Search

A Produção in vitro de embriões (PIVE) depende das etapas de maturação, fertilização e cultivo in vitro, sendo a maturação a etapa decisiva para o oócito atingir o estádio de mórula e blastocisto. Neste trabalho objetivou-se avaliar a qualidade de maturação in vitro, de acordo com a distribuição mitocondrial de oócitos provenientes de ovários de fêmeas de abatedouro, com baixa ou alta contagem de folículos antrais (CFA). Foram aspirados 243 ovários dos quais selecionou-se 334 oócitos perante de cinco repetições para cada grupo. Os ovários foram separados em dois grupos: 1- baixa CFA (n=19), 2- alta CFA (n= 53) e os oócitos recuperados corados com a sonda MitoTracker Red. Os dados obtidos foram analisados pelo teste não paramétrico exato de Fisher (α=5%) mediante o software Statistical Analysis System for Windows (SAS Inst., Inc., Cary, NC). Em relação a localização das mitocôndrias o presente trabalho apresentou diferenças (p

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior As alterações de cromatina, apesar de não serem avaliadas no espermograma de rotina, sabidamente influenciam a fertilidade de touros. O método de avaliação cromatínica mais utilizado é o SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay), entretanto este é de alto custo. Como alternativa a esta metodologia, a coloração com azul de toluidina (AT) após hidrólise ácida associada a análises computacionais se apresenta como uma ferramenta equivalente e acessível. Além de apresentar menor custo, esta metodologia mensura a intensidade de descompactação e heterogeneidade da cromatina. No entanto, ainda não se definiu que níveis de descompactação e heterogeneidade interferem na fertilidade do touro. Este trabalho tem como objetivos definir os níveis de descompactação e heterogeneidade cromatínicas aceitáveis para que não prejudique a fertilidade do touro e o desenvolvimento embrionário, propor uma classificação das alterações cromatínicas de espermatozoides bovinos de acordo com sua localização e verificar se cada tipo de alteração influencia no processo de fecundação e de desenvolvimento embrionário inicial. Para tal, foram utilizadas amostras de sêmen de animais induzidos à subfertilidade, as quais foram utilizadas para produção in vitro de embriões (PIVE). Estas amostras foram avaliadas pelo método de coloração com AT e posterior análise computacional. Para caracterização da fertilidade das amostras de sêmen, foram avaliadas as taxas de clivagem no segundo dia e de blastocistos morfologicamente normais no sétimo dia de cada rotina de PIVE. Utilizando análise de imagem computacional, foi possível fazer a seguinte classificação das alterações cromatínicas: descompactação na base da cabeça (DB), na metade basal (DMB), em áreas dispersas (AD), no eixo central da cabeça (DEC) e em toda a extensão da cabeça (DT). Foi utilizado teste de correlação de Pearson (pp>0,05) para correlacionar essas alterações com a eficiência da PIVE. Em relação à clivagem, DEC e DT apresentaram correlações negativas e significativas (p=0,03 e p=0,047, respectivamente), DB e DMB apresentaram uma tendência para uma correlação negativa (p=0,06 e p=0,07, respectivamente). Em relação à formação de blastocisto, DB apresentou uma tendência para correlação negativa (p=0,09). Além disso, foi testado dois níveis de anormalidade em relação à heterogeneidade (Het) e descompactação (Des) da cromatina: acima de 5% e acima de 10%. A Des apresentou correlação significativa em relação à clivagem quando utilizado níveis acima de 5 e 10% de descompactação (p=0,03 e p=0,02, respectivamente). Já para Het, não houve correlações significativas tampouco tendências com a eficiência da PIVE. Assim, ficou demonstrado que em PIVE, a descompactação no eixo central e total da cabeça do espermatozoide interfere intensamente no processo de fecundação. Os demais tipos de alterações também podem interferir na fecundação de forma menos intensa. A DB pode interferir na formação de blastocistos. Para a avaliação da descompactação, espermatozoides acima de 5% de Des interferem no processo de fecundação. Já a heterogeneidade, independentemente do nível considerado, não interfere em ambos os parâmetros avaliados. Chromatin alterations, despite not being evaluated in the spermogram routine affect the fertility of bulls. The most used method of chromatin evaluation is the SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay). However it is a high method cost. An alternative method is the toluidine blue (TB) after acid hydrolysis associated with computer analysis - this method is presented as an equivalent and affordable tool. In addition to its lower cost, this methodology measures the intensity of decondensation and heterogeneity chromatin. However, it has not yet determined which decondensation and heterogeneity levels interfere with bull fertility. This study aims to define which levels of decondensation and heterogeneity chromatin are acceptable in order not to prejudice the bull fertility and the embryonic development. It also aims to propose a classification of cattle sperm chromatin alteration according to their location, and it also aims to verify if each type of alteration influences the process of fertilization and the early embryonic development. To this, animals semen samples induced to subfertile were used for in vitro production of embryos (IVP). These samples were evaluated using the AT method, and computer analysis. To characterize the semen fertility samples, cleavage ratio were evaluated on the second day and morphologically normal blastocysts in the seventh day of each IVF. With the use of computer image analysis it was possible to make the following classification of chromatin alterations: decondensation of the base of the head (DB), in the basal half (DBH), in scattered areas (SA), in the central axis of the head (DCA) and the entire length of the head (DT). It was used the estimation of Pearson (pp>0,05) in order to relate these alterations with IVP efficiency. In relation to cleavage, DCA and DT had a significant negative correlation (p=0,03 and p=0,047, respectively). DB and DBH showed a tendency to a negative correlation (p=0,06 and p=0,07, respectively). In relation to the blastocyst formation, DB showed a tendency to a negative correlation (p=0,09). In addition to this, two abnormality levels were tested in relation to the Heterogeneity (Het) and Decondensation (Des) of chromatin: above 5%, and above 10%. Des presented a significant correlation related to cleavage when used levels above 5% and 10% of decondensation (p=0,03 and p=0,02, respectively), while Het had no significant correlations neither tendencies with the IVP. It was established that the central axis decondensation of the sperm in IVP intensely affects the fertilization process. Other types of alterations may also affects, but with less intensity. DB may affect in blastocyst formation. To evaluate the decondensation, sperm above 5% Des affect the fertilization process. Related to heterogeneity, regardless of the level considered, does not interfere in both parameters evaluated. Dissertação (Mestrado)

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Durante a produção in vitro de embriões, a maturação ovocitária pode ser influenciada pelo estresse oxidativo. Assim, é importante conhecer os meios para controlar a produção de espécies reativas de oxigênio (ROs). Objetivou-se avaliar o uso do resveratrol associado a nanopartículas de sílica durante a maturação in vitro de ovócitos bovinos. Ovários bovinos foram coletados em frigorífico comercial e os ovócitos foram distribuídos nos seguintes tratamentos durante o processo de maturação: controle, resveratrol 0,5 μM, resveratrol 1 μM, resveratrol ligado a nanopartículas 0,5 μM e resveratrol ligado a nanopartículas 1 μM. Foram avaliadas as taxas de clivagem e produção de blastocistos, produção de ROs, maturação nuclear ovocitária e apoptose celular. Para mensurar a taxa de produção foram utilizados 789 ovócitos e a análise de ROs e maturação nuclear através das probes 2',7'- dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCFDA) e 4',6'-diamino-2-fenil-indol (DAPI), respectivamente, com 130 e 95 ovócitos. A taxa de apoptose celular embrionária foi feita em 117 embriões, através do iodeto de propídio. A análise estatística foi realizada pelo programa Sigma Plot versão 11 e os dados foram considerados significativos quando P < 0,05 (bilateral). O uso do resveratrol na forma diluída na concentração de 1µM diminuiu a taxa de clivagem e de blastocistos e não foi detectada diferença entre os tratamentos em relação a produção de ROs, maturação ovocitária e apoptose celular. O resveratrol quando associado a nanopartículas de silíca apresenta um melhor resultado para a taxa de clivagem e blastocistos em relação a forma diluída na concentração de 1 μM, o que pode estar relacionado a uma diminuição da toxicidade do antioxidante, devido a liberação controlada quando o mesmo está associado a estes nanomateriais. During the in vitro embryo production, the oocyte maturation may be influenced by oxidative stress. This way, it is important to know the means of controlling the production of oxygen reactive species (ROs). The aim of this study was to evaluate the use of resveratrol associated to nanoparticles of silica during the in vitro maturation of bovine oocytes. We collected bovine ovaries in regional slaughterhouses and the oocytes were distributed during the maturation process in the following treatments: control group, resveratrol 0.5 μM, resveratrol 1 μM, resveratrol connected to nanoparticles 0.5 μM, and resveratrol connected to nanoparticles 1 μM. We evaluated the cleavage rate and blastocysts production, ROs production, oocyte nuclear maturation, and cellular apoptosis rate. To measure the production rate, we used 789 oocytes and the Ros and nuclear maturation analysis were made using probes 2',7'- dichlorofluorescin diacetate (DCFDA) and 4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI), respectively, with 130 and 95 oocytes. The cellular apoptosis rate was done in 117 embryos through propidium iodide. The statistical analysis was made using the Sigma Plot program version 11, and the data were considered significant with P< 0.05 (bilateral). The use of diluted resveratrol at 1µM decreased the cleavage rate of the blastocysts, and there was no difference between the treatments at ROs production, oocyte maturation and cellular apoptosis. The resveratrol shows better results when associated to silica nanoparticles at the cleavage rate and blastocysts related to its diluted form at 1μM concentration, which may be associated to a decrease of the toxicity of the antioxidant because of the controlled release when it is associated to these nanomaterials. Dissertação (Mestrado) 2022-03-04

O objetivo deste estudo foi avaliar a maturação e o desenvolvimento embrionário após a fecundação in vitro de oócitos bovinos que tiveram a maturação bloqueada com Butirolactona I e Roscovitina em meio de pré-maturação suplementado com soro fetal bovino (SFB). Oócitos foram divididos em 4 grupos: Controle 0 hora, Controle (maturação por 24 horas), Butirolactona I (bloqueio da maturação com 150µM de Butirolactona I por 24 horas, seguido de 24 horas de maturação) e Roscovitina (bloqueio da maturação com 50µM de Roscovitina por 24 horas, seguido de 24 horas de maturação). Para avaliar a maturação nuclear, os oócitos foram fixados e corados em aceto orceína. Parte dos oócitos dos grupos Controle 24 horas, Roscovitina e Butirolactona I após o período de maturação, foi fecundado in vitro. O desenvolvimento embrionário foi avaliado pelos índices de clivagem (D3) e formação de blastocistos (D7). Oócitos do grupo Butirolactona I apresentaram índices de Vesícula Germinativa após o bloqueio e de Metáfase 2 após a maturação semelhantes ao dos grupos Controle 0 hora e Controle, respectivamente. Por outro lado, a Roscovitina apresentou menores índices de Vesícula Germinativa e Metáfase 2. Os grupos Controle e Butirolactona I apresentaram maiores índices de clivagens. O grupo Controle apresentou maior produção de blastocistos que o Roscovitina e não diferiu do grupo Butirolactona I. Conclui-se que a Butiroloactona I pode ser utilizada no sistema de pré-maturação em meio contendo SFB, pois apresentou resultados semelhantes ao do grupo Controle o mesmo não ocorrendo com a Roscovitina, que apresentou menores índices de maturação oocitária e de desenvolvimento embrionário. This study evaluated the bovine oocyte maturation and embryo development after in vitro fertilization. The maturation of the oocytes was blocked using Butyrolactone I and Roscovitine using pre-maturation medium supplemented with fetal calf serum (FCS). The ocytes were divided in four groups: Control 0 hour, Control (24 hours of maturation), Roscovitine (maturation blockage with 50mM Roscovitine during 24 hours followed by 24 hours of maturation), and Butyrolactone I (maturation blockage with 150mM Butyrolactone I during 24 hours followed by 24 hours of maturation). The oocytes were fixed and stained with aceto orcein to evaluate the nuclear maturation. After the maturation period, the remaining oocytes of the Control group, Roscovitine, and Butyrolactone I were fertilized in vitro. Embryo development was assessed by the cleavage rate (D3) and blastocysts formation (D7). The Butyrolactone I group had similar rates of germinal vesical stage oocytes during blockage, and Metaphase 2 after maturation, comparing to Control group at 0 hour and Control group, respectively. On the other hand, the Roscovitine group had lower rates of vesical stage oocytes during blockage, and Metaphase 2 after maturation comparing to Control groups. After in vitro fertilization, higher rates of cleavage were observed in Control and Butyrolactone I groups. For the blastocyst formation rate, the Control group showed better results than Roscovitine group. In summary, Butyrolactone I group had similar results to the Control group, and for this reason, is suitable for pre-maturation of bovine oocytes using FCS. In contrast, Roscovitine group had lower oocyte maturation and embryo development.