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"El ácido carmínico (AC) es un pigmento rojo brillante obtenido de las hembras de Dactylopius (Hemiptera:Dactylopiidae), particularmente de Dactylopius coccus Costa, popularmente llamado grana cochinilla. La alta estabilidad del AC a temperaturas y pH extremos y su uso autorizado como aditivo en alimentos, cosméticos y medicamentos lo convierten en un colorante natural con alto potencial tecnológico. Sin embargo, el AC todavía se produce principalmente mediante técnicas tradicionales, lo que resulta en producciones de cantidad limitada y calidad variable y desalienta su uso industrial. Además, los mecanismos de síntesis del AC en Dactylopius son aún desconocidos. Aunque se ha propuesto que el AC podría sintetizarse, al menos parcialmente, por endosimbiontes del insecto, hasta la fecha solo se han reportado tres posibles endosimbiontes en Dactylopius, basados en análisis metagenómicos, pero ninguno de ellos ha sido aislado o cultivado. En el presente trabajo, aislamos tres endosimbiontes y cuatro exosimbiontes de hembras de Dactylopius coccus Costa y dos endosimbiontes de Dactylopius sp. Presentamos las características morfológicas y bioquímicas de los microorganismos aislados, así como su posible identidad basada en análisis moleculares. Este es el primer informe de simbiontes cultivables aislados de Dactylopius, lo que podría ser útil para avanzar en el conocimiento del insecto y su producción del AC." "Carminic acid (CA) is a bright red pigment obtained from the females of Dactylopius (Hemiptera:Dactylopiidae), particularly from Dactylopius coccus Costa, popularly called cochineal. The high stability of CA to extreme pH and temperatures and its authorized use as an additive in foods, cosmetics and drugs make it a natural colorant with the greatest technological potential. However, CA is still mostly produced by traditional techniques, which results in productions of limited quantity and variable quality and discourages its industrial use. In addition, the mechanisms of CA synthesis of in Dactylopius are yet unknown. Although it has been proposed that CA could be synthesized, at least partially, by endosymbionts present in the insect, to date only three possible endosymbionts have been reported in Dactylopius, based on bioinformatic analyses, but none of them had been isolated or cultured. In the present work, we isolate three endosymbionts and four exosymbionts from Dactylopius coccus Costa females and two endosymbionts from Dactylopius sp. females. We present the morphological and biochemical characteristics of the isolated microorganisms, as well as their possible identity based on molecular analyses. This is the first report of cultured symbionts isolated from Dactylopius species which could be useful to advance in the knowledge of the insect and its production of CA."

Tesis (Maestría en Ciencias en Biología Molecular) "Ethnopharmacological relevance: The putative medicinal properties of American mistletoes remain empirical and their active compounds and mechanisms of action remain unknown. Aim of the study: To analyze the mechanisms of the vasorelaxant and anti-hyperglycemic effects of Psittacanthus calyculatus and Phoradendron velutinum preparations and to assess their anti-adipogenic potential. Materials and Methods: The effects of mistletoe preparations on the expression of endothelial nitric oxide synthase (NOS3) and relevant adipogenic markers by cultured human adipocytes were evaluated by RT-PCR and their anti-diabetic potential was assessed by adipocyte 2-NBDG incorporation and by an α-glucosidase inhibition assay. Results: Ethyl acetate (EA) and aqueous (WT) fractions of P. calyculatus and crude extract (CE) and WT fraction of Ph. velutinum increased by 2-fold the expression of NOS3 in induced or mature adipocytes. All preparations promoted an 80-125% 2-NBDG incorporation in mature adipocytes. All P. calyculatus preparations and hexane (HX) and EA fractions of Ph. velutinum inhibited 70-98% α-glucosidase enzymatic activity. All preparations reduced the expression of at least two adipogenic markers in induced adipocytes and all Ph. velutinum preparations and EA of P. calyculatus reduced the expression of at least one adipogenic marker in mature adipocytes. Conclusions: Psittacanthus calyculatus and Phoradendron velutinum stimulate the expression of NOS3 and decrease that of relevant adipogenic markers in cultured human adipocytes, while promoting glucose uptake by these cells and inhibiting the enzymatic activity of α-glucosidase. These effects could explain the antihypertensive and anti-diabetic properties attributed to these plants." "Relevancia etnofarmacológica: Las propiedades medicinales atribuidas a los muérdagos Americanos siguen siendo empíricas y aún se desconocen sus compuestos activos y mecanismos de acción. Objetivo del estudio: Analizar los mecanismos de los efectos vasorrelajantes y anti-hiperglicémicos de preparaciones de Psittacanthus calyculatus y Phoradendron velutinum y evaluar su potencial anti-adipogénico. Materiales y métodos: Los efectos de preparaciones de muérdagos en la expresión de la sintasa de óxido nítrico endotelial (NOS3) y marcadores adipogénicos relevantes en adipocitos humanos se evaluó por RT-PCR y su potencial anti-diabético se evaluó por incorporación de 2-NBDG en adipocitos y ensayos de inhibición de α-glucosidasa y α-amilasa. Resultados: Las fracciones de acetato de etilo (EA) y acuosa (WT) de P. calyculatus y el extracto crudo (CE) y fracción WT de Ph. velutinum incrementaron al doble la expresión de NOS3 en adipocitos inducidos o maduros. Todas las preparaciones promovieron 80-125% la incorporación de 2-NBDG en adipocitos maduros. Todas las preparaciones de P. calyculatus y las fracciones hexánica (HX) y EA de Ph. velutinum inhibieron 70-98% la actividad enzimática de α-glucosidasa. Todas las preparaciones redujeron la expresión de al menos dos marcadores adipogénicos en adipocitos inducidos y todas las preparaciones de Ph. velutinum y EA de P. calyculatus redujeron la expresión de al menos un marcador adipogénico en adipocitos maduros. Conclusiones: Psittacanthus calyculatus y Phoradendron velutinum estimulan la expresión de NOS3 y reducen la de marcadores adipogénicos en adipocitos humanos en cultivo, mientras que promueven la captación de glucosa e inhiben la actividad de la enzima α-glucosidasa. Estos efectos pueden explicar las propiedades antihipertensivas y anti-diabéticas atribuidas a estas plantas."

Tesis (Maestría en Ciencias en Biología Molecular) "La generación de células pluripotentes inducidas (iPSCs) por la expresión ectópica de los factores POU5F1 (OCT4), SOX2, KLF4, C-MYC, NANOG y LIN28 ha establecido oportunidades de implementar terapias en el área de medicina regenerativa. Sin embargo, su aplicación clínica está limitada por el uso de vectores virales. Por otro lado, existen fármacos capaces de modificar el epigenoma incrementando la plasticidad celular. El presente trabajo evaluó el efecto de los fármacos epigenéticos sobre la expresión de genes de pluripotencia en células somáticas humanas. Inicialmente, se realizó un ensayo de viabilidad para evaluar la citotoxicidad de los fármacos epigenéticos ácido valproico, hidralazina, talidomida, isotretinoina, ribavirina y azacitidina en una línea celular de fibroblastos dérmicos humanos. Posteriormente, se cultivaron las células humanas en presencia de los fármacos epigenéticos en conjunto con un cóctel de moléculas potenciadoras del proceso de reprogramación. Se comprobó que los fármacos epigenéticos individuales o combinados no causaron una disminución en la viabilidad de los fibroblastos humanos., aunque en combinación con el cóctel de moléculas el efecto citotóxico aumento drásticamente. A consecuencia de esto, se eligió la azacitidina, y el ácido valproico en conjunto con el cóctel de potenciadores de reprogramación con la finalidad de evaluar la expresión de los genes relacionados con la pluripotencia por RT-qPCR. La exposición de los fibroblastos humanos al ácido valproico, azacitidina junto con el cóctel de potenciadores de la reprogramación no fue suficiente para inducir cambios morfológicos, característicos de la transición mesenquimo-epitelio o la activación de los genes relacionados con la pluripotencia. Estos datos sugieren que la modificación de la estructura de la cromatina por el efecto del ácido valproico y azacitidina es solo una parte de una serie de eventos que deben realizarse para inducir la expresión de factores de pluripotencia." "Generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) by ectopic expression of POU5F1 (OCT4), SOX2, KFL4, C-MYC, NANOG and LIN28 has established new opportunities in stem cell research, drug discovery and disease modeling. Nevertheless, genomic integration of viral vectors reduced their clinical applications. On the other hand, there are drugs that increase cell plasticity by modifying the epigenome, among them are valproic acid, hydralazine, thalidomide, isotretinoin, ribavirin and azacytidine. The aim of this study was to evaluate the effect of epigenetic drugs on the expression of pluripotency-related genes in human somatic cells. First, we performed a viability assay to assess the cytotoxicity of the epigenetic drugs in a human cell line. Afterwards, we cultured the human cells in presence of all the epigenetic drugs which we tested. Our results indicate a low cytotoxic effect by the presence of sole and combined epigenetic drugs, although not with the cocktail of reprogramming enhancers. Then, we chose valproic acid, azacytidine, and the cocktail of reprogramming enhancers in order to evaluate the expression of pluripotency-related genes by qPCR. Exposure of the human fibroblasts to valproic acid, azacytidine, and a cocktail of reprogramming enhancers was not enough to induce morphological changes, characteristic of the MET transition, or activation of the pluripotency-related genes. These data suggest, that the modification of the chromatin structure by the effect of valproic acid and azacytidine is only one part of a series of events that must be carried out to induce the expression of pluripotency factors."

"La diabetes mellitus tipo 2 (DM2) es un trastorno metabólico crónico caracterizado por hiperglucemia e intolerancia a la glucosa. El 9.17% de los adultos mexicanos ha sido diagnosticado con DM2 y siete de cada 10 tienen sobrepeso u obesidad, dos condiciones asociadas a la DM2. La DM2 es una enfermedad inicialmente asintomática que requiere diagnóstico temprano y predictivo para su prevención, pero no hay marcadores adecuados para su pronóstico. Los microRNAs (miRNAs) regulan la expresión de más del 60% de los genes de mamíferos y la accesibilidad de sus formas circulantes los hace candidatos idóneos como marcadores clínicos tempranos. Diversos estudios indican que los miRNAs miR-29a-5p, 126-3p, 141-3p, 142-3p, 200c-3p, 221-3p, 320a, 454-3p, 486-5p y 523-3p se asocian a DM2 y obesidad. Para determinar su utilidad como marcadores tempranos de DM2 y obesidad los cuantificamos por RT-qPCR en sangre de adultos con normopeso, sobrepeso y obesidad y exploramos in silico sus posibles genes blanco y las vías de señalización en las que podrían participar En sujetos obesos miR-486-5p y miR-126-3p aumentaron significativamente 2.02 y 5.90 veces (P < 0.0001), y el segundo aumentó 6.23 veces (P < 0.0001) en sujetos con sobrepeso. MiR-454-3p y miR-320a disminuyeron en sujetos con sobrepeso 1.9 y 2 veces y en individuos obesos 2.2 y 1.8 veces, respectivamente (P < 0.0001). Los genes blanco predichos para miR-126-3p participan en glucólisis y gluconeogénesis, los predichos para miR-454-3p en la señalización de TGF-β, y los predichos para miR- 486-5p en la señalización por PI3K-Akt. Nuestros resultados sugieren que estos cuatro miRNAs asociados a la obesidad podrían ser útiles para el diagnóstico temprano de DM2." "Type 2 Diabetes mellitus (T2DM) is a chronic metabolic disorder, characterized by hyperglycemia and glucose intolerance. 9.17% of Mexican adult is diagnosed with T2DM and seven out of 10 are overweight or obese, two etiologic conditions of T2DM. T2DM is initially asymptomatic disease, which requires an early and predictive diagnosis for its prevention and treatment, but no optimal markers have been identified. MicroRNAs (miRNAs) regulate the expression of more than 60% of the genes in mammals and the accessibility of circulating forms makes them suitable early clinical markers. Several researches, indicate that miRNAs miR-29a-5p, 126-3p, 141-3p, 142-3p, 200c-3p, 221-3p, 320a, 454-3p, 486-5p and 523-3p are associated to T2DM and obesity. To determine their utility as early markers, we quantified them by RT-PCR in the blood of adults with different body mass index and we explored, in silico, the genes and signaling pathways in which they may be involved. MiR-486-5p and miR-126-3p content increased in obesity 2.02 and 5.90 fold (P < 0.0001), respectively, and the latter also increased in overweight 6.23 fold (P < 0.0001). MiR-454-3p and miR320a decreased in overweight 1.9 and 2 fold, and decrease 2.2 and 1.8 fold in obesity, respectively (P < 0.0001). The target genes predicted for miR-126-3p are involved in glycolysis and gluconeogenesis, those predicted for miR-454-3p in TGF-β signaling, and those predicted for miR-486-5p play a part in the signaling by PI3K-Akt. Our results suggest that these four miRNAs participate in the development of obesity and T2DM and may be useful in the early diagnosis of both conditions."

Tesis (Maestría en Ciencias en Biología Molecular) "El estudio del tejido adiposo aprovecha modelos experimentales in vitro constituidos por cultivos primarios de preadipocitos o líneas celulares adiposas. Los primeros representan con alta fidelidad el metabolismo del linaje adiposo in vivo, pero tienen un tiempo de vida limitado y una decreciente capacidad adipogénica al subcultivarse. Las segundas muestran capacidad proliferativa ilimitada pero no necesariamente poseen todos los atributos funcionales del linaje adiposo. Las líneas celulares adipogénicas más empleadas son de origen múrido pero tienen diferencias genéticas y metabólicas con las células humanas. Aunque se han descrito líneas celulares adipogénicas humanas, hasta ahora su uso es limitado y no hay un modelo in vitro de adipogénesis humana de uso generalizado. Aquí caracterizamos una cepa de preadipocitos subcutáneos humanos de naturaleza clonal, PASH-4, para explorar su utilidad como modelo in vitro de la adipogénesis humana. Las células PASH-4 proliferaron durante 30 subcultivos consecutivos mostrando tiempos de duplicación de 47 h y 95 h en los subcultivos 17 y 26, y capacidad clonogénica del 7% y 2% en los subcultivos 15 y 25, respectivamente. Las células PASH-4 mantuvieron su capacidad adipogénica aun en el subcultivo 26, expresando los marcadores adipogénicos tempranos C/EBPβ y C/EBPδ aun en preadipocitos. Las células PASH-4 fueron diploides (46XY) al menos hasta el subcultivo 20. Estas características hacen de la cepa PASH-4 un modelo útil para estudios de adipogénesis humana in vitro y una población de preadipocitos humanos normales adecuada para generar una línea establecida de preadipocitos humanos." "The study of adipose tissue takes advantage of in vitro experimental models constituted by cultures of primary preadipocytes or adipose cell lines. The first ones represent with high fidelity the metabolism of the cell adipose lineage but have a limited life span and decreasing capacity when subcultivated. The second ones show an ilimited proliferative capacity but they do not necessarily have all the functional attributes of the adipose cell lineage. The most commonly used adipogenic cell lines have a murine origin and present genetic and metabolic differences withrespect to the human cells. Although human adipogenic cell lines have been described, its use is limited, and currently there is not an vitro model system widely used for the study of human adipogenesis. Here we characterize a clonal cell strain of human subcutaneous preadipocytes, PASH-4, to explore its utility as an in vitro model system for human adipogenesis. The PASH-4 cells proliferated for 30 serial subcultures, showing population doubling times of 47 h and 95 h in the 17 and 26 subculture, and a clonogenic capacity of 7% and 2% in the 15 and 25 subculture, respectively. The PASH-4 cells maintained their adipogenic capacity until the 26 subculture, expressing the early adipose molecular markers C / EBPβ and C/EBPδ even as preadipocytes. The PASH-4 cells were diploid (46XY) at least until 20 subculture. All these characteristics make the PASH-4 strain a useful model for in vitro human adipogenesis studies and a population suitable of normal human preadipocytes to generate an established cell line of human preadipocytes"

"La osteoporosis postmenopáusica es la enfermedad ósea más común, con alto impacto en la salud pública. Sin embargo, los fármacos empleados para el tratamiento de la osteoporosis tienen efectos adversos, por lo cual deben desarrollarse medicamentos más eficaces y seguros. Un subgrupo de fitoestrógenos, los flavonoides, son candidatos para tratar la osteoporosis humana porque estimulan la osteogénesis y no tienen efectos adversos. Aquí evaluamos el potencial osteogénico de la isoorientina (ISO), una C-glucosil flavona, sobre cultivos primarios de osteoblastos humanos. La adición de ISO al medio de cultivo osteogénico (MO-ISO) incrementó 20 veces la actividad de fosfatasa alcalina de los osteoblastos en comparación con el medio basal (MB) y no tuvo diferencias significativas con el control positivo de ácido retinoico adicionado al medio osteogénico (MO-AR). La tinción con rojo picrosirio y el análisis por RT-PCR revelaron un incremento en la expresión de colágena tipo 1 de los osteoblastos en MO-ISO respecto a los expuestos a MO. La microscopía electrónica de barrido detectó mayor densidad celular y matriz extracelular más abundante en los cultivos en MO-ISO que en los expuestos a MO. La cuantificación de calcio no mostró diferencias significativas entre los tratamientos. En resumen, ISO aumenta la expresión de marcadores osteogénicos en osteoblastos humanos por lo cual es un buen candidato para desarrollar nuevos tratamientos contra la osteoporosis." "Postmenopausal osteoporosis is the most common bone disease, with high impact on public health. However, the deleterious side effects of medical treatments for osteoporosis make it necessary the development of more effective and safer drugs. A subgroup of phytoestrogens the flavonoids, are candidates for treating human osteoporosis since them stimulate osteogénesis and do not generate adverse side effects on other tissues. Here we evaluated the osteogenic potential of isoorientin (ISO), a C-glycosyl flavone, in primary cultures of human osteoblasts. Alkaline phosphatase activity increased by 20 fold in the presence of ISO added to osteogenic medium (MO-ISO) compared to the negative control (basal medium; MB), and did not have significant differences against the positive control (osteogenic medium supplemented with retinoic acid; MO-AR). ISO increased the expression of collagen type 1 respect to the MO control as evaluated by picrosirius red staining and RT-PCR analysis. By scanning electron microscopy we detected higher cell density and increased extracellular matrix in the ISO treated cells than in the MO control. Calcium quantification did not reveal significant differences between the treatments. In summary, ISO increases the expression of several osteogenic markers in primary human osteoblasts; thus ISO is a good candidate for the development of new antiosteoporotic medicines."

Tesis (Doctorado en Ciencias en Biología Molecular) "El factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) es un modulador del metabolismo del tejido adiposo. Sin embargo, los mecanismos por los cuales afecta el desarrollo y función de este tejido aún no son totalmente descritos. En este estudio se utilizó la técnica de despliegue diferencial, demostrando que la expresión del inhibidor de serin-proteasas A3g (SepinA3g) es inducida específicamente en preadipocitos 3T3-F442A por TNFα pero no por otros inhibidores adipogénicos, como el ácido retinoico (AR) o el factor de crecimiento transformante tipo beta (TGF-β). La inducción de la SepinA3g por TNFα fue confirmada mediante RT-PCR tanto en preadipocitos, como en adipocitos diferenciados. Además, en células en las que se redujo la expresión de la Serpin3Ag, utilizando un RNA de interferencia (siRNA), se inhibió la antiadipogénesis inducida por TNFα pero no la inducida por RA y TGF-β. Adicionalmente las células 3T3-F442A que no expresan a la SerpinA3g no mostraron la resistencia a la insulina inducida por TNFα. Nuestros resultados demuestran que la SerpinA3g es específicamente inducida por TNFα en células 3T3F442A sin importar su estado de diferenciación, y que esta serpina participa en la antiadipogénesis y la resistencia a la insulina inducidas por esta citocina, sugiriendo que la SerpinA3g juega un papel en la modulación del desarrollo y metabolismo del tejido adiposo. Se requieren estudios adicionales para conocer los mecanismos que median los efectos de la SerpinA3g sobre el tejido adiposo" "Tumor necrosis factor alpha (TNF-) is a proven modulator of adipose metabolism, but the mechanisms by which this cytokine affects the development and function of adipose tissue have not been fully elucidated to date. Using differential display analysis, in this study, we demonstrate that gene expression of the serine protease inhibitor A3g (SerpinA3g) is specifically induced in 3T3-F442A preadipocytes by TNF- but not by other adipogenic inhibitors, such as retinoic acid (RA) or transforming growth factor type beta (TGF-). The specific induction of SerpinA3g by TNF- was confirmed by RTPCR in both preadipose and terminally differentiated 3T3-F442A cells. The knockdown of SerpinA3g using small interfering RNA prevented the antiadipogenesis elicited by TNF- in 3T3-F442A cells but not the antiadipogenesis induced by RA or TGF-β. SerpinA3g-silenced 3T3-F442A cells also did not display TNF--induced insulin resistance. Our results demonstrate that SerpinA3g is specifically induced by TNF- in 3T3-F442A cells, regardless of their stag of differentiation, and participates in the antiadipogenesis and insulin resistance induced by this cytokine. Our results suggest that SerpinA3g plays a role in the TNF- modulation of adipose tissue development and metabolism. Additional studies are warranted regarding the mechanisms mediating adipose SerpinA3g effects."

Tesis (Maestría en Ciencias en Biología Molecular) "El peso al nacimiento es un indicador temprano de enfermedades metabólicas y los microRNAs (miRNAs) son reguladores post-transcripcionales relacionados con diabetes y obesidad. En este trabajo estandarizamos un protocolo para extraer y cuantificar miRNAs a partir de muestras de sangre de tamiz neonatal almacenada en tarjetas de Guthrie y analizamos la expresión de los miRNAs hsa-miR-375, hsamiR-33b y hsa-miR-454-3p de neonatos con normopeso (n=20), bajo peso (n=20) y macrosomía (n=20). La expresión de hsa-miR-375 no tuvo diferencias significativas en los tres grupos (p=0.153), pero hsa-miR-454-3p se sobreexpresó en neonatos con peso bajo (p

Tesis (Doctorado en Ciencias en Biología Molecular) "Tecoma stans (L) Juss. Ex Kunth (Bignoniaceae), Teucrium cubense Jacq (Lamiaceae), Magnolia dealbata Zucc (Magnoliaceae), Justicia spicigera Schltdl (Acanthaceae), Ibervillea sonorae (S. Watson) Greene (Cucurbitaceae) y Parkinsonia aculeata L. (Fabaceae) son ampliamente utilizadas en la medicina tradicional para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 2. Sin embargo, los mecanismos por los que ejercen sus efectos antidiabéticos aún se desconocen. En este trabajo mostramos que extractos acuosos de T. stans, T. cubense, I. sonorae y P. aculeata, así como extractos orgánicos de M. dealbata y J. spicigera, inducen la incorporación de glucosa en adipocitos múridos y humanos sensibles y resistentes a insulina. Asimismo, mostramos que compuestos como los lignanos honokiol y magnolol, y las c-glicosilflavonas isoorientina y vitexina, presentes en plantas reputadas como antidiabéticas, inducen la incorporación de glucosa en células adiposas normales y tipo-diabéticas. Los extractos y compuestos ensayados indujeron la captación de glucosa en adipocitos sensibles a la insulina empleando total o parcialmente la vía canónica de señalización de esta hormona. Nuestros resultados describen por primera vez un mecanismo molecular que explica las propiedades antidiabéticas de las plantas y compuestos estudiados. Palabras clave: 3T3-F442A, adipocitos humanos, vía de la insulina, 2NBDG" "Tecoma stans (L) Juss. Ex Kunth (Bignoniaceae), Teucrium cubense Jacq (Lamiaceae), Magnolia dealbata Zucc (Magnoliaceae), Justicia spicigera Schltdl (Acanthaceae), Ibervillea sonorae (S. Watson) Greene (Cucurbitaceae) and Parkinsonia aculeata L. (Fabaceae) are widely used in the traditional medicine for the treatment of type 2 diabetes mellitus. Although the antidiabetic properties of some of these plants have been experimentally validated, the mechanisms mediating their antidiabetic effects remain unknown. In this work we show that aqueous extracts of T. stans, T. cubense, I. sonorae and P. aculeata and organic extracts of M. dealbata and J. spicigera induce the glucose uptake on insulinsensitive and insulin-resistant murine and human adipocytes. Furthermore, we show that compounds such as the lignans honokiol and magnolol and cglycosylflavones isoorientin and vitexin present in plants reputed as antidiabetic, induce the glucose uptake in normal and diabetic-like adipose cells. The assayed extracts and compounds induced the glucose uptake on insulin-sensitive adipocytes totally or partially using the canonical insulin signaling pathway. Our results describe for the first time a molecular mechanism that explain the antidiabetic properties of the studied plants and compounds."

Tesis (Maestría en Ciencias en Biología Molecular) "El complejo de proteínas asociado a distrofina (DAPC) se expresa en músculo esquelético, corazón, riñón, cerebro y otros tejidos. En células musculares se localiza en el sarcolema y provee una sólida conexión mecánica entre la matriz extracelular y el citoesqueleto. La ausencia del DAPC en el sarcolema conduce a distrofias musculares y sarcoglicanopatías. El DAPC está presente también en tejido adiposo de rata y la expresión de algunos de sus elementos cambian en el curso de la adipogénesis. Aquí mostramos que el DAPC también se expresa en tejido adiposo subcutáneo y visceral humano. Analizamos la transcripción de 13 genes del DAPC en cultivos de adipocitos subcutáneos y viscerales humanos y encontramos que las distrofinas Dp427 y Dp71, las distrobrevinas α y β y el α- sarcoglicano se expresaron diferencialmente durante las etapas de la DAPC como distroglicano, sintrofinas αI, βI y βII y los sarcoglicanos β, γ, δ, y ε no cambiaron durante la adipogénesis. Estos resultados sugieren que el DAPC participa en la diferenciación del tejido adiposo humano y sus mecanismos pueden analizarse ventajosamente en este modelo de estudio." "The dystrophin-associated protein complex (DAPC) is expressed in skeletal muscle, heart, kidney, brain and other tissues. In muscle cells DAPC is located in the sarcolemma and provides a solid mechanical connection between the extracellular matrix and the cytoskeleton. DAPC absence in sarcolemma leads to muscular dystrophies and sacoglycanopathies. DAPC is also expressed in rat adipocytes and the expression of some its elements changes during rat adipogenesis. Here we show that DAPC are also expressed in human subcutaneous and visceral adipose tissues. We analyze the transcription of 13 genes of DAPC in cultured human subcutaneous and visceral adipocytes and we found that mRNAs for Dp427 and Dp71 dystophins, α- and β-dystrobrevins and α- sarcoglycan were differentially expressed during stages of adipose differentiation. Transcripts levels of other DAPC genes such as dystroglycan, αI-, βI- and βIIsyntrophins and β-, γ-, δ-, and ε-sarcoglycans did not change during adipogenesis. These results suggest that DAPC participates in the differentiation of human adipose tissue and their mechanisms can be advantageously analyzed in this model system."

"La Isoorientina (ISO), una isoflavona presente en numerosas plantas empleadas por la medicina tradicional, posee probados efectos hipoglucemiantes pero sus mecanismos de acción son aún poco conocidos. Al analizar los mecanismos moleculares de ISO encontramos que estimula la captación de glucosa en adipocitos múridos y humanos, tanto sensibles como resistentes a insulina. ISO ejerce este efecto mediante la inducción de la fosforilación apropiada de las proteínas de la vía de señalización canónica de la insulina (PI3K) y estimula la transcripción de genes que codifican para esta vía de señalización. Asimismo, encontramos que ISO bloquea la adipogénesis múrida y humana mediante la inhibición de la expresión de los genes proadipogénicos PPARy, C/EBPa y KLF4 e induce la de los genes antiadipogénicos GATA2 y WNT10B, Nuestros resultados sugieren que ISO modula la expresión de estos genes por medio de la translocación al núcleo del factor de transcripción Nrf2. Por otra parte dado que WNT10B induce la osteogénesis de células troncales mesenquimales, analizamos el efecto de ISO sobre la actividad de la fosfatasa alcalina y la deposición extracelular de calcio en preadipocitos 3T3-F442A. Encontramos que ISO induce la expresión de ambos marcadores en preadipocitos múridos. En resumen, ISO induce la captación de glucosa por adipocitos activando las vía de señalización de insulina, bloquea la fromación de nuevos adipocitos e induce la expresión de marcadores osteogénicos en preadipocitos 3T3-F442A. Estos resultados sugieren que ISO tiene un alto potencial para el desarrollo de nuevos tratamientos para el síndrome metabólico." "Isoorientin, an isoflavonoid widely present in the plants, is commonly used in traditional medicine, and has shown hypoglycemic effects, but its mode of action in not well understood. In this study we found that ISO induced glucose uptake in both insulinsenstive and insulin resistant murine and human adipocytes by stimulating the proper phosphorylation of proteins of the insulin canonic signaling pathway (PI3K) and the transcription of the genes encoding its proteins, was also induced. In addition, ISO inhibited the murine and human adipogenesis by inhibiting the expression of proadipogenic genes PPARy, C/EBPa and KLF4 and by inducing the transcription of the antiadipogenic genes GATA2 and WNT10B. Our results suggest that ISO modulates gene expression by promoting the nuclear translocation of the transcription factor Nrf2. Given that it has been shown that WNT10B transcription factor induces osteogenesis in mesenchymal stem cells, we analyzed the effect of ISO on the activity of alkaline phosphatase and extracellular calcium deposition in 3T3-F442A preadipocytes and found that ISO increased the expression of both markers in murine preadipocytes. In summary, ISO iduces glucose uptake in adipocytes through activation of the insulin signaling pathways, the inhibition of adipogenesis and induction of osteogenic markers in 3T3-F442A preadipocytes. These properties confers ISO a therapeutic potential to develop new drugs for metabolic syndrome treatment."

Tesis (Maestría en Ciencias en Biología Molecular) "Los péptidos RFamida son producidos en el hipotálamo y ejercen efectos anorexigénicos y orexigénicos cuando se inyectan intracerebroventricularmente. Resultados de nuestro laboratorio mostraron que los péptidos RFamida anorexigénicos NPAF, NPFF y NPSF bloquean la adipogénesis in vitro. Los péptidos RFamida QRFP (pyroglutamylated arginine-phenylalanineamide peptide) son orexigénicos inyectados en el hipotálamo pero se desconoce si ejercen efectos periféricos. Nosotros evaluamos el efecto de los péptidos QRFP h26RFa, r26RFa, r26RFa1-16, r26RFa20-26 y r43RFa sobre la adipogénesis in vitro de la línea celular 3T3-F442A y encontramos que éstos incrementaron la acumulación lipídica en función de la concentración. Asimismo, determinamos mediante RT-PCR que los mRNAs de QRFP y de su receptor, GPR103, se expresan en preadipocitos 3T3-F442A pero no en los adipocitos de esta línea celular. Los mRNAs y las proteínas de QRFP se expresaron también en depósitos grasos de epiplón, epidídimo, subcutáneo y perirenal provenientes de ratas macho Wistar. Nuestros resultados sugieren que los péptidos QRFP juegan un papel importante en la regulación del metabolismo y la diferenciación del tejido adiposo actuando directamente sobre este tejido, ya sea de forma endocrina o autocrina. Nuestro trabajo futuro estudiará los mecanismos moleculares por los cuales los péptidos QRFP favorecen la acumulación lipídica en células adiposas y caracterizará la expresión de estos péptidos en depósitos grasos de ratas sometidas a diferentes regímenes alimenticios." "Hypothalamic RFamide peptides exert both anorexigenic and orexigenic effects injected intracerebroventricularly. Results from our laboratory showed that anorexigenic RFamide peptides, NPAF, NPFF and NPSF block the in vitro adipogenesis. RFamide QRFP (Pyroglutamylated arginine-phenylalanineamide peptide) peptides are centrally orexigenic but it is unknown whether they exert peripheral effects. We evaluated the effect of the QRFP peptides h26RFa, r26RFa, r26RFa(1-16), r26RFa(20-26) and r43RFa on 3T3-F442A adipogenesis and found that they increased lipid accumulation in a concentration-dependent manner. We also determined by RT-PCR that mRNAs for QRFP and its receptor, GPR103, were expressed in 3T3-F442A preadipocytes but not in mature adipocytes of this cell line. QRFP mRNAs and proteins are also expressed in omental, epididymal, perirenal and subcutaneous fat depots of Wistar rats. Our results suggest that QRFP peptides play an important role in regulating metabolism and differentiation of adipose tissue by acting directly on this tissue, either endocrinally or autocrinally. Our future work will study the molecular mechanisms by which peptides QRFP favor lipid accumulation in fat cells and will characterize the expression of these peptides in fat depots of rats subjected to different diets."

Tesis (Maestría en Ciencias en Biología Molecular) "Aunque se ha propuesto que el receptor-canal TRPV1 media la antiadipogénesis por capsaicinoides, los preadipocitos múridos 3T3-F442A, sensibles a capsaicina, no parecen expresar este receptor. Para estudiar el papel de los canales TRPV en células adiposas, analizamos la expresión de los genes Trpv1, Trpv2, Trpv4, Trpv5 y Trpv6 en las líneas celulares preadipocíticas 3T3-L1, 3T3-F442A y 3T3-F442A/C4. Mediante RT-PCR detectamos los mensajeros de Trpv1 y Trpv2 en preadipocitos y adipocitos 3T3-L1 y para Trpv4 sólo en adipocitos. 3T3-F442A, por su parte, no expresó el mensajero de Trpv1 pero sí el de Trpv2 y Trpv4 en preadipocitos y adipocitos. Las células 3T3- F442A/C4 expresaron los mensajeros de Trpv1 y de Trpv4 en los dos estados de diferenciación y el de Trpv2 sólo en adipocitos. Ninguna de las líneas celulares expresó los mRNAs de Trpv5 ó Trpv6. Por Western blot confirmamos la presencia de TRPV1 y TRPV4 en preadipocitos y adipocitos 3T3-L1 y de TRPV2 en adipocitos de esta línea celular. Asimismo, confirmamos la ausencia de TRPV1 y la presencia de TRPV4 en ambos estados de diferenciación de 3T3- F442A y de TRPV2 en el estado adiposo de esta línea. También detectamos TRPV1 en preadipocitos 3T3-F442A/C4 aunque no logramos confirmar la presencia de la proteína TRPV2 en éstas células, que sí expresaron TRPV4 en ambos estados de diferenciación. Por otro lado, capsaicinoides naturales (capsaicina y resiniferatoxina) y sintéticos (C8 y C9) bloquearon de manera similar la adipogénesis de 3T3-L1 y 3T3-F442A. Nuestros resultados sugieren que TRPV1 es dispensable en la antiadipogénesis por capsaicinoides y que TRPV2 y TRPV4 pueden jugar un papel en el metabolismo y desarrollo del tejido adiposo." "Although it has been proposed that TRPV1 mediates the antiadipogenesis by capsaicinoids, the capsaicinoid-sensitive 3T3-F442A preadipocytes does not seem to express this receptor-channel. To study the role of TRPV channels in adipose cells, we analyzed the expression of Trpv1, Trpv2, Trpv4, Trpv5 and Trpv6 in 3T3-L1, 3T3-F442A and 3T3-F442A/C4 preadipose cell lines. By RTPCR we detected mRNA from Trpv1 and Trpv2 in 3T3-L1 preadipocytes and adipocytes and mRNA from Trpv4 in the adipose stage. 3T3-F442A did not express Trpv1, but it expressed Trpv2 and Trpv4 in both differentiation forms. 3T3-F442A/C4 cells expressed Trpv1 and Trpv4 in both differentiation stages and Trpv4 only in the adipose stage. None of these cell lines expressed Trpv5 or Trpv6. By Western blot analyses we confirmed the presence of TRPV1 and TRPV4 in both differentiation forms of 3T3-L1, and TRPV2 only in the adipose stage. 3T3/F442A cells did not express TRPV1 but they expressed TRPV2 in adipocytes and TRPV4 in both differentiation stages. We also detected TRPV1 and TRPV4 proteins in both differentiation forms of 3T3-F442A/C4, but we couldn’t confirm the TRPV2 presence in these cells. On the other hand, both natural (capsaicin and resiniferatoxin) or synthetic (C8 and C9) capsaicinoids similarly blocked 3T3-L1 and 3T3-F442A adipogenesis. Our results suggest that TRPV1 is dispensable for the antiadipogenesis by capsaicinoids and that TRPV2 and TRPV4 could play a role in adipose tissue development and metabolism."

Tesis (Maestría en Ciencias en Biología Molecular) "Ibervillea sonorae S. Watson (Cucurbitaceae) y Parkinsonia aculeata L. (Fabaceae) son plantas utilizadas para el tratamiento empírico de la diabetes mellitus, aunque se desconocen sus principios activos y mecanismos de acción. Nosotros evaluamos los efectos de extractos acuosos de tubérculos de I. sonorae (EAIs) y de hojas (EAPah) y flores (EAPaf) de P. aculeata sobre la incorporación de 2-NBDGlucosa y la adipogénesis de adipocitos 3T3 de ratón y humanos subcutáneos normales. Los tres extractos estimularon la incorporación de 2-NBDG por adipocitos 3T3-F442A, 3T3-L1 y humanos, en función de la concentración y con potencia similar o mayor a la insulina. La incorporación fue bloqueada por inhibidores de la vía de señalización de la insulina, salvo la inducida por EAIs en adipocitos humanos que no fue bloqueada por wortmanina, un inhibidor de la fosfatidilinositol 3 cinasa. EAIs y EAPah indujeron en diverso grado la adipogénesis múrida pero no la humana. En contraste seis de siete preparaciones comerciales de I. sonorae tuvieron un marcado efecto anti-adipogénico sobre las células 3T3- F442A y modesta estimulación de la incorporación de 2-NBDG. Nuestros resultados muestran que I. sonorae y P. aculeata contienen compuestos hidrosolubles que estimulan la incorporación de glucosa por el tejido adiposo y que la actividad antidiabética de I. sonorae parecen utilizar una vía de señalización parcialmente distinta a la de la insulina. Los potentes efectos de los extractos ensayados sobre la incorporación de 2-NBDG, aunados a su carencia de efectos adipogénicos en células humanas, sugieren que I. sonorae y P. aculeata representan una fuente promisoria de compuestos antidiabéticos. Las preparaciones comerciales de I. sonorae tienen un leve efecto de estimulación de incorporación de 2-NBDG y sugieren la necesidad de evaluar la actividad de los productos naturales de venta en el mercado." "Ibervillea sonorae S. Watson (Cucurbitaceae) and Parkinsonia aculeata L. (Fabaceae) are plants used for the empirical treatment of diabetes mellitus but their active principles and mechanisms of action remain unknown. We evaluated the effects of aqueous extracts of I. sonorae tubers (EAIs) and P. aculeata leaves (EAPah) and flowers (EAPaf) on the 2-NBDglucose uptake and the adipogenesis of murine 3T3 and subcutaneous human normal adipocytes. All three extracts stimulated the 2-NBDG uptake in 3T3-F442A, 3T3-L1 and human adipocytes in a concentrationdependent manner and with similar or even higher potency than insulin. The 2-NBDG uptake was blocked by inhibitors of the insulin signaling pathway, save for the 2-NBDG uptake induced by EAIs which was not repressed by wortmannin, a phosphatidylinositol-3 kinase inhibitor. EAIs and EAPah stimulated murine adipogenesis in diverse degrees, but none of the extracts induced human adipogenesis. In contrast, six of seven commercial formulations of I. sonorae had a marked anti-adipogenic effect on 3T3-F442A cells and modest stimulatory effect on the 2-NBDG uptake. Our results show that I. sonorae and P. aculeata have hydrosoluble compounds that stimulate glucose uptake by adipose tissue and that the anti-diabetic activity of I. sonorae seem to use a partially different insulin signaling pathway. The strong effects of the extracts assayed on the 2-NBDG uptake and their lack of adipogenic effects in human cells suggest that I. sonorae and P. aculeata are promissory sources of anti-diabetic compounds. The commercial formulations of I. sonorae have a small stimulatory effect of 2-NBDG uptake and suggest the necessity of evaluation of the natural products available on the market."

"Esta tesis está estructurada en dos partes para facilitar el análisis de los resultados y se centra en dos diferentes aspectos de la adipogénesis: el efecto de los neuropéptidos RFamida y el cultivo de adipocitos de ratón y humano. Parte 1. Efecto de los neuropéptidos RFamida sobre adipogénesis El metabolismo energético y el tejido adiposo son regulados estrechamente por el sistema nervioso. Los neuropéptidos RFamida NPFF y NPAF alteran la expresión génica en los adipocitos 3T3-L1 terminalmente diferenciados, pero se desconoce su papel en la adipogénesis. Aquí mostramos que los neuropéptidos RFamida NPFF, NPAF y NPSF inhiben la diferenciación de los preadipocitos 3T3-F442A en función de su concentración, pero no afectan la adipogénesis de la línea celular relacionada 3T3-L1. Así mismo, los tres neuropéptidos bloquean la diferenciación de preadipocitos humanos subcutáneos normales y derivados de lipoma. La inhibición de la adipogenesis por los neuropéptidos RFamida es simultánea a la sobreexpresión de Id3, un factor de trascripción que previene la diferenciación adiposa. NPAF bloquea de manera irreversible el establecimiento del compromiso a la diferenciación terminal en los preadipocitos 3T3-F442A. Esto hace a NPAF un inhibidor único y útil para el estudio del compromiso a la diferenciación adiposa terminal. Parte 2. Estrategias de cultivo para el crecimiento y diferenciación de preadipocitos de ratón y humano Con el medio L15 logramos mejores tasas de proliferación y de diferenciación para preadipocitos humanos subcutáneos que con DMEM-F12, el medio tradicionalmente usado en estos cultivos. El medio L15 también permite mejores condiciones de cultivo para los preadipocitos 3T3 de ratón. Conclusiones. Nuestros resultados confirman que los neuropéptidos RFamida generados en el sistema nervioso central regulan el desarrollo del tejido adiposo, siendo NPAF un inhibidor único debido a su capacidad irreversible para prevenir el compromiso de los preadipocitos. Además, proporcionan una técnica mejorada para la diferenciación adiposa y explora técnicas de cultivo de célula humanas troncales derivadas del tejido adiposo humano para usos biotecnológicos." "This thesis is constructed in two reports to facilitate the analysis of the results and it investigation is based on two different aspects of the adipogenesis: the effect of the neuropeptides RFamida and culture of murine and human preadipocytes. Part 1. Effect of the neuropeptides RFamida on adipogenesis Energetic and adipose metabolism are regulated by the nervous system. RFamide neuropeptides NPFF and NPAF affect gene expression of terminally differentiated 3T3-L1 adipocytes but their role on adipogenesis is unknown. Here we show that neuropeptides NPFF, NPAF and NPSF inhibit differentiation of 3T3-F442A preadipocytes in a concentration-dependent manner but do not affect 3T3-L1 differentiation. All three neuropeptides also block adipose differentiation of normal and lipoma-derived human subcutaneous preadipocytes. Inhibition by RFamide neuropeptides is associates to overexpresion of the Id3 gene which encodes a transcription factor that anticipates adipose differentiation. Since inhibition of adipogenesis by NPAF was not arrested after removal of the neuropeptide and further incubation of 3T3 cells with adipogenic medium, this neuropeptide appears to irreversibly block the commitment to terminal differentiation in 3T3-F442A preadipocytes. These results make NPAF a unique inhibitor to study commitment to adipose terminal differentiation. Part 2. Culture techniques for growth and differentiation of murine and human preadipocytes To improve the culture of primary human adipocytes we tested the L15 medium which does not require a special atmosphere. With this medium we achieved better rates of proliferation and differentiation for primary human subcutaneous preadipocytes and 3T3 murine preadipocytes than with the traditionally used DMEM-F12 medium. Conclusions Our results confirm that RFamide neuropeptides generated in the central nervous system regulate the development of adipose tissue system among which NPAF is unique due to its ability to irreversibly prevent preadipocyte commitment, and provide an improved technique for adipocyte differentiation and to explore biotechnological applications of human stromal adipose cell cultures."

"Cecropia obtusifolia Bertol (Cecropiaceae), Guazuma ulmifolia Lam (Sterculiaceae), Ibervillea sonorae S. Watson (Cucurbitaceae) , Opuntia joconostle F.A.C. Weber (Cactaceae), Opuntia leucotricha DC. (Cactaceae) y Teucrium cubense Jacq. (Lamiaceae) son plantas ampliamente usadas en México para el tratamiento empírico de la diabetes mellitus, pero sus principios activos y sus mecanismos de acción aún se desconocen. Para explorar los mecanismos de sus propiedades antidiabéticas, evaluamos los efectos de extractos acuosos de estas plantas sobre la incorporación de glucosa por los adipocitos 3T3-F442A de ratón, así como sobre la diferenciación de estas células. El extracto de G. ulmifolia (EAGu) en medio adipogénico con insulina, no afectó la adipogénesis de las células 3T3, mientras que el extracto de C. obtusifolia (EACo) indujo un incremento marginal de 20% en la acumulación lipídica. Extractos de la pulpa (EAOlp) y las semillas (EAOls) de O. leucoricha, y de T. cubense (EATc) indujeron incrementos en la acumulación lipídica de 62, 43 y 80%, respectivamente, mientras que los extractos de I. sonorae (EAIs) y O. joconostle (EAOj) causaron aumentos marcados de 380% y 350%, respectivamente. Ensayados en medio adipogénico carente de insulina, EACo no indujo la acumulación de triglicéridos, mientras que los extractos restantes promovieron la adipogenesis en 22% (EAGu), 40% (EAIs), 60% (EAOj), 59% (EAOlp), 63% (EAOls), y 58% (EATc). Además, los siete extractos estimularon la incorporación del análogo fluorescente de la glucosa 2-NBDG por los adipocitos 3T3-F442A en 17% (EACo), 27% (EAGu), 46% (EAIs), 54% (EAOj), 62% (EAOlp), 66% (EAOls), y 53% (EATc)." "Cecropia obtusifolia Bertol (Cecropiaceae), Guazuma ulmifolia Lam (Sterculiaceae), Ibervillea sonorae S. Watson (Cucurbitaceae), Opuntia joconostle F.A.C. Weber (Cactaceae), Opuntia leucotricha DC. (Cactaceae) and Teucrium cubense Jacq. (Lamiaceae) are plants empirically employed in México for treatment of diabetes mellitus, however their active compounds and mechanisms of action are yet unknown. To explore the mechanisms of their antidiabetic potential, aqueous extracts of each plant were assayed on adipose differentiation and glucose uptake in murine 3T3-F442A preadipocytes. Assayed in adipogenic medium, G. ulmifolia aqueous extract (EAGu) did not affect 3T3 adipose differentiation whereas the aqueous extract of C. obtusifolia (EACo) induced a marginal increase of 20% in trygliceride accumulation. On the other hand, aqueous extracts of pulp (EAOlp) or seeds (EAOls) of O. leucoricha, and T. cubense aqueous extract (EATc) increased the lipid accumulation by 62, 43 and 80%, respectively. Interestingly, extracts of I. sonorae (EAIs) and O. joconostle (EAOj) induced a high increase in lipid accumulation by 380% y 350%, respectively. In adipogenic medium lacking insulin, EACo did not induce trygliceride accumulation, whereas the other six extracts stimulated adipogenesis in 22% (EAGu), 40% (EAIs), 60% (EAOj), 59% (EAOlp), 63% (EAOls), and 58% (EATc). All seven extracts stimulated the uptake of the fluorescent glucose analog 2-NBDG by the 3T3-F442A adipocytes in 17% (EACo), 27% (EAGu), 46% (EAIs), 54% (EAOj), 62% (EAOlp), 66% (EAOls), and 53% (EATc)."

Tesis (Maestría en Ciencias en Biología Molecular) "Las células troncales mesenquimales pueden diferenciarse en adipocitos, osteocitos, condrocitos o miocitos, aunque desconocemos como es que células que han iniciado la diferenciación en uno de estos linajes pueden transdiferenciarse en otro. Para determinar el potencial osteogénico de los preadipocitos 3T3-F442A y 3T3-F442A/C4, analizamos su respuesta a compuestos que inhiben la adipogénesis y estimulan la osteogénesis. En medio adipogénico adicionado con proteína morfogenética de hueso 2 (BMP-2), ambas líneas celulares mostraron un alto grado de diferenciación adiposa, evaluado por su acumulación lipídica o su actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, aun en presencia de ácido retinoico (AR), un probado agente anti-adipogénico. En estas condiciones, los inhibidores de desacetilasas de histonas (iHDACs) apicidina y ácido valproico inhibieron ambos rasgos adipogénicos en 63% y 30%, respectivamente. La tricostatina A, otro iHDAC, no afectó la expresión de estos caracteres en ninguna de las dos líneas. En condiciones osteo-inductoras, el AR y la BMP-2 indujeron conjuntamente un incremento de ocho veces en la actividad de fosfatasa alcalina, un marcador intermedio de osteogénesis, en ambas clonas de preadipocitos. Este efecto no se observó con ninguno de los iHDACs ensayados. Asimismo, el AR y la BMP-2 indujeron la transcripción de los marcadores osteogénicos Runx2 (13 veces), fosfatasa alcalina (10 veces) y osteocalcina (17 veces), así como la mineralización de la matriz extracelular, un fenotipo de osteocitos maduros. En conclusión, nuestros resultados muestran que el AR y la BMP-2 inducen conjuntamente la osteogénesis en los preadipocitos 3T3-F442A y 3T3-F442A/C4, que este efecto no es ejercido en estas células por iHDACs a los que previamente se atribuyó tal capacidad y que ambas clonas de preadipocitos poseen similar potencial osteogénico." "Mesenchymal stem cells can differentiate into adipocytes, osteocytes, chondrocytes or myocytes, although it is unknown whether cells that have initiated the differentiation into one of these lineages can be transdifferentiated into another. To determine the osteogenic potential of 3T3-F442A and 3T3-F442A/C4 preadipocytes, we analyzed their response to compounds that inhibit adipogenesis and stimulate osteogenesis. In adipogenic medium supplemented with bone morphogenetic protein 2 (BMP-2), both cell lines showed a high degree of adipose conversion as assessed by lipid accumulation or glycerophosphate dehydrogenase activity, even in the presence of retinoic acid (RA), a proven antiadipogenic agent. Under these conditions, the histone deacetylase inhibitors (iHDACs) apicidin and valproic acid inhibited both adipogenic traits by 63% and 30%, respectively. Trichostatin A, another iHDAC, did not affect the expression of these characters in any of the two cell lines. In osteoinductive conditions, RA and BMP-2 cooperatively induced an eight-fold increase in alkaline phosphatase activity, an intermediate osteogenic marker, in both preadipocyte lines. This effect was not observed with any of the iHDACs assayed. RA and BMP -2 also induced the transcription of osteogenic markers Runx2 (13-fold), alkaline phosphatase (10-fold) and osteocalcin (17-fold), as well as the mineralization of extracellular matrix, a mature osteocytes phenotype. In summary, our results show that RA and BMP-2 cooperatively induce osteogenesis of 3T3-F442A and 3T3-F442A/C4 preadipocytes, that this effect is not exerted in these cells by iHDACs to which such capacity was previously attributed and that both preadipocyte lines possess a similar osteogenic potential."

Tesis (Maestría en Ciencias en Biología Molecular) "Los muérdagos son plantas empleadas en medicina tradicional para tratar enfermedades como cáncer e hipertensión, entre otras. Entre los compuestos bioactivos presentes en estas plantas se han identificado viscotoxinas, flavonoides, lectinas y polisacáridos. Actualmente, diversas preparaciones del muérdago europeo, Viscum album, se utilizan como auxiliares en el tratamiento de distintos tipos de cáncer, ya que presentan actividad citotóxica e inmunoestimuladora. Por otra parte, algunos estudios muestran que algunos extractos de muérdagos presentan potencial antihipertensivo. Sin embargo, los estudios controlados sobre las propiedades terapéuticas de este grupo de plantas se han limitado al muérdago europeo. En este trabajo exploramos los efectos biológicos de extractos acuosos y orgánicos obtenidos de los muérdagos americanos Phoradendron tomentosum y Psittacanthus calyculatus. Extractos acuosos de las hojas de P. tomentosum y órgánicos de las hojas y flores de P. calyculatus resultaron citotóxicos para las células HeLa de cáncer cervicouterino humano. Por otro lado, el extracto acuoso de P. calyculatus presentó un efecto vaso-relajante sobreanillos aórticos de cobayo precontraídos con noradrenalina. Dicho efecto fue dependiente de la concentración del extracto, de la presencia del endotelio en el órgano, y parece actuar a través de la sintasa del óxido nítrico (NOS). Nuestros resultados sugieren que P. calyculatus posee propiedades anti-hipertensivas que pueden emplearse en el tratamiento contra enfermedades vasculares." "Mistletoe is employed in folk medicine for treatment of various diseases such as cancer, hypertension and others. Some constituents that have been identified in these plants are viscotoxins, flavonoids, lectins and polysaccharides. At the present, several extracts of european mistletoe, Viscum album, are widely used for different types of cancer treatment, since they exert immunomodulatory and cytotoxic properties. Moreover, some trials show that mistletoe extracts exert antihypertensive effects. However, the controlled trials on the therapeutic properties of this group of plants have been limited to the european mistletoe. In this work, we explored the biological effects of aqueous and organic extracts from the american mistletoes Phoradendron tomentosum and Psittacanthus calyculatus. Aqueous extracts of the P. tomentosum leaves and the organic extracts of the P. calyculatus leaves and flowers were cytotoxic to HeLa cells of human cervical cancer. On the other hand, the P. calyculatus aqueous extract displayed a vaso-relaxant effect on noradrenaline-precontracted guinea pig aortic rings. This vaso-relaxant effect was concentration- and endothelium-dependent and it seems to act through the nitric oxide synthase (NOS) pathway. Our results suggest that P. calyculatus posses anti-hypertensive properties that could be used in the treatment of vascular illness."

Tesis (Maestría en Ciencias en Biología Molecular) "Los genes Id codifican factores de transcripción que actúan como inhibidores de la diferenciación y promueven la proliferación celular, y su sobreexpresión se ha documentado en diversos tipos de cáncer. Id1 ha sido considerado como un marcador molecular de cáncer cervicouterino (CaCu) dado que su sobreexpresión se asocia a la disminución en la esperanza de vida de pacientes con CaCu invasor. Se desconocen los niveles de expresión de los genes Id en lesiones precursoras de CaCu. Para explorar su utilidad como marcadores de progresión en CaCu, analizamos por RT-PCR semicuantitativa la transcripción de los genes Id1, Id2 e Id3 en biopsias de lesiones cervicales intraepiteliales escamosas de bajo (LSIL) y alto grado (HSIL), precursoras de CaCu. Las HSIL sobreexpresaron marcadamente los genes Id1 (363%), Id2 (249%) e Id3 (319%) respecto al cérvix normal. Las líneas celulares HeLa y SiHa, derivadas de CaCu y usadas como control presentaron también altos niveles de transcripción para estos genes. En LSIL sólo el gen Id3 tuvo una sobreexpresión moderada (202%) respecto al tejido normal. El origen epitelial de la sobreexpresión de los genes Id se confirmó en cultivos primarios de queratinocitos cervicales derivados de LSIL. Nuestros resultados sugieren que la sobreexpresión de los genes Id efectivamente es un marcador de progresión desde las etapas tempranas del CaCu." "Id genes encode transcription factors that inhibit cell differentiation and promote cell growth and their overexpression has been shown in various types of cancer. Id1 has been considered a molecular marker of cervical cancer (CC) because its overexpression is associated with a decrease of life expectancy in patients with invasive CC. The expression levels of Id genes in preneoplastic cervical lesions are unknown. To explore their use as CC progression markers, we analyzed the transcription of Id1, Id2 and Id3 in squamous intraepithelial lesions of low (LSIL) and high (HSIL) grade, precursors of CC, by semiquantitative RT-PCR. The HSIL strongly overexpressed the Id1 (363%), Id2 (249%) and Id3 (319%) genes compared with normal cervix. HeLa and SiHa cell lines, derived from invasive CC also showed high levels of expression for these genes. In LSIL only Id3 showed a moderate overexpression (202%) compared with normal tissue. The epithelial origin Id genes overexpression was confirmed in primary cultures of cervical keratinocytes derived from LSIL. Our results suggest that the Id genes overexpression can indeed used as CC progression marker."

"Los capsaicinoides, compuestos picantes del chile (Capsicum annum), afectan el metabolismo de lípidos y el desarrollo del tejido adiposo en animales de laboratorio, pero se desconocen los mecanismos de acción por los que ejercen tales efectos. Para determinar si el tejido adiposo es un blanco directo de los capsaicinoides evaluamos el efecto de la resiniferatoxina (RTX), un análogo ultrapotente de la capsaicina, sobre la diferenciación in vitro de preadipocitos 3T3-F442A de ratón. La acumulación intracitoplásmica de triglicéridos, un rasgo principal de la adipogénesis terminal, fue inhibida por RTX y en función de la concentración. El tratamiento de los preadipocitos 3T3-F442A con RTX 1 µM redujo la acumulación lipídica en un 45%, mientras que RTX 10 µM la redujo en un 90%. El efecto antiadipogénico se revirtió al retirar la RTX del medio de cultivo y realimentar las células con medio adipogénico, pero no cuando éstas se realimentaron con medio no adipogénico. Este resultado sugiere que la RTX previene de manera reversible el establecimiento del compromiso a la diferenciación. Dado que los efectos biológicos de los capsaicinoides son mediados por el receptor va inilloide VR1, analizamos la expresión de los mRNAs para VR1 y su homólogo VRL-1 en preadipocitos y adipocitos 3T3-F442A. Ninguno de los dos estadios de diferenciación expresó el mRNA para VR1, aunque tanto preadipocitos como adipocitos expresaron el mRNA para VRL-1, un receptor vainilloide no activado por capsaicinoides. Nuestros resultados son la primera evidencia de que el tejido adiposo es un blanco directo del efecto antiadipogénico de la RTX y sugieren que tal efecto no es mediado por el receptor VR1." "Capsaicinoids, the pungent compounds in the fruits of Capsicum , affect lipid metabolism and in vivo development of adipose tissue, but their mechanisms of action remain unknown. To determine whether adipose tissue is a direct target for capsaicinoids, we evaluated the effect of resiniferatoxin (RTX), an ultrapotent analog of capsaicin, on the in vitro differentiation of 3T3 -F442A murine preadipocytes. Intracytoplasmic triglyceride accumulation, a main trait of 3T3-F442A adipogenesis, was inhibited by RTX in a dose-dependent manner. One mM RTX decreased triglyceride accumulation by 45%, whereas 10 mM RTX decreased it by in 90%. The antiadipogenic effect of RTX was reverted after toxin removal from the culture medium and when the cells were fed with adipogenic medium but not with nonadipogenic medium. This result suggests that RTX prevents the establishment of cell commitment to adipogenic differentiation in a reversible manner. Because biological effects of capsaicinoids are mediated by the vanilloid receptor VR1, we assayed the mRNA expression of both VR1 and VRL-1 receptors in 3T3-F442A. Neither preadipose nor adipose states of 3T3-F442A cells expressed VR1 mRNA although both cell states expressed VRL-1 mRNA, a vanilloid receptor not activated by capsaicinoids. Our results show for the first time that adipose cells are a direct target for the antiadipogenic effect of RTX and suggest that the antiadipogenic effect is not mediated by VR1 receptor."

"Los neuropéptidos FF (NPFF) y AF (NPAF), los cuales participan en la modulación del dolor, en la analgesia por opioides y el desarrollo de la tolerancia a estos compuestos, también modulan las funciones cardiaca y vascular, la secreción de insulina y somatostatina, así como el consumo de alimento y la temperatura corporal. En adipocitos 3T3-L1 terminalmente diferenciados NPFF y NPAF alteran la expresión de genes que inducen o inhiben la adipogénesis, pero se ignora el papel que estos neuropéptidos pudieran tener sobre el proceso mismo de la diferenciación adiposa. Para determinar si NPAF y otros dos neuropéptidos, NPFF y NPSF, afectan la adipogénesis evaluamos su efecto sobre la diferenciación de los preadipocitos 3T3-F442A. La acumulación intracitoplásmica de triglicéridos, un rasgo principal de la adipogénesis terminal, fue inhibida por cada neuropéptido en función de la concentración. A la concentración de 1 n NPFF indujo un 8% de inhibición, NPAF un 33% y NPSF un 68%, mientras que a la concentración de 1 µM NPFF indujo un 52% de inhibición de la diferenciación, NPAF un 78% y NPSF un 81%. El efecto antiadipogénico NPAF no revirtió cuando el neuropéptido se retiró del medio de cultivo y las células se realimentaron con medio adipogénico, sugiriendo que NPAF inhibe la adipogénesis en forma irreversible, previniendo el establecimiento del compromiso a la diferenciación. El tratamiento de los preadipocitos 3T3-F442A con NPAF durante las primeras 48 h de confluencia duplicó la expresión de Id3, un factor de transcripción cuya sobreexpresión previene la adipogénesis. Nuestros resultados muestran que los neuropéptidos NPFF, NPAF y NPSF inhiben la diferenciación adiposa de las células 3T3-F442A y que el efecto de NPAF es irreversible y parece ser mediado por la sobreexpresión de Id3." "Neuropeptides FF (NPFF) and AF (NPAF), which participate in pain modulation opioid analgesia and tolerance development, also modulate cardiac and vascular function, insulin and somatostatin secretion, food intake and body temperature. In terminally differentiated 3T3-L1 adipocytes, NPFF and NPAF modulate the expression of transcription factors that both induce or inhibit adipogenesis, but it is unknown the role that these neuropeptides could have on the adipogenic process itself. To determine whether NPAF or related neuropeptides NPFF and NPSF affect adipogenesis we assayed their effect on differentiation of 3T3-F442A preadipocytes. The intracytoplasmic triglyceride accumulation, a main trait of 3T3 adipogenesis, was inhibited by each neuropeptide in a concentration-depend manner. At concentration of 1 nM NPFF reduced triglyceride accumulation by 8%, NPAF by 33%, and NPSF by 68%, whereas at 1 µM NPFF inhibited differentiation by 52%, NPAF reduced the process by 78%, and NPSF by 81%. The antiadipogenic effect of NPAF was not reverted when the neuropeptide was removed from the culture medium and cells were refed with adipogenic medium, suggesting that NPAF inhibits adipogenesis in an irreversible manner by preventing the establishment of cell commitment to adipogenic differentiation. Treatment of 3T3-F442A preadipocytes with NPAF during the first 48 h in confluence duplicate the expression of Id3, a transcription factor whose overexpression prevents adipogenesis. Our results show that the neuropeptides NPFF, NPAF and NPSF inhibit adipose differentiation of 3T3-F442A cells and that NPAF effect is irreversible and seems to be mediated by the overexpression of Id3."

Tesis (Maestría en Ciencias en Biología Molecular) "Los astrocitos constituyen el tipo celular más abundante y los astrocitomas son el cáncer más frecuente del sistema nervioso central (SNC). La línea murina Δ202 (modelo transgénico de astrocitoma desarrollado en nuestro grupo) fue obtenida a partir de un cigoto microinyectado con la construcción SVΔ202. Los ratones homócigos para el transgén desarrollan un síndrome neurológico (SN) caracterizado por parálisis, atrofia y proliferación de astrocitos. Tres hipótesis alternativas pueden explicar la patogenia del SN: el transgén 1) inactiva un antioncogén astrocito-específico, 2) activa un protooncogén astrocito-específico o 3) genera un polipéptido de fusión oncogénico. Para poner a prueba estas hipótesis es necesario identificar primero el sitio de inserción del transgén en el genoma murino. Con este propósito empleamos la técnica de PCR inversa (PCRi), que permite amplificar las secuencias desconocidas que flanquean a una secuencia conocida o transgén. En un trabajo preliminar identificamos una secuencia de 797 pares de bases (pb) con homología del 98% al segmento chr3:36422278-36422935; como esta secuencia carecía de los extremos del transgén, no podía asegurarse que flanqueara al transgén. En este trabajo extendimos la estrategia de amplificación del transgén hacia los flancos genómicos mediante tres reacciones sucesivas de PCRi anidada, empleando tres parejas de oligonucleótidos localizadas cada vez más cerca de los extremos del transgén. Amplificamos DNA Δ202 que había sido fragmentado con Bam HI (B), Eco RI (E) o Xba I (X) y obtuvimos seis productos que pudieron ser clonados y secuenciados. Las clonas derivadas de DNA digerido con E y B sólo permitieron identificar secuencias del transgén pero las derivadas de DNA digerido con X permitieron identificar los extremos derecho e izquierdo del transgén y las secuencias murinas que los flanquean, las cuales coincidieron con la secuencia de 797 pb. Nuestros resultados confirman el sitio de inserción del transgén en la región chr3:36422278-36422935, que interviene en la diferenciación de los astrocitos y el desarrollo del SNC." "Astrocytes are the most abundant cell type and astrocytomas the most frequent cancer of the central nervous system (CNS). The Δ202 mouse line (transgenic astrocytoma model developed by our group) was obtained from a zygote microinjectied with the SVΔ202 construct. Mice homozygous for the transgene develop a neurologic syndrome (NS) characterized by paralysis, atrophy and astrocyte proliferation. Three alternative hypotheses might explain the pathogenesis of the NS: the transgene ether 1) inactivates an astrocyte-specific antioncogene, 2) activates an astrocyte-specific protooncogene or 3) generates an oncogenic fusion polypeptide. To test these hypotheses the transgene insertion site in the mouse genome must be identified. To attempt this we used reverse PCR (rPCR), which allows amplification of the unknown sequences flanking a known sequence or a transgene. Our preliminary rPCR results had identified a 797 base pair (pb) seq uence with 98% homology to the segment chr3:36422278-36422935 of chromosome 3, lacking the transgene ends and thus unable to assure that the sequence flanked the transgene. In this work we extended the amplification strategy towards the genomic flanks using two successive nested rPCR reactions with three oligonucleotide pairs, each located closer to the transgene ends. From Δ202 DNA fragmented with Bam HI (B), Eco RI (E) or Xba I (X) we obtained six amplificaiton products that could be cloned and sequenced. The clones derived from DNA digested with E and and B allowed the identification of transgene sequences only, whereas those derived from DNA digested with X allowed the identification of the right and left transgene ends as well as the mouse genomic sequences flanking them, which coincided with the 797 pb sequence. Our results confirm the transgene insertion site in the chr3:36422278-36422935 region, which is involved in astrocyte differentiation and CNS development."