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Epithelial adhesins from Candida glabrata Epithelial adhesins (Epa) are crucial proteins in the colonization, pathogenesis and virulence of Candida glabrata. These adhesins have a similar modular structure to Saccharomyces cerevisiae flocculins, with an N-terminal adhesive A domain, a central neck-like B domain, and an anchorage C-terminal C domain. A hallmark of many fungal adhesins is the presence of a calcium binding PA14 domain within the A domain. The PA14 domain is responsible for carbohydrate binding in a calcium dependent manner, which allows for the classification of these proteins as C-type lectins[1]. In this study, it was possible to elucidate the crystal structures of Epa1A and three variants at resolutions from 1.4 to 2.0 Å. The latter were meant to emulate the specificities of Epa2, Epa3 and Epa6 adhesive domains. The results yielded a profound knowledge of the binding pocket of Epa1A and the mechanisms through which specificity is controlled in the Epa A domain. Especially surprising was the fact that, even though the proteins were crystallized in the presence of lactose, the protein co-crystals never showed the aforementioned sugar. Instead, a galactoseβ1-3glucose disaccharide unit could be modeled into the electron density. The disaccharide is commonly found on cell surfaces and milk derivates, from which the employed lactose was obtained[2]. Epa1A , Epa1→2A, Epa1→3A and Epa1→6A were also functionally characterized by semi- quantitative, high-throughput methodologies. In collaboration with the consortium for functional glycomics, fluorescently labeled proteins were set in contact with large-scale glycan arrays. The results showed a marked preference for galactoseβ1-3 terminal oligosaccharides in the case of Epa1A. For the other proteins, varying degrees of promiscuity were noted. Epa1→6A presented a very similar binding profile to the one presented by Zupancic et. al. in 2008 for Epa6A, demonstrating the validity of the method. Epa1→2A and Epa1→3A were much less active, and presented a preference for sulfated glycans, along with terminal galactose. Fluorescence titrations showed for Epa1A a ~20 time stronger affinity for the T antigen (galactoseβ1-3N-acetyl- galactosamine) than for the milk-derived lactose, showing how marked the adhesin preference for β1-3 linkages is, as compared to β1-4 glycosidic bonds. Adhesins of Helicobacter pylori The adhesins of H. pylori have been shown to be critical for the colonization and immune recognition of the bacterium during gastric invasion and disease development[3]. BabA and SabA figure prominently, as the former is the primary adhesin during early stage colonization, while the latter binds strongly to inflamed tissue[4]. Both of them are autotransporters, with a C-terminal, membrane bound translocation unit and an N-terminal passenger domain which contains the adhesive portion of the protein[5]. Pure, soluble passenger domains of BabA and SabA were successfully overproduced by recombinant expression in Escherichia coli. BabA could be functionally characterized by the same method as the Epa proteins. The results showed that BabA activity was strongly pH dependent, with a ~100 times stronger activity at pH 5.8 than at pH 2.5. This behavior could be further characterized through circular dichroism spectroscopy and size exclusion chromatography, which showed that BabA is in a reversible molten globule-like, aggregation-prone and relaxed conformation at pH 2.5. At pH 5.8, on the other hand, the protein is in a much more compact, defined conformation with a strong tendency to precipitate. H. pylori has been shown to present many pH dependent virulence factors, like the urea transporter, but up to now no direct biochemical data had been presented supporting pH dependent conformational changes in its adhesins., Epitheladhäsine von C. glabrata Die Epitheladhäsine (Epa) sind zentrale Proteine in der Kolonisierung, Pathogenese und Virulenz von C. glabrata. Diese Adhäsine haben einen ähnlichen modularen Aufbau wie S. cerevisiae Flokuline, mit einer N-terminalen adhäsiven A-Domäne, einer halsartigen B-Domäne und einer C-terminalen C-Domäne, die als Verankerung an der Zellwand dient. Flokulin-artige Adhäsine können in vielen Fällen eine Calcium-bindende PA14 Domäne innerhalb der A-Domäne beinhalten. Diese Proteinen wurden als C-Typ Lektine eingestuft, da die PA14 Domäne für eine Calcium abhängige Glycan-Bindung verantwortlich ist[1]. In der folgenden Arbeit war es möglich, die Kristallstrukturen von Epa1A und drei Varianten mit Auflösungen von 1,4 bis 2,0 Å zu lösen. Die Varianten sollten die Spezifitäten der Epa2-, Epa3- und Epa6- adhäsiven A-Domänen emulieren. Diese Erkenntnisse erlaubten eine detaillierte Beschreibung der Bindungstasche von Epa1A und die Mechanismen, durch die die Spezifität in der Epa A- Domäne bestimmt werden. Besonders überraschend war die Tatsache, dass, obwohl die Proteine in Gegenwart von Laktose kristallisiert wurden, die Co-Kristalle keine Laktose zeigten. Stattdessen konnte nur ein Galaktoseβ1-3glukose Disaccharid in die Elektronendichte modelliert werden. Dieses Disaccharid findet sich für gewöhnlich auf Zelloberflächen und in Milchderivaten[2], aus denen die verwendete Laktose stammte. Die funktionelle Charakterisierung von Epa1A , Epa1→2A, Epa1→3A und Epa1→6A verlief über semiquantitative, Hochurchsatz Analysen in Zusammenarbeit mit dem Consortium for Functional Glycomics (CFG). Mit Fluoroforen markierte Proteine wurden mit Glykan Arrays in Kontakt gesetzt. Die Ergebnisse zeigten eine deutliche Präferenz im Falle von Epa1A für Oligosaccharide mit einer terminalen Galaktoseβ1-3 Verknüpfung. Für die anderen Proteinen konnte gezeigt werden, dass die Spezifität in unterschiedlichen Massen verringert war. Das Epa1→6A Bindungsprofil konnte mit der von Zupancic et. al. 2008 publizierten Daten für Epa6A verglichen werden und zeigte große Ähnlichkeit. Epa1→2A und 3A waren deutlich weniger aktiv, zeigten aber eine Präferenz für sulfatierte Glykane sowie für terminale Galaktosen. Quantitative Fluoreszenztitrationen ergaben ungefähr zwanzigfach höhere Affinitäten für das T-Antigen als für die aus Milch gewonnene Laktose, wodurch die Präferenz für β1-3 über β1-4 Verbindungen weiter bestätigt werden konnte. 1.4 Adhäsine von Helicobacter pylori Die Adhäsine von H. pylori zeigten sich als kritisch bei der Kolonisierung und Immunerkennung des Bakteriums während des Eindringens in den Magen und der Entstehung und Entwicklung der Krankheit[3]. BabA und SabA sind zwei besonders wichtige Adhäsine, da ersteres bei einer frühen Kolonisierung als Primäradhäsin wirkt, während SabA stark an entzündetes Gewebe bindet[4]. Es handelt sich bei beiden um Autotransporter, die mit einer C-terminalen, membrangebundenen Translokationseinheit und einer N-terminalen, adhäsiven transportierte Domäne versetzt sind. Reine, lösliche transportierte Domänen von BabA und SabA wurden in großen Mengen in Escherichia coli rekombinant überproduziert. BabA konnte, wie die Epa Proteine, mit Hilfe von Glykan Arrays funktionell charakterisiert werden. BabA-Aktivität erwies sich als stark pH-abhängig, da sich bei pH 5.8 eine etwa hundertfach stärkere Bindung als bei pH 2.5 zeigte. Dieses Verhalten konnte durch Circular-Dichroismus Spektroskopie und chromatographische Analyse weiter untersucht werden. Es zeigte sich, dass BabA bei pH 2.5 sich in eine relaxierten, molten-globule ähnlichen Konformation befand, die leicht aggregierte. Bei pH 5.8 andererseits befand sich das Protein in einer viel kompakteren, klarer definierten Konformation mit einer starken Tendenz zur Präzipitat-Entstehung. Es konnten schon mehrere H. pylori Virulenzfaktoren gefunden werden, deren Aktivität pH abhängig ist, aber bis jetzt gab es noch keine biochemischen Daten, die pH abhängige Konformationsänderungen bei ihren Adhäsinen belegten.