Tese de doutoramento em Ciências da Saúde (Pré-Bolonha), Ramo de Medicina, especialidade de Medicina Interna (Pneumologia), apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Introdução A asma é uma doença heterogénea, expressando-se por vários fenótipos, que novos métodos de análise, tipo cluster, têm tentado distinguir. Contudo, biomarcadores, nomeadamente identificadores de gravidade, são escassos. O conhecimento dos seus endótipos através de técnicas avançadas como a metabolómica pode ser útil, como já demonstrámos com a identificação de marcadores de exacerbação pelo estudo do perfil metabolómico urinário de asmáticos. No entanto, a translação de resultados da metabolómica para a clínica necessita validação. Objectivos 1. Caracterizar clinicamente uma população portuguesa de asmáticos, com enfoque nos doentes graves, com suporte em parâmetros funcionais respiratórios e laboratoriais imunoinflamatórios e nas suas correlações. 2. Identificar fenótipos celulares da expectoração e correlacioná-los com os parâmetros determinados. 3. Identificar factores preditores de ocorrência dos fenótipos clínicos. 4. Distinguir clusters de asmáticos. 5. Determinar a relevância da metabolómica na identificação de biomarcadores de gravidade e na distinção de clusters. 6. Correlacionar características clínicas de gravidade e dos clusters identificados com biomarcadores urinários de peroxidação lipídica. Métodos A amostra foi recrutada nos Serviços de Pneumologia e Alergologia dos Hospitais da Universidade de Coimbra, até se obterem cem doentes com asma. Dos procedimentos realizados destacam-se: a avaliação clínica, o estudo funcional respiratório e as colheitas de sangue, expectoração e urina para estudo analítico. O tratamento estatístico foi feito com o programa SPSS, versão 20.0 ®, usando métodos como a regressão logística. Os clusters foram identificados pelo método Ward. A análise metabolómica foi feita pela técnica de microextracção de fase sólida seguida de cromatografia gasosa bidimensional, a análise desses dados foi multivariada e as correlações estabelecidas usaram o método de regressão dos mínimos quadrados parciais. Em todos os testes foram considerados significativos valores inferiores a 0.05. Resultados e Conclusões Os resultados dos parâmetros avaliados foram amplamente coincidentes com os de outros estudos, tendo-se identificado como mais inovador, no grupo grave, a maior frequência de história de pneumonia e o carácter discriminativo do questionário de gravidade utilizado. Nas correlações estabelecidas destacaram-se: as negativas da função respiratória com o questionário de gravidade da asma e a do FeNO com os valores basais de FEV1 (nos graves); as positivas da eosinofilia periférica com a gravidade da doença, o seu início tardio e a pior qualidade de vida. Nos fenótipos da expectoração, o eosinofílico foi mais prevalente, observando-se correlação negativa entre a percentagem de neutrófilos e o FEV1 basal. Nos fenótipos clínicos estudados destacamos: Atópicos, têm idade de início de doença mais precoce, menor ocorrência de história de pneumonia e melhor qualidade de vida; Asmáticos com início após 12 anos, são mais obesos, menos atópicos, com pior controlo e qualidade de vida e maior gravidade da doença; Nos com hipersensibilidade a AINE’s é maior a prevalência de polipose nasal e pior a qualidade de vida; Os pré-obesos, apresentam menor controlo da doença, pior qualidade de vida e maior gravidade; Os obstrutivos persistentes têm menor controlo da doença e maior coexistência de outras doenças obstrutivas; Os graves, maior ocorrência de pneumonia e de outra doença obstrutiva, pior controlo da doença, de qualidade de vida, de função respiratória e maior uso de terapêutica e grau de eosinofilia periférica. Foram factores favoráveis à ocorrência dos fenótipos: Atópico − início precoce da doença, melhor controlo da doença, menor grau de terapêutica. Asma após 12 anos – género masculino, obstrução fixa da via aérea, maior percentagem de eosinófilos no sangue e da pontuação SOA. Hipersensibilidade a AINE’s – polipose nasal e maior gravidade da doença. Obstrução persistente da via aérea – género masculino, maior intensidade de terapêutica, pior função respiratória, maior gravidade da doença e inflamação neutrofílica da via aérea. Grave – eosinofilia no sangue periférico. Foram desfavoráveis para essa ocorrência: Atópico − história de pneumonia, presença de outra doença obstrutiva, doença grave. Asma com início após 12 anos − atopia. Obstrução persistente da via aérea – início da doença antes dos 12 anos. Nos 5 clusters foi evidente a sobreposição de C1, C2 e C5 com outros estudos. C3 correspondeu a asmáticos intermitentes, cuja gravidade dependeu da ocorrência de exacerbações graves; C4, a um grupo com provável alteração de fenótipo inicial (eosinofílico) pela presença de obesidade. Algumas das características com significado na separação dos clusters (idade, excesso de peso, gravidade e eosinofilia periférica) foram relevantes por permitirem a adaptação dos resultados aos endótipos actualmente descritos na literatura. A análise metabolómica do perfil de peroxidação lipídica mostrou relevância, quer na separação dos doentes por gravidade, quer na distinção dos diferentes clusters, tendo sido identificado o grupo de metabolitos responsáveis pelas separações. Em relação à gravidade, a separação foi clara entre grupos, consoante a faixa etária. Em relação aos clusters, a distinção foi clara para os grupos C1, C3 e C5, passíveis de serem organizados pela extensão da peroxidação lipídica (C1>C3>C5). Demonstramos ainda que os níveis de peroxidação lipídica patentes nos perfis metabolómicos urinários destes doentes podem prever a função respiratória (FEV1), o tipo de inflamação Th2 (FeNO) e o grau de gravidade (SOA). Assim, endótipos obtidos pela metabolómica urinária mostraram que alguns clusters e características da asma podem ser associados com metabolitos específicos da peroxidação lipídica. Introduction Asthma is a heterogeneous disease, expressed by several phenotypes, for which new analysis methods, like cluster approaches, have been trying to establish a distinction. Nevertheless, biomarkers, namely those of severity, are scarce. Understanding its endotypes, particularly through advanced techniques such as metabolomics, can be useful, as we have already shown with the identification of asthma exacerbation biomarkers by the urinary metabolomics profile study of asthmatics. However, the translation of metabolomics results into clinical practice still needs validation. Objectives 1. Clinically characterize a Portuguese asthmatic population, with particular attention to severe patients, supported in lung function, immune-inflammatory parameters and their correlations. 2. Identify the sputum cellular phenotypes and correlate them with evaluated parameters. 3. Identify predictors for the clinical phenotypes. 4. Cluster the asthmatic population. 5. Evaluate the importance of metabolomics in the identification of severity urinary biomarkers and in cluster distinction. 6. Correlate severity´s clinical characteristics and identified clusters with urinary biomarkers of lipidic peroxidation. Methods The sample was recruited from outpatient clinic of Pulmonology and Allergology Unit of Hospitais da Universidade de Coimbra, consecutively, until reaching one hundred patients with asthma. From the procedures, we point out the clinical and lung function evaluation, the immunephenotypic analysis of sputum cells and the urinary metabolomics analysis. Statistics was performed using SPSS, version 20.0 ® and data were analysed by methods such as logistic regression. Clusters were identified using Ward´s clustering method. Metabolomics was carried out using solid phase microextraction followed by comprehensive two-dimensional gas chromatography–time-of-flight mass spectrometry, multivariate data analysis was applied and correlations were studied using partial least squares regression. In all statistical tests, p values were significant when