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RESUMEN La energía que se consume en el planeta en su mayoría provine de fuentes no renovables como los combustibles fósiles, los cuales actualmente reflejan un notable descenso en sus reservas. La Organización de Países Exportadores de Petróleo (OPEP) en el 2018 estimó que el consumo diario de crudo oscila 1,59 millones de barriles por día, y prevé que la demanda para este año aumentará hasta 60,000 millones de barriles diarios. Este consumo refleja la demanda de la población mundial para transformar recursos naturales en productos de bienes y consumo, los cuales puedan satisfacer la creciente población actual estimada en 7,350 millones de habitantes (Erken, 2019). Es por ello, que se deben buscar nuevas alternativas de energía que para sostener las demandas de la población, sin generar consecuencias negativas al medio ambiente (UNFPA, 2017). La biomasa es un residuo agrícola o forestal que constituye una fuente vegetal con un alto potencial de aprovechamiento de azúcares con miras a la producción de bioetanol lignocelulósico (Montes et al., 2012). Es importante mencionar que países en vías en desarrollo, como por ejemplo Brasil, India y México, se enfocan en el manejo de este tipo de materia prima, por lo cual la producción de etanol no compromete la alimentación básica de la población (Álvarez, 2009). El manejo de rastrojos agrícolas para la obtención de bioetanol implica el pretratamiento o sacarificación de la biomasa mediante métodos físicos (presión, pirólisis, trituración), químicos (ácidos fuertes, hidróxido de sodio, cloruro de calcio, etc.) y biológicos, o en muchas ocasiones mediante la combinación de varios de estos métodos (Giraldo, 2012). La problemática en el uso del técnicas químicas o físicas radica en la generación de residuos contaminantes como CO2 e hidroximetilfurfural, este ultimo tóxico para levaduras, microorganismos que realizan posteriormente la fermentación para la obtención de etanol (Viñals, 2012). Además, estos métodos frecuentemente demandan altas temperaturas, que oscilan en el rango de 100 a 700°C (Oliva, 2003) 2 lo cual impone un alto costo energético y declina sustancialmente su valor ambiental (Giraldo, 2012). Por su parte, los métodos biológicos generalmente no generan costo elevados por que no requieren la aplicación de altas temperaturas, y tampoco producen residuos contaminantes. Habitualmente estas herramientas son aplicadas mediante el uso de bacterias y hongos (García et al., 2014). Estos microorganismos han tomado una gran importancia debido a la fácil accesibilidad de sus cultivos, y también se caracterizan por tener excelentes propiedades como productores de enzimas degradadoras de lignocelulosa (Batista et al., 2014). Por ejemplo, los hongos ascomicetos se caracterizan por llevar a cabo la “degradación blanca” de la biomasa vegetal, mineralizando la lignina e hidrolizando la celulosa y hemicelulosa en monómeros simples que servirán como materia prima para las biorefinerías (Morales de la rosa, 2015). Con base en lo anterior se pueden proponer diferentes métodos de sacarificación, donde se combinen los métodos biológicos con un sistema de pretratamiento físico para lograr mayores rendimientos de azúcares fermentables. En muchas ocasiones los métodos físicos y químicos emplean sales o hidróxidos de metales con actividad caotrópica, como por ejemplo, cloruro de sodio (NaCl), hidróxido de sodio (NaOH), cloruro de calcio (CaCl2), clorito de sodio (NaClO2) entre otros, para el pretratamiento de la biomasa (Palomar et al., 2015). Generalmente estos compuestos que coordinan átomos de Na son aplicadas en concentraciones que oscilan entre 1 y 20%, para facilitar la hidrólisis química de la hemicelulosa y celulosa en una extensión mayor al 80%, lo cual genera modificaciones en la estructura cristalina de estos polímeros rompiendo las interacciones mediante por puentes de hidrógeno y las interacciones covalentes inter e intracatenarias (Guarnizo et al., 2009). Debido a la aplicación de estos compuestos un inconveniente de los procesos químicos es que pueden generar como producto final, sustratos lignocelulósico con valores ácidos de pH, y elevados residuos de salinidad (>20% Na), lo cual puede resultar en la inhibición de la actividad de 3 enzimas de organismos que fermentan los azúcares producto de la hidrólisis, así como la inhibición del crecimiento de muchos microorganismos (Folch et al., 2004). En la actualidad la caracterización fisiológica y molecular de organismos halotolerantes, en particular de sus proteínas haloestables ha ganado gran importancia en la búsqueda de enzimas con potencialidades de operación en ambientes hipersalinos, con concentraciones de NaCl superiores a 0.5 M (salinidad del agua de mar) (Hernández et al., 2002). Aspergillus sydowii H1 fue aislado en el laboratorio de Biología Molecular de Hongos en el año 2014 por Batista y colaboradores . Este organismo fue definido como un hongo halófilo, y fue aislado de bagazo de caña suplementado con 2 M de NaCl. Como parte de la caracterización de esta cepa, se examinó su crecimiento en diferentes condiciones concentraciones de NaCl (0, 0.5, 1, 1.5 y 2 M) observando que la velocidad específica de crecimiento resultó óptima entre 0.5 y 1.5 M de NaCl. Esta cepa fue capaz de crecer sobre un amplio rango de sustratos lignocelulósico como paja de trigo, rastrojo de olote, fibras de agave y aserrín, entre otros (Batista et al ., 2014). Una primera caracterización de sus enzimas lignocelulolíticas demostró su potencialidad para la producir celulasas, xilanasas y peroxidasas, sobre diferentes sustratos lignocelulósico como bagazo de caña de azúcar, rastrojo de maíz, fibra de agave, paja de arroz, y paja de trigo, siendo este último identificado como el mejor sustrato para la producción de las enzimas mencionadas anteriormente (Batista et al., 2014). Aunque hay un interés creciente en el estudio de la biodiversidad de los microorganismos extremófilos, y en particular de las potencialidades de estos microorganismos para la producción de enzimas de interés industrial (como las enzimas ligninolíticas), pocos estudios centran su atención en caracterizar la producción de estas enzimas como resultado de las condiciones de extremofilia. En este contexto, la comprensión de como las sales como el NaCl afectan la producción de enzimas lignocelulolíticas en hongos resulta sumamente interesante como 4 conocimiento que permita optimizar tratamientos fúngicos de sustratos lignocelulósicos en condiciones de hipersalinidad. Con base en lo expuesto anteriormente, este trabajo tiene como objetivo analizar el secretoma de Aspergillus sydowii H1 por cuantificación relativa empleando marcaje peptídico asistido por isotopos isobáricos estables (iTRAQ). El análisis se realizó a partir de las proteínas extracelulares producidas por Aspergillus sydowii H1 creciendo en presencia de paja de trigo (1%) como única fuente de carbono, y en presencia o ausencia de 1 M de NaCl. Estos análisis contribuirán a profundizar el conocimiento sobre la degradación de lignocelulosa en condiciones de hipersalinidad, temática pobremente abordada en la actualidad desde sus bases moleculares y celulares desde una perspectiva de estudios globales ómicos.

Resumen Los hongos ascomicetos filamentosos en particular los del género Aspergillus, son modelos especialmente atractivos para el estudio de los mecanismos de tolerancia al estrés osmótico pues pueden crecer en el rango de los valores más bajos de actividad de agua (aw) que sostienen la vida (0.75-0.80). Aspergillus sydowii aislado a partir de bagaso de caña está descrito como un hongo halotolerante con un crecimiento óptimo entre 0.5 M y 1 M de NaCl tolerando hasta 2 M de NaCl. Varias especies de este mismo género, caracterizadas como halófilas, son atractivas por sus potenciales aplicaciones industriales y biotecnológicas, siendo eficientes en la degradación de la biomasa, de compuestos orgánicos recalcitrantes y en la producción de enzimas con funciones importantes. Con el fin de comprender los mecanismos moleculares y celulares involucrados en la respuesta al estrés en este trabajo se propone analizar comparativamente el transcriptoma de Aspergillus sydowii en condiciones de crecimiento óptimas (CO) (1M) y estresantes (CE) (5.13M). La concentración de NaCl en la CE utilizada en este estudio, está reportada como saturante correspondiendo a una aw = 0.75 y para la cual no existen estudios anteriores de transcriptómica en este organismo. Métodos: la extracción total de ARN se realizó a los 4 días de crecimiento en YMB con el kit Zymo-Spin IC para la CO y el método tradicional con fenol ácido fue utilizado para la CE. La secuenciación se realizó a través de la plataforma Illumina, con extremos pareados, con una profundidad de entre 30 y 50 millones de lecturas. Trinity se usó para el ensamble de novo; para la cuantificación de los niveles de expresión se empleó kallisto, el análisis de expresión diferencial se realizó con edgeR y el programa Blast2Go se usó para la anotación funcional y el enriquecimiento de GO y vías metabólicas. Además se estudió la presencia de enzimas relacionadas con la respuesta del hongo al estrés oxidativo la CE. El análisis bioinformático mostró que debido a la CE, 704 genes se regularon positivamente y 1138 negativamente. Entre los principales procesos sobrerrepresentados se encuentran la biosíntesis de la pared celular que se conoce como una estrategia de vida de los hongos halófilos; la actividad de la enzima 1-3 β glucanosiltranferasa y la biosíntesis de polisacáridos. Los procesos metabólicos del glicerol, de polioles, y de la transducción de señales mediante la fosforilación de proteínas se encuentran regulados negativamente. Se encontraron genes con sobreexpresión significativa con la relacionados actividad de los sistemas antioxidantes. Abstract Filamentous ascomycete fungi, particularly those of the genus Aspergillus, are especially attractive models for studying the mechanisms of tolerance to osmotic stress since they can grow in the range of the lowest values of water activity (aw) that support life (0.75 -0.80). Aspergillus sydowii isolated from cane bagasus is described as a halotolerant fungus with optimal growth between 0.5 M and 1 M NaCl, tolerating up to 2 M NaCl. Several species of this same genus, characterized as halophilic, are attractive for their potential industrial and biotechnological applications, being efficient in the degradation of biomass, recalcitrant organic compounds and in the production of enzymes with important functions. In order to understand the molecular and cellular mechanisms involved in the stress response, this work proposes comparatively analyzing the Aspergillus sydowii transcriptome under optimal growth conditions (CO) (1M) and stressful conditions (CE) (5.13M). The concentration of NaCl in the CE used in this study is reported as saturating, corresponding to aw = 0.75 and for which there are no previous transcriptomic studies in this organism. Methods: total RNA extraction was carried out at 4 days of growth in YMB with the Zymo-Spin IC kit for CO and the traditional method with acid phenol was used for CE. Sequencing was performed through the Illumina platform, with paired ends, with a depth of between 30 and 50 million reads. Trinity was used for the ensemble de novo; kallisto was used for the quantification of the expression levels, the differential expression analysis was carried out by edgeR and Blast2Go was used for the functional annotations and GO enrichments and metabolic pathways. In addition, the presence of enzymes related to the response of the fungus to oxidative stress CE was studied. Bioinformatic analysis showed that due to CE, 704 genes were up-regulated and 1138 negatively. Among the main overrepresented processes are cell wall biosynthesis which is known as a life strategy of halophilic fungi; the activity of the enzyme 1-3 β glucanosyltranferase and the biosynthesis of polysaccharides. The metabolic processes of glycerol, polyols, and signal transduction through protein phosphorylation are negatively regulated. Genes with significant overexpression were found with related activity of antioxidant systems.

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RESUMEN Las malas prácticas de gestión agrícola y de los recursos hídricos, así como el uso excesivo de fertilizantes y pesticidas, han dado lugar a la erosión y la desertificación del suelo. Actualmente alrededor del 70% de los suelos tienen problemas de degradación en diferentes niveles, desde leves hasta extremos. El desarrollo de nuevas estrategias para el control de las enfermedades vegetales y para el mejoramiento de las plantas, reduciendo el empleo de fertilizantes industriales, puede constituir una alternativa que ayude a disminuir la contaminación y al mismo tiempo, controlar la incidencia de los patógenos resistentes. Physcomitrella patens es un organismo modelo ampliamente utilizado para el estudio de las respuestas de defensa en plantas. Colletotrichum gloeosporioides es un hongo fitopatógeno responsable de grandes pérdidas en la agricultura a nivel mundial. En este estudio se analizó mediante microscopía óptica, fenómica y transcriptómica comparativa la interacción entre P. patens y C. gloeosporioides. A partir de las 8 horas posteriores a la infección se observaron respuestas tanto celulares como moleculares de P. patens ante el ataque del patógeno, aun cuando los síntomas no eran visibles a simple vista. También se calculó el rendimiento cuántico de la fotosíntesis como medida indirecta del estrés en la planta, y se observó cómo este parámetro disminuye drásticamente en las muestras infectadas. Asimismo, se analizó el efecto de la aplicación las fitohormonas ácido salicílico y ácido jasmónico, en la respuesta de defensa de P. patens. Se observó que, en presencia de ácido salicílico y ácido jasmónico, disminuye significativamente el daño celular en P. patens ante la infección con C. gloeosporioides. Se obtuvo el transcriptoma de P. patens a las 8 y 24 horas de infección con C. gloeosporioides. El análisis bioinformático reveló que, debido al efecto de la infección 841 genes se regulan positivamente y 410 negativamente, mientras que como consecuencia de la duración de la infección 206 genes son regulados positivamente y 160 negativamente. Entre las principales rutas bioquímicas sobrerrepresentadas como consecuencia de la infección se encontró la síntesis de fenilpropanoides, que está estrechamente relacionado con la respuesta de defensa en plantas. También se encontraron sobrexpresadas las vías relacionadas con las especies reactivas del oxígeno (H2O2) y de síntesis y remodelación de componentes de la pared celular como lignanos, celulosa y pectina. Genes específicos de respuesta de defensa, como los que codifican para las proteínas tipo DIR1, ERG3 y SNC1 también estaban sobrexpresados, al igual que varios factores de transcripción típicos de las respuestas a estrés biótico en plantas. Sin embargo, no se encontraron diferencialmente expresados algunos genes típicos de la respuesta de defensa en plantas vasculares como el gen que codifica para la proteína reguladora NPR1 o los factores de transcripción WRKY. ABSTRACT Poor agricultural and water management practices, as well as excessive use of fertilizers and pesticides, have led to soil erosion and desertification. Currently around 70% of soils have degradation problems at different levels, from mild to extreme. The development of new strategies to control plant diseases and to improve plants, reducing the use of industrial fertilizers, can be an alternative that helps to reduce contamination and, at the same time, control the incidence of resistant pathogens. Physcomitrella patens is a model organism widely used for the study of defense responses in plants. Colletotrichum gloeosporioides is a phytopathogenic fungus responsible for large losses in agriculture worldwide. In this study, the interaction between P. patens and C. gloeosporioides was analyzed using comparative light microscopy, phenomic, and transcriptomic. Since 8 hours after infection, both, cellular and molecular responses of P. patens to the attack of the pathogen were observed, even when the symptoms were not visible to the naked eye. The quantum yield of photosynthesis was also calculated as an indirect measure of stress in the plant. It was observed how this parameter decreases dramatically in the infected samples. Likewise, the effect of the application of the phytohormones salicylic acid and jasmonic acid on the defense response of P. patens was analyzed. It was observed that, in the presence of salicylic acid and jasmonic acid, cell damage in P. patens decreases significantly when infected with C. gloeosporioides. The P. patens transcriptome was obtained at 8 and 24 hours after infection with C. gloeosporioides. Bioinformatic analysis revealed that, due to the effect of infection, 841 genes are upregulated and 410 downregulated, while 206 genes are upregulated and 160 downregulated as a consequence of the duration of infection. Synthesis of phenylpropanoids was one of the main biochemical over-represented pathways as consequence of infection. This pathway is closely related to the defense response in plants. The pathways related to reactive oxygen species (H2O2) and synthesis and remodeling of cell wall components, such as lignans, cellulose and pectin were also overexpressed. Specific defense response genes, like those encoding DIR1, ERG3, and SNC1 porteins, were also overexpressed, as well as several transcription factors typical of responses to biotic stress in plants. However, some genes also typical of the defense response in vascular plants, such as genes encoding the regulatory protein NPR1 or transcription factors WRKY were not differentially expressed.

RESUMEN El tratamiento de biosólidos municipales actualmente representa un gran desafío. Los biosólidos se obtienen de plantas de tratamiento de aguas residuales y se consideran residuos orgánicos con altos porcentajes de fenoles, metales pesados, compuestos farmacéuticos y otros contaminantes emergentes. Los microorganismos representan una alternativa para los tratamientos ambientales. En particular, los hongos son microorganismos ubicuos con una vasta maquinaria para degradar, adsorber y/o eliminar xenobióticos como compuestos farmacéuticos, hidrocarburos y pesticidas, entre otros. Las enzimas extracelulares (lacasa, peroxidasa) producidas por hongos ligninolíticos podrían desempeñar un papel importante durante los tratamientos de biosólidos. Sin embargo, los estudios que describen esta utilidad son escasos. Además, los biosólidos también podrían emplearse como sustrato para producir enzimas fúngicas. El objetivo del presente trabajo es: Evaluar el potencial de hongos filamentosos en el tratamiento y valorización de biosólidos municipales. En esta investigación se caracterizaron las actividades enzimáticas aril alcohol oxidasa, amilasa, celulasa, esterasa, lacasa, lignina peroxidasa, lipasas, manganeso peroxidasa, peroxidasas totales y xilanasa durante el tratamiento de biosólidos municipales con las cepas Aspergillus sydowii-like H1 y Aspergillus destruens EXF-10411. Se evaluó la remoción de fenoles, metales pesados y compuestos farmacéuticos de los mejores tratamientos seleccionados a partir del análisis estadístico realizado. Las pruebas toxicológicas post-tratamiento se realizaron mediante pruebas de germinación de plántulas de lechuga (Lactuca Sativa). Ambas cepas demostraron ser eficaces en la remoción de fenoles, metales pesados y compuestos farmacéuticos. También fueron capaces de expresar enzimas extracelulares (aril alcohol oxidasa, amilasa, celulasa, esterasa, lacasa, lignina peroxidasa, lipasas, manganeso peroxidasa, peroxidasas totales y xilanasa) durante el tratamiento de biosólidos municipales en procesos fermentativos sólidos y líquidos. En este estudio, se desarrolló una estrategia de reducción de costos, que se refirió a la capacidad presentada por las cepas de estudio para producir cócteles enzimáticos utilizando biosólidos municipales como sustrato, lo que redujo considerablemente el costo de producción de enzimas. ABSTRACT The treatment of biosolids currently represents a great challenge. Biosolids are obtained from wastewater treatment plants and are considered emerging wastes with high percentages of phenols, heavy metals, pharmaceutical compounds and other emerging contaminants. In recent decades, biosolids treatments have gained great attention. Microbes represent a unique opportunity for environmental treatments. In particular, fungi are ubiquitous microorganisms with a vast machinery to degrade, adsorb an/ or eliminate xenobiotics such as pharmaceutical compounds, hydrocarbons and pesticides, among others. Extracellular enzymes (lacasse, peroxidases, produced by ligninolytic fungi could play an important role during biosolids treatments. However, studies describing this utility are scarce. In addition, biosolids could also be used as a substrate to produce fungal enzymes. The aim of the present work is: To evaluate the potential of filamentous fungi in the treatment and valorization of municipal biosolids. In this work the enzymatic activities were characterized aryl -alcohol oxidase, amylase, cellulase, esterase, laccase, lignin peroxidase, lipases, manganese peroxidase, total peroxidase and xylanase during the treatment of municipal biosolids with Aspergillus sydowii-like H1 and Aspergillus destruens EXF-10411. The removal of phenols, heavy metals and pharmaceutical compounds from the best treatments selected from the statistical analysis was evaluated. Post-treatment was evaluated through germination trials lettuce (Lactuca Sativa). Both strains proved to be effective in removing phenols, heavy metals and pharmaceutical compounds. They were also able to express extracellular enzymes (aryl -alcohol oxidase, amylase, cellulase, esterase, laccase, lignin peroxidase, lipases, manganese peroxidase, total peroxidase and xylanase) during the treatment of municipal biosolids in solid and liquid fermentation processes. In this study, a cost reduction strategy was also developed, which referred to the capacity presented by the study strains to produce enzymatic cocktails using municipal biosolids as a substrate, which considerably reduced the cost of production of enzymes.

RESUMEN El uso indiscriminado de combustibles fósiles, los derrames de petróleo, entre otras causas relacionadas, son los factores principales que han contribuido a lo largo del tiempo a la persistencia de contaminantes xenobióticos en el ambiente. Ejemplo de este tipo de compuestos son los hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPAs), caracterizados por ser tóxicos, carcinogénicos y mutagénicos debido a la estabilidad de su estructura aromática. En este sentido se han implementado varias estrategias ambientales con el objetivo de remover este tipo de compuestos, entre las que se encuentra la biorremediación. El empleo de hongos filamentosos en este campo ha probado tener ciertas ventajas sobre el uso de bacterias. Sin embargo, muy pocos estudios en la actualidad se enfocan en los mecanismos moleculares que permiten a los hongos utilizar los HPAs como fuente de carbono en condiciones de halofilia; donde se esperaría produzcan enzimas funcionalmente estables para degradarlos en condiciones de hipersalinidad (1M NaCl). En este estudio se analizó el transcriptoma de Aspergillus sydowii-like, un hongo halófilo con potencialidad para degradar HPAs en condiciones hipersalinas. A. sydowii-like fue capaz de crecer en presencia de HPAs como única fuente de carbono, y luego de 4 días de cultivo, fue capaz de degradar un 48 y un 58% de benzo [a] pireno y fenantreno, respectivamente. Se investigó su capacidad para producir lacasas, peroxidasas y esterasas bajo condiciones hipersalinas. Este estudio reveló que la biodegradación era predominante sobre la biosorción como estrategia de eliminación. Se empleó la técnica de RNAseq para identificar y caracterizar el transcriptoma de A. sydowii-like. El ARN total se purificó y secuenció a partir de cultivos crecidos en presencia de HPAs o glucosa en condiciones hipersalinas (1M NaCl). El análisis bioinformático realizado reveló que 170 genes regulados positivamente y 76 regulados negativamente se expresaron diferencialmente en presencia de HPAs respecto al crecimiento de este hongo en presencia de glucosa (control). En presencia de HPAs, A. sydowii-like aumenta el número de transcritos de enzimas involucradas directamente en la degradación de este tipo de compuestos, tal es el caso de la glutatión-S-transferasa, la NADH- 2 ubiquinona oxidorreductasa y la cloroperoxidasa. Así mismo se favorece la respiración celular con el objetivo de oxidar los HPAs hasta CO2 y H2O. Este es el primer intento de análisis de la expresión génica de un hongo halófilo en presencia de HPAs. ABSTRACT The indiscriminate use of fossil fuels and oil spills, among other related causes are the main factors that have contributed over time to the persistence of xenobiotic pollutants in the environment. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are defined as persistent xenobiotic compounds with strong carcinogenic and mutagenic properties, highly toxic and stable in the environment due to their aromatic rings. Several eco-friendly strategies have been used to remove them from aquatic ecosystems, bioremediation included. The use of filamentous fungi in this field has proven to have certain advantages over the use of bacteria. However, very few studies focus on the molecular mechanisms that allow fungi to use PAHs as a carbon source under halophilic conditions; where it would be expected the production of functionally stable enzymes to degrade them under hypersaline conditions (1M NaCl). In this study we analyze the transcriptome of Aspergillus sydowii-like, a halophile fungus with the potential for PAHs degradation under hypersaline conditions. The growth profile of A. sydowii-like was measured, revealing that this fungus could use PAHs as a sole carbon source. After 4 days of culture, it was capable to degrade a 48 and 58% of benzo [a] pyrene and phenantrene respectively. Its ability to produce laccases, peroxidases and esterases under hypersaline conditions was investigated. This study revealed that biodegradation was predominant over biosorption as the removal strategy. High-throughput sequencing was employed to identify and characterize the transcriptome of A. sydowii-like. Total RNA was purified and sequence from hipersaline cultures (1M NaCl) growing in presence of PAHs or glucose. The bioinformatic analysis showed that 170 genes were up regulated whereas 76 were down regulated demonstrating differential expression in PAHs vs glucose. In the presence of PAHs, A. sydowii-like increases the number of transcripts of the enzymes directly involved in the degradation of this type of compounds, such as glutathione-S-transferase, NADH-ubiquinone oxidoreductase and chloroperoxidase. Likewise, the respiratory chain is favored with the aim of oxidizing 4 the PAHs to CO2 and H2O. This is the first attempt to analyse with a high- throughput vision the gene expression of a halophile fungus in presence of PAHs