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A indústria de laticínios tem participação expressiva no setor de alimentos, tendo a produção de produtos lácteos com teor de lactose reduzido pela enzima β-galactosidase, com crescente demanda. O custo destes produtos sem lactose é maior do que produtos lácteos com lactose devido a etapa de hidrólise enzimática empregando enzimas solúveis, assim o uso da β-galactosidase imobilizada surge como alternativa face ao alto custo de enzimas em sua forma livre. As pesquisas são continuamente direcionadas para se aperfeiçoar o biocatalisador, utilizando suportes e condições que viabilizem e melhorem o processo final. No primeiro momento da pesquisa foi realizado um estudo exploratório do efeito causado pela força iônica e pH no processo de imobilização por adsorção física em suporte Duolite A 568. Empregou-se elevadas concentrações da solução tampão Britton-Robinson (BR) de 300 mM a 1000 mM variando o pH entre 3,5 a 4,5 mantendo o tempo de imobilização em 2 horas. Durante os experimentos foi observado o surgimento inesperado de aglomerados (grânulos) enzimáticos, aos quais verificou-se relevante atividade enzimática de 719 (U) em pH 4,0 (300 mM), 767 U em pH 4,5 (300 mM) e 348 U em pH 4,0 (500 mM), com indicativo de possível imobilização livre de suporte. Para as condições de alta molaridade de tampão (1000 mM), os resultados não demonstraram melhora na atividade da enzima imobilizada. Na seqüência avaliou-se a influência conjunta da força iônica e tempo de imobilização em um planejamento composto central rotacional (PCCR) juntamente com a análise do processo de imobilização pelas respostas de rendimento, eficiência e recuperação. Na atividade hidrolítica da enzima β-galactosidase os melhores resultados foram entre 396 U a 470 U, que se concentraram em tempos curtos ou longos associados a condições de baixa força iônica, evidenciando o efeito de interação nas faixas estudadas entre a concentração do tampão BR (5,12 a 99,88) e tempo (0,46 a 6,12 horas). Nos parâmetros do efeito da análise do desempenho da imobilização em observação a maior atividade da enzima de 470 U em condições de 86 mM em 5,3h uma das melhores regiões obteve-se 91,01 de rendimento, 96,71 de eficiência e 88,01 de recuperação demostrando ser uma boa abordagem de aprofundamento em novas pesquisas. Esta pesquisa demostrou que a concentração da força iônica do tampão com tempos definidos e pH da composição do meio são parâmetros importantes que afetam o sítio ativo catalítico da enzima em sua estabilidade, podendo beneficiar ou inibir a atividade da enzima imobilizada. The dairy industry has expressive participation in the food sector, with the production of dairy products with lactose content reduced by the enzyme β-galactosidase, in increasing demand. Lactose-free products have a higher production cost than dairy products with lactose due to the enzymatic hydrolysis step using soluble enzymes, so the use of immobilized β- galactosidase emerge as an alternative to the high cost of enzymes in their free form Researchesare continuously directed to improve the biocatalyst, using supports and conditions that make the final process feasible and improved. At the first moment in the research, an exploratory study was carried out on the effect caused by ionic strength and pH in the process of immobilization by physical adsorption on Duolite A 568 support. High concentrations of the Britton-Robinson (BR) buffer solution were used, from 300 mM to 1000 mM, varying the pH between 3.5 to 4.5, keeping the immobilization time at 2 hours. During the experiments, the unexpected appearance of enzymatic clusters (granules) was observed, which showed relevant enzymatic activity of 719 (U) at pH 4.0 (300 mM), 767 U at pH 4.5 (300 mM) and 348 U at pH 4.0 (500 mM), indicating possible support-free immobilization. For high buffer molarity conditions (1000 mM), the results showed no improvement in the activity of the immobilized enzyme. In sequence, the joint influence of ionic strength and immobilization time in a central rotational composite design (PCCR) was evaluated together with the analysis of the immobilization process by the yield, efficiency and recovery responses. For the hydrolytic activity of the β-galactosidase enzyme, the best results were between 396 U to 470 U, which were concentrated in short or long periods associated with low ionic strength conditions, evidencing the interaction effect in the studied ranges between the BR buffer concentration (5. 12 to 99.88) and time (0.46 to 6.12 hours).In the parameters of the effect of the analysis of the immobilization performance in observation the highest activity of the enzyme of 470 U under conditions of 86 mM in 5.3h one of the best regions was obtained 91.01 of yield, 96.71 of efficiency and 88, 01 recovery proving to be a good approach to deepening in new research. This research demonstrated that the concentration of the ionic strength of the buffer with defined times and pH of the composition of the medium are important parameters that affect the catalytic active site of the enzyme in its stability, which can benefit or inhibit the activity of the immobilized enzyme. Dissertação (Mestrado)

No Brasil não há um consenso sobre a prevalência da intolerância à lactose, mas estima-se que 40% a 60% da população seja intolerante à lactose. Nos últimos anos, a indústria alimentícia desenvolveu uma ampla gama de produtos com lactose reduzida objetivando que uma pessoa intolerante não desista de consumir produtos lácteos. A produção de leite com redução de lactose é feita utilizando a enzima β-galactosidase que tem a capacidade de quebrar a lactose em glicose e galactose. Enzimas são catalisadores de alto custo e o seu uso torna o processo oneroso. A imobilização é um processo de retenção de uma biomolécula no interior de um reator ou de um sistema analítico. A recuperação e reutilização de enzimas através de biocatalisadores imobilizados torna o processo economicamente viável, por isso tem sido considerada uma técnica promissora para tornar competitiva a aplicação de enzimas em larga escala. Neste trabalho foi estudada a imobilização da β-galactosidase de Bacillus licheniformis em resina de troca iônica. O processo de imobilização foi testado em resinas Duolite A568 e Amberlite XAD761, sendo que a Duolite A568 apresentou melhor retenção da atividade enzimática. A influência da concentração da enzima, do tempo e da presença do substrato no processo de imobilização foi testada preliminarmente. A melhor condição de imobilização foi: 43 mL.L-1 de enzima na solução de imobilização, 2 horas de reação e que o substrato no processo de imobilização não incrementou a atividade imobilizada. Na sequência foi avaliada a imobilização em diferentes tampões e forças iônicas e o tampão BR 20 mM foi escolhido para a sequência desta pesquisa por possuir uma ampla faixa de pH ajustável. Um Planejamento Composto Central Rotacional (PCCR) foi proposto para avaliar o processo de imobilização em relação as variáveis: concentração da enzima, força iônica e pH da solução de imobilização. As condições que maximizaram a resposta foram: força iônica de 40 mM, pH 4,0 e concentração da enzima em 43 mL.L-1. Posteriormente foi estudado a influência das ligações multipontuais na atividade da enzima imobilizada, utilizando solução tampão pH 9,0 a 25oC por 24 horas, e ligações cruzada com diferentes concentrações de glutaraldeído. Foi verificado que a etapa de estabilização interferiu drasticamente na atividade da enzima imobilizada, sendo inviável a utilização desta etapa nas condições experimentais deste trabalho. A reticulação com diferentes concentrações de glutaraldeído apresentou influência significativa na atividade da enzima imobilizada, sendo que maiores concentrações do glutaraldeído (3,5 g.L-1) impactou negativamente na atividade enzimática retida no suporte, mas demonstrou 92% e 69% de estabilidade em relação ao número de usos nas temperaturas de reação de 40ºC e 5ºC respectivamente. Por outro lado, a utilização de glutaraldeído em menor concentração (1,0 g.L-1) não afetou a atividade da enzima imobilizada e também não ofereceu boa estabilidade ao biocatalisador, atingindo a atividade relativa de 63% após 6 usos à 40oC e de 48% após 3 usos à 5oC. Por fim, os testes de armazenamento por 36 dias reafirmaram a teoria de que a utilização do glutaraldeído como agente reticulante melhora a estabilidade do biocatalisador imobilizado. In Brazil, there is no consensus about prevalence of lactose intolerance, although it is estimated to be between 40% and 60% of the population. In the last years, the food industry developed a wide range of lactose-reduced products aiming to allow the intolerant person to keep consuming dairy products. The lactose-reduced milk is produced with the enzyme β-galactosidase, which has the ability of breaking the lactose into glucose and galactose. Enzymes are expensive catalyzes and their use burdens the cost of the whole process. The retention of a biomolecule inside of a reactor or analytical system is called immobilization. The recover and reuse of enzymes through immobilized biocatalyzers makes the process affordable; so, the enzymatic immobilization has been considered the most promising method to turn the use of enzyme in large-scale more competitive. The aim of this work was the study of immobilization of β-galactosidase of Bacillus licheniformis in ion exchange resin. The immobilization process was tested in Duolite A568 and Amberlite XAD761 resins. The Duolite A568 showed better retention of the enzymatic activity and was chosen to be used at this study. The influence of enzyme concentration, duration and substrate presence in the immobilization process was tested previously. The best condition of immobilization was: 43 mL.L-1 of enzyme in the immobilization solution, 2 hours of reaction and the substrate didn’t improve the immobilized activity at this process. Then, the immobilization was evaluated in different buffers with diverse ionic strengths. The best result was obtained with BR 20 mM buffer because of its wide range of adjustable pH. A Central Composite Rotational Design (CCRD) was proposed to evaluate the immobilization process for the variables: enzymatic concentration, ionic strength and pH of the immobilization solution. The conditions that maximize the response are: ionic strength of 40 mM, pH 4.0 and enzymatic concentration of 43 mL.L-1. Then, the influence of multipoint attachment on the activity of immobilized enzyme was studied by using buffer solution pH 9.0 at 25oC for 24h. The influence of cross-linking through the use of glutaraldehyde in different concentrations as reticulant agent was also assessed. The stabilization step drastically impacted the activity of the immobilized enzyme, making the use of this step impossible at the experimental conditions of this study. The reticulation with different concentrations of glutaraldehyde showed significant influence on the activity of the immobilized enzyme; higher reagent concentrations (3.5 g.L-1) negatively impacted the enzymatic activity on the support, but showed stability of 92% and 69% related to number of uses in temperatures of reaction of 40oC and 5oC, respectively. On the other hand, the use of glutaraldehyde at lower concentrations (1.0 g.L-1) didn’t affect the activity of the immobilized enzyme and didn’t show good stability to the biocatalyzer, achieving the relative activity of 63% after 6 uses at 40oC and 48% after 3 uses at 5oC. At last, the storage tests for 36 days corroborated the theory that the use of glutaraldehyde as reticulant agent improves the stability of the immobilized biocatalyzer. Dissertação (Mestrado)