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Eine Trockenextrakt-Zubereitung aus dem Wurzelstock der Traubensilberkerze (Actaea racemosa L., syn. Cimicifuga racemosa (L.) Nutt.) wird in Fertigarzneimitteln seit Jahrzehnten erfolgreich und wissenschaftlich belegt zur Linderung von Wechseljahresbeschwerden eingesetzt. Die Anwendungsgebiete umfassen Hitzewallungen und Schweißausbrüche, psychische Beschwerden, Schlafstörungen, Störungen der Blase und Harnwege sowie die Prophylaxe bei der Entwicklung einer menopausalen Osteoporose. Pflanzliche Fertigarzneimittel, die A. racemosa Zubereitungen enthalten, zeigen sehr gute evidenzbasierte Wirksamkeit bei hoher Arzneimittelsicherheit und geringem Nebenwirkungsrisiko. Dadurch bestätigt sich der Einsatz als Alternative zu einer Hormonersatztherapie, welche mit höherem Nebenwirkungsrisiko behaftet ist, sowie mit dem Risiko der Entwicklung eines Mammakarzinoms. Der Aufklärung der Wirkungsweise sowie dem Erforschen der aktiven Wirkstoffe aus dem BNO 1055 Trockenextrakt aus A. racemosa wurde das Hauptaugenmerk in der Arbeit gewidmet. Durch die Entwicklung eines Fraktionierungsprozess konnte der Trockenextrakt in eine lipophile und eine hydrophile Fraktion getrennt werden. Anschließend wurden mittels präparativer Chromatographie beide Fraktionen in 6 Unterfraktionen geteilt. Mit hochsensitiver Massenspektrometrie (triple ToF/MS) konnte eine umfassende Charakterisierung der Fraktionen bzw. des Gesamtextraktes durchgeführt werden. Actein und 27-Deoxyactein konnten als Hauptinhaltsstoffe in der Subfraktion L 2 identifiziert werden, während die lipophileren Saponine wie Cimiracemosid C, Cimigenolxylopyranosid und Acetylcimigenolxylopyranosid in der Fraktion L 3 vorhanden waren. Die hydrophilen Unterfraktionen sind charakterisiert durch den hohen Anteil an Zuckern (H 1) und die bekannten Phenylpropanoide (H 2). In der Unterfraktion H 3 konnten die N-haltigen Verbindungen Cimipronidin und Cyclocimipronidin, sowie das Serotonin-Analogon Nω Methylserotonin nachgewiesen werden. Alle Unterfraktionen, der Gesamtextrakt sowie die lipophile und hydrophile Fraktion wurden in Zusammenarbeit mit der Medizinischen Fakultät der Georg-August-Universität Göttingen auf pharmakologische Wirkung untersucht. Der Gesamtextrakt, die LF und die L 2 Fraktion konnten signifikant die Entwicklung einer Osteoporose von ovariektomierten Ratten verhindern. Aufgrund der Wirksamkeit der L 2-Fraktion und deren Hauptinhaltsstoff 27-Deoxyactein wurde diese Verbindung mit Hilfe eines Caco 2 Permeabilitätsassay auf ihre Bioverfügbarkeit untersucht. Zu diesem Zweck konnte eine LC-MS Methode (HPLC-Methode 06) zur Quantifizierung von 27 Deoxyactein erfolgreich validiert werden. Vorab durchgeführte Toxizitätsversuche zeigten, dass der Gesamtextrakt in keiner Weise toxisch auf die Caco Zellen wirkte. Anhand des Permeabilitätsassay konnte für 27-Deoxyactein ein Papp-Wert von A → B von 10,6 x e-6 bzw. 9,2 x e-6 in den Extrakten C001 und C005 ermittelt werden. Die Transporte wurden ebenso in umgekehrter Richtung durchgeführt, dabei wurde bei C001 ein Papp-Wert von 17,4 x e-6 und bei C005 von 21,3 x e-6 für 27-Deoxyactein berechnet. Die errechnete Efflux-Ratio, die einen Aufschluss auf den Transportmechanismus zulässt, ergab im Mittel einen Wert von 2, woraus man auf die aktive Sekretion der Substanz schließen kann. Nach der Identifizierung von Nω-Methylserotonin in A. racemosa wurde im dritten pharmakologischen Teil der Arbeit in einem zellbasierten funktionellen Bindungsassay untersucht, inwiefern der Gehalt von Nω-Methylserotonin in unterschiedlichen Drogenchargen mit der Bindungsaffinität an den Serotoninrezeptor 5-HT 7 und damit der Wirksamkeit der Drogenchargen korreliert. Ein eindeutiger Zusammenhang zwischen dem ermittelten Gehalt von Nω-Methylserotonin und der EC 50 aus dem Bindungsassay konnte nicht nachgewiesen werden. Vielmehr scheint das Zusammenspiel unterschiedlicher Substanzen in der Pflanze für die Wirkung verantwortlich zu sein. Der 5-HT 7 Rezeptor konnte durch diese Arbeit aber als ein Target von Actaea racemosa Zubereitungen identifiziert werden. Die Traubensilberkerze gilt als eine hochpotente Arzneipflanze, deren detaillierte Erforschung noch weitere Jahre andauern wird. Durch diese Arbeit konnte eine umfassende Inhaltsstoffprofilierung sowie ein reproduzierbarer Fraktionierungsprozess erstellt werden. Es konnte gezeigt werden, dass Saponine aus der lipophilen Fraktion L 2 protektiv gegen Osteoporose in der Menopause wirken, während die Bestandteile der hydrophilen Fraktion H 3 spezifisch serotonerge und dopaminerge Wirkungen aufweisen und damit die zentralnervösen klimakterischen Beschwerden positiv beeinflussen. Diese Daten sowie der durchgeführte Fraktionierungsprozess könnten zukünftig dazu beitragen, hochspezifische Trockenextrakte zur Behandlung von Erkrankungen in der Menopause herzustellen. Herbal medicinal products with specific extracts from rhizome and root material of black cohosh [Actaea racemosa L., syn.: Cimicifuga racemosa (L.) Nutt.] are widely accepted to relieve climacteric symptoms in postmenopausal women. The indication encompasses hot flushes, mental and sleep disorders, bladder diseases and prophylaxis of menopausal osteoporosis. Phytotherapeutics containing black cohosh show high evidence based efficacy with a good safety profile. This justifies black cohosh to be a promising phytotherapeutic alternative to hormone replacement therapy which is usually associated with a high risk of adverse events as well as the risk of development breast cancer. The aim of the thesis was to explore active components and their mode of action of BNO 1055 dry extract. In the first part the special extract BNO 1055 from black cohosh was fractionated by preparative chromatograhy into six subfractions which were subsequently characterised by high resolution mass spectrometry (LC/ToF-MS). Analytical data clearly prove the presence of the main triterpene glycosides acteine and 27 deoxyacteine in the lipophilic subfractions L 2 whereas cimiracemoside C, cimigenolxylopyranoside and acetylcimigenolpyranoside were present in L 3. High amounts of carbohydrates characterised H 1. The hydrophilic subfraction H 2 contained phenylpropanic acid derivatives. Nω-methylserotonin as well as the alkaloids cimipronidine and cyclocimipronidine were identified in H 3. Additionally in cooperation with the medical department of the Georg-August-Universität Göttingen the development of osteoporosis in ovariectomised rats was shown to be inhibited significantly by the whole extract, LF and L 2 fraction. Further bioavailability of 27-deoxyactein was determined by using a caco-2 permeability assay. For this purpose a LC-MS quantification method was successfully validated. Preliminary toxicity test results showed no cytotoxic activity of the whole extract against caco-cells. The permeability assay determined Papp-values of 10.6 x e-6 and 9.20 x e-6 respectively for 27-deoxyacteine in the extracts C001 and C005 for efflux from A to B. Papp-values of 17.4 x e-6 and 21.3 x e-6 respectively for 27-deoxyacteine in C001 and C005 were computed for reverse direction. The calculated efflux ratio, which suggest the preferred mechanism of transport, was 2 indicating an active secretion of 27-deoxyacteine. In addition using a cell-based functional binding assay a distinct correlation between the content of Nω methylserotonin and the binding affinity to the serotonin receptor 5-HT 7 in different drug batches could not be shown. This indicates that the content of Nω methylserotonin is not solely responsible for the efficacy of black cohosh; this is rather accounted to an interaction of various components of the plant. Confirmation of the 5-HT 7 receptor as a target of black cohosh could be demonstrated in this study. Black cohosh is considered to be a highly potent medicinal plant and years of further research will be needed to fully explore its broad range of efficacy in climacteric disorders. Within this thesis a complete ingredient screening and fractionation process was performed. The data showed that saponines from the lipophilic fraction L 2 are protective against osteoporosis, whereas the constituents of the hydrophilic fraction exhibit specifically serotonergic and dopaminergic actions and could therefore positively influence central nervous climacteric symptoms. These data and the fractionation process used may contribute to establish high specific and targeted dry extracts in the future.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Struktur einer flüssigkristallinen Cholesterolformulierung mittels Licht- und Elektronenmikroskopie, Röntgendiffraktometrie sowie mit Hilfe der Differentiellen Thermoanalyse und rheologischer Messungen analysiert. Dazu wurden zunächst eine geeignete Herstellungsmethode etabliert und notwendige Rezepturbedingungen ausfindig gemacht. Durch anschließende Untersuchung von Solubilisationseigenschaften sowie der Wirkstoffpermeation und der Wechselwirkung mit Stratum corneum-Lipiden wurde die Eignung dieser Formulierung als ein innovatives Vehikelsystem zur topischen Applikation geprüft.

In der vorliegenden Arbeit wird die Entwicklung und Charakterisierung von Pulverformulierungen für die nasale Vakzinierung beschrieben. Dabei werden mit den mikropartikulären und nanopartikulären Formulierungen zwei unterschiedliche Formulierungsansätze verfolgt. Die mikropartikulären Formulierungen beinhalten sprühgetrocknete Chitosan-Mikropartikel, in denen ein Modellantigen, das Rinderserumalbumin (BSA), inkorporiert ist. Die Partikelgröße der Mikropartikel liegt im unteren Mikrometerbereich, was im Hinblick auf eine partikuläre Aufnahme durch spezialisierte Zellen des lymphatischen Gewebes der Nase und eine anschließende lokale Prozessierung vorteilhaft ist. Allerdings lassen sich die Mikropartikel durch die verwendete Applikationshilfe, den PowderJet, nicht reproduzierbar dispergieren und weisen ein ungünstiges nasales Depositionsprofil mit einer hohen post-nasalen Fraktion auf. Um diese Eigenschaften zu verbessern, wurden die Mikropartikel zusammen mit unterschiedlichen Trägermaterialien (Mannitol, Sorbitol, Maltitol) gemischt und so interaktive Pulvermischungen hergestellt. Die Mikropartikel adhärieren auf der Oberfläche der größeren Trägerpartikel, welche aufgrund ihrer Größe und der damit verbundenen Trägheit überwiegend nasal abgeschieden werden. Aufgrund der Codeposition von Mikro- und Trägerpartikeln kann die nasale Deposition verbessert und die post-nasale Fraktion deutlich reduziert werden. Die Untersuchungen zeigten außerdem, dass die nasale Deposition nicht nur von der Formulierung, sondern auch von der Applikationshilfe abhängig ist. So konnten mit Hilfe des Powder UDS, welches für die Einmalapplikation von Pulvern entwickelt wurde, bessere Ergebnisse als mit dem reservoirbasierten PowderJet erzielt werden. Für die nanopartikulären Formulierungen wurden Nanopartikel aus Agarose mittels einer Präzipitationsmethode hergestellt, die mit einem Modellantigen, dem Ovalbumin (OVA), beladen sind. Um diese Nanosuspension in eine finale Pulverformulierung zu überführen, wurden zwei unterschiedliche Methoden genutzt. Zum einen wurde die Nanosuspension zusammen mit Mannitol sprühgetrocknet, so dass die Nanopartikel in eine mikropartikuläre Matrix eingebettet wurden. Zum anderen wurden Trägerpartikel aus Mannitol mit der Nanosuspension gecoatet. In diesem Fall lagen die Nanopartikel auf der Oberfläche des Mannitols vor. Beide Formulierungen lassen sich mit Hilfe des Powder UDS dispergieren, allerdings unterscheiden sie sich in ihren Depositionsprofilen. Während die gecoatete Formulierung zu einer unerwartet hohen post-nasalen Fraktion führt, zeigt die sprühgetrocknete Formulierung eine angemessene nasale Deposition und ist daher für die nasale Anwendung besser geeignet. Neben der Entwicklung und der anwendungsorientierten Charakterisierung der Formulierungen wurde auch die Stabilität der verwendeten Modellantigene untersucht. Die Herstellung der primären Antigenträger (Mikropartikel und Nanopartikel) beeinflusst die Primärstruktur der Proteine nicht und die Sekundärstruktur nur geringfügig. Die Untersuchung der Lagerstabilität der Chitosan-Mikropartikel zeigte, dass eine Lagerung bei erhöhter Temperatur und Luftfeuchte (40°C/75% rF) zwar zu einer nennenswerten Reduzierung des Proteingehalts führte, allerdings bleiben sowohl die Primär- als auch die Sekundärstruktur des BSAs bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von sechs Monaten annähernd unverändert. Allerdings ist die Proteinstabilität insgesamt noch nicht zufriedenstellend und im Hinblick auf eine dahingehende Optimierung der Formulierung sollte auch der Einsatz alternativer Polymere evaluiert werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sowohl der mikro- als auch der nanopartikuläre Ansatz zu vielversprechenden Pulverformulierungen für die nasale Vakzinierung geführt haben. Die Mikropartikel bieten den Vorteil, dass eine Aufnahme größerer Mengen eines Antigens über spezialisierte M-Zellen erfolgen kann. Die Nanopartikel werden dagegen schneller, vor allem von im Gewebe verteilten dendritischen Zellen, aufgenommen. Daher wäre im Hinblick auf eine optimale Formulierung auch eine Kombination dieser beiden Antigenträger denkbar. The aim of the study was the development and characterization of dry powder formulations for nasal vaccination. For this, two formulation strategies were evaluated, which involve nano- as well as microparticulate formulations. The microparticulate formulations contain spray dried chitosan microparticles with incorporated bovine serum albumin (BSA) as a model antigen. The particle size of the microparticles is in the low micrometer range which allows uptake of the particles by specialized cells of the nasal lymphoid tissue and hence local processing. However, the microparticles cannot be dispersed reproducibly by the utilized nasal device (PowderJet) and nasal deposition profiles show an undesired high post-nasal fraction. In order to improve the performance interactive powder blends showing low separation tendency were implemented using sugar alcohols (mannitol, sorbitol, maltitol) as carriers. Based on the co-deposition of microparticles and carrier the nasal deposition is improved and the post-nasal fraction is significantly reduced. In addition, experiments showed that the nasal deposition is not only dependent on the formulation but also on the device. Comparing two devices, the Powder UDS, which is a disposable single use device, leads to better deposition profiles and is therefore superior to the reservoir-based PowderJet. For the nanoparticulate formulations agarose nanoparticles containing the model antigen ovalbumin (OVA) were prepared by a precipitation method. In order to convert the obtained nanosuspension into a dry powder two different methods were used. On the one hand, the nanosuspension was spray dried together with mannitol. In this case the nanoparticles were embedded in a microparticulate mannitol matrix. On the other hand, mannitol carrier particles were coated with the nanosuspension so that in the final formulation the nanoparticles were located on the surface of the carrier. Both formulations can be readily dispersed by means of the Powder UDS, but show differences in the nasal deposition profiles. While the coated formulation leads to a high post-nasal fraction the spray dried formulation reveals an appropriate nasal deposition profile and is therefore more suitable for nasal administration. In addition to the development and application-oriented characterization of the formulations the stability of the model antigens was analyzed. The preparation methods of the antigen delivery systems (micro- and nanoparticles) do not influence the primary structure of the proteins and the secondary structure was only marginally changed. The examination of the storage stability of the chitosan microparticles revealed that storage at elevated temperature and relative humidity (40°C/75% RH) leads to a noteworthy decrease in protein content, but during six months storage at room temperature the protein showed no change in primary and secondary structure. Overall the protein stability needs to be improved and for this the use of alternative polymers should be evaluated. In conclusion, the developed micro- and nanoparticulate formulations are promising delivery systems for nasal vaccination. Microparticles can be taken up by specialized M-cells in the nasal associated lymphoid tissue and are able to deliver higher amounts of antigens, whereas nanoparticles can be taken up faster especially by dendritic cells distributed throughout the epithelium. Therefore a combination of both delivery systems might also be feasible.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Exopolysaccharide (EPS) von verschiedenen cyanobakteriellen Stämmen isoliert und Untersuchungen zu deren Struktur und biologischer Aktivität durchgeführt. Bei der Kultivierung von Arthrospira platensis SAG 21.99 (A. plat.), Gloeothece membranacea SAG 26.84 (G. memb.) und Phormidium spec. SAG 47.90 (P. sp.) korrelierte jeweils der Anstieg des Kohlenhydratgehalts im Medium mit dem Wachstum der Biomasse. Dies spricht dafür, dass die EPS dem Primärstoffwechsel zugehörig sind. Es ergaben sich maximale EPS-Ausbeuten von 55,3 mg/l für P. sp. und 103,4 mg/l für A. plat.. Die höchste EPS-Produktion zeigte G. memb. mit 125,9 mg/l. Die EPS von A. plat. zeigten einen Kohlenhydratanteil von 78,6% und einen Proteinanteil von 9,7%. Außerdem lagen Sulfat-, Pyruvat- und Acetatgruppen zu 1,1%, 3,0% und 3,9% vor. Der Kohlenhydratteil bestand zu 30% aus Uronsäuren und zu 70% aus einem Neutralzuckeranteil, welcher, wie für cyanobakterielle EPS charakteristisch, aus 7 verschiedenen Monomeren mit Glucose als dominierendem Zucker bestand. Durch die Bindungstypanalyse und die gelpermeationschromatographische Untersuchung ergab sich für die EPS ein eher globulärer als langgestreckter Aufbau mit einem geringen Anteil von knapp 20% Verzweigungen und 60% linear-verknüpften Zuckern. Es konnte weder bei den Testungen auf antimikrobielle Eigenschaften und Zytotoxizität noch bei der Untersuchung auf komplement-modulierende Eigenschaften eine biologische Aktivität nachgewiesen werden. Die von P. sp. isolierten EPS hatten einen Proteinanteil von 12,9% und einen Gesamtkohlenhydratgehalt von 59,9%, von dem gut 10% aus Uronsäuren bestanden. Die Neutralzuckerzusammensetzung zeigte, wie bei A. plat., 7 verschiedene Monomere mit Glucose als Hauptzucker. Außerdem waren in den EPS 1,5% Sulfat-, 0,6% Pyruvat- und 9,1% Acetatgruppen enthalten. Zum strukturellen Aufbau der EPS ließ sich keine eindeutige Aussage treffen, da, vermutlich aufgrund von zu schlechter Löslichkeit, die Ergebnisse der Bindungstypanalyse und der Molekulargewichtsbestimmung nicht stimmig waren. Auch eine signifikante biologische Aktivität ließ sich bei keiner der oben genannten Testungen nachweisen. Für die EPS von G. memb. wurde ein Gesamtkohlenhydratgehalt von 50,5% bestimmt; Uronsäuren machten davon knapp 12% aus. Der dominierende Zucker war in diesem Fall Galactose, dennoch ließen sich, cyanobakterientypisch, 8 verschiedene Monomere nachweisen. Hierbei fiel 2-O-Methyl-Xylose als sonst relativ selten vorkommender Zucker auf. Der Proteinanteil betrug 3,7%, Pyruvat- und Acetatgruppen ließen sich zu 1,2% bzw. 3,7% nachweisen. Die Bindungstypanalyse und die gelpermeationschromatographische Untersuchung wiesen auf ein eher langgestrecktes Molekül mit kleinen Seitenketten hin. Auffällig war eine relativ hohe Sulfatierung von 13,9% der EPS von G. memb.. Dies scheint der Grund dafür zu sein, dass sie eine biologische Aktivität im Komplement-Assay aufwiesen. Es zeigte sich eine schwache Hemmung des klassischen Wegs mit einer IC50 von 428,4 µg/ml. Bei den Testungen auf antimikrobielle und zytotoxische Eigenschaften ließ sich jedoch keine Aktivität erkennen.

Unter den cyanobakteriellen Exopolysacchariden (EPS) stellen diejenigen von Synechocystis aquatilis Sauvageau SAG 90.79 eine Besonderheit dar. Zum ersten Mal wurde der Aminozucker α-N-Acetyl-Fukosamin(p) in cyanobakteriellem Material gefunden. Dieser befindet sich in auch sonst bemerkenswerten EPS mit den Hauptkomponenten α-Fukose(p), β-Arabinose(p) und Glukose. Zusätzlich sind diese EPS hochsulfatiert. Basierend auf einer Vielzahl von weiteren Ergebnissen konnte ein Strukturmodell für die EPS von S. aquatilis erarbeitet werden. Der Kohlenhydratanteil der EPS von Synechocystis pevalekii SAG 91.79 hingegen entspricht dem generellen charakteristischen Aufbau cyanobakterieller EPS mit 7 Monosacchariden und zusätzlich dem Aminozucker N-Acetyl-Glukosamin. Zwar ist dieses Polysaccharide nicht sulfatiert, dafür aber vermutlich kovalent an einen großen Proteinanteil gebunden, der reich an Asparagin- und Glutaminsäure ist. Es zeigte sich, dass die EPS jeweils überwiegend aus einem Hauptpolysaccharid bestehen. Hingegen konnte gezeigt werden, dass die EPS zweier weiterer Synechocystis aquatilis Sauvageau-Kulturen anderer Algen-Sammlungen, namentlich CAUP A 801 und CCALA 189, eine grundlegend andere Zusammensetzung aufweisen als die EPS von S. aquatilis Sauvageau SAG 90.79. Es wurden die Einflüsse der EPS auf das humane Komplementsystem getesten. Die EPS von S. pevalekii zeigten keinerlei stärkere Beeinflussung der Komplementaktivität. Für die EPS von S. aquatilis (SAG 90.79) konnte zum ersten Mal eine Inhibition des Lektin-Weges beobachtet werden. Außerdem bestätigte sich die potente Inhibition des klassischen Komplementweges. Als wirksamkeitsbestimmende Voraussetzungen für die Hemmung des klassischen Weges konnten ausreichende Molekülgröße und Sulfatierung nachgewiesen werden. The exopolysaccharides (EPS) from Synechocystis aquatilis Sauvageau SAG 90.79 are exceptional for cyanobacterial EPS. For the first time the amino sugar α-N-acetyl-fucosamine(p) was found in cyanobacterial material. It is present in the remarkable EPS from S. aquatilis besides α-fucose(p), β-arabinose(p) und glucose. Additionally, these EPS are highly sulfated. Via further results a structural model of EPS from S. aquatilis could be established. The sugar moiety of EPS from Synechocystis pevalekii SAG 91.79 is characteristic as described for other cyanobacterial EPS consisting of 7 monosaccharides and the amino sugar N-acetyl-glucosamine. This polysaccharide is not sulfated, but is probably covalently linked to a large quantity of protein, containing high amounts of aspartic- and glutamic acid. It could be shown that both EPS are composed of main polysaccharides respectively. However, it was shown that two further Synechocystis aquatilis Sauvageau-cultures from different culture collections, namely CAUP A 801 und CCALA 189, are of fundamental different composition of EPS compared to S. aquatilis Sauvageau SAG 90.79. The influence of EPS on the human complement system was tested. The EPS from S. pevalekii had no influence on any of the complement pathways. For EPS from S. aquatilis (SAG 90.79) an inhibition of the lectin pathway was observed for the first time, and the potent inhibition of the classical pathway could be confirmed. Sufficient molecular size and degree of sulfation are important structural elements for complement inhibitory activity.

Pyrrolizidinalkaloide (PAs) werden von zahlreichen Arten der Angiospermen als chemische Barriere gegen Herbivorie gebildet. Auf welche Weise sich der komplette Stoffwechselweg im Verlauf der Evolution etablieren konnte, ist ein derzeit noch kaum verstandenes Phänomen. Ein gut untersuchter Schritt der PA-Biosynthese wird von der Homospermidin-Synthase (HSS) katalysiert. Aus der Literatur ist bekannt, dass die HSS ausschließlich in spezialisierten Zellen exprimiert wird. Diese Spezifität wurde genutzt, um mittels cDNA-Subtraktion und Pyrosequenzierung Gen-Transkripte von HSS exprimierenden Zellen zu identifizieren. Zellspezifische Analysen wurden durch die laserunterstützte Mikrodissektion erreicht. Mehrere Kandidatengene der PA-Biosynthese werden diskutiert. Pyrrolizidine alkaloids (PAs) are produced by several angiosperm species as part of their chemical defence against herbivory. How the complete PA pathway was realised during evolution is far from being understood. One well characterized step in PA biosynthesis is catalyzed by homospermidine synthase (HSS). It is shown in the literature that HSS expression is restricted to specialized cell types. This specificity was utilized in order to identify gene transcripts of HSS expressing cells using cDNA subtraction and pyrosequencing. Cell specific analysis have been achieved by laser capture microdissection. Several candidate genes of PA biosynthesis are discussed.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmalig Arabinogalaktan-Proteine (AGPs) in der Familie der Geraniaceae - speziell von der Art Pelargonium sidoides - nachgewiesen, isoliert und charakterisiert. Dabei dienten getrocknete und frische Wurzeln sowie etablierte Zellkulturen, die ein optimales Wachstum in MS-Medium mit 1 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 0,2 mg/l Kinetin und je 50 mg/l Ascorbin- und Citronensäure zeigten, als Ausgangsmaterial. Die Isolierung von reinem AGP aus dem Wurzelmaterial erwies sich als schwierig, da die Glykoproteine mit den in der Pelargonium-Wurzel vorkommenden Proanthocyanidinen und hydrolysierbaren Gerbstoffen sowie der Stärke vermutlich nicht-kovalente Interaktionen ausbildeten. Im Gegensatz dazu war die Isolierung von reinen AGPs sowohl aus Kalluskulturen als auch aus den Zellen und dem Kulturmedium von Suspensionskulturen erfolgreich. Im Rahmen ihrer Charakterisierung konnte der 10% große Proteinanteil mit einer für klassische AGPs annähernd typischen Aminosäurezusammensetzung mit hohen Mengen an Ala (12%), Ser (11%), Asx (11%) und Thr (8%), sowie relativ niedrigen Anteilen von Pro (3%) und Hyp (4%) detektiert werden. Den Hauptteil des AGPs macht das Polysaccharid aus, welches ein stark verzweigtes Arabinogalaktan (AG) des Typ-II darstellt. Dabei bildet eine β-1,3-glykosidisch verknüpfte Galaktosekette das Rückgrat des AGs, welches über 1,3,6-Galp-Verzweigungspunkte mit 1,6-Gal-Seitenketten verbunden ist, die ihrerseits 1,2- und 1,5-verknüpfte furanosidische Arabinosen tragen. Mit ca. 28% bilden die terminalen Arabinosen neben 6-7% terminaler Glukuronsäure und ca. 4% terminaler Galaktose die dominierenden Endgruppen des Moleküls. Neben diesen stark verzweigten Arabinogalaktaneinheiten, die unterschiedliche Größen aufweisen, lassen sich auch kleine Oligosaccharide aus Arabinose finden. Die Zucker sind vor allem über O-glykosidische Bindungen via Hyp und eventuell auch via Ser und Thr mit dem Proteinteil verknüpft und bilden ein 90 kDa großes AGP. Neben der analytischen Charakterisierung wurden verschiedene biologische Aktivitäten der AGPs sowohl auf den menschlichen Organismus als auch auf die pflanzlichen Gewebe und ihre Entwicklung getestet. Im Gegensatz zu AGPs aus Echinacea purpurea konnte keine signifikante Inhibition oder Aktivierung des humanen Komplementsystems über die drei verschiedenen möglichen Wege (klassisch, alternativ und Lektin-abhängig) durch aufgereinigtes Pelargonium-Zellkultur-AGP ermittelt werden. Anhand von Suspensionskulturen wurde nachgewiesen, dass die Blockade von AGPs durch Zugabe von Yariv-Reagenz zum programmierten Zelltod (PCD) der behandelten Zellen führt. In speziell angefertigten Nasenkolben zeigten mit β-Glc-Yariv-Reagenz behandelte Zellkulturen von P. sidoides nicht nur eine konzentrations- und zeitabhängige Wachstumsinhibition, sondern auch die typischen morphologischen Veränderungen von Zellen, die dem PCD unterliegen, wie z.B. das Schrumpfen des Zytoplasmas. Des Weiteren konnte erfolgreich die beim PCD mittels Endonukleasen entstehenden DNA-Bruchstücke isoliert, gelelektrophoretisch aufgetrennt und als DNA-Ladder detektiert werden. Daneben wurde der Einfluss der AGPs auf die somatische Embryogenese bzw. in der Induktion der Embryonen an dem erstmals für P. sidoides etablierten Vermehrungsverfahren nachgewiesen.

In der vorliegenden Arbeit wird die Entwicklung pulmonal applizierbarer gefriergetrockneter Formulierungen mit Insulin als Modellprotein und geeigneter Inhalationssysteme zur Dispergierung dieser beschrieben. Um diese Ziele zu erreichen, wurden zunächst Proteinformulierungen auf Basis von verträglichen und mit Ausnahme von Polysorbat 80 körpereige-nen Substanzen entwickelt. Neben Insulin als Wirkstoff wurden L-Glutaminsäure, L-Leucin, myo-Inositol und Polysorbat 80 verwendet. Eine physiko-chemische Charakterisierung der verschiedenen Formulierungsansätze führte zur Auswahl einer besonders geeigneten Formulierung, bestehend aus Insulin, L-Glutaminsäure und Polysorbat 80. Diese Formulierung konnte hinsichtlich der kritischen Formulierungstemperatur von -28°C überzeugen und ließ sich mit den vorhandenen Gefriertrocknern problemlos lyophilisieren. Das Insulin liegt in dieser Formulierung einge-bettet in einer teilkristallinen Hilfsstoffmatrix vor. Die amorphe Phase der Hilfsstoffmatrix stabilisiert es während der Lyophilisation, während die kristalline Phase dem Lyophilisat Struktur verleiht und so dessen Kollaps verhindert. Langzeitbeobachtungen an gelagerten Lyophilisaten beweisen die mechanische Stabilität. Der Hilfsstoffkonzentration kommt dabei eine entscheidende Rolle zu: Hohe Hilfsstoffkonzentrationen führten zu einer vollständigen Stabilisierung des Wirkstoffes, waren aber im Hinblick auf die Generierung eines lungengängigen Aerosols nicht überzeugend. Niedrige Hilfsstoffkonzentrationen führten zu einer akzeptablen Feinpartikelfraktion des Aerosols, induzierten jedoch deutliche Einbußen an biologischer Aktivi-tät während der Lyophilisation und damit zu inakzeptablem Wirkverlust. Insulin ist mit einem Milligramm pro Einzeldosis vergleichsweise hoch dosiert. Viele inhalativ zur Anwendung gebrachte Wirkstoffe sind hochpotent und kommen daher, wie zum Beispiel das Anticholinergikum Tiotropi-umbromid, in Konzentrationen von 18 µg pro Einzeldosis auf den Markt. Bei Verwendung eines ebenfalls niedrig dosierten Proteins nivelliert sich dieser Konflikt zwischen Dispergierbarkeit und Stabilität. Dies ist im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht worden. Messungen der aerodynamischen Partikelgrößenverteilung der dispergierten Lyophilisate zeigten die Eignung dieser Arzneiform zur pulmonalen Therapie. Bedingt durch die sehr geringe Dichte der entwickelten Formulierung von nur 0,006 g/cm³ kann sie durch einen Gasimpuls beliebiger Natur spontan in ein Trocken-pulveraerosol überführt werden. Dieses Prinzip der Dispergierung nutzen beide der entwickelten Inhalationssysteme. Der erste entwickelte Inhalator nutzt einen aktiven Dispergiermechanismus zur Aerosolisierung der ge-friergetrockneten Zubereitung. Dieses System generierte Aerosole mit Feinpartikelfraktionen von etwa 20%, bezogen auf die ausgewiesene Dosis. Diese konnten durch Optimierungsversuche nicht gesteigert werden, so dass von einer weiteren Entwicklung durch beispielsweise Testung weiterer Dispergierdrücke oder Verwendung eines größeren Spacers abgesehen wurde. Es wurde daher die Entwicklung eines weiteren Inhalationssystems angestrebt, das die aus der Entwicklung des vorangegangenen Inhalators gewonnenen Informationen zur Dispergierung nutzt. Dieser zweite entwickelte DPI ist atemzuggesteuert, das heißt, der Patient selbst steuert den Dispergiervorgang. Er weist einige Vorteile gegenüber der ersten Entwicklung auf: Er ist erheblich kleiner, benötigt kein Druckgas und generiert Aerosole von besserer Qualität. Die Dispergierleistung lag schon bei Ver-wendung eines ersten Prototypes bei der des optimierten aktiven Inhalators. Auf Basis von statistischen Versuchsplänen und Vergrößerung der Geometrien konnte diese Leistung schrittweise optimiert werden. Die finale Version des Inhalators zeigt eine akzeptable Feinpartikelfraktion bezogen auf die ausgewiesene Dosis von 44% entsprechend ca. 440 µg Feinpartikel-dosis bei marginalem Rückstand in Vial, Inhalator und Rachen von nur 2,6%. Durch Anwendung der Lyophilisation als Herstellungsverfahren konnte ein labiler Wirkstoff in eine Formulierung gebracht werden, die pulmonal appliziert werden kann. Die mithilfe des atemzuggesteuerten Inhalators dispergierten Lyophilisate führten zu Trockenpulveraerosolen, die hinsichtlich des lungengängigen Anteils der Exubera®-Formulierung, die eine Fein-partikelfraktion von 41% erreichte, leicht überlegen sind. Der im Rahmen dieser Untersuchungen entwickelte atemzuggesteuerte Inhalator ist aufgrund seiner geringen Größe aber weitaus patientenfreundlicher. Das entwickelte System aus einem Lyophilisat geringer Dichte in Kombination mit dem einfach zu benutzenden Inhalator stellt durch seine Versatilität auch für viele andere inhalativ zu applizierende Wirkstoffe eine gute Alter-native zu den auf dem Markt erhältlichen Inhalationssystemen dar. The present study describes the development of low-density freeze-dried protein compositions intended for inhalation with human insulin as model protein and inhalation systems for application thereof. At first, various substances were evaluated regarding their ability to act as protein stabilizers. After accomplishing and analyzing the results of physicochemical measurements, one formulation seemed to be appropriate in particular, containing 1 mg of human insulin besides glutamic acid and polysorbate 80. This combination shows a favourable and applicable glass transition temperature of the maximally freeze-concentrated solution of about -28°C and leads to mechanically stable semi-crystalline lyophilisates after freeze-drying. The protein is protected against pertubations during lyophilisation and storage by an amorphous matrix while semi-crystalline glutamic acid forms a framework warranting mechanical stability. The concentration of excipients was found to be essential in terms of maintaining biological activity of insulin and enabling dispersion into a fine aerosol. High concentrations led to fully active insulin after lyophilization but poor aerosolization performance. Low concentrations led to loss of activity but promising aerosolization properties indicating a lack between activity preservation and dispersibility. With a content of 1 mg per single dose, insulin is high dosed compared to other inhaled therapeutics, for example tiotropium bromide with a single dose of only 18 µg. By application of such a low-dosed API the conflict between dispersibility and stability will possibly be eliminated. Due to the extremely low density of the freeze-dried composition of 0.006 g/cm³ it was easily dispersed into a fine aerosol by an impact of air suitable for lung delivery. This mechanism was used by both of the developed inhalation systems. The first one was based on an active dispersion mechanism by an impact of a gas, regardless whether nitrogen or pressurized air was used. By this impact, the lyophilisate was dispersed in to a spacer device from which the patient can inhale the aerosol taking one or several breaths. Investigations to optimize the dispersion event by changing dispersion parameters like dispersion pressure and time were unsuccessful. Resulting fine particle doses were approximately 200 µg insulin per dose which is equal to 20% fine particle fraction related to the labeled dose of 1 mg. High amounts of insulin did not reach the impactor due to high retention in spacer, vial and induction port. The optimized inhaler was designed to be breath-actuated meaning the patient himself disperses the composition by inhaling deeply through the device. It was much smaller than the previous one and had several additional advantages. No pressurized gas was needed and the quality of generated aerosols was higher. A first prototype achieved fine particle fractions as high as the active inhaler but, in contrast, with better reproducibility and higher values for delivered dose. Retention in vial, inhaler and induction port nearly could be avoided amounting to approximately 2.6% using the latest version. Fine particle doses could be increased with every conducted design of experiment with highest values gained of about 440 µg which is equal to 44% fine particle fraction related to the labeled dose of 1 mg. By using lyophilisation as production method, a labile drug as insulin could be transferred into an inhalable formulation with promising aerosol performance. The customized patient-friendly breath-actuated inhalation system in combination with the low-density freeze-dried cake yielded fine particle fractions which slightly exceeded the per-formance of the first inhalable protein formulation on the market, Exubera® from Pfizer (44% vs. 41%), wherein the developed system was smaller and much easier to handle. Its versatility could make it capable of dispersing any possible drug into an aerosol.

Die Larven der Blattkäfer C. populi und C. tremulae sind in der Lage den eigentlich fraßhemmenden Sekundärstoff Salicin ihrer Futterpflanze unbeschadet aufzunehmen und diesen im Extrazellularraum des Wehrapparates enzymatisch in Salicylaldehyd umzuwandeln. Das Salicylaldehyd können die Larven wiederum effktiv gegen ihre eigenen Fraßfeinde einsetzten. Zur Erlangung dieser Fähigkeit wurden vermutlich die β-Glucosidase und die Oxidase aus der ursprünglichen autogenen Wehrsekretsynthese verwandter Blattkäferlarven rekrutiert. Um Aufschluss über die Evolution der an der Wehrsekretsynthese beteiligten Enzyme zu erhalten, wurde bereits in früheren Arbeiten eine full-length-Sequenz der SAO aus C. tremulae sowie eine Teilsequenz der SAO aus C. populi identifiziert. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte die Vervollständigung der Teilsequenz mittels 5‘-RACE. Beide cDNA-Sequenzen wurden heterolog in E. coli-Zellen mit dem Chaperon pREP4-groELS coexprimiert. Anhand eines Enzymassays, dessen Produkt mittels GC und GC-MS quantifiziert und qualifiziert wurde, konnte eindeutig belegt werden, dass es sich bei den identifizierten cDNA-Transkripten um die gesuchten SAOs aus den Wehrapparaten handelt. Die Zugehörigkeit der Sequenzen zur Familie der GMCs konnte durch Eingabe in BLAST und anhand homologer Bereiche in Alignments mit verschiedenen GMC-Sequenzen gezeigt werden. Die Familie der GMCs gliedert sich nochmals in mehrere Unterfamilien. Ein Sequenzvergleich der SAOs mit GMC-Sequenzen aus T. castaneum zeigte, dass die SAOs der Unterfamilie der ιGMCs zugeordnet werden können. Dadurch wurde erstmalig die Funktion zweier ιGMCs-Sequenzen beschrieben. Die Ergebnisse deuten daraufhin, dass der gemeinsame genetische Ursprung der SAOs und der Oxidasen aus dem autogenen Syntheseweg in der Unterfamilie der ιGMCs zu finden ist. Zur Untersuchung weiterer Oxidasen wurden u.a. die Larven von P. vitellinae herangezogen. Die Identifizierung des cDNA-Transkriptes der PvSAO erfolgte auf gleiche Weise wie die der Pappelblattkäferlarven. In einem Sequenzvergleich konnte gezeigt werden, dass die PvSAO wie die CpSAO und CtSAO zur Familie der ιGMCs gehört. Neben der Identifizierung der Oxidase unterschieder Wehrsekretsynthesen aus verschiedenen Käferlarven wurden zusätzlich Versuche zur Identifizierung der genetischen Information der β-Glucosidase und Katalase aus C. populi durchgeführt, die ebenfalls an der Wehrsekretsynthese beteiligt sind. Während für die Katalase eine Teilsequenz identifiziert werden konnte, wurden für die β-Glucosidase zwei unterschiedliche full-length-Sequenzen identifiziert. Die Durchführung gewebespezifischer RT-PCRs belegte, dass das cDNA-Transkript der CpGLUWA2 im Wehrapparat exprimiert ist. So ist mit hoher Wahrscheinlichkeit davon auszugehen, dass die CpGLUWA2 die im Wehrsekret ablaufende Reaktion von Salicin zu Salicylalkohol katalysiert. Larvae of C. populi and C. tremulae use a specific defence strategy to displace their predators. Upon attack they release defensives chemical from specialized glands. Larvae need to take up salicin as an herbal precursor from leaves of their host plant (poplar trees) to produce the defensive secretion. To achieve the ability to transform salicin into salicylaldehyde larvae have most likely recruited the salicyl alcohol oxidase (SAO) from an oxidase involved in the autogenous biosynthesis of iridoid monoterpenes that is found in related Chrysomelid leaf beetle species. This work focuses on the identification and characterization of specific SAOs from the defensive secretions of C. populi and tremulae in order to understand the evolution of the enzymes that have been evolved during adaptation of larvae to new host-plants. A full-length cDNA encoding for CtSAO was already identified by Mohagheghi (2007) as well as part of the cDNA encoding CpSAO that was accomplished by 5’-RACE during this work. Both cDNA-sequences were cloned and heterologously coexpressed in E. coli-cells with the chaperon pREP4-groESL. Enzyme activity and quantification of the produced salicylaldehyde was measured by gas chromatography. Biochemical analyses showed that both enzymes have basically the same characteristics as the native CpSAO that was characterized in the past. Sequence comparison revealed that the SAOs belong to the family of glucose-methanol-choline oxidoreductase-like sequences (GMCs) with mostly unknown function. Comparing the SAOs with GMC-like sequences from T. castaneum, SAOs were found to be part of the ιGMCs-subfamily. This suggests that the SAOs and the oxidase from the autogenous biosynthesis share a common ancestor belonging to the ιGMCs-subfamily. For further studies of the evolutionary origin of the specific oxidase larvae of P. vitellinae were examined. The cDNA encoding for the PvSAO was identified the same way as the cDNA from C. populi and tremulae. Sequence comparison with CpSAO, CtSAO and GMC-like sequences from T. castaneum showed that that PvSAO is also a member of the ιGMC-subfamily. Beside the identification of different oxidases from various defensive strategies this work also concentrated on identifying the β-glucosidase und catalase from larvae of C. populi. Part of the catalase-like sequence was found that could be related to the synthesis of the defensive secretion. Unlike that two different sequences were found showing homology to β-glucosidase. Since both sequences feature a signal peptide tissue specific RT-PCR was performed to analyze the expression site of both sequences. This experiment revealed that the cDNA-sequence of CpGLUWA2 is expressed in the defensive glands. So it is most likely that CpGLUWA2 catalysis the hydrolysis of the plant-derived salicin.

Auslösung von Zelltod in C6-Astrogliomazellen in Abhängigkeit von der Konzentration und der Expositionszeit des eingesetzten Peroxids. Einfluss der Antioxidantien Quercetin und α-Tocopherol auf den Peroxid-induzierten Zelltod. Wirkungen von kontinuierlichem oxidativen Stress

In der vorliegenden Arbeit wurde ein Aquaglyceroporin des Krankenhausproblemkeims Burkholderia cenocepacia, BccGlpF, charakterisiert. Unter besonderer Beobachtung stand die Struktur-Funktionsbeziehung der eigentlich kochkonservierten NPA-Motive.

Aus dem wässrigen Extrakt der Früchte von Triticum aestivum L., Secale cereale L. und Avena sativa L. wurden hochmolekulare Fraktionen isoliert und aus diesen dann erstmals mit (β-D-Glc)3-Yariv-Phenylgykosid (Yariv-Reagenz) Arabinogalactan-Proteine (AGPs) isoliert. Eine Charakterisierung der AGPs hinsichtlich ihres Kohlenhydrat- und Proteinanteils ergab, dass das Proteoglykan aus Weizen 5,5% (m/m), Roggen-AGP 6,3% (m/m) und Hafer-AGP 5,4% (m/m) Protein enthielt, wobei die Aminosäuren Ala, Hyp, Ser, Gly und Glx die dominierenden Aminosäuren darstellten. Der stark verzweigte Kohlenhydratanteil der Makromoleküle zeigte in der Bindungstyp-Analyse die Grundstruktur eines typischen AGPs mit einem 1,3-, 1,6- und 1,3,6-verknüpften pyranosidischen Galactosegrundgerüst, welches furanosidische Arabinosereste in Position 3 und 6 tragen kann. Diese traten als terminale Arabinose auf. Weiterhin wird die Anwesenheit von 1,5-verknüpften Oligo-Arabinoseketten vermutet. Die Erstellung eines Strukturmodells des AGPs aus Getreide stützt sich zudem auf die freigesetzten Zucker durch eine enzymatische Hydrolyse von Hafer-AGP. Neben der Strukturaufklärung wurden die AGPs im Weizenkeimling und in der Haferpflanze fluoreszenzmikroskopisch lokalisiert. Dazu wurde das synthetische Yariv-Reagenz, welches spezifisch an AGPs bindet, zur Immunlokalisierung eingesetzt. Es wurden polyklonale Antikörper gegen Yariv-Reagenz generiert, um damit Querschnitte aus der Wurzeln und dem Sproß der Haferpflanze zu inkubieren, die vorher mit Yariv-Reagenz behandelt worden waren. Nach Zusatz von FITC-markierten Sekundärantikörpern wurden die Schnitte durch Konfokale Laser-Raster Mikroskopie (Confocal Laser Scanning Microscopy = CLSM) analysiert. Die AGPs wurden in der Wurzel und im Sproß der Haferpflanze vornehmlich im xylematischen Leitbündelbereich lokalisiert; hier waren Tüpfelkanäle deutlich markiert. Weiterhin wurde eine Immunmarkierung von Hafer-Spross und-Wurzel mit einem monoklonalen Antikörper durchgeführt, der eigens gegen Hafer-AGP generiert wurde. Hier wurden insbesondere in den Zellwänden des Phloems AGPs lokalisiert. From the high molecular weight fraction of aqueous extracts from fruits of Triticum aestivum L., Secale cereale L. und Avena sativa L., arabinogalactan-proteins (AGPs) were isolated by precipitation with (β-D-Glc)3 Yariv phenylgycoside (Yariv-reagent) for the first time. Characterization of AGPs with regard to amino acid composition and structure of the polysaccharide moiety resulted in a structural model for cereal AGPs. The protein content of the AGP from wheat was 5,5% (w/w), protein-content of rye-AGP was 6,3% and oat-AGP 5,4% with the dominating amino acids Ala, Hyp, Ser, Gly and Glx. The highly branched polysaccharide moiety shows a linkage composition typical of AGPs with 1,3-, 1,6- and 1,3,6-linked galactopyranosyl residues and arabinofuranosyl residues predominantly as terminal residues in position 3 and 6 of galactose. Short oligo-arabinose-chains seem to be also present in the carbohydrate-part of AGP. Additionally, liberated sugars after enzymatic hydrolyses of oat-AGP gave important conclusions to set a structural model. Furthermore, localization of AGPs in plant tissue of oat has been accomplished. Yariv-reagent is known to bind specifically to AGPs. For immunolocalization, polyclonal Yariv-reagent-antibodies have been generated and were used to label Yariv-treated thin sections of shoots and roots from oat. After addition of FITC-conjugated secondary antibodies, the sections were analyzed by confocal laser scanning microscopy (CLSM). AGPs were mainly detected in the area of the xylem, especially there was a strong labelling of the pit canals. Additionally, immunolocalisation was done with a monoclonal antibody generated against oat-AGP. AGPs could be detected in the cell wall of the phloem in shoots and roots of oat via CLSM with a FITC conjugated secondary antibody.

The mycotoxin ochratoxin A (OTA) exhibits a wide range of toxic effects in animals and humans including hepato-, nephro-, neuro-, and genotoxicity. The toxicity mechanisms of OTA are not yet fully understood. It has been suggested that inhibition of protein synthesis, disturbance of mitochondrial function, and oxidative stress are involved in OTA mediated toxicity. The studies presented in this thesis aimed to counteract OTA cytotoxicity in HepG2 cells by various antioxidants such as vitamin E and dietary flavonoids, for example epigallocatechin gallate and quercetin. Furthermore, the effects of N-acetylcysteine (NAC) and buthionine sulfoximine (BSO), modulators of intracellular glutathione (GSH) levels, on OTA cytotoxicity were investigated. Neither vitamin E nor flavonoids protected HepG2 cells from OTA induced cell death. This lack of protection by antioxidants might be due to an insufficient access of the antioxidants to the intracellular sites of reactive oxygen species (ROS) production and/or suggests a minor role for ROS in OTA mediated hepatotoxicity. In agreement, neither NAC nor BSO affected OTA induced cytotoxicity, suggesting that GSH may not be pivotally involved in the protection from acute OTA toxicity in HepG2 cells. A second aim of this thesis was to study the gene modulatory activity of OTA in HepG2 cells using Affymetrix GeneChip® technology. OTA reduced mRNA levels of genes encoding for proteins that are centrally involved in energy metabolism, such as phosphoglycerate kinase 1, isocitrate dehydrogenase 3 (NAD+) beta, and uncoupling protein 2. All mitochondrial genes affected by OTA were at least twofold down regulated. A particularly strong downregulation was observed for mRNA and protein levels of the insulin-like growth factor binding protein 1, which has been demonstrated to counteract p53 mediated apoptosis in mitochondria. Overall, the data presented in this thesis suggest that OTA may mediate its cytotoxicity in liver cells partly by lowering mRNA levels of genes crucial for energy homeostasis.

Endothelin-1 ist ein potenter Vasokonstriktor, der aber auch an einer Reihe anderer komplexer Mechanismen im Organismus beteiligt ist, so vor allem an der Entstehung kardiovaskulärer oder renaler Erkrankungen. Ziel dieser Arbeit war es, die Regulation des Endohelin-1-Gens und seine Interaktionen mit dem Renin-Angiotensin-System, den PPARα- bzw. PPARγ-Agonisten und LOX-1 zu untersuchen. Der Einfluss des +138 D/I-Polymorphismus auf die Expression, Aktivität und Transkription und dessen Interaktionen mit den ersten 201 bp des ppET-1-Promotors wurde durch In-vitro-Versuche beleuchtet. Die Folgen der Stimulation der mRNA-Expression verschiedener Gene des Renin-Angiotensin- und Endothelinsystems durch Angiotensin II wurde in zwei Modellen, Cyp1a1ren2- und Angiotensin-II-infundierten SD-Ratten untersucht. Die Ergebnisse der Untersuchungen des humanen Gens weisen auf eine Bedeutung der 5’-UTR des ppET-1-Gens sowohl auf transkriptioneller als auch translationeller Ebene hin. Der +138 D/I-Polymorphismus trägt entscheidend zur Expression bei. Es konnte eine DNA-Protein-Interaktion in der 5’-UTR zwischen Position +122 und +152 nachgewiesen werden, die Existenz einer AP1- und GATA-2-Bindungsstelle im vorderen Promotor konnte dagegen nicht bestätigt werden. Die DNA-rotein-Interaktionen in der 5‘-UTR und dem Promotor können indirekt von PPARα-Agonisten wie Clofibrat verstärkt werden. Stimulatorische Effekte auf den Promotor konnten für Clofibrat auch in Abhängigkeit der putativen GATA-2- Bindungsstelle gezeigt werden und auch die mRNA-Expression von ppET-1 konnte durch Clofibrat induziert werden. Die Wirkung des Angiotensin II scheint dagegen durch mehr Faktoren beeinflusst zu werden als bisher bekannt, die Behandlung mit Angiotensin II führte nur bei Vektoren, die ausschließlich die 5’-UTR enthielten, zu einem induzierenden Effekt. Alle anderen Untersuchungen zu Angiotensin II, sowohl im Zellmodell als auch in den beiden Tiermodellen zur Hypertonie, konnten im Gegensatz zu den Erwartungen keinen Effekt auf die Regulation des ppET-1-Gens zeigen. Die Untersuchungen der SD-Ratten und der Cyp1a1ren2-Ratten zeigten deutliche Unterschiede in der Beeinflussung der untersuchten kardiovaskulären Gene, in den Cyp1a1ren2-Ratten war die Expression fast aller Gene unverändert. Zusätzlich konnte beobachtet werden, wie sehr das Endothelin-System mit anderen Systemen verbunden ist, ein Eingriff in das Endothelin-System ist nicht allein über kardiovaskuläre Effektoren, sondern auch über ubiquitär vorkommende Substanzen wie polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe möglich. Das untersuchte Cyp1a1ren2-Modell ist daher für die Untersuchung der Hypertonie nur eingeschränkt geeignet. Die Ergebnisse dieser Arbeit erweitern das Wissen über die Regulation des Endothelin-1 und tragen somit auch zu dem inzwischen zwanzig Jahre währenden Weg vom Vasokonstriktor zum multifaktoriellen Peptid und der sukzessiven Erweiterung der Bedeutung des Endothelins als pharmakologisches Target bei.

Aus dem wässrigen Extrakt der Wurzeln von Echinacea purpurea (L.) MOENCH wurde eine hochmolekulare Fraktion, die Arabinogalactan-Proteine (AGPs) isoliert und aufgereinigt. Die AGPs wurden hinsichtlich ihres Proteinanteils und der Zusammensetzung des Kohlenhydratanteils charakterisiert. Das Proteoglykan enthielt 4,8% (m/m) Protein, wobei Glx, Hyp, Asx, Ser, Thr und Ala die dominierenden Aminosäuren darstellten. Der stark verzweigte Kohlenhydratanteil zeigte in der Bindungstyp-Analyse den Aufbau eines typischen AGPs mit einem 1,3-, 1,6- und 1,3,6-verknüpften pyranosidischen Galactosegrundgerüst, welches furanosidische Arabinosereste trägt. Diese traten als terminale oder 1,5-verknüpfte Arabinose auf. Des Weiteren wurden terminale Glucuronsäurereste gefunden. Neben der Strukturaufklärung wurde eine neue Methode der Lokalisierung von AGPs in pflanzlichen Geweben entwickelt. Das synthetische (β-D-Glc)3 Yariv Phenylgykosid (βGlcY) bindet spezifisch an AGPs. Zur Immunlokalisierung wurde ein polyklonaler Antikörper gegen βGlcY generiert. Mit diesem wurden mikroskopische Schnitte der sekundären Wurzel von Echinacea purpurea behandelt, die vorher mit βGlcY inkubiert wurden. Nach dem Zusatz von FITC-markierten Sekundärantikörpern wurden die Schnitte durch eine Konfokale Laser-Raster Mikroskopie (Confocal Laser Scanning Microscopy = CLSM) analysiert. Die AGPs wurden vornehmlich im Xylembereich des Zentralzylinders detektiert. Die Zellwände von Tracheen und Tracheiden sowie die Tüpfelkanäle waren deutlich markiert, insbesondere zum Zelllumen hin.

In der vorliegenden Arbeit wird eine neue Methode zur Herstellung von Pulvern zur Inhalation beschrieben, die zwei Wirkstoffe beinhalten. Dabei handelt es sich um das langwirksame beta-2-Sympathomimetikum Salmeterolxinafoat und das Glucocorticoid Fluticasonpropionat. Beide Substanzen werden in der Asthmatherapie eingesetzt und finden Anwendung in der Behandlung bei einem Schweregrad der Stufe drei und vier. Neuere Untersuchungen belegen eine synergistische Wirkung, wenn beide Substanzen an derselben Zielstruktur in der Lunge zur Wirkung kommen. Dazu ist eine Codeposition beider Wirkstoffe im Respirationstrakt notwendig. Die bisher auf dem Markt befindlichen Kombinationspräparate versuchen dies über eine physikalische Mischung der beiden Substanzen zu realisieren. In dieser Arbeit wird eine Copräzipitation der beiden Substanzen zur Herstellung von Wirkstoffpartikeln verwendet, die zur Inhalation geeignet sind und beide Wirkstoffe in einem Partikel vereinigen. Dazu werden beide Substanzen im therapeutischen Verhältnis in einem organischen Lösemittel gelöst und anschließend in einem Mikromischer im Verhältnis 1 + 10 kontinuierlich mit Wasser als Nichtlösemittel gemischt, das verschiedene oberflächenaktive Additive enthalten kann. Die so hergestellte Dispersion wird anschließend durch Sprühtrocknung in ein Pulver überführt. Dieses kann dann beispielsweise in Kapseln abgefüllt und mithilfe eines Pulverinhalators inhaliert werden. Das Lösemittel, aus dem die Präzipitation erfolgt, beeinflusst den Habitus der Partikel und damit auch die aerodynamischen Eigenschaften der resultierenden Pulver. Eine Präzipitation aus methanolischer Lösung ergibt flache nadelförmige Partikel, die mit einer Feinpartikelfraktion von zirka 30% gute aerodynamische Eigenschaften aufweisen. Auch die Additivauswahl und deren Einsatzkonzentration haben einen Einfluss auf die resultierende Partikelgröße, da sie ein Partikelwachstum bei der Präzipitation behindern können. Hier hat vor allem das eingesetzte Polysorbat 80 einen guten Effekt bewiesen. Darüber hinaus beeinflussen die Additive auch das aerodynamische Verhalten der Pulver, da sie sich feinverteilt im Pulver zwischen den Wirkstoffpartikeln befinden können und so das Dispergiervermögen deutlich verbessern. Dies wird in der vorliegenden Arbeit für Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) gezeigt, welche fein verteilte sphärische Partikel im Produkt ergibt, die die Feinpartikelfraktion des Pulvers signifikant erhöhen. Die optimierte Formulierung mit 0,01% Polysorbat 80 und 0,05% HPMC im Nichtlösemittel ergibt inhalierbare Pulver mit einer Feinpartikelfraktion von mehr als 40% bei einem Wirkstoffgehalt von etwa 50%. Anders als bei den meisten Pulvern zur Inhalation kann so auf die Mischung mit einem grobdispersen Trägerstoff verzichtet werden. Betrachtet man die in-vitro Deposition im Next Generation Pharmaceutical Impactor, so ist eine gleichmäßige Deposition der beiden Wirkstoffe zu beobachten, welche auf eine gute Co-Deposition schließen lässt. Die Bestimmung der Einzelpartikelzusammensetzung mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie sowie der Raman-Mikroskopie zeigt, dass die hergestellten Partikel beide Wirkstoffe enthalten. Dabei kann eine unterschiedliche Partikelmorphologie mit unterschiedlichen Verhältnissen der Wirkstoffe im Partikel in Zusammenhang gebracht werden. Durch das vorgestellte Verfahren lässt sich ein Kombinationspräparat zur Therapie des Asthmas herstellen, das die synergistische Wirkung der beiden Wirkstoffe Salmeterolxinafoat und Fluticasonpropionat optimal ausnutzen kann, da die Wirkstoffe durch die Formulierung bereits auf partikulärer Ebene kombiniert werden und dadurch an denselben Wirkort gelangen. In this work, a novel method for the formulation of dry powders for inhalation containing two active ingredients is described. The active ingredients used are Salmeterol xinafoate, a long acting beta-2-agonist, and Fluticasone propionate, a corticosteroid, which are both utilised in the therapy of asthma with a severity of stage three and four. Recent studies suggest a synergistic effect of these substances when acting at the same target cell in the lung. For this, both substances have to be co-deposited at the same place in the respiratory tract after inhalation. The formulations of the combination products being currently on the market, exclusively work with physical mixtures of 2-agonist and corticosteroid to address co-deposition in the lung. In this work, co-precipitation as a novel formulation approach is utilised for the production of particles capable of being inhaled and containing both active ingredients. For the precipitation, both substances are dissolved in a therapeutic ratio in an organic solvent. This solution is then mixed with the non-solvent water containing surface active additives in a ratio of 1 + 10 with continuous mixing in a micromixer. The obtained dispersion is spraydried subsequently to obtain a dry powder capable of being filled in a capsule and being dispersed with the help of an inhalation device. It is shown, that the solvent used for the precipitation, influences the resulting particle shape. A precipitation from methanol results in elongated needle-like particles having a good particle fraction of about 30% after aerodynamic assessment with the Next Generation Pharmaceutical Impactor (NGI). Further on, the choice of excipient and its concentration influences the particle size of the precipitate and its aerodynamic behaviour. Within the developed additive combination of Polysorbate 80 and hydroxypropyl methylcellulose (HPMC), Polysorbate can alter particle size and minimise particle growth after precipitation while HPMC can influence the aerodynamic behaviour depending on the used concentration. An excess concentration of HPMC results in small excipient spheres being evenly distributed throughout the dry product and acting as dispersion modifier. With an optimised formulation containing 0.01% Polysorbate 80 and 0.05% HPMC in the non-solvent solution, powders with about 50% drug content and with a fine particle fraction of more than 40% can be produced. In contrast to most of the dry powder inhalation formulations, the use of a coarse carrier like lactose can be avoided with these formulations. The two drugs are distributed very evenly throughout the stages of the NGI indicating good co-deposition. A closer analysis of the single particle composition with fluorescence microscopy and Raman microscopy revealed that every particle contains Salmeterol xinafoate as well as Fluticasone propionate. The proportion varies with differences in particle morphology. With the method described, a combination product can be created, which utilises the synergistic effect of beta-2-agonist and corticosteroid in an advantageous way, as the substances are already combined on a particulate level by the formulation and with this delivers both drugs to the same site of action.

Fruktane, unverdauliche Polysaccharide bestehend aus einer Glukoseeinheit und einer mehr oder weniger großen Anzahl an Fruktoseeinheiten, werden hauptsächlich aufgrund ihrer prebiotischen und günstigen lebensmitteltechnologischen Eigenschaften in der Arzneimittel- und Lebensmittelindustrie eingesetzt. Um Fruktane zu charakterisieren, gibt es unterschiedliche analytische Ansätze. So lässt sich z. B. der durchschnittliche Polymeristionsgrad, der molekulare Aufbau oder ein „Fingerprint“, d. h. die Verteilung der Fruktane bezüglich ihrer Kettenlänge (DP) bestimmen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass über eine sequentielle Lösung von Fruktanen in unterschiedlichen Lösungsmitteln eine gute und schnell durchzuführende Fraktionierung von Fruktanen nach ihrem DP möglich ist. Weiter konnte gezeigt werden, dass mit einer HPLC-Analytik mit Amino-Phasen eine Fingerprint-Analytik bis zu einem DP von 25 erreicht werden kann. Über eine Nachsäulenderivatisierung der Fruktane mit Guanidinumchlorid und Fluoreszenz-Detektion konnte die Nachweisgrenze von Fruktanen deutlich gesenkt und eine Fingerprintanalytik bis zu einem DP von 20 durchgeführt werden. Die Ergebnisse konnten über eine bereits etablierte HPAEC-PAD- und GC-Analytik bestätigt werden. Die in dieser Arbeit entwickelten Methoden wurden mit anderen Analyseverfahren (GPC, NMR u.a.) verglichen, um die jeweiligen Stärken und Schwächen der einzelnen Methoden beurteilen zu können. In dieser Arbeit konnten erfolgreich einfache und kostengünstige Routineverfahren zur Trennung und DP-Bestimmung von Fruktanen entwickelt werden. Fructans are indigestible polysaccharides consisting of one monomer of glucose and a differing number of fructose molecules. They are mainly used by the pharmaceutical and food industry due to their beneficial prebiotic and technological properties. For characterization of fructans several analytical methods are available. So it is possible to determine the average degree of polymerization, the molecular structure or a fingerprint analysis of the fructan composition. Fingerprint analyses are performed to determine the degree of polymerization (DP) of fructans. In this study a fast and reliable method, to fractionate fructans according to their DP was developed, namely the sequential solution of fructans with different solvents. Furthermore a HPLC analysis using amino phases was established, which allows fingerprint analysis up to a DP of 25. The detection limit of fructans was considerably lowered by post-column derivatisation with guanidinum chloride and fluorescence detection. Thus fingerprint analysis of fructans could be performed up to a DP of 20. The obtained results could be confirmed by HPAEC-PAD and GC analysis and were additionally compared with established analytical methods (e.g. SEC, NMR) used for the analysis of fructans. Strength and weakness of each method are discussed. In summary a simple and cheap analytical method was developed, which can routinely be used for the separation of fructans and the determination of their DP.

Mittels Real-time PCR, Immunhistochemie und PCR/RFLP wurde in 82 nephrektomierten Nierenzellkarzinompatienten untersucht, wie die beiden Membrantransporter ABCB1 und ABCC2 sowohl im normalen, wie auch tumorösen Nierengewebe exprimiert sind, ob genetische Varianten deren Expression beeinflussen und ob diese dadurch Risikofaktoren für die Entstehung des Nierenzellkarzinoms darstellen. ABCB1 und ABCC2 zeigten im Tumorgewebe auf mRNA- und auf Proteinebene eine niedrigere Expression als im gesunden Nierengewebe. ABCB1 war dabei signifikant niedriger in klarzelligen als in nicht-klarzelligen Karzinomen exprimiert. Im normalen Nierengewebe wiesen die genetischen Varianten 2677G>T/A und 3435C>T signifikant höhere ABCB1-mRNA-Expressionen auf als die homozygoten Wildtyp-Allelträger. Die ABCC2-mRNA-Expression war im normalen Nierengewebe bei homozygoten -24C-Allelträgern signifikant höher als bei den -24T-Allelträgern. Darüber hinaus erwies sich keiner der untersuchten Polymorphismus als Risikofaktor für das Nierenzellkarzinom. Im Reporter-Gen-Assay wies das -24C-Allel gegenüber dem T-Allel eine signifikant höhere Luciferase-Aktivität auf, welche aber nicht durch unterschiedliche DNA-Protein-Interaktionen im Elektrophoretic Mobility Shift Assays zu erklären waren. In in silico-Untersuchungen beeinflusste -24C>T die ABCC2-mRNA-Sekundärstruktur nicht. Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die untersuchten ABCB1- und ABCC2-Polymorphismen zwar keine Risikofaktoren für die Entstehung des Nierenzellkarzinoms darstellen, dass sie aber die Expression im normalen Nierengewebe beeinflussen und damit bei der Ausscheidung insbesondere renal eliminierter Stoffe eine Rolle spielen könnten.

Part I . MHC peptides derived from tumor associated antigens (TAA) can serve as the basis for development of immunotherapeutics for treatment of human malignancies. Recently, we identified novel HLA-A*0201 (HLA-A2) restricted peptides recovered from soluble HLA (sHLA) molecules secreted by sHLA-transfected human tumor cell lines. Here, four candidate peptides eluted from sHLA-A2 were selected on the basis of their precursor proteins being TAA. Peptide p1028 (GLIEKNIEL), derived from DNA methyl transferase I (DNMT-1), which is overexpressed in various human tumors, showed the highest affinity to HLA-A2 and was relatively abundant in the sHLA/peptide complexes of all transfected breast, ovarian and prostate cancer cell lines. Peptide p1028 was immunogenic in vitro and p1028 effector CTL were capable of lysing tumor cells. p1028 CTL were peptide-specific and HLA-A2-restricted. Since DNMT-1 is a widely expressed tumor-associated enzyme, the novel DNMT-1-derived and HLA-A2 restricted peptide GLIEKNIEL identified here might find use as a therapeutic cancer vaccine. Part II. CD28 and CTLA-4 are the critical costimulatory receptors that predominantly determine the outcome of T cell stimulation, with CD28 promoting positive costimulation and CTLA-4 inducing inhibitory signals. However, the exact mechanism of CTLA-4’s inhibitory function remains elusive. Here, we investigated CD8+ T cell regulation by CTLA-4 and the influence of CTLA-4 upregulation on CD28 expression using CD8+ CTLA-4+ T cell transfectants. Upregulation of CTLA-4 induced abrogation of IL-2 production as well as inhibition of the TcR proximal tyrosine kinases ZAP-70, p56lck and p59fyn, a phenotype of anergic T cells. In addition, CTLA-4 upregulation promoted the internalization and proteolytic degradation of CD28, leading to decreased CD28 surface expression. These data suggest that apart from the established competition of CD28 and CTLA-4 for their ligands CD80 and CD86, inhibition of T cells by CTLA-4 might be explained by significant reduction of CD28 on the cell surface, which might impede T cell response to stimulation. Our data provide a previously unrecognized mechanism for T cell regulation by CTLA-4.

(Keine Zusammenfassung in deutscher Sprache vorhanden.) (No summary in German language.) This thesis investigates the influence of the WD-Repeat proteins FAN (Factor associated with neutral Sphingomyelinase Activation) and RACK1 (Receptor for Activated C-Kinase 1) on TNF-Signalling. The structural resemblance of the protein CHS (Chediak-Higashi Symptom) to FAN, the mutated PKC (Protein-Kinase C) activity in CHS cells and the described interaction between RACK1 and FAN gave reason to take a closer look at the translocation and co-localization of RACK1 in murine cells after stimulation. No co-localization between RACK1 and PKC-beta II was seen in murine embryonic fibroblasts and murine NK-cells after PMA stimulation of PKC and antibody-incubation. After over-expression of PKC-beta-II-EGFP the translocation of PKC to the plasma membrane could be shown, but no co-localization of RACK1 was seen. TNF Stimulation did not seem to cause a change in the distribution of PKC or RACK1 no matter if FAN was present or not There was no unregulated phosphorylation of RACK1 after TNF-stimulation which is another indication that TNF-stimulation does not activate the PKC in murine fibroblasts. The interaction of RACK1 with Actin could be observed, after TNF-stimulation there is a different co-localization, this difference is not FAN dependent. The mapping of interacting domains of FAN and RACK1 as shown in the yeast-two-hybrid system and co-immunoprecipitation revealed the importance of WD7 of RACK1. In relation to preceding experiments of the group this shows the importance of WD 5-7 for the interaction of FAN and RACK1. Over expression of nSMase2 in murine Fibroblasts revealed a changed phenotype, but so far no hint of senescence could be observed. Interaction studies of FAN and nsMase2 using the yeast-two-hybrid system, co-immunoprecipitation and the laser scanning microscope showed no direct interaction of these two proteins in spite of the described influence of FAN on the activation of nSMase2. The missing link in this chain has yet to be found.