialmente revertido após 24 h de exposição a AgNP+Hg. Ainda, decréscimos da viabilidade celular, metabolismo, proliferação e atividade dos transportadores MDR foram mais pronunciados em células co-expostas aos contaminantes do que aos contaminantes individuais. As co-exposições levaram ao aumento da morte celular, principalmente por necrose, e aumento na concentração intracelular de Hg. Desta forma, interações toxicológicas resultam na potencialização da toxicidade de AgNP, Cd e Hg. Enquanto o aumento intracelular de Hg pode estar relacionado com a maior toxicidade de AgNP+Hg, essa lógica não é válida para os efeitos deletérios observados após a co-exposição a AgNP+Cd. Desta forma, o segundo capítulo foi conduzido de modo a explorar mais aprofundadamente os efeitos celulares e moleculares induzidos pela associação entre as AgNP e Cd. A viabilidade celular e relação ADP/ATP foram pouco alteradas após 4 h de exposição; no entanto, esses parâmetros foram substancialmente alterados após 24 h. Os resultados da análise proteômica seguiram o mesmo padrão: enquanto após 4 h as exposições aos contaminantes o proteoma total das células foi pouco alterado, após 24 h de exposição às AgNP e Cd, cerca de 7% e 2% do proteoma total foi desregulado, respectivamente, enquanto 43% deste foi alterado após co-exposição a AgNP+Cd. Resumidamente, a toxicidade desta associação parece estar envolvida com a inativação de Nrf-2, o que pode resultar na redução dos níveis da defesa antioxidante, e proteínas relacionadas aos proteossomos; redução dos níveis de proteínas envolvidas na via glicolítica e aumento nos níveis de proteínas envolvidas com a fosforilação oxidativa e metabolismo de lipídios, o que pode indicar uma tentativa de retorno às condições de homeostase energética. No entanto, essa estratégia de adaptação celular não foi suficiente para reestabelecer a homeostase de ADP/ATP e impedir a morte celular. De maneira geral, este estudo fornece as primeiras informações a respeito da interação toxicológica entre AgNP e metais não essenciais em modelo in vitro. Palavras-chave: AgNP, cádmio, mercúrio, co-exposição, interação, ensaios bioquímicos, proteômica. Abstract: Due to the increasing production and applications of AgNP in consumer products, AgNP are expected to be, directly or indirectly, released into natural environments, representing a potential threat to the biota and humans. An increasing number of studies have described the toxic potential of AgNP in cells and organisms. However, co-exposure of AgNP with ubiquitous contaminants, such as metals, may result in non-predictable outcomes. In this thesis, toxicological interactions of AgNP, Cd and Hg were investigated in HepG2 cells. In the first chapter, biochemical endpoints, confocal microscopy and intracellular metal concentration indicated that the co-exposures led to toxicological interactions, with AgNP + Cd being more toxic to HepG2 cells than AgNP + Hg. Early (2-4 h) increases of cytosolic and mitochondrial ROS were observed in the cells co-exposed to AgNP + Cd/Hg, in comparison to the control and individual contaminants, but the effect was partially reverted in AgNP + Hg at the end of 24 h-exposure. In addition, decreases of mitochondrial metabolism, cell viability, cell proliferation and ABC-transporters activity were also more pronounced in the co-exposure groups. Foremost, co-exposure to AgNP and metals potentiated cell death (mainly by necrosis) and Hg (but not Cd) intracellular levels. Therefore, toxicological interactions seem to increase the toxicity of AgNP, Cd and Hg. While an increase of Hg uptake might be related to the increase of toxicity after exposure to AgNP+Hg, this logic is not valid for the high toxicity observed after co-exposure to AgNP+Cd. Therefore, the second chapter was conducted to further explore cellular and molecular effects induced by this co-exposure. Cell viability and ADP/ATP ratio were slightly affected after the 4 h exposure to individual and combined exposures. However, these endpoints were strongly altered after 24 h co-exposure to AgNP+Cd compared to the control and individual exposures. The proteomics data followed the same trend: minor deregulation at 4 h-exposure in all groups and 7% (AgNP), 2% (Cd) and 43% (AgNP+Cd) at 24 h-exposure. Briefly, the toxicity induced by AgNP+Cd seems to be involved the inactivation of Nrf-2, which can result in down-regulation of antioxidant defense and proteasome related proteins, down-regulation of glycolysis related proteins and upregulation of oxidative phosphorylation and lipid metabolism proteins. This may indicate an attempt to reestablish homeostasis. Thus, the adaptation strategy was not able to restore ADP/ATP homeostasis and avoid cell death. Overall, this study provides the first insights into cellular outcomes after the co-exposure to AgNP and non-essential metals. Key words: AgNP, cadmium, mercury, co-exposure, interaction, biochemical endpoints, proteomics.

Orientador : Prof. Dr. Fernando M. Louzada Co-orientador : Prof. Dr. Érico P. G. Felden Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 22/03/2017 Inclui referências : f. 136-145 Resumo: Pesquisas em todo o mundo têm indicado a ampliação do acesso a dispositivos eletrônicos por crianças e adolescentes, sendo que o hábito de uso de dispositivos eletrônicos tem se tornado parte da rotina diária dos sujeitos nessa faixa etária, inclusive próximo à hora de dormir e durante despertares noturnos. Diversos estudos encontraram associações entre o uso de dispositivos eletrônicos e prejuízos dos padrões de sono de crianças e adolescentes. No entanto, em função da falta de resultados conclusivos sobre o tema, da escassez desse tipo de estudos no Brasil e do avanço tecnológico contínuo, desenvolveu-se o presente estudo. Os dados de uso de dispositivos eletrônicos e de padrões de sono de 2.340 estudantes de 18 escolas estaduais do município de Curitiba, com idades entre 10 e 18 anos foram obtidos por meio de questionários aplicados em sala de aula. Os padrões de sono, de posse e uso de dispositivos eletrônicos e as associações entre esses padrões foram avaliados. Entre os voluntários de nossa amostra total, 89,9% possuíam celular pessoal, 91,3% possuíam acesso à internet em casa e 67,5% possuíam hábito de assistir televisão ou de utilizar o celular ou computador antes de dormir. Os estudantes de ambos os turnos escolares que faziam uso de algum tipo de dispositivo eletrônico antes de dormir apresentavam atrasos dos horários de dormir e acordar, menor tempo na cama, maior sonolência diurna e pior qualidade de sono quando comparados aos sujeitos que não os utilizavam. Dentre os usuários de dispositivos eletrônicos, observou-se que sujeitos que utilizavam o celular antes de dormir apresentavam maior pontuação na escala pediátrica de sonolência diurna (PDSS) e 3,6 vezes mais chances (IC 95%:1,87-7,05) de retomada do uso do celular durante despertares noturnos do que os usuários de outros dispositivos. Por meio de análises de regressão logística binária observou-se que fatores como turno escolar, faixa etária, e status de peso associaram-se à redução do tempo na cama dos sujeitos, enquanto sexo e atividade física associaram-se à ocorrência de sonolência diurna. Assim, é possível afirmar que o uso de dispositivos eletrônicos antes de dormir está relacionado a prejuízos aos padrões de sono de crianças e adolescentes urbanos. Além disso, o uso de aparelhos celulares antes do horário de deitar está associado à retomada do uso desse dispositivo eletrônico durante despertares noturnos e à maior sonolência diurna do que a observada entre usuários de outros dispositivos eletrônicos. Por fim, outros fatores, além do uso de dispositivos eletrônicos, devem ser observados em razão da sua associação com os padrões de sono, sonolência diurna e qualidade de sono de crianças e adolescentes. Palavras-chave: Ciclo vigília/sono. Sonolência diurna. Dispositivos eletrônicos. Crianças. Adolescentes. Abstract: Researchs around the world have indicated the expansion of access to electronic devices by children and adolescentes. The habit of using electronic devices has become part of the daily routine of subjects in this age group, including around bedtime and during nocturnal awakenings. Several studies have found associations between the use of electronic devices and impairment of sleep patterns in children and adolescents. However, due to the lack of conclusive results, the scarcity of this type of studies in Brazil and the continuous technological advance, the present study was developed. Data from electronic device use and sleep patterns from 2,340 students from 18 public schools in the city of Curitiba, aged between 10 and 18 years old were obtained through questionnaires filled out in class. The patterns of sleep, ownership and use of electronic devices and the associations between these patterns were evaluated. Of the total number of volunteers in our sample, 89.9% had a personal cell phone, 91.3% had internet access at home, and 67.5% had a habit of watching television or using a cell phone or computer before sleep. Students in both school schedules who used some type of electronic device before bedtime had delays in sleeping and waking hours, shorter bedtime, greater daytime sleepiness, and poor sleep quality when compared to subjects who did not use them. Children and adolescents using cell phones before bedtime scored higher on the pediatric daytime sleepiness scale (PDSS) and presented a 3.6 greater chance of resuming cell phone use during nocturnal arousals (CI 95%: 1.87-7.05) when compared to users of other electronic devices. By means of binary logistic regression analysis, factors such as school schedule, age group, and weight status were associated with a reduction in the bedtime of the subjects, while sex and physical activity were associated with the occurrence of daytime sleepiness. Thus, it is possible to affirm that the use of electronic devices before sleeping is related to impairments to sleep patterns of urban children and adolescents. In addition, the use of cell phones before bedtime is associated with the resumption of use of this electronic device during nocturnal awakenings and greater daytime sleepiness than that observed among users of other electronic devices. Finally, other factors besides the use of electronic devices should be observed because of their association with sleep patterns, daytime sleepiness and sleep quality of children and adolescents. Key-words: Sleep/wake cycle. Daytime sleepiness. Electronic devices. Children. Adolescents.

Orientador : Profª. Drª. Andrea Senff-Ribeiro Coorientador : Profª. Drª. Olga Meiri Chaim Coorientador : Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 17/02/2017 Inclui referências : f. 102-115 Área de concentração Resumo: As aranhas do gênero Loxosceles (aranhas-marrons) são responsáveis pela maioria dos acidentes envolvendo animais peçonhentos em Curitiba e região metropolitana, sendo consideradas um problema de saúde pública. O veneno dessas aranhas tem sido amplamente estudado e diversos grupos de pesquisa têm investido na caracterização de suas toxinas. Entretanto, a literatura referente à hemolinfa dessas aranhas é bastante restrita: o único artigo existente foi publicado pelo nosso grupo em 2015. Baseado na premissa de que o conhecimento dos conteúdos celular, lipídico e protéico podem fornecer informações importantes sobre a toxinologia e sobre moléculas bioativas, o objetivo deste trabalho foi a caracterização bioquímica e celular da hemolinfa de L. intermedia, bem como analisar potenciais atividades biológicas da hemolinfa e suas moléculas. O perfil proteico da hemolinfa de L. intermedia em eletroforese (SDS-PAGE) uni e bidimensional revelou a presença de proteínas e peptídeos com massas variando de 20 a 200 kDa. As proteínas da hemolinfa apresentaram os resíduos de glicosilação: galactose ? (1,4) N-acetilglucosamina e alta manose. Por meio de espectrometria de massas foi verificado que os lipídios predominantes na hemolinfa são a fosfatidilcolina e a fosfatidiletanolamina. Quanto à fração celular da hemolinfa, quatro tipos de hemócitos foram identificados: os pró-hemócitos, os plasmatócitos, os adipohemócitos e os granulócitos. A atividade esfingomielinásica da toxina recombinante fosfolipase-D de L. intermedia (LiRecDT1) foi reduzida em 70% na presença da hemolinfa, contudo não foi encontrado um inibidor específico para essa enzima, sugerindo que essa redução tenha sido decorrente da dificuldade da toxina em encontrar seu substrato preferencial. O ensaio de imunodetecção indicou na hemolinfa a presença de uma proteína de aproximadamente 36 kDA com epítopo similar ao da toxina LiRecDT1, mas a hemolinfa não apresentou toxicidade para camundongos nas concentrações testadas. O cultivo primário dos hemócitos foi realizado em meio Sf-900-III SFM contendo 250 ?g/ml de gentamicina e 10% de soro (SFB). Verificou-se que a incubação dos hemócitos com veneno de L. intermedia e com a toxina loxoscélica recombinante LiRecDT1 não alterou as características morfológicas das células em microscopia optica, sugerindo ausência de processos de apoptose ou necrose. Dificuldades metodológicas não permitiram a caraterização dos hemócitos por microscopia eletrônica de transmissão. O estudo de proteômica (shotgun) não identificou inibidores de proteases ou de outras enzimas presentes no veneno; e grande parte das identificações foram relacionadas a proteínas estruturais e à hemocianina. Os experimentos de citometria de fluxo utilizando a sonda fluorescente Mitotracker permitiram a separação eficiente das populações de pró-hemócitos e plasmatócitos, contudo havia granulócitos nas duas amostras isoladas. Os ensaios de atividade antimicrobiana de peptídeos presentes na hemolinfa isolados por HPLC não evidenciou a inibição do crescimento dos microrganismos Candida albicans, Escherichia coli e Staphylococcus aureus. A hemolinfa é uma amostra biológica muito rica que deve continuar a ser investigada, contudo as dificuldades de estudá-la estão relacionadas com o baixo rendimento da coleta da amostra e a grande complexidade bioquímica do seu conteúdo (celular e proteica). Palavras-chaves: hemolinfa, L. intermedia, hemócitos, antimicrobiano, cultivo primário, inibidores, citometria. Abstract: Loxosceles genus spiders (Brown spiders) are responsible for most of the accidents involving venomous animals in Curitiba and metropolitan region and for this reason they are considered a public health problem. The venom from these spiders has been widely studied and several research groups have been focused in the characterization of the toxins. However, the literature on the hemolymph from these spiders is rather restricted: the only article was published by our group in 2015. Based on the premise that knowledge of the cellular, lipidic and proteic contents can provide important information about toxinology and bioactive molecules, the aim of this work was biochemical and cellular characterization from L. intermedia hemolymph as well as to analyze potential biological activities present in this hemolymphand yours molecules. The protein from hemolpymph of L. intermedia hemolymph in one and two-dimensional SDS-PAGE revealed the presence of proteins and peptides with molecular mass varying from 20 to 200 kDa. The protein from hemolymph presented glycosylation: galactose ? (1,4) N-acetylglucosamine and high mannose. By means of mass spectrometry analysis was verified the lipidic predominance in the hemolymph are phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine. In relation to the hemolymph cellular fraction four types of hemocytes were identified: pro-hemocytes, plasmatocytes, adipohemocytes and granulocytes. The sphingomyelinase activity of L. intermedia recombinase phospholipase-D (LiRecDT1) was decreased 70% In the presence of hemolymph, however, no specific inhibitor to this enzyme was found, suggesting that this reduction was related to difficulty of the toxin to find your preferential substrate. The immunodetection assay indicated there are in the hemolymph a protein with nearly 36 kDa with epitope resembling LiRecDT1, but this protein showed no toxicity to mice at the concentrations tested. The primary culture of hemocytes was done in Sf-900-III SFM medium plus 250 ?g /ml gentamycin and 10% FBS. It was found that the incubation venom from L. intermedia and toxin LiRecDT1with hemocytes did not present morphological alterations in these cells analyzed by optical microscopy, indicated no apoptosis or necrosis. Methodological difficulties did not allow the hemocytes to be characterization by transmission electron microscopy. In proteomic (shotgun) analysis no protease inhibitors or other enzymes present in the venom; and the most of identification were related to structural proteins and hemocyanin. The experiments of flow citometry with MitoTracker probe labeling resulted in the efficient isolation of prohemocytes and plasmatocytes, however there was granulocytes in both of samples isolated. The antimicrobial activity assays of peptides present in hemolymph isolated by HPLC did no show isolated activity against Candida albicans, Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Hemolymph is a very rich biological sample that needs to be investigated more thoroughly, but the difficulties of studying it are related to the low amount of sample (cellular and protein). Key-words: Hemolymph, L. intermedia, hemocytes, antimicrobial, primary culture, inhibitors, cytometry.

Orientadora : Dra. Andréa Rodrigues Ávila Coorientador : Prof. Dr. Alexandre Haruo Inoue Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 23/02/2017 Inclui referências : f. 151-158 Resumo: Trypanosoma cruzi é o protozoário causador da doença de Chagas, uma endemia da América Latina que afeta milhões de pessoas. Este parasita tem um ciclo de vida alternado entre hospedeiros vertebrados e invertebrados, e necessita se adaptar a mudanças em diferentes ambientes que encontra ao longo do ciclo de transmissão. O T. cruzi controla a expressão de genes a partir de eventos majoritariamente pós-transcricionais. Vias que controlam a estabilidade do mRNA ou a tradução de proteínas são bem conhecidas, enquanto que mecanismos moleculares de exportação de mRNA do núcleo para o citoplasma ainda não são bem compreendidos nem em tripanossomatídeos, nem em outros patógenos. Sabe-se, até o momento, que a maioria das proteínas envolvidas com o transporte de mRNA em outros eucariotos não está conservada em diversas espécies de parasitas. Exceto pela proteína Sub2 de T. cruzi (TcSub2), homóloga das proteínas de mamífero e levedura (UAP56/Sub2) e essencial para exportação de mRNA em tripanossomatídeos. Logo, para investigar os componentes desta via, nosso grupo tem investido em identificar proteínas exclusivas e essenciais para a exportação de mRNA em T. cruzi. Abordagens de proteômica, usando como alvo TcSub2, vem permitindo a identificação de fatores com função ainda desconhecida e/ou que são conservados apenas entre espécies de tripanossomatídeos, tornando-os alvos de interesse. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a interação de proteínas alvo com TcSub2 e seu papel na exportação de mRNA em T.cruzi. Duas proteínas não caracterizadas apresentaram motivos conservados e foram denominadas como TcFOP-like e TcAPI5-like. Interessantemente, estes motivos estão presentes em proteínas de outros organismos que estão envolvidas com a via de exportação de mRNA. Aqui, nós confirmamos que TcFOP-like e TcAPI5-like são proteínas nucleares e parecem interagir com TcSub2. Além disso, silenciamento e supereexpressão de TcFOP-like afeta o crescimento do parasita, e nós confirmamos sua interação com outros componentes da via de exportação de mRNA, tais como TcMex67 e TcHel45. Estas evidências suportam presença de components diveregentes na via de exportação de mRNA em Tripanossomatídeos. Palavras chaves: Trypanosoma cruzi. Exportação de mRNA. TcSub2.TcHel45 Abstract: Trypanosoma cruzi is the protozoan causative of Chagas disease, an endemic disease in Latin America that affects millions of people. This parasite alternates between vertebrate and invertebrate hosts during his life cycle, and needs to adapt to the changes in different environments along the transmission cycle. T. cruzi controls the gene expression mostly by post-transcriptional events. Pathways that control mRNA stability or protein translation are well known, while the molecular mechanisms for mRNA export from nucleus to cytoplasm are still not well understood nether in trypanosomatids or other pathogens. So far, it's known that the most of the proteins that are involved in mRNA transport of other eukaryotes are not conserved in many species of parasites. One exception is T. cruzi Sub2 (TcSub2), a homologue of the proteins in mammalian and yeast (UAP56 / Sub2) and essential for mRNA export in tripanossomatids. Therefore, to investigate the components of this pathway, our group has invested in identifying unique and essential proteins for the export of mRNA in T. cruzi. Proteomic approaches, using TcSub2 as target, have allowed identification of factors with the unknown function and/or that are conserved only in species of trypanosomatids, turning into interesting targets. Then, the aim of this work was to evaluate the interaction of target proteins with TcSub2 and their role in the mRNA export pathway in T. cruzi. Two uncharacterized proteins presented conserved motifs and were named here as TcFOP-Like and TcAPI5-like. Interestingly, those motifs are present in proteins of other organisms which are involved in mRNA export pathway. Here, we confirmed that TcFOP-like and TcAPI5-like are nuclear proteins and seems to interact with TcSub2. Furthemore, knockdown and overexpression of TcFOP-like affect the growth of parasites and we confirmed its interaction with other components of the mRNA export pathway, such as TcMex67 and TcHel45. Those evidences supporte the presence of divergent components in the mRNA export pathway of Tripanossomatids. Keywords: Trypanosoma cruzi. Export of mRNA. TcSub2. TcHel45.

Orientador: Prof. Dr. Ciro Alberto de Oliveira Ribeiro Coorientadora: Profa. Dra. Claudia Feijó Ortolani Machado Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 20/12/2017 Inclui referências: p.94-102 Resumo: Como uma diversidade de xenobióticos tem sido descritos como causadores de diversos tipos de malformações durante o desenvolvimento embrionário, incluindo o sistema nervoso central, este tema passou a ser de grande relevância à saúde pública. Os estádios iniciais de desenvolvimento dos embriões de ave são muito similares aos dos mamíferos tornando-os, assim, um modelo promissor para o estudo da toxicologia e permitindo extrapolar, com algumas ressalvas, para os efeitos de exposição aos humanos. Com as dificuldades impostas ao trabalho com embriões de mamíferos, incluindo humanos, o uso do embrião de galinha (Gallus gallus) surge como uma opção na avaliação do efeito da exposição a poluentes, inclusive na avaliação de misturas complexas. Assim, neste estudo buscamos avaliar o uso de embriões de ave empregando a exposição a um metal e um metalóide reconhecidamente tóxicos: chumbo (Pb) e arsênio (As) 1,5; 15 e 150 ng/ovo, incluindo a mistura binária destes com as menores concentrações. Os embriões de ave foram expostos de forma isolada ou combinada, e os aspectos morfológicos e bioquímicos (atividade da catalase e GST e os níveis de GSH, LPO e PCO), bem como a expressão de proteínas chaves no mecanismo de adesão celular (caderina e catenina) foram empregados na avaliação dos efeitos dos poluentes nos embriões após 3 e 7 dias de desenvolvimento. Os resultados mostraram que esses contaminantes causam um aumento na mortalidade embrionária e no aparecimento de diversas malformações anatômicas, incluindo malformações na região caudal, no olho e vesícula óptica e principalmente no sistema nervoso. Tanto as exposições isoladas quanto a mistura desencadearam uma desregulação do sistema redox nas células embrionárias. Essas alterações causadas no sistema redox pode ser um dos fatores envolvidos com o aumento de malformações e com a taxa de mortalidade observada nos grupos contaminados com esses xenobióticos. Foi observado ainda que os dois poluentes apresentaram a capacidade de interferir com a expressão das caderinas e cateninas, alterando vias de sinalização e adesão celular. Podemos sugerir então, que a desregulação na expressão dessas moléculas também é um fator envolvido com as malformações observadas. O modelo de embrião de ave foi considerado adequado para avaliar a toxicidade durante o desenvolvimento, pois apresentou alterações em diferentes níveis de organização biológica, as quais mostraram-se danosas para o embrião, podendo comprometer o desenvolvimento intrauterino e pós-natal do indivíduo. Palavras-chave: Embriotoxicologia, chumbo, arsênio, mistura, risco de exposição. Abstract: Once a diversity of xenobiotics have been described as causing various types of malformations during embryonic development, including the central nervous system, this topic has become of great relevance to public health. The early stages of development of bird embryos are very similar to those of mammals thus making them a promising model for the study of toxicology and allowing extrapolating, with some caveats, for the effects of exposure to humans. With the difficulties imposed on working with mammalian embryos, including humans, the use of the chicken embryo (Gallus gallus) appears as an option in the evaluation of the effect of exposure to pollutants, including the evaluation of complex mixtures. Thus, in this study we sought to evaluate the use of bird embryos using exposure to a metal and a metalloid known as toxic: lead (Pb) and arsenic (As) 1,5, 15 and 150 ng / egg, including the binary mixture of these with the lowest concentrations. The avian embryos were exposed in an isolated and combined manner, and the morphological and biochemical aspects (catalase and GST activity and levels of GSH, LPO and PCO) as well as the expression of key proteins in the cadherin and catenin cell adhesion mechanism, were used to evaluate the effects of pollutants on embryos after 3 and 7 days of development. The results showed that these contaminants cause an increase in the embryonic mortality and in the appearance of several anatomical malformations, including malformations in the caudal region, in the eye and optic vesicle and mainly in the nervous system. Both isolated and mixed exposures triggered a deregulation of the redox system in embryonic cells. These changes caused in the redox system may be one of the factors involved in the increase in malformations and in the mortality rate observed in the groups contaminated with these xenobiotics. It was also observed that the two pollutants showed the ability to interfere with the expression of cadherins and catenins, altering signaling pathways and cell adhesion. We can then suggest that deregulation in the expression of these molecules is also a factor involved with the observed malformations. The bird embryo model was considered adequate to evaluate developmental toxicity, as it presented alterations in different levels of biological organization, which were harmful to the embryo, and could compromise the intrauterine and postnatal development of the individual. Keywords: Embryotoxicology, lead, arsenic, mixture, risk of exposure.

Orientador: Prof. Dr. Ciro A. Oliveira Ribeiro Coorientador: Prof. Dr. Francisco Filipak Neto Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 29/09/2017 Inclui referências: p.84-90 Resumo: A extensa utilização de agroquímicos aumenta a liberação de xenobióticos no meio ambiente; que podem ser potencialmente capazes de atuar como indutores ou promotores do processo tumoral. Adicionalmente, suas misturas presentes no ambiente, podem interagir direta ou indiretamente por diferentes mecanismos, e os efeitos tóxicos da associação podem diferir do efeito esperado da substância isolada. Os estudos epidemiológicos são controversos nos achados que identificam a relação entre a exposição a agroquímicos e o aumento do risco de câncer; e, estudos que investigam a atuação de poluentes no prognóstico do câncer não estão disponíveis até o presente momento. O objetivo deste trabalho é verificar a resposta celular e o mecanismo de quimiorresistência por transportadores de efluxo de drogas, frente à exposição aos agroquímicos de importância comercial e ambiental e seus metabólitos isolados ou associados, nas linhagens de melanoma murino B16F1. A exposição aos agroquímicos e misturas pode alterar de forma diferente a viabilidade e o metabolismo das células B16F1; afetando negativamente a proliferação, o número de colônias e a capacidade de resistência a múltiplos fármacos das células B16F1 mesmo em concentrações abaixo da ingestão diária aceitável, disponíveis pela agência reguladora nacional. Estas respostas significativas e distintas são muito importantes, uma vez que as linhagens de melanoma geralmente possuem responsividade reduzida. As células expostas ao 2,4,6-tribromofenol (2,4,6-TBF) aumentaram o metabolismo e os níveis de mRNA de ABCB5 (qPCR), mas demonstraram uma redução da proliferação, migração e atividade de transportadores de efluxo de drogas, demonstrando que as concentrações testadas apresentam baixa toxicidade para as células de melanoma B16F1; no entanto, o duplo efeito no perfil metastático e de quimiorresistência sugerem que o aumento do ABCB5 modula positivamente a quimiorresistência celular, mas diminui a migração celular e a proliferação. Há uma forte indicação de que os agroquímicos podem interferir com o mecanismo de quimiorresistência, responsável pelo fracasso terapêutico relacionado à alta morbidade e mortalidade do melanoma cutâneo. Palavras-chave: Agroquímicos, Tribromofenol, B16F1, Cancer, Misturas. Abstract: The extensive use of agrochemicals increases the release of xenobiotics in the environment; which may be potentially capable of acting as inducers or promoters of the tumor process. Additionally, their mixtures, present in the environment, may interact directly or indirectly through different mechanisms, and the toxic effects of the association may differ from the expected effect of the isolated substance. Epidemiological studies are controversial in the findings that identify the relationship between exposure to agrochemicals and increased risk of cancer; and, studies investigating the performance of pollutants in the prognosis of cancer are not available until the present moment. The objective of this work is to verify the cellular response and mechanism of chemoresistance by drug efflux transporters, by exposure to agrochemicals of commercial and environmental importance and their metabolites isolated or associated, in the murine melanoma B16F1 lineage. Exposure to agrochemicals and mixtures may alter the viability and metabolism of B16F1 cells differently; negatively affecting the proliferation, number of colonies and multi-drug resistance capacity of B16F1 cells even at concentrations below the acceptable daily intake available by the national regulatory agency. These significant and distinct responses are very important, since melanoma lineages generally have reduced responsiveness. Cells exposed to 2,4,6-tribromophenol (2,4,6-TBF) increased metabolism and levels of ABCB5 mRNA (qPCR), but demonstrated a reduction in proliferation, migration, and activity of drug efflux transporters, demonstrating that the concentrations tested showed low toxicity to the B16F1 melanoma cells; however, the double effect on the metastatic profile and chemoresistance suggest that increased ABCB5 positively modulates cell chemoresistance but decreases cell migration and proliferation. There is a strong indication that agrochemicals may interfere with the mechanism of chemoresistance, responsible for therapeutic failure related to high morbidity and mortality of cutaneous melanoma. Key-words: Agrochemicals, Tribromophenol, B16F1, Cancer, Mixtures.

Orientador: Prof. Dr. Marco Aurélio Krieger Coorientador: Prof. Dr. Nilson I. T. Zanchin Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 24/02/2017 Inclui referências: p.128-137 Resumo: O vírus sincicial respiratório humano (HRSV) é o principal causador de infecções respiratórias agudas, incluindo pneumonia e bronquiolite em recém-nascidos e crianças pequenas; pode acometer também idosos, transplantados e pacientes imunocomprometidos. Atualmente, nenhum tratamento terapêutico eficaz ou vacina contra esta doença está disponível. Sua alta relevância reforça a necessidade do desenvolvimento de um método de diagnóstico que seja capaz de detectar o vírus logo após o surgimento dos primeiros sintomas. Porém, deve-se levar em conta as caracteristicas genéticas, que é um dos fatores limitantes dos ensaios imunológicos de detecção. O HRSV é um vírus RNA(-) de cadeia simples que codifica onze proteínas. Dados da literatura indicam que as proteínas do envelope F1 e G, e a proteína do nucleocapsídeo (N), são as que apresentam maior potencial imunogênico. As sequências codificadoras destas proteínas foram utilizadas na construção de vetores de expressão para obtenção dos seus respectivos antígenos recombinantes em Escherichia coli. Após a purificação por cromatografia de afinidade e troca iônica, estes antígenos foram utilizados para obtenção de anticorpos policlonais em camundongos. Foi produzido também um fragmento sintético de anticorpo do tipo Fab em Pichia pastoris, que reconhece a proteína F1 do HRSV. A capacidade dos anticorpos policlonais e do fragmento Fab para detectar seus respectivos antígenos recombinantes ou nativos em swabs nasofaringeal, foram avaliadas pelos ensaios de ELISA, Luminex e Western blot. Através dos ensaios de ELISA e Luminex não foi possível detectar os antígenos vírais nas amostras clínicas para nenhuma das condições testadas. Porém, nos ensaios de Western blot foi possível detectar tanto o antígeno F1 recombinante quanto os antígenos nativos, quando presentes nas amostras clínicas. Este ensaio demonstrou que o fragmento Fab recombinante está funcional e que possui a mesma capacidade para reconhecer o antígeno que o anticorpo monoclonal completo, o qual foi usado como referência nos experimentos. O fragmento Fab pode ser usado eficientemente em muitos tipos de testes diagnósticos baseados na captura de partículas virais, que são os recomendados para a fase aguda desta infecção. Palavras-chave: HRSV. Fragmento Fab. Imunodiagnóstico. Detecção de antígenos. Abstract: The human respiratory syncytial virus (HRSV) is the main cause of acute respiratory infections, including pneumonia and bronchiolitis in infants and young children, but can also affect vulnerable adults, elderly, transplanted and immunocompromised patients. Currently, no effective treatment or vaccine against this disease is available, and its high relevance enforces the necessity of the development of a diagnostic method capable of detecting the virus, as soon as the first symptoms appear and according to its genetic characteristics, which is one of the limiting factors of immunological detection assays. HRSV is a single stranded RNA(-) virus encoding only 11 proteins. The literature indicates that the envelope proteins F1 and G and the nucleocapsid protein (N) are the major immunogenic proteins. The coding sequences of these proteins were used to construct expression vectors from which their respective recombinant antigens were produced in Escherichia coli. After purification affinity and ion exchange chromatography, these antigens were used to obtain polyclonal antibodies in mice. A synthetic fragment of a Fab-type antibody that recognizes HRSV F1 protein was also produced in Pichia pastoris. The capacity of the polyclonal and the Fab fragment to detect their respective recombinant or native antigens, from nasopharyngeal swabs, was evaluated by ELISA, Luminex system and Western blot assays. The ELISA and Luminex assays fail to detect the viral antigens in the clinical samples in all tested conditions. However, with Western blot assays, it was possible to detect both, the recombinant F1 and the native antigens when present in the clinical samples. Through these assays it was possible to demonstrate that the recombinant Fab fragment is functional and has the same ability to recognize antigens as the complete monoclonal antibody, which was used as a control in the experiments. This fragment can be efficiently used in many types of diagnostic tests based on the capture of viral particles which are recommended for the acute phase of infection. Key-words: HRSV. Fab fragment. Immunodiagnosis. Antigen detection.

Orientador : Prof. Dr. Ciro Alberto de Oliveira Ribeiro Coorientador : Prof. Dr. Anderson Joel Martino de Andrade Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 05/07/2017 Inclui referências : f. 98-107 Resumo: O uso de antimônio (Sb) pelas diversas sociedades vem de tempos remotos. Seu mais antigo e mais comum uso é no tratamento da leishmaniose, no entanto seu uso como sinergista em retardantes de chamas e na catálise de polímeros plásticos vem crescendo enormemente nas últimas décadas. O potencial tóxico das formas pentavalentes, utilizadas no tratamento de doenças já foi extensivamente estudando, no entanto esta não é a forma biologicamente ativa, sendo convertida na forma trivalente pelos sistemas biológicos. Frente a isto torna-se essencial estudar os efeitos das formas trivalentes, considerando doses relevantes para a exposição humana. Desta forma, diversas doses de antimônio no seu estado de oxidação +3 (trióxido de antimônio - Sb2O3) foram testadas seguindo diversos protocolos. No capítulo 1, são relatados os efeitos do Sb2O3 sobre o sistema endócrino e reprodutivo de ratos Wistar, seguindo protocolos experimentais específicos para avaliar disfunção endócrinas propostos pela Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (EPA-US). Neste caso nenhum efeito de disfunção endócrina (anti) estrogênica ou (anti) androgênica foram observados, no entanto danos histológicos em tireóide e testículos foram comuns frente a exposição ao Sb2O3. No capítulo 2 são relatados os efeitos desta substância sobre as condições oxido redutoras e danos em macromoléculas de fígado, rim, pulmão e coração. Também foram analisados danos histológicos em órgãos de biotransformação e excreção e possíveis danos neurológicos. Os resultados deste capítulo levam a conclusão de que o Sb2O3, mesmo em baixas doses pode alterar a homeostase especialmente hepática e renal, alterando enzimas e moléculas relacionadas ao balanço oxi-redutor bem como danificar macromoléculas essenciais à integridade celular. Desta forma conclui-se que, embora o Sb2O3 não tenha propriedades desreguladoras endócrinas, ele possui efeitos tóxicos sobre o organismo como um todo. Palavras chave: Desregulação endócrina, Estresse oxidativo, Antimônio, ratos Wistar. Abstract: Antimony is a world widespread substance used a long time ago in human history. It most common use is in leishmaniosis treatment, but it use as a flame retardant and in plastic catalysis are increasing in last decades. Antimony exist as pentavalent and trivalet forms. The toxicology of pentavalent Sb, commonly used in disease treatment, are well studied. However, the pentavalent form is converted in the trivalent form by biological systems, and Sb+3 is more toxic than the Sb+5 oxidation state, turning necessary study the most toxic form in a dose relevant for human exposure. In the present thesis, Sb2O3, were used as a Sb+3 contaminant, considering diverse exposure protocols. In the first chapter, the effects of Sb2O3 under endocrine and reproductive systems were evaluated following EPA protocols proposed for endocrine disrupting contaminants. No (anti) estrogenic or (anti) androgenic effects of Sb were observed in all tested doses and protocols, but damages in thyroid and testis were common after Sb2O3 exposure. In the second chapter of this thesis, the effects of Sb under oxidative stress, as well histologic alterations and neurologic effects were considered. The present results show that antimony can alter the body homeostasis, especially renal and hepatic enzymes related to oxidative balance and cause damages to macromolecules. Considering all presented results, we conclude that Sb do not exert endocrine disrupting effects, but exert toxic effects, especially for liver and kidneys. Key - words: Endocrine disfunction, oxidative stress, antimony, Wistar rats.

Orientador : Prof. Dr. Silvio Marques Zanata Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 12/12/2016 Inclui referências : f. 65-70 Resumo: A ubiquitinação está envolvida em vários processos no organismo, desde ciclo celular até vias de sinalização de apoptose. Por esse amplo envolvimento, é de extrema importância uma fina regulação que é realizada por enzimas chamadas deubiquitinases (DUBs) que hidrolisam ligações isopeptídicas. Dentre todas as DUBs, USP é a família mais extensa tendo como membro USP2 que possui duas isoformas fruto de processamento alternativo: USP2a (de 69kDa) e USP2b (de 45kDa) que se diferenciam apenas na região N-terminal. Alguns estudos relacionam essas isoformas com a via da p53, miogênese, tumores de próstata, agressividade de tumores de mama e manutenção dos níveis de Na+ e pressão sanguínea. Apesar desses estudos, a distribuição tecidual da USP2 ainda não está completamente estabelecida. A presença de duas isoformas distintas de processamento e a inexistência de anticorpos comerciais que possam distinguir entre as duas isoformas justifica a produção de reagentes confiáveis para o estudo de USP2. Desde modo, o objetivo foi produzir anticorpo monoclonal, isoforma específico, para USP2a e clonar, produzir proteína recombinante em bactérias e superexpressar USP2b em células eucariontes. USP2a foi produzida em E. coli BL21(DE3)STAR fusionada com etiqueta de histidina e purificada por coluna de Ni-NTA. A proteína purificada foi usada para imunizar camundongos balb/c. O soro policlonal desses animais foi testado por western blot para a presença de anticorpo anti-USP2a quanto ao reconhecimento da proteína endógena e superexpressa em linhagens de próstata LNCaP e RWPE-1 tendo dois animais positivos usados para a fusão com mieloma. Os hibridomas após a diluição limitante foram varridos por ELISA chegando-se a um clone 4GD2 que reconheceu USP2a superexpressa em HEK293T e não reconheceu USP2b superexpressa em HEK293T, indicando que obteve-se sucesso na produção de um anticorpo monoclonal isoforma específico para USP2a. Além disso, a isoforma USP2b foi clonada com sucesso nos vetores pET28a(+) e pcDNA3.1(-)6his. Esta isoforma não foi expressa em E. coli mesmo com várias mudanças no sistema, desde cepa bacteriana até temperatura, meio e tempo de expressão, mas foi superexpressa em HEK293T. As ferramentas produzidas serão de extrema importância para estudos de mapeamento tecidual, análise de cinética e busca de novos parceiros moleculares para essas isoformas. Palavras-chave: USP2, USP2a, USP2b, anticorpo monoclonal, proteína recombinante. Abstract: Several physiological processes involve ubiquitylating modification, from cell cycle to apoptosis pathways. Because this involvement has a large range, it is extremely important that this post-translational modification be tightly regulated. Enzymes called deubiquitinases (DUBs) hydrolyze isopeptide bond and have a pivotal role in this regulation. Among all DUBs, the USP is the largest family. USP2, a member of this family, has two isoforms from alternative splicing: USP2a (69kDa) and USP2b (45kDa) and differences rely within their N-terminal regions. These isoforms have related to p53 pathway, myogenesis, prostate tumors, breast tumors aggressiveness and maintenance of Na+ levels and blood pressure. Despite these studies, the tissue distribution of USP2 is not completely established. Absences of commercial antibody that recognize specific isoforms justify the production of reliable reagents to study USP2. Thus, the aims of this study were (1) to express both USP2a and USP2b in heterologous bacterial system; (2) to overexpress USP2b in mammalian cells and (3) to produce monoclonal antibodies specific to USP2a isoform. USP2a was produced in E. coli BL21(DE3)STAR fused with polyhistidine tag and purified by Ni-NTA column. The purified protein was used to immunize Balb/c mice strain. We have tested the polyclonal serum of these animals by western blot to the presence of antibody anti-USP2a that recognize endogenous and overexpressed protein in prostate line LNCaP and RWPE-1. Two animals were positive and employed in fusion procedures. After hybridoma supernatant screenings for anti-USP2a presence by ELISA, we isolated the clone 4GD2, which was stable and still secreting antibodies after several freeze-thaw cycles. Monoclonal antibody 4GD2 recognizes USP2a overexpressed in HEK293T cells and does not cross-react with USP2b, suggesting that MoAb 4GD2 is highly specific. In addition, USP2b was successfully cloned in pET28a(+) and pcDNA3.1(-)6his vectors, both expression vectors for prokaryotic and eukaryotic systems, respectively. We were not able to express successfully USP2b in E. coli under different protocols (e.g. temperature, medium and time parameters changes), however we expressed His-tagged USP2b in HEK293T cells. The produced tools will be extremely important in further studies, such as tissue and temporal USP2 expression mapping, USP2 expression and disappearing kinetics in cell lines and characterization of new molecular partners for this DUB. Key words: USP2, USP2a, USP2b, monoclonal antibody and recombinant protein.

Orientador : Profª. Drª. Lucélia Donatti Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 30/11/2016 Inclui referências : f. 94-114 Área de concentração Resumo: Os peixes antárticos são considerados animais extremamente estenotérmicos. Porém, estudos têm apontado que algumas espécies são capazes de compensar sua taxa metabólica para lidar com o aquecimento. As brânquias são estruturas multifuncionais e bastante sensíveis a variações térmicas, podendo apresentar alterações compensatórias nos níveis das enzimas glicolíticas e mitocondriais em reposta à elevação térmica. O estresse térmico pode gerar, também, em excesso, espécies reativas de oxigênio, altamente deletérias e capazes de promover estresse oxidativo. Considerando as tendências de aquecimento na região da Península Antártica e com intuito de verificar a plasticidade térmica de duas das espécies mais abundantes da Baía do Almirantado, Ilha do Rei George, foram avaliados os efeitos do estresse térmico de curto prazo (8ºC), por 2, 6, 12, 24, 72 e 144 horas, e de longo prazo (4 e 8ºC), por 1, 4, 15 e 30 dias, no potencial osmorregulatório, metabolismo de carboidratos e sistema de defesa antioxidante em brânquias de Notothenia rossii e Notothenia coriiceps. As alterações observadas foram dependentes da espécie e dos tempos de exposição às temperaturas avaliadas. N. rossii apresentou maior tolerância térmica que N. coriiceps, já que indivíduos dessa espécie morreram após 6 dias de exposição a 8ºC. Com relação ao potencial osmorregulatório, os níveis de atividade da Na+/K+-ATPase (NKA) aumentaram em resposta à elevação térmica apenas em N. rossii, provavelmente devido a um maior turnover enzimático ou como consequência de alteração na fluidez de membrana em decorrência da LPO. As consequências de maiores níveis de atividade da NKA seria uma redução da osmolalidade sérica e maior demanda energética pelos órgãos osmorregulatórios, mas que não foi verificada neste estudo. Com o estresse térmico de curto prazo, foi verificada uma situação de anaerobiose nas brânquias de N. rossii, através da elevação dos níveis de atividade da lactato desidrogenase (LDH) e de lactato. Porém, o metabolismo aeróbico foi recuperado, com o estresse térmico de longo prazo. Nas brânquias de N. coriiceps, o estresse térmico de curto prazo resultou, num primeiro momento, em anaerobiose, seguida por recuperação da aerobiose, juntamente com uma redução dos níveis de glicogênio, o que pode ser consequência de uma maior demanda energética. A longo prazo, a anaerobiose foi, mais uma vez, ativada, o que pode ter comprometido a tolerância térmica desses indivíduos. Nas brânquias de N. rossii, mesmo com maiores níveis de antioxidantes, verificou-se um maior índice de lipoperoxidação (LPO) e de proteínas carboniladas com o estresse térmico de curto prazo, provavelmente em resposta ao quadro de hipóxia tecidual. Com o estresse térmico de longo prazo o índice de LPO foi ainda maior, provavelmente devido a uma falha do sistema antioxidante de N. rossii em reposta ao estresse térmico de longo prazo. O estresse térmico de curto prazo, nas brânquias de N. coriiceps, não resultou em danos oxidativos, provavelmente devido à eficiência de seu sistema de defesa antioxidante. O estresse térmico de longo prazo (4ºC), resultou em maior LPO, devido à condição de hipóxia observada nessa situação. Considerando os resultados deste estudo, embora as brânquias de N. rossii tenha sofrido com elevado índice de LPO, o que pode ter comprometido o potencial osmorregulatório nessa espécie, N. rossii conseguiu ser aclimatada à temperatura de 8ºC após exposição de longo prazo, devido, provavelmente, à inibição do metabolismo anaeróbico. N. coriiceps, por sua vez, não conseguiu reverter a condição de anaerobiose, sendo essa a causa provável de sua morte. Palavras-chaves: temperatura, metabolismo de carboidratos, estresse oxidativo, Na+/K+-ATPase, Notothenia, aquecimento. Abstract: Antarctic fish are extremely stenothermal animals. However, studies have shown that some species are able to compensate their metabolic rate to deal with the higher costs of living at elevated temperature. The gills are very sensitive to temperature variations and may perform compensatory changes in the levels of glycolytic and mitochondrial enzymes. Heat stress can also increase the generation of reactive oxygen species, extremely reactive and therefore harmful molecules, capable of causing oxidative stress. In the latter half of the 20th century, the Antarctic Peninsula was among the fastest warming places on Earth. The thermal plasticity of Notothenia rossii and Notothenia coriiceps, Antarctic notothenids very abundant in Admiralty Bay, King George Island, were evaluated by short-term heat stress (8°C) for 2 6, 12, 24, 72 and 144 hours, and long-term heat stress (4 and 8°C) for 1, 4, 15 and 30 days. The osmoregulatory potential, carbohydrates metabolism and antioxidant defense system were evaluated int rhe gills of both species. The results showed that heat stress effects was dependant on the specie, exposure time and temperature. N. rossii presented higher thermal tolerance than N. coriiceps, which died after 6 days at 8°C. With regard to the osmoregulatory potential of the gills against heat stress, the levels of activity of the Na+/K+-ATPase (NKA), increased only in N. rossii, probably due to greater enzyme turnover, or as a consequence of altered membrane fluidity due to LPO. The consequences of increased NKA activity levels would be serum osmolality decrease and increased energy demand for osmoregulatory organs, but this was not verified in this study. The short-term thermal stress resulted in anaerobiosis on the gills of N. rossii; however the aerobic metabolism was recovered with the long-term thermal stress. In N. coriiceps, the short-term heat stress resulted, at first, in anaerobiosis, and the energy demand, characterized by glycogen consumption, increased; aerobic metabolism was activated within 144 h. In the long term, anaerobiosis was activated, which may have compromised the thermal tolerance of N. coriiceps.. Even with the upregulation of antioxidant defence, the short-term heat stress caused increased lipid peroxidation (LPO) and protein carbonylation, probably due to tissue hypoxia in N. rossii gills. After long-term heat stress, the LPO levels were even higher, probably due to an inhibition of the antioxidant system of N. rossii. In N. coriiceps, the short-term heat stress did not result in oxidative damage by the efficiency of its antioxidant defense system. However, the long-term heat stress (4°C), resulted in higher LPO levels, probably due to tissue hypoxia. Although the gills of N. rossii showed a high LPO index, which could have compromised the osmoregulatory potential of this specie, it is likely that N. rossii has been acclimated to of 8°C after long-term heat stress, probably due to anaerobic metabolis inhibition. N. coriiceps, on the other hand, could not reverse the condition of anaerobiosis, which is the probable cause of the death. Key-words: temperature, carbohydrate metabolism, oxidative stress, Na+/K+-ATPase, Notothenia, warming.

Orientador : Christian Macagnam Probst Coorientador : Daniela Parada Pavoni Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 29/08/2016 Inclui referências : f. 133-147 Resumo: O Trypanosoma cruzi é o agente da doença de Chagas, sendo um protozoário flagelado pertencente à ordem Kinetoplastida. Este parasita está distribuído em 21 países. Possui um ciclo de vida bastante complexo com diferenças morfológicas ultra-estruturais, funcionais e bioquímicas, apresentando sob diferentes formas nos hospedeiros invertebrados e vertebrados. A forma epimastigota é não infectiva e proliferativa, encontrada naturalmente no trato digestivo do inseto vetor, podendo ser cultivada in vitro. Um importante passo para melhor entendimento desse parasita é estudo das suas características celulares e moleculares apresentadas durante a sua curva de crescimento. Nesse trabalho foi apresentada uma visão global do perfil de expressão gênica a partir das frações de mRNA total e polissomal ao longo de 10 dias da curva de crescimento de epimastigotas de T. cruzi. Usando a metodologia de RNA-seq, 2491 genes diferencialmente expressos (DEGs) foram identificados, dos quais 768 foram modulados em ambas as frações. De acordo com os padrões de modulação encontrados, os DEGs foram agrupados em 13 clusters e alguns destes apresentaram enriquecimento de termos de ontologia gênica (GO) indicando os processos biológicos e moleculares envolvidos. Análises do perfil polissomal podem revelar quais genes estão sendo traduzidos em uma determinada condição, assim o padrão de expressão desses mRNAs pode ser diferente nas frações de total e polissomal. No entanto, foi encontrada uma extensa sobreposição dos padrões de modulação para a maioria dos clusters. Claramente durante a fase estacionária o conteúdo de polissomos apresentou uma forte diminuição associado ao surgimento de grânulos de mRNA. Isto sugere que durante esta fase a maioria dos transcritos isolados a partir do colchão de sacarose está provavelmente associada a complexos de mRNA invés de polirribossomos. Isto pode indicar que os mRNAs da fase estacionária podem estar sendo protegidos por esses grânulos para posterior tradução quando o ambiente se tornar novamente favorável. Vários aspectos da curva de crescimento deste parasita foram destacados, principalmente em relação as alterações pelas quais o parasita transita ao longo da fase estacionária. Além disso, foi investigada uma possível via de controle através da concentração de glicose a qual foi proposta a partir de comparações com estudos de Saccharomyces cerevisiae. Para um estudo complementar da curva de crescimento foi realizada uma abordagem de proteômica. Os dados preliminares mostraram uma boa identificação de grupos de proteínas (3.249), a maioria representando uma proteína por grupo. Algumas proteínas diferencialmente expressadas (DEPs) foram detectadas, apesar do baixo poder estatístico das análises. Dentre 68 DEPs identificadas, 21 mostraram correlação no padrão de modulação com os dados de transcritômica. Também foi apresentada uma análise de transcritômica preliminar de epimastigotas em fase estacionária inicial submetidos a diferentes condições nutricionais (PBS, TAU e TAU3AAG) por 1, 2, 4, 6 e 24 horas. Foram identificados 612, 804 e 941 supra-genes diferencialmente expressos nos meios PBS, TAU e TAU3AAG, respectivamente. A maioria dos supra-genes modulados foram comuns nas três condições. Juntos, esses estudos representam uma etapa importante na obtenção de dados em larga escala que geração de conhecimento sobre o comportamento e resposta do parasita em diferentes condições ambientais. Palavras-chave: Trypanosoma cruzi, doença de Chagas, curva de crescimento, RNA-seq, polissomos, proteômica e estresse. Abstract: The Trypanosoma cruzi is a flagellated protozoa that belongs to the Kinetoplastida order and is the etiologic agent of Chagas disease, an endemic illness distributed in 21 countries. The T. cruzi life cycle is complex including morphological, functional and biochemical changes. The epimastigote form is proliferative and non-infective, founded naturally in the insect vector gut and can be cultivated in vitro. An important step to comprehend the T. cruzi biology is the study of cellular and molecular features presented during its growth curve. Here, we show a global view of gene expression profile for total and polysomal RNA fractions along 10 days of the T. cruzi epimastigote growth curve in vitro. A total of 2491 differential expressed genes (DEGs) were established using RNA-Seq approach, of which 768 were modulated in both fractions. According to the modulation pattern, these DEGs were grouped into 13 clusters and some of them show enrichment to important GO terms, indicating molecular and cellular biological processes involved. The polysomal profile might reveal mRNAs that are being translated and their expression pattern could be different from the total RNA fraction, nevertheless, in most clusters we see remarkable overlapped modulation. Moreover, at the stationary phase the polysomal content greatly decline while the RNA granules seems to increase. This suggests that most of mRNAs isolated from sucrose cushion at this growth stage should be associated with granules instead with polyribosomes. This possible indicates that stationary phase mRNAs are being protected by granules for further translation when the environment becomes favorable. We highlight some views on the T. cruzi growth curve, mainly related to the alteration that the parasite pass along the stationary phase. Moreover, a possible sensing pathway for glucose depletion was suggested for T. cruzi based on Saccharomyces cerevisiae studies comparison. Growth curve complementary study was performed using proteomic approach. Preliminary data shows the identification of 3,249 protein groups, mostly representing one protein per group. Some differential expressed proteins (DEPs) were identified, besides the limited statistical power. Among the 68 DEPs identified, 21 showed correlation in their proteomic and transcriptomic modulation pattern. Preliminary transcriptomic analysis of epimastigote in early stationary phase under three nutritional different conditions (PBS, TAU, TAU3AAG) during 1, 2, 4, 6 and 24 hours were also present here. Total of 612, 804 and 941 differential expressed supra-genes were identified in PBS, TAU and TAU3AAG conditions, respectively. Most of supra-genes were common to all treatments. Together, these works represent an important step for large scale data generation that will provide insights into the parasite behavior and response to different environmental conditions. Key-words: Trypanosoma cruzi, Chagas disease, growth curve, RNA-seq, polysomes, proteome and stress.

Orientador : Profª. Drª. Rosana Nogueira de Morais Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 19/12/2016 Inclui referências : f. 64-72;80-91 Área de concentração : Fisiologia Resumo: Durante o período embrionário a ação dos androgênios tem papel determinante na diferenciação sexual, no desenvolvimento dos órgãos sexuais masculinos e, naturalmente, produzem efeitos masculinizantes no cérebro. A baixa razão 2D:4D, obtida pela divisão do comprimento do segundo dedo (indicador) pelo quarto dedo (anelar), é apontada como indicador de androgenização pré-natal e associada com desempenho esportivo em muitas modalidades. Nós analisamos a associação da medida da razão 2D:4D com desempenho esportivo, caracteristicas fisicas, psicológicas e hormonais. Foram três estudos apresentados no formato de artigo. No estudo 1 analisanos a medida da razão 2D:4D direta (diretamente na mão do sujeito) e a medida indireta (em imagens da mão por escâner) de 114 homens e 90 mulheres e, adicionalmente, realizamos uma revisão de literatura minuciosa para comparar nossos dados. Demonstramos que há um efeito direcional no qual a medida direta da razão 2D:4D tende a ser maior que a medida indireta, ou seja, a medida indireta superestima o grau de androgenização pré-natal. No estudo 2, avaliamos, a produção de força muscular, liberação de testosterona, cortisol, agressividade e estabilidade emocional em 89 homens adultos, quando expostos a um vídeo contendo imagens de agressão no esporte (situação desafiadora) comparando com os mesmos em situação controle. Foi demostrado que a situação desafiadora modula um aumento de força muscular, de agressividade e de concentração de testosterona e ainda diminui a estabilidade emocional. A maior produção de força na situação de desafio, foi associada por regressão múltipla com baixa razão 2D:4D e a maior controle emocional. No estudo 3, avaliamos a razão 2D:4D de 64 tenistas infanto-juvenis do sexo masculino e observamos que a menor razão 2D:4D foi associada em 35% com melhor desempenho tenístico, em 20% com maior produção de força muscular, em 9% com maior potência muscular de membros inferiores e em 7% com maior índice de autoconfiança. Não encontramos associação da razão 2D:4D com concentrações hormonais, apenas confirmamos o resultado do estudo 2, no qual ocorre um aumento de testosterona em 13% quando os sujeitos foram submetidos aos desafios dos testes físicos. Por fim, indicamos que há associação da razão 2D:4D e desempenho no tênis, porém estudos em mulheres e mais aspectos necessitam ser investigados para entender melhor qual componentes explicam a relação da androgenização pré-natal e desempenho no tênis. Mesmo assim, apresentamos dados suficientes para sugerimos que a medida da razão 2D:4D pode auxiliar treinadores, como medida adicional, na avaliação física de jovens atletas. Palavras-chave: Diferenciação sexual, Razão do dedo, 2D:4D, medida direta e indireta, força estatística, testosterona, agressão, força de preensão manual. 2D:4D. Abstract: Prenatal androgenization plays an important role in human brain development and influences human behaviour. Digit ratio (2D:4D), the relative lengths of the index finger (2D) and the ring finger (4D), is a putative marker for prenatal testosterone and is correlated with performance in many sports. This thesis analysed the relationship between 2D:4D ratio with sport performance and physical, psychological and endocrine characteristics. It divided in three studies, and in the first one we investigated a methodological question regarding 2D:4D measuring. We compared direct versus indirect measurement of digit ratio (114 males and 90 females). And reviewed the literature on this issue. We found that direct 2D:4D measuring tends to be larger than indirect ones, indicating that direct and indirect mean 2D:4D's should not be compared in between-population studies. On the second study, we hypothesised that correlation between 2D:4D and strength may be strongest in challenge conditions when short-term changes occur in steroid hormones. The challenge condition increased Handgrip strength (HGS), and elicited modest changes in testosterone (T), physical aggression and emotional stability. HGS correlated negatively with left hand 2D:4D. In a multiple regression, left hand 2D:4D was negatively related to HGS and emotional stability was positively related to HGS. In the control condition HGS was not correlated with 2D:4D. Our conclusions were that 2D:4D is a negative correlate of strength in challenge situations and this finding may in part explain associations between 2D:4D and sports performance. In the third study, we assessed 64 male junior tennis players and found that low 2D:4D ratios were associated in 35% with better tennis performance, in 20% with higher HGS, in 9% with explosive muscular strength and in 7% with best self-confidence. There was no relationship between 2D:4D ratios and steroid hormones, although, as we found on study two there was a T increase in 13% after the physical tests challenge. Finally, we suggest that there are associations with 2D:4D ratios and junior tennis performance, however, studies in female junior tennis players and other sports-related variables are still needed. We suggest that 2D:4D ratios could help sports coaches as an additional measure on young athlete assessments. Key words: Sexual Differentiation, Digit Ratio, 2D:4D; direct vs indirect measurement; Tennis; Testosterone; Aggression; Hand-grip Strength

Orientador : Profª. Drª Daniela Parada Pavoni Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 31/08/2016 Inclui referências : f. 106-114 Resumo: A doença infecciosa da bursa (IBD) ou doença de Gumboro é uma doença viral de galinhas (Gallus gallus) relevante para o comércio internacional de animais e de seus produtos. Está associada à mortalidade e imunossupressão dos animais. Considerando a importância econômica da avicultura para o Brasil e o estado do Paraná, é obrigatório a tomada de medidas de controle em granjas comerciais, que visem a prevenção de surtos e a vigilância sobre o aparecimento de novas variantes, mais patogênicas, e que não respondem às vacinas. Testes diagnósticos confiáveis são ferramentas importantes no controle dessa infecção. A utilização de proteínas recombinantes como substrato de testes sorológicos é uma atraente alternativa para a produção nacional de reagentes, uma vez que os testes atualmente utilizados são importados. Sequências das proteínas antigênicas VP2 e VP3 de cepas brasileiras e estrangeiras, selvagens e vacinais foram buscadas no banco de dados do NCBI e alinhadas utilizando o programa ClustalW. Foram selecionadas 10 sequências nucleotídicas para síntese comercial clonadas no pUC57, das quais 9 da VP2 e uma da VP3. Os genes sintéticos foram clonados no vetor pET-28a (Novagen) para expressão em Escherichia coli e pMIB/V5-His (Invitrogen) para expressão em células de insetos. Fragmentos da VP3 foram obtidos por PCR fusionados à GFP para aumentar a massa molecular dos peptídeos. A expressão da VP2 em células de insetos e em E. coli não foi obtida. A VP3 e os fragmentos foram expressos na cepa BL 21 Star. A VP3 foi expressa em corpos de inclusão e solubilizada com 2 M de ureia. Os fragmentos foram obtidos na fração solúvel. A purificação das proteínas foi realizada por afinidade em resina de níquel. A reatividade da VP3 e fragmentos foi testada no teste de ELISA indireto. O teste de ELISA da VP3 com soros de animais vacinados e não vacinados apresentou 93,75% de sensibilidade e 85,19% de especificidade. Utilizando somente soros de animais imunizados o teste de ELISA apresentou 100% de sensibilidade e especificidade. O mapeamento das regiões antigênicas da VP3 mostrou duas regiões, fragmentos 2 e 7, que concentraram maior número de epitopos. Os fragmentos 5, 6, e 7 foram as regiões da VP3 mais reativas. Este estudo mostrou que a proteína recombinante VP3 pode ser utilizada para avaliar o status imunológico pós-vacinal das aves. A utilização da VP3 recombinante para diagnosticar a presença/ausência da doença em animais não vacinados deve ser melhor avaliada utilizando uma amostragem maior desses animais no teste de ELISA. Através dos resultados do mapeamento foi possível estabelecer regiões da proteína VP3 mais antigênicas, entretanto mais testes devem ser conduzidos antes de considerar a utilização dos fragmentos no diagnóstico do vírus da doença infecciosa da bursa (IBDV) em galinhas. Palavras-chave: doença infecciosa da bursa, doença de Gumboro, proteína recombinante, vírus da doença infecciosa da bursa, proteína VP2, proteína VP3, mapeamento de regiões antigênicas, teste de ELISA, diagnóstico da doença infecciosa da bursa. Abstract: Infectious bursal disease (IBD) or Gumboro disease is a viral disease of chickens (Gallus gallus) relevant to international trade in animals and their products. It is associated with mortality and immunosuppression in animals. Considering the economic importance of poultry production to Brazil and to the state of Paraná, taking control measures on commercial farms is mandatory for the prevention of outbreaks and surveillance of the appearance of new more pathogenic variants that do not respond to vaccines. Reliable diagnostic tests are important tools in the control of this infection. The use of recombinant proteins as serological tests substrates is an attractive alternative to the domestic production of reagents, since the currently used tests are imported. Sequences of antigenic proteins VP2 and VP3 of Brazilian and foreign strains, wild and vaccine were sought in the NCBI database and aligned using the ClustalW program. Ten nucleotide sequences were selected, 9 sequences of VP2 and one of VP3. These sequences were commercially synthesized and cloned into pUC57. The synthetic genes were cloned into pET-28a vector (Novagen) for expression in Escherichia coli and into pMiB/V5-His (Invitrogen) for expression in insect cells. Fragments obtained by PCR using VP3 as template were used fused to GFP to increase the molecular weight of the peptides. Expression of VP2 in insect cells and E. coli was not obtained. The VP3 and the fragments were expressed in BL 21 Star strain. The VP3 was expressed in inclusion bodies and was solubilized with 2 M urea. The VP3 fragments were obtained in the soluble fraction. Purification of the protein was accomplished by nickel affinity resin. The reactivity of VP3 and fragments was tested by ELISA. The ELISA test with VP3 sera of animals vaccinated and non-vaccinated showed sensitivity of 93.75% and specificity of 85.19%. Using only the sera of immunized animals ELISA showed sensitivity and specificity of 100%. Mapping the antigenic regions of VP3 showed that two regions, fragments 2 and 7, present the highest proportion of epitopes. Fragments 5, 6, and 7 were the most reactive VP3 regions. This study showed that the recombinant protein VP3 can be used to assess post-vaccination immune status of the birds. The use of recombinant VP3 for diagnosing the presence / absence of the disease in non-vaccinated animals should be further evaluated using a larger sample of these animals in the ELISA test. Through the results of the mapping it was possible to establish regions of more antigenic protein VP3, though more tests should be conducted before considering the use of fragments in the diagnosis of IBDV in chickens. Keywords: infectious bursal disease, Gumboro disease, recombinant protein, infectious bursal disease vírus, VP2 protein, VP3 protein, mapping of antigenic regions ELISA test, diagnosis of infectious bursal disease.

Orientador : Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga Coorientador : Profª. Drª. Olga Meiri Chaim Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 26/02/2015 Inclui referências : f. 102-115 Área de concentração Resumo: O conteúdo total do veneno das aranhas do gênero Loxosceles permanece ainda desconhecido, entretanto, muitos estudos têm mostrado que se constitui uma mistura complexa de compostos biologicamente ativos. Por meio de análises eletroforéticas, observa-se a predominância de moléculas de baixa massa molecular (3-45 kDa), enquanto moléculas de alta massa molecular são menos abundantes. Os venenos de aranhas estão funcionalmente relacionados à defesa contra predadores e também à paralisia e captura de presas, especialmente insetos. As aranhas desenvolveram um arsenal de moléculas inseticidas, resultando em uma biblioteca combinatória de peptídeos que tem sido aprimorada durante sua evolução. Comumente, tais peptídeos consistem em moléculas de cadeia única com massa molecular variando de 3 a 10 kDa, ricos em resíduos de cisteína, os quais estabelecem pontes dissulfeto intramoleculares características. Essas pontes se organizam em um motivo estrutural característico denominado "nó de cistina inibidor" ou ICK (Inhibitor Cystine Knot) e, por isso, os peptídeos que o contém são denominados peptídeo ICK ou notinas ("knottins"). Recentemente, análises do transcriptoma da glândula de veneno de L. intermedia (GREMSKI et al., 2010) revelaram ESTs com similaridade a peptídeos ICK previamente descritas como LiTx (De CASTRO et al., 2004). Sequências relacionadas à LiTx3, por exemplo, foram as mais abundantes no transcriptoma de L. intermedia, representando aproximadamente 13,9% de todas as ESTs obtidas e compreendendo 32% dos mRNAs codificantes de toxinas; as sequências relativas aos demais grupos de peptídeos ICK, LiTx1, LiTx2 e LiTx4 representaram 6,2%, 11,4% e 3,8% de todos os transcritos codificantes de toxinas, respectivamente. Devido a alta proporção de sequências codificantes para peptídeos ICK os objetivos deste trabalho foram o rastreamento de sequências codificantes de peptídeos ICK em outras duas aranhas do gênero (Loxosceles gaucho e Loxosceles laeta), bem como a obtenção de um peptídeo ICK semelhante à LiTx3 de forma recombinante em Pichia pastoris e sua caracterização biológica. A partir do RNA total extraído das glândulas de veneno de L. laeta e L. gaucho, procedeu-se o rastreamento de sequências relacionadas a peptídeos ICK; sequências codificantes para todos os grupos de peptídeos ICK já descritos (LiTx1-4) foram encontradas, algumas revelando sutis diferenças na sua estrutura primária, outras revelando divergências importantes como a não presença de sequências consenso para modificações pós-traducionais importantes para a atividade biológica dos mesmos. Quanto à produção do peptídeo recombinante, várias formas foram obtidas; entretanto, análises de SDS-PAGE e western blotting mostraram que os peptídeos obtidos ou não apresentavam a conformação nativa ou apresentavam glicosilação indesejada. A atividade biológica desses peptídeos foi testada in vivo em insetos e in vitro em cultura de células, contudo nenhum efeito tóxico pode ser comprovado. As sequências encontradas em L. laeta e L. gaucho representam potenciais moléculas a serem exploradas do ponto de vista biotecnológico, ao passo que o peptídeo recombinante estudado deve ser expresso em outros modelos com intuito de obtê-lo em conformação adequada e, assim, comprovar sua atividade biológica. Palavras-chave: Peptídeo ICK, notinas, Loxosceles, veneno, Pichia pastoris. Abstract: The whole content of Loxosceles spider venom still remains unknown, but several studies have shown that is a complex mixture of biologically active and inactive components. By eletrophoretic analysis, the predominance of low molecular mass molecules (3-45kDa) can be observed, while high molecular mass ones are less abundant. Spider venoms are functionally related to defense against predators as well as to paralyze and capture a natural prey, especially insects. Spiders had developed an arsenal of insecticidal molecules, resulting in a combinatorial peptide library of peptides that has been improved during evolution. Commonly, such peptides consist in single chain molecules ranging between 3- 10 kDa and are rich in cystein residues, which form intramolecular disulfide bridges. These bridges establish a structural motif "Inhibitor Cystine Knot" (ICK), then, these peptides are named ICK peptides or "knottins". Recently, a transcriptome analysis of L. intermedia venomous gland (GREMSKI et al., 2010) has revealed ESTs with similarity to ICK peptides previously described as LiTx (De CASTRO et al., 2004). LiTx3-related sequences were the most abundant in the L. intermedia transcriptome representing about 13.9% of all ESTs obtained and comprise 32% of toxin-encoding messengers; the sequences related to the other groups of ICK peptides, LiTx1, LiTx2 e LiTx4, represented 6,2%, 11,4% and 3,8% of all EST coding for toxins, respectively. Due to the high proportion of sequences encoding ICK peptides verified by the transcriptome analyses, the present study aimed screening ESTs related to these peptides in other two Loxosceles species (L. gaucho and L. laeta), as well as the obtainment of an ICK recombinant peptide with high similarity to LiTx3 in Pichia pastoris and its biological activity characterization. From total RNA purified from the venom glands of L. gaucho and L. laeta, it was performed the screening of ICK peptides sequences. ESTs coding for all groups of ICK peptides already described were found (LiTx1-4), some of them revealed subtle differences in their primary structures while others showed important divergences, for example, the absence of consensus sequences for posttranslational modifications that are essential for biological activities. The recombinant peptide was produced in different forms, however, SDS-PAGE and western blotting analyses indicated that they were not properly folded or presented unwanted glycosylation. The biological activity of the recombinant peptide was tested in insects microinjection's assays and in vitro cultivated cells, nevertheless no toxic effects were proven. The sequences identified form L. laeta and L. gaucho RNA represent potential molecules to be biotechnologically explored, whereas the studied recombinant peptide must be expressed in other heterologous expressions models in order to obtain it in the native conformation and, thus, verify its biological activity. Keywords: ICK peptides, knottins, Loxosceles, venom, toxins, Pichia pastoris. recombinant peptide was tested in insects microinjection's assays and in vitro cultivated cells, nevertheless no toxic effects were proven. The sequences identified form L. laeta and L. gaucho RNA represent potential molecules to be biotechnologically explored, whereas the studied recombinant peptide must be expressed in other heterologous expressions models in order to obtain it in the native conformation and, thus, verify its biological activity. Keywords: ICK peptides, knottins, Loxosceles, venom, toxins, Pichia pastoris.

Orientadora : Profª. Drª. Lucélia Donatti Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 31/03/2015 Inclui referências : f. 126-144 Área de concentração Resumo: A ictiofauna antártica evoluiu ao longo dos últimos milhões de anos isolada e sob a pressão seletiva de temperaturas baixas e estáveis. Os níveis elevados de fluoreto da carapaça do krill antártico não exerce efeito tóxico sobre os organismos que se alimentam desse crustáceo. Contudo, não existem estudos mostrando o efeito desse halogênio sobre o metabolismo de peixes antárticos, principalmente, sob condições de estresse térmico e hiposalino. A presença humana na Antártica motivou a elaboração de um amplo protocolo de proteção ambiental, o qual recomenda o desenvolvimento de pesquisas científicas voltadas ao monitoramento ambiental. O descarte de esgotos tem gerado preocupações quanto ao seu possível impacto sobre os ecossistemas marinhos. O presente estudo avaliou os efeitos do: a) fluoreto sobre o metabolismo hepático de N. rossii; b) efluente do esgoto da Estação Antártica Comandante Ferraz (EACF) sobre o metabolismo do fígado, rins, brânquias e músculo, bem como sobre os níveis de constituintes plasmáticos de N. rossii e N. coriiceps. Os níveis teciduais de enzimas do metabolismo energético, defesa antioxidante e do catabolismo de L-arginina foram utilizadas como indicadores metabólicos. A capacidade hepática de metabolizar xenobióticos foi avaliada pelos níveis da enzima etoxiresorufin-o-dietilase (EROD). Os experimentos com fluoreto trófico combinaram duas temperaturas (0 e 4 oC), duas salinidades (35 e 20 psu) e duas condições tróficas (com e sem fluoreto). Os experimentos com efluente foram conduzidos: a) no curto prazo (96 h), com ambas espécies e com o efluente do esgoto diluído à 0,5% (v/v); b) no longo prazo (25 dias), apenas com N. rossii, mas com o efluente do esgoto diluído à 0,05% e 0,5% (v/v). O metabolismo hepático de N. rossii não foi modulado pelo fluoreto trófico em nenhuma das condições termo-salinas experimentais, diferente de peixes não antárticos, em que o fluoreto trófico é capaz de causar lesões histopatológicas e provocar alterações metabólicas. Nos experimentos com esgoto, com N. rossii e N. coriiceps, ficou evidente que: a) brânquias e rins modularam positivamente os níveis de enzimas do metabolismo energético, embora, no curto prazo, ocorreu redução dos níveis de hexoquinase; b) fígado elevou o potencial gliconeogênico e glicogenolítico, e manteve os níveis glicêmicos de N. rossii, mas não de N. coriiceps, que evoluiu para hipoglicemia; c) o marcador do potencial energético de osmorregulação branquial não foi alterado; d) N. rossii manteve níveis plasmáticos mais elevados de substratos energéticos e eletrólitos não proteicos do que N. coriiceps; e) o tecido muscular reduziu o potencial ativador de glicose, mas elevou o seu potencial aeróbio gerador de ATP; f) o aumento dos níveis de enzimas da defesa antioxidante ficou mais evidente nos rins e fígado; g) brânquias e rins modularam positivamente o metabolismo argininolítico no curto prazo; h) os níveis de EROD hepática não foram modulados em N. coriiceps, mas sofreram redução em N. rossii, tanto no curto como no longo prazo. Em ambas as espécies, o efluente do esgoto diluído foi capaz de alterar os níveis de enzimas do metabolismo energético, principalmente nas brânquias e rins, sugerindo um profundo aumento na demanda energética desses tecidos. Embora próximas na escala filogenética, N. rossii e N. coriiceps apresentaram respostas metabólicas distintas frente ao efluente do esgoto da EACF. O estudo mostrou que os níveis de enzimas do metabolismo energético dessas duas espécies de peixes são potenciais biomarcadores de poluição por esgoto na Antártica. Abstract: The Antarctic ichthyofauna evolved in isolation under the selective pressure of low and stable temperature during the last few million years. The elevated levels of fluoride present in the carapace of Antarctic krill do not appear to have any toxic effects on the organisms that feed on it. However, as far as we are aware there are no studies about the effect of this halogen on Antarctic fish metabolism particularly when subjected to thermal and hypo-saline stress. The increased human activity in this region has resulted in the Antarctic protection protocol that calls for increased research for monitoring the environment. The discharge of sewage in the region has raised questions about its possible effects on the marine ecosystems. The present study investigates the effects of a) fluoride on the hepatic metabolism on N. rossii; b) sewage from the Antarctic station Commandant Ferraz (EACF) on the hepatic, renal, gill and muscle metabolism as well as on the plasma constituents in the fishes N. rossii and N. coriiceps. The activity of the enzymes involved in the energy metabolism, antioxidant defense and the catabolism of L-arginine were used as metabolic indicators. The hepatic capacity to metabolize xenobiotics was evaluated by the enzyme ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD). Experiments involving tropic fluoride were conducted using a combination of two temperatures (0 and 4oC), two salinities (35 and 20 psu) and two trophic fluoride (with and without) conditions. Experiments involving sewage were conducted for a) short term (96 hours) with both the species with sewage diluted to 0.5% (v/v); b) long term (25 days) with only N. rossii, but with the sewage diluted to 0.05% (v/v) and 0.5% (v/v). The hepatic metabolism of N.rossii, was not modulated by trophic fluoride in any of the experimental conditions. This is in contrast to non-Antarctic fishes were elevated trophic fluoride cause histo-pathologic lesions and altered the hepatic metabolism. In experiments with sewage, with both species a) the enzymes involved in the energy metabolism of both gills and kidneys were positively modulated, though for a short term there was a reduction in hexokinase; b) the liver elevated the glyconeogenic and glycogenolitic potential and retained the glycemic levels in N. rossii, but not in N. coriiceps which developed hypoglycemia; c) the gill osmoregulation energy potential marker was not altered in either species; d) N. rossii had higher plasma levels of energy substrates and non-protein electrolytes compared to N. coriiceps; e) muscle tissue reduced the glucose potential activator, but elevated the ATP aerobic generation potential in both species; f) the elevation of anti oxidant defense enzymes was most evident in the kidneys and liver; g) the gills and kidneys positively modulated the arginine metabolism for the short term; h) Hepatic EROD were not modulated in N. coriiceps, but was reduced in N. rossii for both the long and short term. In both species, diluted sewage altered the energy metabolism enzymes, particularly in the gills and kidneys, indicating a large increase in the energy demands in tissues of these two organs. Even though the two species N. rossii and N. coriiceps, are philogenetically close, they have distinct response on exposure to sewage from EACF. The study shows that the enzymes involved in the energy metabolism of these two fish species can be candidate biomarkers of sewage pollution in the Antarctic.

Orientador : Prof. Dr. Francisco Filipak Neto Co-orientador : Prof. Dr. Ciro Alberto de Oliveira Ribeiro Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 27/02/2015 Inclui referências Área de concentração : Biologia celular e molecular Resumo: O aumento das atividades antropogênicas vem sendo causa de uma crescente eutrofização dos ambientes aquáticos, levando a floração de cianobactérias, dentre as quais algumas produtoras de cianotoxinas potencialmente tóxicas à vida animal e à saúde humana. Desta forma, fazem-se necessárias a avaliação dos principais danos causados pelas toxinas assim como a investigação os mecanismos de toxicidade da cilindrospermopsina (CYN) em células. Particularmente, modelos in vitro empregando a linhagem de hepatocarcinoma humano (HepG2) são importantes para a investigação dos mecanismos de toxicidade das cianotoxinas nas células. O objetivo do presente estudo foi investigar as respostas de células HepG2 frente à exposição a diferentes concentrações da cilindrospermopsina (CYN) através de ensaios de viabilidade celular; atividade das enzimas de biotransformação de fase II (Glutationa S-transferase - GST); sistema de resistência a multidrogas (MDR); ambiente redox celular, quantificação da produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio; danos oxidativos a biomoléculas; e alterações na morfologia das células. Além disso, determinou-se se a indução de isoformas do citocromo P450 aumenta a sensibilidade das células à CYN e avaliou-se a expressão diferencial de proteínas (proteoma). A CYN não se apresentou tóxica na concentração de 10 ?g l-1, levando a um aumento da viabilidade e toxicidade celular em células cultivadas com 10% de soro bovino fetal (SBF). A redução da concentração de SBF para 2% e a indução das isoformas do citocromo P450 (CYP) tornaram o metabolismo das células HepG2 mais próximas das células "normais". Após a indução, poucos parâmetros foram alterados, como a peroxidação lipídica. No entanto, baixas concentrações de CYN (inferior ou igual a 10 ?g l-1) induziram um aumento da proliferação e toxicidade celular. Analisando o proteoma das células expostas a CYN, identificaram-se 26 proteínas, as quais estão envolvidas em diferentes processos biológicos como enovelamento de proteínas, efluxo de xenobióticos, defesa antioxidante, metabolismo energético, anabolismo, sinalização, potencial tumorigênico e estrutura do citoesqueleto. Este perfil de proteínas indica que a exposição à CYN leva a um aumento da absorção e oxidação da glicose para proporcionar energia às células responder ao estresse químico. Aumento da proteína G (GPCRs), heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) e dos níveis das espécies reativas de oxigênio (EROs) podem estar provocando o aumento da proliferação celular, e aumento do potencial tumorigênico das células HepG2. O excesso de espécies reativas de oxigênio ativou mecanismos de proteção celular como a multidrug resistance protein (MRP3) e a glutationa peroxidase. As alterações provocadas pela CYN nas proteínas do citoesqueleto também podem estar associadas com a proliferação celular bem como a reposição das proteínas danificadas pelas EROs. Palavras-chave: cianotoxina, cilindrospermopsina, HepG2, CYPs, proteômica, imunofluorescência Abstract: The increase of anthropogenic activities has been causing eutrophication of aquatic environments, leading to bloom of cyanotoxin-producer cyanobacteria that can thread wildlife and human health. The evaluation of the toxic effects and the mechanisms of toxicity of cyanotoxins such as cylindrospermopsin (CYN) are important issues in toxicology. For these purposes, cell lines such as human hepatocellular carcinoma (HepG2) are very useful in vitro models. The aim of the current study was to investigate the responses of HepG2 cells after exposure to different concentrations of CYN through assays of cell viability; activities of glutathione S-transferase (GST, a phase II biotransformation enzyme) and the efflux transporters involved in multidrug resistance phenotype (MDR); oxygen and nitrogen reactive species levels; oxidative damage to biomolecules; and alterations of cell morphology. In addition, the possibility of increased toxicity to CYN due to cytochrome P450 (CYP) induction and the differential expression of proteins (proteome) have been investigated. CYN at 10 ?g l-1 was not toxic to HepG2 cells, leading to increased cell viability and metabolism in cells cultured with 10% fetal bovine serum (FBS). Decrease of FBS concentration to 2% and induction of CYP isoforms have made HepG2 cells more sensitive to exposure to CYN. After induction, few parameters have changed, e.g., lipid peroxidation. However, CYN at low concentrations (bellow or equal 10 ?g l-1) has induced increases of cell proliferation and metabolism. A total of 26 proteins have been differentially expressed in CYN-exposed cells versus control. These proteins are involved in different biological processes like protein folding, xenobiotic efflux, antioxidant defense, energy metabolism, anabolism, cell signaling, tumorigenic potential and cytoskeleton structure. This protein profile indicates that the exposure to CYN leads to an increased absorption and breakdown of glucose as to provide energy for the cells to respond to chemical stress. Increased G protein (GPCRs), nuclear ribonucleoprotein heterogeneous (hnRNP) and the levels of reactive oxygen species (ROS) may be associated with increased cell proliferation, and increased tumorigenic potential of HepG2 cells. The excess ROS has activated cellular protection mechanisms such as MRP3 and glutathione peroxidase. The changes caused by CYN in cytoskeletal proteins may also be associated with cell proliferation as well as replacement of proteins damaged by ROS. Keywords: cyanotoxin, Cylindrospermopsin, HepG2, CYP, proteomics, immunofluorescence

Orientador : Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga Co-orientadora : Profª. Drª. Olga Meire Chaim Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 26/03/2015 Inclui referências : f. 82-99 Resumo: Aranhas do gênero Loxosceles são conhecidas como aranhas-marrons, cuja picada é capaz de induzir envenenamento em humanos, em um quadro conhecido como loxoscelismo, o qual se manifesta em sintomas cutâneos e/ou sistêmicos. Tais sintomas incluem dermonecrose com espalhamento gravitacional decorrente de uma resposta inflamatória exacerbada e envolvimento sistêmico que pode incluir insuficiência renal aguda, trombocitopenia e hemólise, podendo ainda levar a vítima a óbito. Entre as diversas toxinas presentes no veneno, destacam-se as fosfolipases-D, as quais são capazes de sozinhas reproduzir manifestações do veneno total, como por exemplo: dermonecrose, aumento na permeabilidade vascular, intensa resposta inflamatória, hemólise, agregação plaquetária e insuficiência renal aguda. As fosfolipases-D apresentam ação nefrotóxica direta sobre o tecido renal, sendo esse efeito dependente da sua atividade enzimática. Nesse ínterim, sabe-se que citocinas e quimiocinas são importantes mediadores envolvidos na manutenção do processo inflamatório, podendo estimular ou inibir a resposta imune, sendo este sabidamente influenciado por metabólitos de lipídios ou alterações em membranas celulares. Dentro desse contexto, o objetivo desse trabalho foi avaliar os mecanismos moleculares e os efeitos biológicos associados ao efeito de fosfolipases-D recombinantes que trouxessem subsídios para a compreensão da atividade nefrotóxica do veneno de aranhas Loxosceles. As toxinas recombinantes LiRecDT1 e LgRec1 foram capazes de induz aumento de mRNA das citocinas inflamatórias IL-1?, IL-6, TNF-? e CXCL1 em células renais humanas (HEK- 293) analisadas por PCR quantitativo em tempo real nas concentrações de 50 ?g/mL e 100 ?g/mL analisadas nos tempos de 6, 12 e 24 horas. Ensaio imunoenzimático (ELISA) demonstrou aumento na expressão de proteínas referentes às citocinas IL-1?, IL-6, TNF-? e CXCL1 após 6 horas de incubação. A exposição da linhagem HEK-293 com as toxinas LiRecDT1 e LgRec1 diminuiu a viabilidade celular avaliada pelo método de captação do corante azul de Tripan. Após 6 horas, a LiRecDT1 reduziu o numero de células viáveis em 8,4% (superior ao valor apresentado pelo veneno de L. intermedia de 6,36%). LgRec1 diminui o numero de células viáveis em 6,54% no tempo de 6 horas e 7,42% após 24 horas. Em ensaio in vivo com ratos Wistar machos demonstrou-se proteinúria, hemoglobinúria e hematúria, bem como aumento na concentração sérica de ureia e creatinina, marcadores de dano renal. Além disso, estudo in vivo com ratos wistar demonstrou que a toxina LiRecDT1 foi capaz de induzir danos renais evidenciados por marcadores de função renal. Dessa forma, nosso estudo caracterizou um perfil de expressão de citocinas pró-inflamatórias frente à exposição de células renais humanas às toxinas dermonecróticas LiRecDT1 e LgRec1. Mais estudos são necessários para melhor entendermos o papel da fosfolipase D no desenvolvimento de insuficiência renal aguda. Palavras-chave: fosfolipase D, nefrotoxicidade, aranha-marrom, inflamação Abstract: Spiders of the genus Loxosceles, known as brown-spiders, whose bite can induce poisoning in humans, in a clinical manifestation known as loxoscelism, which manifests as cutaneous and / or systemic symptoms. These symptoms include dermonecrosis with gravitational spreading due to an exacerbated inflammatory response and systemic involvement may include acute renal failure, thrombocytopenia and hemolysis, and may lead the victim to death. Phospholipases-D are able to cause dermonecrosis, hemolysis, platelet aggregation, acute renal failure, increased vascular permeability and dysregulated inflammatory response. Recent data have shown that phospholipase-D has a direct nephrotoxic action on the renal tissue and this effect is dependent on the catalytic site. Meanwhile, it is known that cytokines and chemokines are important mediators involved in the maintenance of the inflammatory process and may stimulate or inhibit the immune response, which is known to be influenced by lipid metabolites or changes in cell membranes. Recombinant toxins LiRecDT1 e LgRec1 induce increased inflammatory cytokine mRNA of IL-1?, IL-6, TNF-? and CXCL1 in humand embryonic kidney cells (HEK-293) analised by real-time quantitative PCR. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) showed increased protein expression related to cytokines IL-1?, IL-6, TNF-? and CXCL1 after 6 hours of incubation. The incubation of HEK-293 line with the LiRecDT1 LgRec1 toxins demonstrated decreased cell viability assessed by the uptake of trypan blue method. After 6 hours, LiRecDT1 reduced the number of viable cells in 8.4% (higher than the value presented by L. intermedia venom 6.36%). LgRec1 decreases the number of viable cells in 6.54% at time of 6 hours and 7.42% after 24 hours. In vivo assay with male Wistar rats showed the presence of protein in the urine (proteinuria), hemoglobinuria and hematuria, and an increase in serum urea and creatinine. Furthermore, in vivo study with Wistar rats exposed to LiRecDT1 demonstrated that dermonecrotic toxin induces renal damage evidenced by markers of renal function. Thus, our study featured a expression profile of proinflammatory cytokines from human kidney cells exposed to the dermonecrotic toxins LiRecDT1 and LgRec1. More studies are needed to better understand the role of phospholipase D in the development of acute renal failure. In this context, the aim of this study was to evaluate the molecular mechanisms and biological effects associated with the effect of phospholipase- D to bring subsidies for understanding the nephrotoxic activity of the recombinant toxins and LiRecDT1 LgRec1. Key-words: phospholipase D, nephrotoxicity, brown spider, inflammation

Orientadora : Drª. Maria Cristina Leme Godoy dos Santos Co-orientador : Drª. Aline Pic-Taylor Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 27/11/2015 Inclui referências : f. 54-61 Resumo: Patologias do tecido conjuntivo estão entre as mais comuns desde a infância até a idade adulta. Por muito tempo, as pesquisas sobre estas doenças se basearam em descrever a epidemiologia e o quadro clínico, do ponto de vista da evolução, do tratamento e das consequências para os portadores. Neste trabalho, estudamos geneticamente indivíduos portadores de duas patologias importantes que afetam tecido conjuntivo: a tendinopatia primária do tibial posterior e a craniossinostose. As tendinopatias resultam de desarranjos na matriz extracelular tendínea que ocasiona disfunção do tecido conjuntivo denso e consequente dificuldade de movimentos. A craniossinostose, por sua vez, é uma das mais graves anormalidades do desenvolvimento e resulta da ossificação precoce de uma ou mais suturas entre os ossos cranianos. Mediante parceria com o Departamento de Ortopedia e Traumatologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo foram selecionadas 50 mulheres com tendinopatia primaria do tibial posterior submetidas a tratamento cirúrgico, com a doença confirmada por exame histopatológico (degeneração mixóide associado à proliferação vascular multifocal) e por imagem de ressonância magnética (T2 mostrando sinal intermediário de intensidade e espessamento do tendão) e 100 mulheres assintomáticas na topografia do tendão, que não mostram mudanças de sinal na ressonância magnética. Análise genotípica por PCR-RFLP foi realizada para avaliar a influência do polimorfismo -519 (rs1144393) do MMP-1 isoladamente e em haplótipo com o polimorfismo -1607 (rs1799750) também do MMP-1 na insuficiência primária do tendão tibial posterior. Em parceria com os Laboratórios de Biologia do Desenvolvimento e de Genética Humana do Departamento de Genética e Morfologia da Universidade de Brasília genomas de 13 casos de craniossinostose, inicialmente caracterizados como não sindrômicos, foram estudados por meio de análise cromossômica por microarranjo de DNA (CGH-Array) utilizando a plataforma Cytoscan 750k (Affymetrix) no intuito de investigar a presença de rearranjos cromossômicos submicroscópicos. Nossos resultados mostram que o alelo G do polimorfismo -519 da MMP-1 aumenta a susceptibilidade à tendinopatia do tibial posterior (p ? 0,01). Análise de haplótipos dos polimorfismos -519 e -1607 da MMP-1 indicou uma diferença significativa entre os dois grupos (p ? 0,0001). Haplótipos G- 2G e A-2G parecem ser fator de risco (G-2G, p < 0.001; OR = 5.72 (CI, 2.84-11.52) e A-2G p = 0.002, OR = 3.95 (CI, 1.65-9.44). Em relação ao estudo molecular de pacientes com craniossinostose verificamos em dois pacientes duplicação parcial distal do braço longo do cromossomo 1, sugerindo um possível papel dos genes relacionados às proteínas morfogenéticas WNT9A, WNT3A e do regulador de sinalização por proteínas G-7 (RGS7) na etiologia de malformações das suturas cranianas. Com isso identificamos marcadores genéticos relacionados à tendinopatia primaria do tibial posterior e à craniossinostose, aumentando o conhecimento molecular a respeito da etiologia de tipos diferentes de patologias do tecido conjuntivo propriamente dito. Palavras-chave: Tendinopatia do tibial posterior. Craniossinostose. MMP-1. Duplicação parcial em 1 q. PCR-RFLP. CGH-ARRAY. Abstract: Connective tissue diseases are common from childhood to adulthood. For a long time, research on these diseases were based on describe the epidemiology and clinical features related to the development, treatment and consequences for patients. We studied genetically individuals with two important diseases that affect connective tissue: the primary tendinopathy of the posterior tibial and craniosynostosis. Tendinopathies result of tendon extracellular matrix breakdowns that cause dysfunction of dense connective tissue and consequent difficulty in movement. Craniosynostosis is one of the most severe developmental abnormalities and results from one or more sutures early ossification between the cranial bones. Through a partnership with the Department of Orthopedics and Traumatology of the Faculty of Medicine of the São Paulo University, were selected 50 women with primary tendinopathy of the posterior tibial treated surgically and with the disease confirmed by histopathology (myxoid degeneration associated with multifocal vascular proliferation) and magnetic resonance imaging (T2 showing intermediate signal intensity and thickening tendon) and 100 asymptomatic women in the tendon topography and show no sign changes in magnetic resonance imaging. Genotypic analysis by PCR-RFLP was performed to evaluate the influence of the -519 polymorphism (rs1144393) MMP-1 alone and in haplotype with the -1607 polymorphism (rs1799750) also on the MMP-1 in the etiology of primary failure of the posterior tibial tendon. In partnership with the Developmental Biology and Human Genetics Laboratories of the Department of Genetics and Morphology of the University of Brasilia, genomes of 13 cases of craniosynostosis, initially characterized as non-syndromic, were studied by DNA microarray human chromosome analysis (CGH-Array) using the Cytoscan platform 750k (Affymetrix) in order to investigate the presence of submicroscopic chromosomal rearrangements. Our results show that the G allele of the -519 polymorphism of MMP-1 increases the susceptibility of the posterior tibial tendinopathy (p ? 0.01). Haplotype Analysis of the -519 and -1607 polymorphism of MMP-1 indicated a significant difference between the two groups (p ? 0.0001). Haplotypes G-A-2G and 2G appear to be a risk factor (G-2G, p

Orientador : Prof. Dr. Silvio Marques Zanata Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 31/03/2015 Inclui referências : f. 155-165 Resumo: ADAM23 é uma proteína transmembrana, da família ADAM (A Disintegrin and Metalloprotease), altamente expressa em células neuronais, cujo papel biológico não está bem elucidado. Sabe-se que a ADAM23 está envolvida no processo de adesão celular em neuroblastomas através da interação com integrinas. Mecanismos de adesão celular envolvendo a ADAM23 humana, informações sobre o seu processamento intracelular e as propriedades do seu ectodomínio podem servir para a compreensão do papel estrutural e biológico dessa proteína. O presente estudo visou o desenvolvimento de vetores de expressão para a produção de quimeras protéicas constituídas pelo ectodomínio de ADAM23 e a região Fc de IgG humana (domínios CH2 e CH3). As quimeras serão utilizadas como bioferramentas no estudo do processamento de ADAM23 e da sua função na adesão e proliferação celular. Os fragmentos de nucleotídeos que codificam os resíduos 60-792 (ADAM23C1) e 287-792 (ADAM23C2) da ADAM23 humana foram clonados no vetor pINFUSE-hIgG1-Fc2 (secreção através do peptídeo sinal da IL-2) enquanto a sequência 1-792 foi clonada no vetor pcDNA3.1-hIgG1-Fc2 (secreção utilizando o peptídeo sinal da ADAM23). As três construções foram transfectadas nas linhagens N2A (neuroblastoma de camundongo), HEK-293T (rim humano) e CHO-K1 (ovário de hamster) e tanto os extratos celulares como os sobrenadantes de cultura foram analisados para a expressão das quimeras. A linhagem N2A apresentou a mais eficiente secreção das três proteínas quiméricas. As quimeras ADAM23C1 e ADAM23C2, foram adequadamente expressas e recuperadas dos sobrenadantes das culturas de células N2A e HEK-293T. A quimera ADAM23C3 (full-length do ecdomínio) foi identificada sempre na forma processada, indicando que seu peptídeo sinal foi reconhecido pelas maquinarias de secreção e processamento das células utilizadas. Diferentes métodos de purificação das quimeras foram comparados, sendo que a precipitação por sulfato de amônio mostrou-se ser o mais adequado, por aliar economicidade de recursos e retenção da estrutura da proteína. Paralelamente foi avaliada a expressão de ADAM23 em diferentes linhagens e tecidos, além do estabelecimento da localização celular das formas imatura e processada da ADAM23. Com a ajuda do anticorpo monoclonal DL11C8 foi possível determinar que a forma processada de ADAM23 (70 kDa) é a mais abundante no encéfalo de camundongos e é expressa na face externa da membrana plasmática da linhagem N2A. Estes dados mostram pela primeira vez que há uma baixa expressão da forma de 100 kDa (não-processada) no sistema nervoso, ao contrário do que foi observado em linhagens tumorais. A relevância da razão de expressão entre as formas imatura e processada para a função da ADAM23 no sistema nervoso, como a sua relevância na progressão do fenótipo tumoral merecem mais investigação. Palavras-chave: ADAM23. Ectodomínio. Desintegrina. Metaloprotease. Proteínas Fc quiméricas. Abstract: ADAM23 is a transmembrane protein, member of ADAM (A Disintegrin and Metalloprotease) family, highly expressed in neuronal cells, whose biological role is not yet totally elucidated. It is known that ADAM23 is involved in the cellular adhesion process in neuroblastoma. ADAM23 interacts with integrins promoting cell adhesion. However, ADAM23 full-involvement in cellular adhesion mechanisms remains to be established. The present study aimed for the development of biological tools, particularly the production of expression vectors that code for chimeric proteins containing human ADAM23 ectodomain fused to a human IgG Fc region. Nucleotide fragments coding for the residues 60-792 (ADAM23C1) and 287-792 (ADAM23C2) were cloned in the vector pINFUSE-hIgG1-Fc2 while the sequence 1-792 (ADAM23C3) was inserted onto modified plasmid pcDNA3.1-hIgG1-Fc2. Three different cell lineages (N2A, HEK-293T and CHO-K1) were transfected with the expression plasmids and the chimeric proteins detected in both cell extracts and culture supernatants by monoclonal antibody DL11C8. N2A cell lineage presented the most efficient expression/secretion of the three chimeric proteins. CHO-K1 showed chimeric ADAM23C1 and ADAM23C2 secretion, although ADAM23C3 was not observed in supernatants. The full-length construction (C3) was always detected as a processed protein, indicating that endogenous ADAM23 signal peptide and processing signals were correctly translated by cellular host machinery. Several protocols were compared for purification of chimeric proteins from culture supernatant, being ammonium sulfate salting-out the most practical and convenient. Besides, it was established that mature ADAM23 (70 kDa) is the abundant form in the mouse brain and the processed protein is located at N2A cell surface. In addition it was showed, for the first time, that non-processed ADAM23 (100 kDa) has low expression in the central nervous system when compared with the processed 70 kDa form. Interestingly, tumoral cell lines (MDA-MB-435 and N2A) presented the opposite behavior. If the non-processed/mature ratio profile is specific for each cell line or has a role in the tumoral phenotype will be further investigated in future. Key words: ADAM23. Ectodomain. Disintegrin. Metalloprotease. Fc chimeric proteins.

Orientadora : Profª. Drª. Dorly de Freitas Buchi Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 20/03/2015 Inclui referências : fls. 66-72 Resumo: A pele, o maior órgão do corpo humano, principal interface entre o organismo e o meio ambiente, está constantemente exposta a fatores físicos, químicos e biológicos. Essas interações podem ocorrer de forma exacerbada e prejudicial, resultando em reações adversas, como processos inflamatórios cutâneos. Dentre o grupo de substâncias que podem apresentar riscos à saúde humana via exposição dérmica, têm-se os corantes têxteis. Inúmeros corantes têm sido empregados no tingimento de tecidos, entretanto, estudos têm mostrado que diversos grupos de corantes comumente utilizados são capazes de induzir efeitos deletérios aos organismos expostos, por exemplo, danos no DNA e reações alérgicas. O fato dos vestuários poderem conter substâncias químicas nocivas e o conhecimento de que, mesmo após sucessivas lavagens, os corantes são capazes de migrarem e penetrarem na pele em casos de transpiração intensa, a necessidade de uma melhor avaliação da segurança destes produtos tem se mostrado relevante e de caráter imediato. Métodos alternativos à experimentação animal (métodos in vitro) são atualmente utilizados para avaliar o potencial nocivo de diferentes produtos, tanto pelo setor acadêmico como industrial. O objetivo desse trabalho foi avaliar as respostas celulares relacionados a um possível processo inflamatório de dois corantes têxteis [Reactive Red 120 (RR120) - grupo azo e Reactive Blue 19 (RB19) - grupo antraquinona] comumente empregados no tingimento de fibras de algodão. A fim de mimetizar a via de exposição dérmica foram utilizadas duas linhagens celulares murinas, fibroblastos (BALB 3T3) e macrófagos (RAW 264.7). Para tanto, após a definição da faixa de concentração tóxica de cada corante teste por ensaios de citotoxicidade (MTT e NRU), foram avaliadas a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em conjunto com a detecção e quantificação de citocinas inflamatórias. A condição geral das células da pele foi determinada pela avaliação da morfologia celular através de técnicas de microscopia de luz e eletrônica de varredura. Para a análise estatística foi utilizada a análise de variância ANOVA seguido do teste de Tukey. As culturas celulares expostas a estes corantes por 24 horas mostraram, tanto através da microscopia de luz quanto na eletrônica de varredura, que os corantes em estudo possuem ação citotóxica nas concentrações acima de 500 ?g/ml. As duas linhagens celulares aumentaram a liberação de ROS, com maior destaque para o corante RB19. A ação inflamatória dos corantes RR120 e RB19 foi então detectada nos fibroblastos pelo aumento na liberação das proteínas Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1) e IL-6, caracterizando uma resposta imunológica do tipo celular. Já nos macrófagos, foram detectados aumento na liberação de IL-10, inibidora da resposta imunológica do tipo celular e ativadora de linfócitos B, e diminuição na liberação de MCP-1 e TNF, caracterizando uma resposta imunológica do tipo humoral. Estes resultados indicam que os corantes RR120 e RB19 podem ser nocivos quando em contato com o tecido cutâneo em concentrações acima de 500 ?g/ml. Nos permite concluir também que o potencial de uma substância química em causar respostas inflamatórias cutâneas possa ser previsto com testes in vitro, através da utilização de técnicas como microscopia de luz, microscopia eletrônica de varredura, testes bioquímicos básicos e citometria de fluxo, métodos alternativos a serem considerados na substituição à experimentação animal. Palavras-chave: corantes têxteis reativos; células de pele murina in vitro; respostas inflamatórias; exposição dérmica. Abstract: The skin, the largest organ of the human body, the main interface between the organism and the environment, constantly exposed to physical, chemical and biological factors. These interactions may occur exacerbated and harmful, resulting in adverse reactions, such as skin inflammation. Among the group of substances that may pose risks to human health through dermal exposure, have been the textile dyes. Numerous dyes have been used in fabric dyeing, however, studies have shown that various dyes groups commonly used are capable of inducing deleterious effects to the exposed organisms, for example, DNA damage and allergic reactions. The fact of garments may contain harmful chemicals and the knowledge that, even after repeated washings, the dyes are able to migrate and penetrate the skin in cases of heavy sweating, the need for better safety assessment of these products has proven relevant and immediacy. Alternative methods to animal experiments (in vitro methods), currently used to evaluate the harmful potential of different products, both by academia and industry. The objective of this study was to evaluate the cellular responses related to a possible inflammatory process of two textile dyes [Reactive Red 120 (RR120) - azo group and Reactive Blue 19 (RB19) - anthraquinone group] commonly used in the dyeing of cotton fibres. To mimic via of dermal exposure were used two murine cell lines, fibroblasts (BALB 3T3) and macrophages (RAW 264.7). To this end, after defining the range of toxic concentration of each dye test for cytotoxicity assays (MTT and NRU) were evaluated the production of reactive oxygen species (ROS) in conjunction with the detection and quantification of inflammatory cytokines. Determined the general condition of the skin cells by evaluation of cell morphology by techniques of light and scanning electron microscopy. For statistical analysis, we used the ANOVA followed by Tukey test. Cell cultures exposed to these dyes for 24 hours showed both through light microscopy and scanning electron, the dyes studied have cytotoxic action at concentrations above 500 ?g/ml. Both cell lines increased the release of ROS, most notably the RB19 dye. Detected the inflammatory action of RB19 and RR120 dyes in fibroblasts by increasing the release of Monocyte Chemoattractant Protein-1 proteins (MCP-1) and IL-6, featuring an immune response of cellular type. However in macrophages were detected increase in the release of IL-10, an inhibitor of immune response on the cell type and activating B-lymphocytes, and reduction in release of MCP-1 and TNF, featuring an immune response of humoral type. These results indicate that the RR120 and RB19 dyes can be harmful when in contact with the skin tissue at concentrations above 500 ?g/ml. Also allows us to conclude that the potential of a chemical to cause cutaneous inflammatory responses can be predicted with in vitro tests, using techniques such as light microscopy, scanning electron microscopy, basic biochemical tests and flow cytometer, alternative methods to consider in the replacement of animal experiments. Key words: reactive textile dyes; murine skin cells in vitro; inflammatory responses; dermal exposure.

Orientador : Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga Co-orientadora : Profª. Drª. Olga Meiri Chaim Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 26/02/2014 Inclui referências Resumo: O gênero Loxosceles inclui várias espécies popularmente conhecidas como aranhas-marrons. O envenenamento pode causar, entre outras manifestações clínicas, reações inflamatórias que incluem aumento da permeabilidade vascular, infiltrado leucocitário, rash cutâneo e exantema pustuloso. Relatos de acidentes com animais peçonhentos comumente causam reações alérgicas assim como choques anafiláticos. As moléculas descritas no veneno de Loxosceles intermedia incluem fosfolipases-D, hialuronidases, metaloproteases e toxinas não-enzimáticas. Devido ao pequeno volume produzido e a baixa representatividade dessas toxinas no veneno, técnicas de biologia molecular permitem a identificação e expressão de várias dessas toxinas. A partir de uma biblioteca de cDNA de Loxosceles intermedia foi identificado um transcrito que apresentou identidade com alérgenos presentes em uma espécie de vespa e formiga. A sequência nucleotídica dessa proteína homóloga a alérgeno possui 415aa. Por meio de predição da sequência aminoacídica foram encontrados possíveis sítios de Nglicosilação. Segundo o banco de dados ProtParam esta molécula pertence a uma família de proteínas ricas em cisteínas. O objetivo deste trabalho foi a clonagem, expressão heteróloga e avaliação da sua atividade biológica de uma possível toxina alergênica presente no veneno de Loxosceles intermedia, com o intuito de compreender o papel desta no loxoscelismo. De acordo com a nomenclatura da área (WHO/IUIS): a toxina recombinante foi denominada Lox i 1. Foram utilizados modelos heterólogos de expressão procariótico Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS e modelo eucariótico Pichia pastoris X-33. A ligação da sequência nucleotídica do alérgeno Lox i 1 foi obtida em vetor de expressão pET-20b e pPICZ_C, assim como, a transformação destas construções em E. coli e P. pastoris, respectivamente. Por meio de testes de indução nas concentrações de 0,1 a 1,0mM de indutor a 37 _ C não houve expressão da proteína recombinante. Entretanto, foi possível obter a toxina recombinante em cultura de leveduras Pichia pastoris, cuja a padronização foi feita em 1% de metanol a 30º C por 5 dias. A purificação foi feita por cromatografia de afinidade utilizando resina Ni-NTA em pH 9,0. Análises espectroscópicas em Dicroísmo Circular foram realizadas para a formação de estruturas secundárias da proteína recombinante, o que indicou o dobramento e solubilidade da toxina recombinante em meio aquoso. Os dados da deconvolução indicaram 16% de ±-hélice e 19% de ±-folha. Os dados obtidos permitiram investir na prospecção da atividade biológica de Lox i 1 por meio de um ensaio de Permeabilidade Vascular em camundongos. O qual foi capaz de aumentar a permeabilidade vascular em camundongos. Portanto, foi pela primeira vez na literatura relatada a expressão e a avaliação da atividade biológica de uma proteína homóloga a alérgeno presente no veneno de L. intermedia. Soma-se a isso o fato de que é crescente a utilização de alérgenos recombinantes em imunoterapia e testes diagnósticos para hipersensibilidade. Futuramente estudos estruturais e imunológicos de Lox i 1 irão contribuir para um maior conhecimento das bases moleculares de alergenicidade no loxoscelismo. Palavras-chave: Reações alérgicas, Loxoscelismo, Alérgeno, Rash cutâneo. Abstract: The Loxosceles genus includes several species known as brown spiders. The envenomation can trigger among other clinical manifestations, inflammatory conditions including increased vascular permeability, cutaneous rash, edema and exanthema pustulosis. Reports of accidents involving venomous animals commonly cause allergic reactions like rash, exanthem pustulosis and anaphylactic shock. The molecules described in the Loxosceles intermedia venom include phospholipase-D, hyaluronidase, metalloproteases and non-enzymatic toxins. Due to the small volume produced and the low representation of these toxins in the venom, molecular biology techniques allow the identification and expression of several of these toxins. By a cDNA library of Loxosceles intermedia a sequence show identity with allergens present in a species of wasp and ant was identified. The nucleotide sequence of this protein homologous to allergen has 415 aminoacids. A putative N-glycosylation site was observed in this sequence. According to the ProtParam database this molecule belongs to a family of cysteine-rich proteins. The objective of this work was the cloning, heterologous expression and evaluation of the biological activity of a putative allergen toxin present in the venom of Loxosceles intermedia, in order to further the knowledge of the loxoscelism. According to the nomenclature of the allergens (WHO / IUIS) the recombinant toxin L. intermedia venom was named Lox i 1. The subcloning of Lox 1 was obtained in vector pET-20b and pPICZ_C to use heterologous expression with a prokaryotic model, E. coli BL21(DE3)pLysS, and eukaryotic model Pichia pastoris X-33. The test of the recombinant protein expression was performed from 0.1 to 1.0 mM IPTG concentrations at 37 _ C. However, it was only possible to obtain the recombinant toxin in cultured yeast Pichia pastoris, whose standardization parameters was 1 % methanol at 30°C for 5 days. Purification was performed by affinity chromatography using Ni-NTA resin with pH 9.0. Analysis by Dichroism Circular were performed for analyses of Lox i 1 secondary structures and solubility The data indicated the deconvolution of 16 % ± - helix of ± 19% sheet. The biological activity of Lox i 1 was tested by vascular permeability assay in mice. The Lox i 1 was able to increase vascular permeability in this model. For the first time is report in the literature the heterologous expression and evaluation of biological activity of a protein homologous to allergens present in the venom of L. intermedia. In addition, future structural and immunological studies of Lox i 1 will contribute to a better understanding of the molecular basis of allergenicity in loxoscelism. Key words: Allergic reactions, Loxoscelism, Allergen, Cutaneous rash.

Orientadora : Profª. Drª. Andrea Senff Ribeiro Co-orientadora : Profª. Drª. Olga Meiri Chaim Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 27/04/2012 Inclui referências Área de concentração : Biologia celular e molecular Resumo:As aranhas do gênero Loxosceles (aranha marrom) estão entre os animais venenosos envolvidos com acidentes em humanos. A picada da aranha marrom pode provocar reações cutâneas locais e/ou reações sistêmicas, podendo levar à falência renal e óbito. O quadro clínico desencadeado pelo veneno nas vítimas denomina-se Loxoscelismo. As espécies de maior ocorrência no estado do Paraná são: L. intermedia, L. gaucho e L. laeta. Várias proteínas do veneno total de Loxosceles intermedia já foram estudadas e caracterizadas, como fosfolipases-D, metaloproteases do tipo astacinas, hialuronidase, peptídeos inseticidas, TCTP, entre outras. Este trabalho tem como objetivo principal o estudo da conservação biológica de epítopos imunogênicos de toxinas presentes nos venenos das aranhas do gênero Loxosceles que prevalecem no estado do Paraná. Este estudo utiliza como bioferramentas anticorpos policlonais, produzidos em coelhos, que reconhecem o veneno total de cada uma das três espécies de aranhas marrom, bem como diferentes toxinas loxoscélicas recombinantes de L. intermedia (isoformas de fosfolipases-D: LiRecDT1, LiRecDT2, LiRecDT3, LiRecDT5, LiRecDT6; isoforma de metaloprotease do tipo astacina: LALP1; hialuronidase; peptídeo inseticida: LiKp e TCTP). O reconhecimento de toxinas presentes nos três venenos de Loxosceles pelos soros policlonais que reconhecem as diferentes toxinas recombinantes de Loxosceles intermedia também foi avaliado. O reconhecimento imunogênico foi avaliado por meio de imunoensaios que reconhecem epítopos conformacionais (técnica de ELISA) e epítopos lineares (técnica de western-blotting). Os resultados obtidos revelam que as toxinas dos venenos das espécies de aranha marrom L. intermedia, L. gaucho e L. laeta apresentam conservação biológica de epítopos imunogênicos, reforçando a ideia de famílias de toxinas loxoscélicas inter-espécies. As reações cruzadas nos imunoensaios evidenciam a aplicabilidade biotecnológica de antissoros e toxinas recombinantes na prevenção, diagnóstico e tratamento do Loxoscelismo, bem como na toxinologia de forma geral. Abstract: Spiders from Loxosceles genus (brown spiders) are among the venomous animals involved in human accidents. Brown spider bites are associated with lesions including dermonecrosis, along with systemic problems that may cause renal failure and death. Clinical effects evoked by the venom in the victims is named Loxoscelism. The main species found in the state of Paraná are L. intermedia, L. gaucho e L. laeta.Several proteins from Loxosceles intermedia have already been studied and characterized as: fosfolipases-D, metalloproteases from astacin family, hyaluronidase, insecticidal peptides, TCTP, etc. The present work aimed the study of the biological conservation of immunogenic epitopes from toxins found in the venom of Loxosceles, which are common in Paraná. This study used as biotools: polyclonal antibodies, raised in rabbits, which recognizes the venom from each of the three brown spider species; and different recombinant toxins from L. intermedia (fosfolipase-D isoforms: LiRecDT1, LiRecDT2, LiRecDT3, LiRecDT5, LiRecDT6; LALP1: astacin metaloprotease; LiKp: inseticidal peptide and TCTP). The recognition of toxins from the three different Loxosceles venoms by the polyclonal serum raised against each of the L. intermedia recombinant toxins mentioned above was also performed. In order to evaluate the immunogenic recognition, imunoassays that analyse conformational epitopes (ELISA) and that analyse linear epitopes (western-blotting) were used. The results show that the toxins from the venom of the three species studied herein, L. intermedia, L. gaucho e L. laeta, present biological conservation of immunogenic epitopes, reinforcing the idea of families of toxins throughout the genus. The cross-reactivity in the immunological studies point to the biotechnological applications of antiserum and recombinant toxins at prevention, diagnosis and treatment of Loxocelism, as well as, in the toxinology field in general.

Orientadora : Profa. Dra. Andréa Rodrigues Ávila Co-orientador : Prof. Dr.Stenio Perdigão Fragoso Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 30/04/2014 Inclui referências Área de concentração : Biologia celular e molecular Resumo: A doença de Chagas e toxoplasmose são problemas de saúde pública no Brasil e entender com detalhes a biologia dos agentes causais, T. cruzi e T. gondii respectivamente, pode ser um ponto crucial para gerar informações relevantes voltadas para o desenvolvimento de tratamento efetivo no combate a estas doenças. No entanto, a busca de novos alvos para quimioterapia de algumas doenças parasitárias esbarra, por exemplo, na ausência de ferramentas que possibilitem o estudo da função de genes essenciais para a sobrevivência do organismo. Dentro desta problemática, o objetivo central deste estudo é a identificação de proteínas envolvidas no transporte nucleocitoplasmático de RNAs, mais especificamente a exportação de mRNAs, com a utilização de ferramentas de genética reversa para análise de proteínas essenciais envolvidas nestas vias em T. cruzi e T. gondii. Além disso, T. gondii tem sido o modelo de estudo escolhido por diversos grupos, uma vez que dispõe de várias ferramentas de genética reversa consideradas inviáveis ou laboriosas em outros parasitas (como Plasmodium ou Trypanosoma). A escolha do tema foi baseada em dois fatos principais: a) dentro do contexto de eventos moleculares essenciais, o transporte de RNA mensageiro (mRNA) ao local de tradução é uma etapa essencial e crucial na seleção de genes a serem expressos em uma célula eucariótica; b) escassez de publicações envolvendo diversos grupos de parasitas, demonstrando ser um tema da pesquisa básica em parasitologia que necessita ser explorado. Os dados gerados neste estudo permitiram identificar que a maioria das proteínas relacionadas com a exportação de mRNAs não são tão conservadas ao longo da filogenia de eucariotos, principalmente em relação aos protozoários que divergiram na base da árvore filogenética. A exceção encontrada foi Sub2/UAP56, uma proteína relacionada com exportação de mRNAs em fungos e humanos, respectivamente, que se encontra altamente conservada ao longo da filogenia de eucariotos. Em T. cruzi foi observado que TcSub2 é uma proteína nuclear, relacionada com alguns sítios de transcrição por RNA Polimerase II e essencial, não sendo possível obter o nocaute duplo do respectivo gene. Em T. brucei e T. gondii foi observado que a diminuição gradual das proteínas em questão, TbSub2 e TgUAP56 respectivamente, resulta em acúmulo de mRNAs poliadenilados nos núcleos afetando a exportação dos mRNAs e resultando em morte celular. A partir da observação da participação de proteínas ortólogas de Sub2 na exportação de mRNAs em parasitas, a outra parte deste estudo foi identificar proteínas associadas a TcSub2 para iniciar o entendimento sobre esta via bem como verificar a presença de proteínas específicas e provavelmente essenciais de parasitas para futuros estudos funcionais. Abstract: Chagas disease and toxoplasmosis are public health issues in Brazil and understanding in detail the biology of its causative agents, T. cruzi and T. gondii respectively, could generate relevant information to develop effective treatment(s) against these diseases. The search for new chemotherapy targets against parasitic disease faces a number of challenges as the lack of tools that enable the study of essential gene function in parasites. Taking this into consideration, the aim of this study was to develop reverse genetic tools to identify and analyse essential proteins in T. cruzi and T. gondii, in particular those involved in nucleocytoplasmic transport of RNAs, specifically in mRNA export. T. gondii has served as model organism because it has an ample wide repertoire of reverse genetic tools. However, transferring these tools to other parasites, i.e. Plasmodium or Trypanosoma, has not been a straightforward task. The hypothesis of this study was based on two main facts: a) the transport of mRNA to the site of translation, within the context of key molecular events, is an essential step in the selection of genes to be expressed in an eukaryotic cell and b) the lack of publications in this topic in parasites proving to be a subject of basic research in parasitology that needs to be explored. The data obtained in this study showed that most proteins related to the export of mRNAs are not well conserved throughout eukaryotic phylogeny, especially eukaryotes that diverged at the base of the phylogenetic tree, the parasites. An exception to this observation was Sub2/UAP56, a protein directly related to export of mRNAs in yeast and human respectively, which is highly conserved throughout eukaryotic phylogeny. In T. cruzi, TcSub2 is an essential nuclear protein, associated with a number of sites of RNA polymerase II transcription and, a double knockout of the gene is lethal. It has been observed in T. brucei and T. gondii that the knockdown of TbSub2 and TgUAP56 respectively, results in nuclear accumulation of polyadenylated mRNAs, effectively reducing mRNA export and leading to cell death. Extending these observations that highlight the important role of Sub2 orthologues in mRNA export, we aim to identify proteins partners of TcSub2 to better understand this pathway in T. cruzi and verify the presence of specific and likely essential proteins for future studies in this parasite.

Orientador : Prof. Dr. Edvaldo da Silva Trindade Co-orientadora : Profª. Drª. Carolina Camargo de Oliveira Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 24/02/2014 Inclui referências Área de concentração : Biologia celular molecular Resumo: O melanoma é um tipo de câncer de pele altamente metastático. Drogas quimioterápicas convencionais usadas atualmente possuem efeitos limitados, assim, terapias mais efetivas são necessárias. Este trabalho objetivou a investigação e elucidação de possíveis mudanças nas características das células de melanoma B16F10, desencadeadas pelo tratamento in vitro com os complexos naturais altamente diluídos (M1 ou M8). Para tanto, as células foram tratadas por 96 horas com M1 ou com M8 e diversos parâmetros foram analisados, enfocando possíveis alterações na expressão de mRNA de proteínas envolvidas na invasão, migração e proliferação celular; bem como avaliação de moléculas envolvidas em espécies reativas; na melanogênese e mecanismo de resistência a multidrogas. Por fim, avaliação em glicoconjugados foi realizada. Os resultados mostram claramente que o tratamento com M1 ou M8 reduz características metastáticas importantes, evidenciada, pela diminuição da expressão de metaloproteases (MT1-MMP, MMP-2 e MMP-9), e de sua atividade gelatinase; bem como da migração celular. Essa última, foi, possivelmente, decorrente do aumento de espécies reativas de oxigênio (ROS), liberação de óxido nítrico (NO) e redução de NO intracelular. Curiosamente esse efeito foi acompanhado pela redução na síntese de melanina e atividade e expressão da tirosinase (TYR), bem como da expressão gênica da TYRP-1, TYRP-2 e do MITF. Por fim, observou-se redução do mecanismo de resistência a multidrogas (transportadores ABC). Quanto aos glicoconjugados, houve uma clara redução da secreção de ácido hialurônico e da expressão gênica de hialuronidases. Ainda, foi evidente a redução da expressão gênica de proteoglicanos e de enzimas que modificam heparam sulfato. Esses resultados em conjunto sugerem que características fenotípicas metastáticas são modificadas pelo tratamento com M1 e M8, justificando os resultados anteriores encontrados in vitro e in vivo. Assim, esses complexos podem ser considerados candidatos promissores na terapia do câncer, embora estudos mais aprofundados devam ser realizados para melhor entendimento dos seus mecanismos de ação. Abstract: Melanoma is a highly metastatic skin cancer type. Conventional chemotherapy drugs currently in used are of limited value, thus more effective therapies are needed. This work aimed at investigation and elucidation of possible changes in tumor cell features triggered by highly diluted natural complex (M1 and M8) in vitro treatment using B16F10 melanoma cells. For this, cells were treated upon 96h with either M1 or M8 and several parameters were analyzed, focusing on possible changes in mRNA expression of invasion related proteins, migration and proliferation; and evaluation of reactive species; melanogenese and multidrug resistance mechanism. Finally, glycoconjugates evaluation was performed. The results clearly demonstrated that M1 and M8 treatment accounts to reduction in metastasis related features important by decreasing metaloproteases gene expression (MT1-MMP, MMP-2 and MMP-9), and your gelatinase activity, as well as cell migration. The latter was, possibly due to increased reactive oxygen (ROS), release of nitric oxide (NO) and reduction intracellular NO. Interestingly this effect was accompanied by melanin synthesis reduction and activity and expression reduction of tyrosinase (TYR), as well as TYRP-1, TYRP-2 and MITF expression. Finally, was observed reduction of drugs resistance mechanism (ABC transporters). As for glycoconjugates, there was a clear reduction in the secretion of hyaluronic acid and the gene expression of hyaluronidases. Still, it was evident the reduction of gene expression of proteoglycans and heparan sulfate enzymes modifiers. Taken together these findings suggest that metastatic phenotypic characteristics are modified by M1 and M8 treatment, justifying previous in vitro and in vivo findings. Thus these complexes can be considered as promising cancer therapy candidates, although further studies should be conducted to better understand their way of action.

Orientador : Prof. Dr. Alexander Welker Biondo Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 24/10/2014 Inclui referências Área de concentração : Biologia Celular e Molecular Resumo: Micoplasmas hemotrópicos, também conhecidos como hemoplasmas, são bactérias pertencentes à classe Mollicutes, patógenos obrigatórios dos eritrócitos de uma diversidade de espécies animais. São responsáveis pelo desenvolvimento de quadro agudo caracterizado por anemia ou uma infecção crônica assintomática ou com variadas síndromes ainda pouco caracterizada podendo, inclusive, interferir em resultados de estudos experimentais em animais de pesquisa. Devido à incapacidade em cultivar estes organismos, técnicas moleculares tem sido utilizadas como padrão no seu diagnóstico e estudo, e novas espécies vem sendo descritas em todo o mundo, principalmente em animais silvestres e de vida livre. Mycoplasma coccoides e Mycoplasma haemomuris são os hemoplasmas mais comumente reconhecidos no sangue de roedores selvagens e de laboratório. Até o presente momento nenhum trabalho tratou de estudar a ocorrência, epidemiologia e caracterização clínica e molecular de hemoplasmas de roedores de vida livre no Brasil. Como a presença de animais selvagens em cativeiro em zoológicos inviabiliza a utilização de raticidas tóxicos ou anticoagulantes, a captura dos animais vivos tem sido utilizada como método de controle paliativo da infestação por roedores nestes locais. O objetivo deste estudo é investigar a ocorrência de micoplasmas hemotrópicos em ratazanas (Rattus norvegicus) de vida livre capturados no Passeio Público e Zoológico de Curitiba e comparar com variáveis hematológicas. Quarenta e três ratazanas foram capturadas entre o Passeio Público e o Zoológico de Curitiba, e 20 outras foram amostradas do criatório do Passeio Público, onde são mantidas para a alimentação dos animais carnívoros do acervo. Mais de sessenta e três porcento das ratazanas foram positivas em triagem universal para micoplasmas hemotrópicos por PCR quantitativa através de técnica de SYBR® Green. Uma amostra de ao menos 50% de cada TM obtida foi submetida a sequenciamento e determinadas como M. haemomuris com exceção de uma amostra, 94% similar ao hemoplasma felino 'Candidatus M. turicensis'. Análise filogenética de um fragmento de aproximadamente 1300 pb do gene 16S rRNA revelou que esta amostra é homóloga a um micoplasma hemotrópico descrito infectando um rato de colheita europeu da espécie Micromys minutus. A relevância da presença de uma nova espécie de micoplasma hemotrópico infectando essas duas espécies diferentes de roedores de vida livre em continentes tão distantes é incerta. Não foram detectadas alterações estatisticamente significativas nos parâmetros hematológicos entre as ratazanas infectadas e não infectadas, o que corrobora o caráter de baixa patogenicidade e/ou infecção silenciosa destes microrganismos. Estes achados sugerem que hemoplasmas possivelmente são endêmicos na região de Curitiba, e a epidemiologia destes microrganismos precisa ser investigada, assim como seu impacto na fauna local, nos animais selvagens e de cativeiro dos parques, com especial atenção ao seu potencial zoonótico. Palavras-chave: ratazana, anemia, hemoplasmose. Abstract: Hemotropic mycoplasmas, also known as hemoplasmas, are bacteria belonging to the class Mollicutes, obligatory pathogens of the red blood cells of a variety of animal species. There organisms are responsible for the development of anemia and disease with acute or chronic course and may occur silently interfering with results of experimental studies in animal research. Due to the inability to cultivate these organisms, molecular techniques have been used as standard diagnosis and study, and new species are being described worldwide, mainly in wild and free living animals. Mycoplasma coccoides and Mycoplasma haemomuris are the most commonly recognized hemoplasmas in the blood of wild and laboratory rodents. To date no work attempted to study the incidence, epidemiology, and clinical and molecular characterization of hemoplasmas in free-ranging rodents in Brazil. As the presence of wild animals in captivity in zoos hinders the use of toxic rodenticides or anticoagulants, capturing live animals has been used as a method of palliative control of rodent infestation in these locations. The aim of this study is to investigate the occurrence of hemotropic mycoplasmas in free-ranging rats (Rattus norvegicus) captured in the Passeio Público and the Curitiba Zoo and compare with hematological parameters. Fourty three rats were captured and 20 others were sampled from the nursery, where they are kept for feeding the carnivorous animals of the parks. 63.5% of rats were positive in universal screening for hemotropic mycoplasmas by quantitative PCR using the SYBR® Green technique. A sample of at least 50% of each TM was subjected to sequencing and determined as M. haemomuris except for one sample, 94% similar to the feline hemoplasma 'C M. turicensis'. Phylogenetic analysis of a fragment of approximately 1300 bp of the 16S rRNA gene showed that this sample was homologous to a hemotropic mycoplasma described infecting a European harvest mouse (Micromys minutus). The relevance of the presence of a new species of hemoplasma infecting two different free-ranging rodent species in such distant continents is uncertain. No statistically significant changes in hematological parameters between infected and uninfected rats were found, which confirms the low pathogenicity and/or silent infection character of these microorganisms. These findings suggest that possibly hemoplasmas are endemic in the region, and the epidemiology of these organisms need to be investigated as well as its impact on local wildlife, captivity animals, with special attention to its zoonotic potential. Key-words: rats, anemia, mycoplasmal disease.