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Chantier qualité GA; Background: Accurate interpretation of transcriptome profiling by quantitative PCR requires the establishment of species-specific standards. However, the selection of reference genes for assessing RNA expression profiles in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis was mostly based on historical reasons and they often only reflect the traditions of a laboratory. Results: We investigated the expression stability of 10 genes (dicer1, drosha, eef1a1, elavl3, gsc, h4, odc1, rpl8, smn2, tbp), 8 of which are commonly used as internal controls in published RT-qPCR experiments. We defined specific primer pairs and evaluated their suitability as reference genes by performing RT-qPCR expression profiling in Xenopus tropicalis. Gene expression stability was assayed in a set of 15 developmental stages from the egg to the froglet, and in dissected embryos. Conclusions: Overall, we determined a set of qualified reference genes for distinct developmental periods. We recommend the use of dicer1, drosha, eef1a1, and smn2 from early embryonic development up to the end of metamorphosis. During early embryogenesis drosha, eef1a1, smn2 are suitable. For the whole post-embryonic development and for metamorphic stages including pro-metamorphosis and metamorphic climax, we recommend the use of drosha and smn2. These reference genes should prove their usefulness for data comparison across studies.

Résumé synthétique des activités de rechercheMon expérience de recherche débuta avec mon DEA puis ma thèse et se continua pendant un séjour post-doctoral à Heidelberg. Depuis Décembre 2000, j'ai rejoint le Laboratoire de Transgenèse et Génétique des Amphibiens à Orsay en qualité de chargé de recherche au CNRS.Au Kremlin-Bicêtre, à l'unité 347 de l'INSERM “ Génétique et mécanismes des maladies du foie de l'enfant ” dirigée par Michelle Hadchouel, et sous la direction de Michèle Meunier Rotival, mon travail de thèse se centrait sur l'identification par clonage positionnel du gène dont les dysfonctions sont responsables du syndrome d'Alagille.A Heidelberg, au centre allemand de recherche sur le cancer (le DKFZ) au sein du département "Molecular Embryology" dirigée par Christof Niehrs, la recherche porte sur l'embryogenèse précoce chez les vertébrés en utilisant l'amphibien anoure Xenopus laevis comme modèle expérimental. J'ai travaillé plus particulièrement sur l'analyse systématique des profils d'expression génique, l'étude de l'anatomie moléculaire de l'embryon de vertébré et l'isolement de nouveaux gènes impliqués dans le contrôle du développement embryonnaire. A Orsay, au sein du Laboratoire de Transgenèse et Génétique des Amphibiens de l'UPRESA808 dirigée par le Pr Maurice Wegnez, je mène une approche de génomique fonctionnelle pour appréhender les mécanismes de régulation transcriptionnelle au cours de la métamorphose chez Xenopus tropicalis.Travail de thèseLe syndrome d'Alagille (AGS, MIM 118450) est défini par l'association d'anomalies cardiaque, hépatique, oculaire, squelettique et un faciès particulier. La région p12 du chromosome 20 humain a été associée à l'AGS par l'observation de patients porteurs de délétions. Mon travail de thèse a consisté à rechercher le gène responsable de ce syndrome par clonage positionnel. Dans un premier temps, une carte physique contenant le locus AGS et couvrant 3,7 Mb a été construite (Pollet et coll., 1995). Dans un deuxième temps, un contig de 67 YACs couvrant 10 Mb a été caractérisé et a permis d'ordonner 72 marqueurs, et de localiser 20 gènes. Le gène Jagged1 a été identifié comme étant le seul localisé dans la région critique, et a été proposé comme gène candidat responsable de l'AGS (Pollet et coll., 1997). Une recherche de mutations a été effectuée sur 109 patients AGS après une première mise en évidence de mutations de ce gène chez des patients AGS par deux équipes américaines. Il en ressort que sur les 59 mutations différentes recensées se situent dans le domaine extracellulaire, la plupart sont de nature à donner naissance à une protéine JAGGED1 tronquée. L'analyse de la transmission des mutations a révélé que 70% des cas de patients AGS sont sporadiques (Crosnier et coll., 1999).Mes travaux de stage post-doctoral ont consisté à caractériser systématiquement l'expression de gènes exprimés au cours de l'embryogenèse par hybridation in situ sur embryons de xénope, à séquencer partiellement les ADNc correspondants et à maintenir une base de données accessible via l'Internet. 10000 clones d'ADNc ont été caractérisés, 1300 ont été séquencés partiellement. Une base de données d'accès public (Axeldb, Pollet et coll., 2000) de type Acedb compile les premiers résultats publiés concernant l'identification de 273 gènes exprimés différentiellement, dont 204 sont nouveaux chez le xénope (Pollet et coll., 1998). 26 % des ADNc caractérisés correspondent à des gènes d'expression régionalisée au cours du développement, 51 % à des gènes d'expression ubiquitaire et 23 % ne donnent aucun résultat. L'analyse globale des profils d'expression révèle l'existence de groupes de gènes différents qui ont une expression régionalisée comparable. De tels groupes de « synexpression » permettent de prédire la fonction de certains gènes pour lesquels l'analyse de séquence reste non-informative (Niehrs et Pollet, 1999).Recherches en cours Aujourd'hui, le génome complet de plusieurs organismes procaryotes et eucaryotes, unicellulaires et pluricellulaires a été séquencé. Ces avancées ont mis en évidence un important nombre de gènes de fonction inconnue (gènes orphelins). Pour tirer pleinement profit de la connaissance intime des génomes, humain en particulier, une analyse fonctionnelle détaillée et systématique par l'expérimentation et l'étude des génomes d'organismes modèles est nécessaire. L'étude des patrons d'expression des transcrits est une approche qui se prête bien à une analyse systématique et à grande échelle visant à proposer un rôle biologique à chaque gène et peut fournir des informations inédites sur ceux qui sont déjà connus.La grande majorité du programme génétique s'exprime pendant le développement embryonnaire. Le modèle murin reste coûteux et lourd à établir pour étudier les mécanismes moléculaires du développement précoce. En ce sens, le xénope, et en particulier Xenopus tropicalis qui présente tous les avantages de Xenopus laevis plus celui d'être un vrai diploïde, s'annonce comme un modèle vertébré prometteur. Ces caractéristiques vont permettre d'appliquer des systèmes perfectionnés d'études génétiques.Je réalise une étude systématique et à grande échelle d'identification et de caractérisation de l'expression des gènes pendant le développement et la métamorphose chez Xenopus tropicalis. Les différents aspects traités dans ce projet font appel à la réalisation d'un catalogue de gènes (séquençage d'aDNc), à la caractérisation par analyse systématique de profils d'expression génique (puces à ADN) et l'analyse in silico des résultats obtenus (approche bioinformatique). Les connaissances issues de ce projet permettront de constituer un atlas de l'expression des gènes au cours de l'embryogenèse des vertébrés. Cette ressource sera une aide précieuse dans l'étude des réseaux de régulation génétique et des mécanismes par lesquels l'expression différentielle des gènes se met en place au cours du développement embryonnaire. Enfin, les méthodes que je propose d'utiliser vont certainement permettre de définir de nouveaux groupes de synexpression caractéristiques de certaines voies du métabolisme ou de certaines cascades de signalisation.

Résumé synthétique des activités de rechercheMon expérience de recherche débuta avec mon DEA puis ma thèse et se continua pendant un séjour post-doctoral à Heidelberg. Depuis Décembre 2000, j'ai rejoint le Laboratoire de Transgenèse et Génétique des Amphibiens à Orsay en qualité de chargé de recherche au CNRS.Au Kremlin-Bicêtre, à l'unité 347 de l'INSERM “ Génétique et mécanismes des maladies du foie de l'enfant ” dirigée par Michelle Hadchouel, et sous la direction de Michèle Meunier Rotival, mon travail de thèse se centrait sur l'identification par clonage positionnel du gène dont les dysfonctions sont responsables du syndrome d'Alagille.A Heidelberg, au centre allemand de recherche sur le cancer (le DKFZ) au sein du département "Molecular Embryology" dirigée par Christof Niehrs, la recherche porte sur l'embryogenèse précoce chez les vertébrés en utilisant l'amphibien anoure Xenopus laevis comme modèle expérimental. J'ai travaillé plus particulièrement sur l'analyse systématique des profils d'expression génique, l'étude de l'anatomie moléculaire de l'embryon de vertébré et l'isolement de nouveaux gènes impliqués dans le contrôle du développement embryonnaire. A Orsay, au sein du Laboratoire de Transgenèse et Génétique des Amphibiens de l'UPRESA808 dirigée par le Pr Maurice Wegnez, je mène une approche de génomique fonctionnelle pour appréhender les mécanismes de régulation transcriptionnelle au cours de la métamorphose chez Xenopus tropicalis.Travail de thèseLe syndrome d'Alagille (AGS, MIM 118450) est défini par l'association d'anomalies cardiaque, hépatique, oculaire, squelettique et un faciès particulier. La région p12 du chromosome 20 humain a été associée à l'AGS par l'observation de patients porteurs de délétions. Mon travail de thèse a consisté à rechercher le gène responsable de ce syndrome par clonage positionnel. Dans un premier temps, une carte physique contenant le locus AGS et couvrant 3,7 Mb a été construite (Pollet et coll., 1995). Dans un deuxième temps, un contig de 67 YACs couvrant 10 Mb a été caractérisé et a permis d'ordonner 72 marqueurs, et de localiser 20 gènes. Le gène Jagged1 a été identifié comme étant le seul localisé dans la région critique, et a été proposé comme gène candidat responsable de l'AGS (Pollet et coll., 1997). Une recherche de mutations a été effectuée sur 109 patients AGS après une première mise en évidence de mutations de ce gène chez des patients AGS par deux équipes américaines. Il en ressort que sur les 59 mutations différentes recensées se situent dans le domaine extracellulaire, la plupart sont de nature à donner naissance à une protéine JAGGED1 tronquée. L'analyse de la transmission des mutations a révélé que 70% des cas de patients AGS sont sporadiques (Crosnier et coll., 1999).Mes travaux de stage post-doctoral ont consisté à caractériser systématiquement l'expression de gènes exprimés au cours de l'embryogenèse par hybridation in situ sur embryons de xénope, à séquencer partiellement les ADNc correspondants et à maintenir une base de données accessible via l'Internet. 10000 clones d'ADNc ont été caractérisés, 1300 ont été séquencés partiellement. Une base de données d'accès public (Axeldb, Pollet et coll., 2000) de type Acedb compile les premiers résultats publiés concernant l'identification de 273 gènes exprimés différentiellement, dont 204 sont nouveaux chez le xénope (Pollet et coll., 1998). 26 % des ADNc caractérisés correspondent à des gènes d'expression régionalisée au cours du développement, 51 % à des gènes d'expression ubiquitaire et 23 % ne donnent aucun résultat. L'analyse globale des profils d'expression révèle l'existence de groupes de gènes différents qui ont une expression régionalisée comparable. De tels groupes de « synexpression » permettent de prédire la fonction de certains gènes pour lesquels l'analyse de séquence reste non-informative (Niehrs et Pollet, 1999).Recherches en cours Aujourd'hui, le génome complet de plusieurs organismes procaryotes et eucaryotes, unicellulaires et pluricellulaires a été séquencé. Ces avancées ont mis en évidence un important nombre de gènes de fonction inconnue (gènes orphelins). Pour tirer pleinement profit de la connaissance intime des génomes, humain en particulier, une analyse fonctionnelle détaillée et systématique par l'expérimentation et l'étude des génomes d'organismes modèles est nécessaire. L'étude des patrons d'expression des transcrits est une approche qui se prête bien à une analyse systématique et à grande échelle visant à proposer un rôle biologique à chaque gène et peut fournir des informations inédites sur ceux qui sont déjà connus.La grande majorité du programme génétique s'exprime pendant le développement embryonnaire. Le modèle murin reste coûteux et lourd à établir pour étudier les mécanismes moléculaires du développement précoce. En ce sens, le xénope, et en particulier Xenopus tropicalis qui présente tous les avantages de Xenopus laevis plus celui d'être un vrai diploïde, s'annonce comme un modèle vertébré prometteur. Ces caractéristiques vont permettre d'appliquer des systèmes perfectionnés d'études génétiques.Je réalise une étude systématique et à grande échelle d'identification et de caractérisation de l'expression des gènes pendant le développement et la métamorphose chez Xenopus tropicalis. Les différents aspects traités dans ce projet font appel à la réalisation d'un catalogue de gènes (séquençage d'aDNc), à la caractérisation par analyse systématique de profils d'expression génique (puces à ADN) et l'analyse in silico des résultats obtenus (approche bioinformatique). Les connaissances issues de ce projet permettront de constituer un atlas de l'expression des gènes au cours de l'embryogenèse des vertébrés. Cette ressource sera une aide précieuse dans l'étude des réseaux de régulation génétique et des mécanismes par lesquels l'expression différentielle des gènes se met en place au cours du développement embryonnaire. Enfin, les méthodes que je propose d'utiliser vont certainement permettre de définir de nouveaux groupes de synexpression caractéristiques de certaines voies du métabolisme ou de certaines cascades de signalisation.

Cell lines are useful tools to facilitate in vitro studies of many biological and molecular processes. We describe a new permanent fibroblast-type cell line obtained from disaggregated Xenopus tropicalis limb bud. The cell line population doubling time was ∼ 24 h. Its karyotype was genetically stable with a chromosome number of 2n = 21 and a chromosome 10 trisomy. These cells could be readily transfected and expressed transgenes faithfully. We obtained stable transformants using transposon-based gene transfer technology. These cells responded to thyroid hormone and thus can provide a complementary research tool to study thyroid hormone signaling events. In conclusion, this cell line baptized “Speedy” should prove useful to couple in vitro and in vivo biological studies in the X. tropicalisfrog model. genesis 50:316–324, 2012. © 2011 Wiley Periodicals, Inc.