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Orientadores: Gilson Paulo Manfio, Valeria Maia de Oliveira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Trinta linhagens de bactérias acidotermofílicas isoladas do processamento industrial de suco de laranja concentrado congelado (Frozen Concentrated Orange Juice, FCOJ) em diferentes regiões do estado de São Paulo foram estudadas, utilizando-se uma abordagem polifásica, a fim de se determinar a diversidade e potencial deteriogênico destas em processos de produção de FCOJ no país. A caracterização dos isolados envolveu a determinação da capacidade de crescimento e produção de odor em suco reconstituído, análises fenotípicas (padrão de utilização de carboidratos, sistema API 50 CH), quimiotaxonômicas (perfil de FAMES, sistema MIDI) e de caracterização molecular (ARDRA de região espaçadora DNAr 16S-23S com Hae III, Hha I e Msp I, e análise filogenética de DNAr 16S). Todos os isolados foram identificados como pertencentes ao gênero Alicyclobacillus pelos padrões característicos de ácidos graxos. Diferentemente de relatos de literatura, foi confirmada a presença de omega-ciclohexil-C17:0 e omega-ciclohexil-C19:0 em amostras identificadas como A. pomorum. Das 30 amostras ambientais de aliciclobacilos analisadas, 21 foram capazes de se multiplicar em suco de laranja reconstituído após 24 ou 48 h de incubação a 45 °C, mas apenas 10 produziram odor característico de biodeterioração. Seis ribotipos de ARDRA foram obtidos para os isolados, permitindo a alocação destes nas espécies A. acidocaldarius e A. acidoterrestris, e em grupos relacionados a espécies válidas designados como A. acidocaldarius-like e A. pomorum-like Abstract: Thirty strains isolated from industrial processing of frozen concentrated orange juice (FCOJ) in different regions of the state of São Paulo were studied using a polyphasic approach with the goal of determining the diversity and deteriogenic potential of isolates from FCOJ production in Brazil. Characterization of isolates involved determining their ability to grow and produce odor in reconstituted orange juice, and phenotypic (carbohydrate utilization, API 50 CH), chemotaxonomic (FAMES, MIDI system) and molecular analyses (ARDRA of 16S-23S rDNA spacer region, Hae III, Hha I and Msp I, and 16S rDNA phylogenetic analysis). All isolates were identified as Alicyclobacillus spp. according to the characteristic fatty acid patterns. Contrary to literature data, omega-cyclohexyl-C17:0 and omega-cyclohexyl-C19:0 were confirmed in samples identified as A. pomorum. From the 30 environmental alicyclobacili samples analyzed, 21 were able to grow in reconstituted orange juice after 24 or 48 hs incubation at 45 °C, but only 10 isolates yielded a characteristic biodeterioration odor. Six ARDRA patterns were obtained for the isolates analyzed, enabling them to be assigned to A. acidocaldarius and A. acidoterrestris, and to groups related to valid species named A. acidocaldarius-like and A. pomorum-like Doutorado Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Valéria Maia Merzel Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O manguezal é um dos biomas mais importantes para a manutenção da vida nos mares e o equilíbrio da biosfera. O sedimento do mangue é uma grande fonte de novos recursos genéticos para pesquisa. Estes ambientes têm sofrido impacto antropogênico por muito tempo, principalmente a poluição causada por derramamento de petróleo. Diversos estudos estão sendo conduzidos para explorar o potencial genético destas comunidades com a finalidade de desenvolver novos processos biotecnológicos para o tratamento de ambientes contaminados. Dentro deste contexto, este trabalho visou identificar e caracterizar genes que codificam dioxigenases, proteínas envolvidas na degradação de hidrocarbonetos aromáticos, a partir de clones fosmidiais de uma biblioteca metagenômica construída de sedimento de mangue impactado por petróleo do município de Bertioga-SP. A coleta e processamento das amostras ambientais, juntamente com a construção da biblioteca metagenômica fosmidial, foi realizada previamente no âmbito do projeto FAPESP "Prospecção de metagenoma microbiano de sedimentos de manguezais na busca por novos compostos bioativos" (Processo no. 2011/50809-5). O DNA metagenômico das amostras de sedimento, coletadas em triplicata, foi extraído e usado em reações de PCR para a construção de bibliotecas dos genes de dioxigenases que hidroxilam anéis aromáticos (ARHDs) e análise de seus padrões de distribuição biogeográfico. O DNA total da biblioteca fosmidial foi isolado e sequenciado em plataforma Illumina para prospecção in silico de genes envolvidos no metabolismo de compostos aromáticos. Ainda, os clones fosmidiais foram submetidos a uma triagem preliminar por colorimetria, baseada no uso do composto MTT [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2 H-tetrazolium bromide] (Merck) e, posteriormente, ensaios de degradação de hidrocarbonetos por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) para confirmar e quantificar a atividade de degradação de hidrocarbonetos aromáticos (fenol, naftaleno, fenantreno, pireno e benzopireno) dos clones. O DNA fosmidial dos clones com melhor potencial de degradação foi sequenciado e processado para montagem de grandes fragmentos metagenômicos. Caracterização estrutural e funcional dos insertos metagenômicos foram feitos nas plataformas RAST e IMG, para elucidação de clusters gênicos envolvidos na degradação de hidrocarbonetos aromáticos. Alvos gênicos foram isolados, ligados em vetor de expressão pET28a(+) e transformados em cepas de E. coli BL21(DE3) e Rosetta. A análise da diversidade dos genes ?-ARHD revelou que Pseudomonas, Streptomyces, Variovorax, Bordetella e Rhodococcus foram os cinco gêneros mais abundantes entre os 15 sítios analisados. A análise de distribuição biogeográfica revelou forte endemismo de algumas Operational Protein Families (OPF) de alfa-ARHD em cada região geográfica e uma considerável proximidade evolutiva entre OPFs encontradas em sítios da Antártica e da América do Sul. O sequenciamento da biblioteca fosmidial permitiu identificar um total de 71.729 sequências metagenômicas parciais na categoria SEED para metabolismo de compostos aromáticos (1% do total). Estas foram classificadas nas subcategorias Anaerobic degradation of aromatic compounds (20,34%), Metabolism of central aromatic intermediates (35,40%), e Peripheral pathways for catabolism of aromatic compounds (22,56%). Além disso, foi evidenciado o predomínio das dioxigenases de Catecol, Protocatecuato e Homogentisato, envolvidas no metabolismo central, e das dioxigenases de Fenilpropionato, Lignostilbeno, Bifenil e Benzoato envolvidas nas vias periféricas de degradação de aromáticos. As análises de bioinformática dos dados de sequenciamento dos clones fosmidiais potencialmente degradadores revelaram uma interessante diversidade de genes envolvidos direta e indiretamente no metabolismo de compostos aromáticos. Os ensaios de cromatografia mostraram a eficiência de 3 clones na degradação de fenol (98%), pireno (75%) e naftaleno (71%). Os clones contendo os genes alvos para dioxigenases apresentaram sinais positivos nos testes de expressão. Os resultados deste trabalho permitiram elucidar a riqueza, distribuição e relação genética entre os genes ARHD de diferentes sítios ao redor do mundo. Além disso, a avaliação da biblioteca metagenômica pelas diferentes técnicas empregadas, revelou seu extenso potencial genético para o metabolismo de compostos aromáticos Abstract: Mangrove is one of the most important biomes for the maintenance of life in the seas and the balance of the biosphere. Mangrove sediment is a major source of new genetic resources for research. These environments have long been suffering anthropogenic impacts, especially pollution caused by oil spills. Many microbial species are able to degrade petroleum compounds, and several studies are being conducted to explore the genetic potential of these communities with the purpose of developing new biotechnological processes for the treatment of contaminated environments. In this context, this work aimed to identify and characterize genes encoding dioxygenases, proteins involved in the degradation of aromatic hydrocarbons, from fosmid clones of a metagenomic library constructed from oil-impacted mangrove sediments located in the city of Bertioga-SP. Sampling and further processing of environmental samples, together with the metagenomic fosmid library construction, were performed previously under the project "Bioprospecting microbial metagenome from mangrove sediments in the search for novel bioactive compounds" (FAPESP Process no. 2011/50809-5). Metagenomic DNA from sediment samples, collected in triplicate, was extracted and used in PCR reactions for the assembly of Aromatic Ring-Hydroxylating Dioxygenases (ARHDs) gene library and analysis of their biogeographic distribution patterns. Total fosmid DNA was isolated and sequenced on the Illumina platform for in silico prospecting of genes involved in the metabolism of aromatic compounds. Further, fosmid clones were subjected to a preliminary colorimetric screening, based on the use of the compound 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2 H-tetrazolium bromide (MTT, Merck) and, subsequently, to hydrocarbon degradation assays by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) to confirm and quantify the aromatic hydrocarbon degradation activity (phenol, naphthalene, phenanthrene, pyrene and benzopyrene) of the clones. Fosmid DNA from clones with the best degradation potential was sequenced and processed for the assembly of large metagenomic fragments. Further structural and functional characterization of the metagenomic inserts was performed in the RAST and IMG platforms, to elucidate gene clusters involved in the aromatic hydrocarbon degradation. Gene targets were isolated, ligated into pET28a (+) expression vector and transformed into E. coli strains BL21 (DE3) and Rosetta. Diversity analysis of the ?-ARHD genes revealed that Pseudomonas, Streptomyces, Variovorax, Bordetella and Rhodococcus were the five most abundant genera harboring dioxygenases among the 15 sites analyzed. The biogeographic distribution analysis revealed strong endemism of some Operational Protein Families (OPF) of alpha-ARHD in each geographic region and a significant evolutionary relatedness between OPFs found in sites of Antarctica and South America. Sequencing of the fosmid library allowed the identification of a total of 71,729 partial metagenomic sequences in the SEED category for the metabolism of aromatic compounds (1% of the total). These were classified in the categories of Anaerobic degradation of aromatic compounds (20.34%), Metabolism of central aromatic intermediates (35.40%), and Peripheral pathways for catabolism of aromatic compounds (22.56%). In addition, we have demonstrated the predominance of Catechol, Protocatechuate and Homogentisate dioxygenases involved in central metabolism, and the dioxygenases of Phenylpropionate, Lignostilbene, Biphenyl and Benzoate involved in the peripheral pathways of aromatics degradation. Bioinformatics analyzes of sequencing data from potentially degrading fosmid clones revealed an interesting diversity of genes involved directly or indirectly in the aromatic compounds metabolism. Chromatography assays showed the efficiency of three clones in the degradation of phenol (98%), pyrene (75%) and naphthalene (71%). Clones containing the target genes for dioxygenase showed positive signals in expression tests. The results of this work allowed to elucidate the richness, distribution and genetic relationships among ARHD genes from different sites around the world. In addition, the evaluation of the metagenomic library by the different techniques employed revealed its extensive genetic potential for the aromatic compounds metabolism Doutorado Genética de Microorganismos Doutor em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2013/22555-4

Orientador: Lucia Regina Durrant Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Os microrganismos halofilicos sao aqueles capazes de viver em ambientes salinos. Dentre eles encontram-se, por exemplo, as bacterias halofilicas e as haloarqueias. Estas duas classes de organismos foram o objeto de estudo deste projeto. Estes microrganismos foram testados quanto a habilidade de degradacao de compostos monoaromaticos e poliaromaticos. A capacidade de degradacao destes compostos por microrganismos halofilicos e de extrema importancia ja que ambientes salinos estao sujeitos a contaminacoes por compostos toxicos, alem de muitos efluentes industriais, como por exemplo, a agua de producao de petroleo, possuir alta salinidade. As linhagens de haloarqueias testadas apresentaram a capacidade de crescer e degradar acidos aromaticos como unica fonte de carbono e energia. A degradacao foi menor em presenca de 0,05% de extrato de levedura. Estas mesmas linhagens tambem apresentaram a capacidade de degradar HAP em presenca de 0,05% de extrato de levedura. Foram utilizados primers para a amplificacao de genes que sintetizam catecol 1,2-dioxigenase, protocatecuato 3,4-dioxigenase e gentisato 1,2-dioxigenase. Somente a linhagem Halococcus morhuaea apresentou o gene da gentisato 1,2-dioxigenase. As haloarqueias estudadas foram identificadas atraves da amplificacao e sequenciamento do gene RNAr 16S e foram identificadas como pertencentes ao genero Haloferax. Foram isoladas 7 linhagens de haloarqueias a partir de coletas realizadas no Brasil (Nossa Senhora do Socorro-SE e Arraial do Cabo-RJ), uma delas foi identificada como Halosarcina pallida. Duas linhagens de bactérias halofilicas foram isoladas em meio contendo 3 mM de fenol como unica fonte de carbono e energia, a linhagem HU que foi isolada de uma regiao salina contaminada em Huelva-Espanha e outra linhagem AP isolada a partir de agua de producao de petroleo (Petrobras/Sao Sebastiao-SP). Estas foram identificadas como Modicisalibacter tunisiensis e Arhodomonas aquaeolei, respectivamente. As duas linhagens alem de Halomonas organivorans demonstraram a capacidade de degradar fenol. Monodicisalibacter tunisiensis degradou 3 mM de fenol apos 72 horas. Nas tres linhagens foram encontrados os genes de degradacao das enzimas catecol 1,2-dioxigenase e protocatecuato 3,4- dioxigenase. Todas as linhagens de haloarqueias e bacterias halofilicas foram utilizadas para a biorremediacao da agua de producao de petroleo e reduziram a DQO deste efluente. A linhagem AA31 promoveu a maior reducao da DQO do efluente bruto (87,47%) dentre as haloarqueias. Já entre as bacterias H. organivorans promoveu a maior reducao da DQO deste efluente (89,5%). Estes resultados demonstram o grande potencial de degradacao de compostos aromaticos pelas linhagens estudadas, assim como para a biorremediacao da agua de producao de petroleo Abstract: The halophilic microorganisms are those able to live in saline environments. Among them are, for example, halophilic bacteria and haloarchaea. These two classes of organisms have been the aim of study of this Project. These microorganisms were tested for their ability to degrade monoaromatic and polyaromatic compounds. The capacity of degradation of these compounds by halophilic microorganisms is extremely important because saline environments are subject to contamination by toxic compounds, and many industrial effluents, such as the wastewater of oil production have high salinity. The strains of haloarchaea tested here were able to grow and degrade aromatic acids as sole source of carbon and energy. There was a decrease in the degradation when 0.05% of yeast extract was added. These same strains were also able to degrade PAHs in the presence of 0.05% of yeast extract. Primers were used for the amplification of genes that synthesize catechol 1,2-dioxygenase, protocatecuate 3,4-dioxygenase and gentisate 1,2-dioxygenase. Halococcus morhuaea was the only strain showing the gene for gentisate 1,2-dioxigenase. The haloarchaea strains were identified by amplification and sequencing of the 16S rRNA gene and were identified as belonging to the genus Haloferax. Seven haloarchaea strains were isolated from samples collected in Brazil (Nossa Senhora do Socorro-SE and Arraial do Cabo-RJ), one of them was identified as Halosarcina pallida. Two halophilic bacterial strains were isolated in medium containing 3 mM phenol as the sole source of carbon and energy, strain HU, which was isolated from a contaminated region of salt marsh in Huelva, Spain and strain AP isolated from wastewater from oil production (Petrobras / Sao Sebastiao-SP). These two strains were identified as Modicisalibacter tunisiensis and Arhodomonas aquaeolei, respectively. The two strains and Halomonas organivorans demonstrated the ability to degrade phenol. HU degraded 3 mM of phenol after 72 hours. These three strains have the genes for the enzyme catechol 1,2-dixiogenase and protocatecuato 3,4-dioxygenase. All the halophilic bacteria and haloarchaea strains were used for bioremediation of water from oil production and reduced the COD of effluent. Among the haloarchaea, strain AA31 promoted the highest reduction of COD present in the natural effluent (87.47%). Among the bacteria H. organivorans promoted the highest reduction of COD of the effluent (89.5%). These results demonstrate the great potential for degradation of aromatic compounds by the strains studied, as well as for the bioremediation of water produced during oil production Doutorado Doutor em Ciência de Alimentos