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This study evaluated the effect of gamma radiation and endodontic treatment on the microhardness and flexural strength of human and bovine root dentin. Forty single-rooted human teeth and forty bovine incisor teeth were collected, cleaned and stored in distilled water at 4 °C. The human and bovine teeth were divided into 4 groups (n=10) resulting from the combination of two study factors: first, regarding the endodontic treatment in 2 levels: with or without endodontic treatment; and second, radiotherapy in two levels: with or without radiotherapy by 60 Gy of Co-60 gamma radiation fractioned into 2 Gy daily doses five days per week. Each tooth was longitudinally sectioned in two parts; one-half was used for the three-point bending test and the other for the Knoop hardness test (KHN). Data were analyzed by 3-way ANOVA and Tukey HSD test (α=0.05). No significant difference was found for flexural strength values. The human dentin had significantly higher KHN than the bovine. The endodontic treatment and radiotherapy resulted in significantly lower KHN irrespective of tooth origin. The results indicated that the radiotherapy had deleterious effects on the microhardness of human and bovine dentin and this effect is increased by the interaction with endodontic therapy. The endodontic treatment adds additional negative effect on the mechanical properties of radiated tooth dentin; the restorative protocols should be designed taking into account this effect. Resumo Este estudo avaliou o efeito da irradiação gama e tratamento endodôntico na microdureza e resistência à flexão de dentina radicular humana e bovina. Quarenta dentes humanos unirradiculares e quarenta dentes incisivos bovinos foram coletados, limpos e armazenados em água destilada a 4 °C. Os dentes humanos e bovinos foram divididos em 4 grupos (n=10) gerados pela combinação de dois fatores de estudo: tratamento endodôntico em 2 níveis: com ou sem tratamento endodôntico; e radioterapia em dois níveis: com ou sem radioterapia utilizando 60 Gy de radiação gama de Co-60 fracionado em 2 Gy por dia, cinco dias por semana. Cada dente recebeu um corte longitudinal, resultando em duas metades por raiz, sendo uma metade utilizada para o ensaio de flexão de três pontos e a outra para o teste de dureza Knoop (KHN). Os dados foram analisados por ANOVA e teste de Tukey (α=0,05). Nenhuma diferença estatística foi encontrada para todos os fatores de resistência à flexão. A dentina humana teve KHN significativamente maior do que a dentina bovina. O tratamento endodôntico e radioterapia resultaram em significativa menor KHN, independentemente do tipo de dente. Os resultados indicaram que a radioterapia produziu efeitos deletérios sobre a microdureza da dentina humana e bovina e este efeito é exacerbado pela interação com a terapia endodôntica. O tratamento endodôntico causou efeito negativo adicional à radioterapia nas propriedades mecânicas da dentina. Este aspecto deve ser considerado no momento de se restaurar dentes tratados endodonticamente que receberam terapia endodôntica