Die (6-4) Photolyasen der bakteriellen Cryptochrom/Photolyase (BCP) -Gruppe gehoren zu einer Familie von Flavoproteinen, die als Reparaturenzyme fur UV-B-induzierte DNA-Lasionen (Photolyasen) oder als Blaulicht-Photorezeptoren (Cryptochrome) fungieren. Die (6-4) BCP-Proteine kommen ausschlieslich in Prokaryoten vor. In dieser Arbeit wurden 3 Mitglieder der (6-4) BCP-Gruppe, PhrB von Agrobacterium fabrum, CryB von Rhodobacter sphaeroides und Proma-PL von Prochlorococcus marinus mit einer eukaryotischen (6-4) Photolyase von Ostreococcus tauri OtCPF1 und einem Mitglied der Klasse III CPD Photolyasen PhrA von Agrobacterium fabrum verglichen. Es zeigte sich, dass die DNA-Reparatur-Effizienz von (6-4) BCP-Proteinen durch Mg2+ oder andere zweiwertige Kationen stimuliert wird, wahrend bei OtCPF1 und PhrA keine Wirkung von zweiwertigen Kationen beobachtet wurde. Der Einfluss zweiwertiger Kationen auf die Photoreduktion bei verschiedenen Photolyasen wurde ebenfalls untersucht. Die Photoreduktion von PhrB wurde durch Mg2+ negativ beeinflusst, wahrend bei PhrA Mg2+ einen stimulierenden Effekt hatte. Es stellte sich klar heraus, dass die Abhangigkeit von Mg2+ bei der DNA-Reparatur der (6-4) BCP und nicht bei der Photoreduktion zu suchen ist. Die veranlasste uns zu der Annahme, dass Mg2+ die DNA-Bindung und -Reparatur in (6-4) BCP-Proteinen beeinflusst. Zusammen mit den Strukturdaten und der Sequenzanalyse fanden wir eine vorgeschlagene Mg2+ Bindungsposition neben der DNA-Lasion und modifizierten die beiden betreffenden Aminosauren durch ortsgerichtete Mutagenese. Der Effekt von Mg2+ ging fur beide Mutanten verloren, wahrend die Basisreparaturaktivitat ohne Mg2+ von der Mutation nicht beeinflusst wurde. Vermutlich fordert Mg2+ die Bindung der (6-4) Lasion und erhoht die Elektronen-Affinitat des Substrats. Auserdem wird die Barriere fur Elektronentransfer verringert, wodurch und die Reaktion reibungsloser verlauft. Ich untersuchte auch die Reparatureffizienz fur verschiedene Langen einzelstrangiger und doppelstrangiger DNA. Je langer die DNA war, desto schneller war die Reparatur. Bei einer Lange der DNA von 12 nt oder mehr anderte sich allerdings mit Zunahme der Lange die Geschwindigkeit der Reparatur nicht mehr. In dieser Arbeit werden auch die Mutanten PhrB-Y424F und PhrB-I51W vorgestellt. Tyr424 von PhrB ist Teil der DNA-Bindungsstelle und konnte eine Elektronenverbindung zum Fe-S-Cluster bilden. Die PhrB-Y424F-Mutante zeigte eine starke Verringerung der Bindung von Lasions-DNA und DNA-Reparatur. Die Mutante PhrB-I51W ist durch den Verlust des DMRL-Chromophors, reduzierte Photoreduktion und reduzierte DNA-Reparaturkapazitat gekennzeichnet. Die Kristallstrukturen zeigen eine hohe Ubereinstimmung mit der Wildtyp-Struktur, somit beeinflussen Mutationen nur lokale Proteinumgebungen. Die Photoreduktion von PhrB sich unterscheidet von dem typischen Muster, da die dem FAD benachbarte Aminosaure der Elektronenkaskade ein Tyrosin (Tyr391) ist, wahrend Photolyasen und Cryptochrome anderer Gruppen ein Tryptophan als direkten Elektronendonor von FAD besitzen. In einer Mutante, in der Tyr391 durch Tryptophan ersetzt wurde, ging der Cofaktor-FAD verloren und die PhrB-Struktur war instabil. Trp342 und Trp390 sind fur den Ladungstransfer essentiell sind. Trp342 befindet sich an der Peripherie von PhrB. Die Rolle von Tyr391, die zwischen Trp390 und FAD liegt, war jedoch unklar, da der Ersatz durch Phenylalanin die Photoreduktion nicht blockierte. Bei der Substitution von Tyr391 durch Ala wurde die Photoreduktion blockiert, was darauf hindeutet, dass Tyr391 ein Teil der Elektronentransferkette ist und zeigt, dass der Ladungstransfer uber die Triade 342-391-390 erfolgt. Diese Ergebnisse deuten auf ein tunneling (Elektronentransfer ohne Ladungsanderung) zwischen Trp390 und FAD hin. more...