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The V-ATPase is a large complex involved in the acidification of intracellular organelles. It is formed by a proton pore (V0 sector) and ATP hydrolysis domain (V1 sector). Pioneering studies in S. cerevisiae have shown that the assembly of the V0 sector occurs in the endoplasmic reticulum (ER) under the guidance of 5 assembly factors: Vma21p, Vma12p, Vma22p, Pkr1p and Voa1p. The newly assembled V0 sector is then escorted by Vma21p to the cis-Golgi, where it will bind the V1 sector to constitute a functional holoenzyme. How the assembly works in mammalian systems is currently still unclear. Yet, it was recently shown that all the assembly factors except Pkr1p are conserved in mammals and that mutations in three of them, ATP6AP1, TMEM199 and CCDC115, were identified to cause a new subgroup of congenital disorders of glycosylation (CDG). Using human genetics and functional validation, I identify in the first part of my thesis a novel mammalian assembly factor called ATP6AP2 that causes a similar CDG-like disease when mutated. Apart from glycosylation defects, patients with missense mutations in ATP6AP2 show steatotic liver disease, cognitive defects and immune defects. Previously exon-skipping mutations in ATP6AP2 had been associated with a late onset cerebral disease, with Parkinsonism and epilepsy. Our work revealed that ATP6AP2 missense mutations lead to defective V-ATPase activity, subsequently causing reduced organellar acidification, lysosomal degradation and autophagic flux. Because of this, clearance of lipid droplets cannot take place in the autolysosomes, giving rise to the steatotic phenotype in the patients hepatocytes. Consistent with the similar clinical phenotype, we found that ATP6AP2 interacts with V0 assembly factors, while the missense mutations reduced the interaction, suggesting a compromised V-ATPase assembly in the patients. By contrast, in patients with exon-skipping mutation we found normal glycosylation of serum proteins and no effect on the interaction between ATP6AP2 and ATP6AP1, suggesting that the missense mutations have a stronger impact on overall ATP6AP2 function than the exon-skipping ones. These results shed light on the V-ATPase assembly in the ER and suggest that ATP6AP2 is an additional mammalian member of the assembly factors. In the second part of my thesis, I demonstrate that mutations in VMA21 also cause CDG with liver disease. Previously, mutations of VMA21 had been associated with an X-linked myopathy with excessive autophagy (XMEA), characterized by progressive vacuolation and atrophy of skeletal muscle. Yet, we were able to identify VMA21 mutations with a similar clinical phenotype compared to the other V-ATPase assembly factor deficiencies. Using patient fibroblasts, we tested the functional impact of the newly identified VMA21 mutations on V-ATPase assembly and function, with the attempt to highlight the differences between with the XMEA ones. First, we could show that VMA21 mutations are hypomorphic and reduce both Vma21 mRNA and protein expression. Second, VMA21 mutations cause autophagic defects with decreased lipid droplet degradation, similar to those observed in ATP6AP2-deficient cells. Finally, VMA21 fibroblasts showed an accumulation of unesterified cholesterol in vesicular structures, similar to what has been reported for the lysosomal storage disease Niemann-Pick type C (NPC). The sequestration of cholesterol in lysosomes triggers lipogenic pathways mediated by the sterol response element-binding protein (SREBP), most likely leading to hypercholesterolemia in the patients. Altogether, our results show that V-ATPase deficiencies are a novel group of metabolic syndromes that affect lysosomal/autophagic homeostasis. Studying these rare V-ATPase assembly disorders that are featured by liver steatosis as a unifying pathology may lead to a better understanding of the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), which is a common problem in metabolic syndrome.; La pompe protonique V-ATPase est un complexe impliqué dans l'acidification intracellulaire. Elle est formée par le secteur V0 pour le transport des protons et le secteur V1 pour l'hydrolyse de l'ATP. Des études pionnières chez S. cerevisiae montrent que l'assemblage du secteur V0 commence dans le réticulum endoplasmique (ER) grâce au contrôle de 5 facteurs d'assemblage: Vma21p, Vma12p, Vma22p, Pkr1p et Voa1p. Une fois assemblé, le secteur V0 est transporté par Vma21p jusqu'au cis-Golgi, où, avec le secteur V1, constitue un holoenzyme fonctionnel. Ce processus chez l'homme n¿est pas encore clair. Il a été récemment démontré que tous les facteurs d'assemblage, à l'exception de Pkr1p, sont conservés chez l'homme et que des mutations chez trois d'entre eux, ATP6AP1, TMEM199 et CCDC115, sont responsables d'un nouveau sous-groupe d'anomalies congénitales de la glycosylation (CDG). Dans la première partie de ma thèse, j'ai identifié des mutations faux-sens dans ATP6AP2, qui provoquent une CDG similaire, avec des anomalies de la glycosylation, une stéatose du foie et des anomalies cognitives et immunitaires. Auparavant, des mutations exon-skipping dans ATP6AP2 avaient été associées à une maladie cérébrale d'apparition tardive, avec du parkinsonisme et de l'épilepsie. Nos travaux ont révélé que les mutations faux-sens dans ATP6AP2 conduisent à une activité défectueuse de la V-ATPase, avec réduction de l'acidification organellaire, de la dégradation lysosomale et du flux autophagique. De ce fait, la clairance des gouttelettes lipidiques ne peut pas se produire dans les autolysosomes, produisant une stéatose dans le foie des patients. Conformément au phénotype clinique similaire, nous avons constaté que ATP6AP2 interagissait avec les facteurs d'assemblage du secteur V0, tandis que les mutations faux-sens en réduisaient l'interaction, suggérant un assemblage compromis chez les patients. En revanche, chez les patients présentant une mutation exon-skipping, nous avons trouvé une glycosylation normale des protéines sériques et aucun effet sur l'interaction entre ATP6AP2 et ATP6AP1, ce qui suggère que les mutations faux-sens ont un impact plus fort sur la fonction globale de ATP6AP2 que celles exon-skipping. Ces résultats révèlent des nouveaux aspects de l'assemblage de la V-ATPase dans l'ER et suggèrent que ATP6AP2 est un membre supplémentaire des facteurs d'assemblage chez l'homme. Dans la deuxième partie de ma thèse, j'ai démontré que des mutations dans VMA21 sont également à l'origine d'une CDG associée à une maladie du foie, avec un phénotype similaire aux autres déficits en facteur d'assemblage de la V-ATPase. Auparavant, des mutations en VMA21 étaient associées à une myopathie X-linked avec une autophagie excessive (XMEA), une vacuolisation progressive et une atrophie du muscle squelettique. En utilisant des fibroblastes de patients, nous avons testé l'impact fonctionnel de ces mutations sur l'assemblage et la fonction de la V-ATPase. Les mutations de VMA21 sont hypomorphes, réduisant l'expression de l'ARNm et de la protéine, et provoquent des défauts de l'autophagie avec une moindre dégradation des gouttelettes lipidiques, similaires à ce qui a été observé dans la déficience en ATP6AP2. Enfin, les fibroblastes des patients montrent une accumulation de cholestérol non estérifié dans des vésicules, similaire à celle observée dans la maladie de surcharge lysosomale Niemann-Pick de type C (NPC). La séquestration du cholestérol dans les lysosomes active la lipogenèse via la protéine SREBP, ce qui conduit à une hypercholestérolémie chez les patients. Globalement, nos résultats montrent que les déficiences de la V-ATPase constituent un nouveau groupe de syndromes métaboliques qui affectent l'homéostasie lysosomale et autophagique. L'étude de ces maladies rares permettra de mieux comprendre la pathogénie de la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD), un problème fréquent dans le syndrome métabolique.

The V-ATPase is a large complex involved in the acidification of intracellular organelles. It is formed by a proton pore (V0 sector) and ATP hydrolysis domain (V1 sector). Pioneering studies in S. cerevisiae have shown that the assembly of the V0 sector occurs in the endoplasmic reticulum (ER) under the guidance of 5 assembly factors: Vma21p, Vma12p, Vma22p, Pkr1p and Voa1p. The newly assembled V0 sector is then escorted by Vma21p to the cis-Golgi, where it will bind the V1 sector to constitute a functional holoenzyme. How the assembly works in mammalian systems is currently still unclear. Yet, it was recently shown that all the assembly factors except Pkr1p are conserved in mammals and that mutations in three of them, ATP6AP1, TMEM199 and CCDC115, were identified to cause a new subgroup of congenital disorders of glycosylation (CDG). Using human genetics and functional validation, I identify in the first part of my thesis a novel mammalian assembly factor called ATP6AP2 that causes a similar CDG-like disease when mutated. Apart from glycosylation defects, patients with missense mutations in ATP6AP2 show steatotic liver disease, cognitive defects and immune defects. Previously exon-skipping mutations in ATP6AP2 had been associated with a late onset cerebral disease, with Parkinsonism and epilepsy. Our work revealed that ATP6AP2 missense mutations lead to defective V-ATPase activity, subsequently causing reduced organellar acidification, lysosomal degradation and autophagic flux. Because of this, clearance of lipid droplets cannot take place in the autolysosomes, giving rise to the steatotic phenotype in the patients hepatocytes. Consistent with the similar clinical phenotype, we found that ATP6AP2 interacts with V0 assembly factors, while the missense mutations reduced the interaction, suggesting a compromised V-ATPase assembly in the patients. By contrast, in patients with exon-skipping mutation we found normal glycosylation of serum proteins and no effect on the interaction between ATP6AP2 and ATP6AP1, suggesting that the missense mutations have a stronger impact on overall ATP6AP2 function than the exon-skipping ones. These results shed light on the V-ATPase assembly in the ER and suggest that ATP6AP2 is an additional mammalian member of the assembly factors. In the second part of my thesis, I demonstrate that mutations in VMA21 also cause CDG with liver disease. Previously, mutations of VMA21 had been associated with an X-linked myopathy with excessive autophagy (XMEA), characterized by progressive vacuolation and atrophy of skeletal muscle. Yet, we were able to identify VMA21 mutations with a similar clinical phenotype compared to the other V-ATPase assembly factor deficiencies. Using patient fibroblasts, we tested the functional impact of the newly identified VMA21 mutations on V-ATPase assembly and function, with the attempt to highlight the differences between with the XMEA ones. First, we could show that VMA21 mutations are hypomorphic and reduce both Vma21 mRNA and protein expression. Second, VMA21 mutations cause autophagic defects with decreased lipid droplet degradation, similar to those observed in ATP6AP2-deficient cells. Finally, VMA21 fibroblasts showed an accumulation of unesterified cholesterol in vesicular structures, similar to what has been reported for the lysosomal storage disease Niemann-Pick type C (NPC). The sequestration of cholesterol in lysosomes triggers lipogenic pathways mediated by the sterol response element-binding protein (SREBP), most likely leading to hypercholesterolemia in the patients. Altogether, our results show that V-ATPase deficiencies are a novel group of metabolic syndromes that affect lysosomal/autophagic homeostasis. Studying these rare V-ATPase assembly disorders that are featured by liver steatosis as a unifying pathology may lead to a better understanding of the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), which is a common problem in metabolic syndrome., La pompe protonique V-ATPase est un complexe impliqué dans l'acidification intracellulaire. Elle est formée par le secteur V0 pour le transport des protons et le secteur V1 pour l'hydrolyse de l'ATP. Des études pionnières chez S. cerevisiae montrent que l'assemblage du secteur V0 commence dans le réticulum endoplasmique (ER) grâce au contrôle de 5 facteurs d'assemblage: Vma21p, Vma12p, Vma22p, Pkr1p et Voa1p. Une fois assemblé, le secteur V0 est transporté par Vma21p jusqu'au cis-Golgi, où, avec le secteur V1, constitue un holoenzyme fonctionnel. Ce processus chez l'homme n¿est pas encore clair. Il a été récemment démontré que tous les facteurs d'assemblage, à l'exception de Pkr1p, sont conservés chez l'homme et que des mutations chez trois d'entre eux, ATP6AP1, TMEM199 et CCDC115, sont responsables d'un nouveau sous-groupe d'anomalies congénitales de la glycosylation (CDG). Dans la première partie de ma thèse, j'ai identifié des mutations faux-sens dans ATP6AP2, qui provoquent une CDG similaire, avec des anomalies de la glycosylation, une stéatose du foie et des anomalies cognitives et immunitaires. Auparavant, des mutations exon-skipping dans ATP6AP2 avaient été associées à une maladie cérébrale d'apparition tardive, avec du parkinsonisme et de l'épilepsie. Nos travaux ont révélé que les mutations faux-sens dans ATP6AP2 conduisent à une activité défectueuse de la V-ATPase, avec réduction de l'acidification organellaire, de la dégradation lysosomale et du flux autophagique. De ce fait, la clairance des gouttelettes lipidiques ne peut pas se produire dans les autolysosomes, produisant une stéatose dans le foie des patients. Conformément au phénotype clinique similaire, nous avons constaté que ATP6AP2 interagissait avec les facteurs d'assemblage du secteur V0, tandis que les mutations faux-sens en réduisaient l'interaction, suggérant un assemblage compromis chez les patients. En revanche, chez les patients présentant une mutation exon-skipping, nous avons trouvé une glycosylation normale des protéines sériques et aucun effet sur l'interaction entre ATP6AP2 et ATP6AP1, ce qui suggère que les mutations faux-sens ont un impact plus fort sur la fonction globale de ATP6AP2 que celles exon-skipping. Ces résultats révèlent des nouveaux aspects de l'assemblage de la V-ATPase dans l'ER et suggèrent que ATP6AP2 est un membre supplémentaire des facteurs d'assemblage chez l'homme. Dans la deuxième partie de ma thèse, j'ai démontré que des mutations dans VMA21 sont également à l'origine d'une CDG associée à une maladie du foie, avec un phénotype similaire aux autres déficits en facteur d'assemblage de la V-ATPase. Auparavant, des mutations en VMA21 étaient associées à une myopathie X-linked avec une autophagie excessive (XMEA), une vacuolisation progressive et une atrophie du muscle squelettique. En utilisant des fibroblastes de patients, nous avons testé l'impact fonctionnel de ces mutations sur l'assemblage et la fonction de la V-ATPase. Les mutations de VMA21 sont hypomorphes, réduisant l'expression de l'ARNm et de la protéine, et provoquent des défauts de l'autophagie avec une moindre dégradation des gouttelettes lipidiques, similaires à ce qui a été observé dans la déficience en ATP6AP2. Enfin, les fibroblastes des patients montrent une accumulation de cholestérol non estérifié dans des vésicules, similaire à celle observée dans la maladie de surcharge lysosomale Niemann-Pick de type C (NPC). La séquestration du cholestérol dans les lysosomes active la lipogenèse via la protéine SREBP, ce qui conduit à une hypercholestérolémie chez les patients. Globalement, nos résultats montrent que les déficiences de la V-ATPase constituent un nouveau groupe de syndromes métaboliques qui affectent l'homéostasie lysosomale et autophagique. L'étude de ces maladies rares permettra de mieux comprendre la pathogénie de la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD), un problème fréquent dans le syndrome métabolique.