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Myocardial infarction is a pathology affecting 80,000 people a year in France. Despite the effectiveness of the curative treatments in place, restoring lost function is only possible by using heart transplantation. It is necessary to develop new therapeutic strategies, in particular regenerative medicine, which may induce neovascularisation and the reduction of scar tissue in order to limit ventricular remodelling following cardiac ischaemia. For this purpose, extracellular vesicles carrying the morphogen sonic hedgehog (lEVs) have been identified as exerting a beneficial cardioprotective therapeutic effect. Their biodistribution, observed following systemic administration, highlights the importance of using a mechanism to increase the retention of lEVs within the heart. For this purpose, we have developed a therapeutic combinaison associating lEVs with 3D supports which can also release a growth factor. Thus, we assessed the therapeutic potential of lEVs in combination with pharmacologically active microcarriers releasing HGF over time (PAMsHGF). These MPAs, functionalised with fibronectin (FN) and poly-D-Lysine (PDL), allow the adhesion of lEVs and the induction of neovascularisation in vitro. In the in vivo model of ischaemia-reperfusion in rats, the intracardial injection of these complexes showed a cardioprotective and regenerative potential exerted by the combined action of lEVs-PAMsHGF. They induced arteriogenesis and a decrease in the macrophage infiltration 28 days after myocardial infarction. This study therefore makes it possible to highlight the major therapeutic potential of the combination of lEVs with PAMsHGF for the treatment of myocardial infarction., L’infarctus du myocarde est une pathologie touchant 80 000 personnes par an en France. Malgré l’efficacité des traitements curatifs mis en place, la restauration de la fonction perdue n’est possible qu’en employant la transplantation cardiaque. Il est nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, notamment la médecine régénératrice afin d’induire une néovascularisation et la réduction du tissu cicatriciel pour limiter le remodelage ventriculaire, consécutif à une ischémie cardiaque. Pour cela, des vésicules extracellulaires porteuses du morphogène sonic hedgehog (lEVs) ont été identifiées comme exerçant un effet thérapeutique bénéfique cardioprotecteur. Leur biodistribution, observée suite à leur administration systémique, met en évidence l’importance d’utiliser un mécanisme permettant d’augmenter la rétention des lEVs au sein du coeur. Pour cela, nous avons développé une combinaison thérapeutique associant les lEVs avec des supports 3D qui peuvent également libérer un facteur de croissance. Ainsi, nous avons évalué le potentiel thérapeutique des lEVs portées par des microcarriers pharmacologiquement actifs libérant de l’HGF au cours du temps (MPAsHGF). Ces MPAs,fonctionnalisés avec de la fibronectine (FN) et de la poly-D-Lysine (PDL), permettent l’adhérence des lEVs et l’induction d’une néovascularisation in vitro. Dans le modèle in vivo d’ischémie-reperfusion chez le rat, l’injection intracardiaque de ces complexes a montré un potentiel cardioprotecteur et régénératif exercé par l’action combinée des lEVs-MPAsHGF. Ils induisent une artériogenèse et une diminution de l’infiltration macrophagique 28 jours après l’infarctus du myocarde. Cette étude permet donc de mettre en évidence le potentiel thérapeutique majeur de l’association lEVs avec des MPAsHGF pour le traitement de l’infarctus du myocarde.

An approach to regenerative nervous system medicine is to develop biological substitutes with restorative function using stem cells and biomaterials that can be coated with extracellular matrix molecules. We have developed pharmacologically active microcarriers, PAMs. These are PLGA based, biodegradable and biocompatible polymeric microspheres (MS) coated with adhesion molecules that provide 3-dimensional support for cells. The microcarriers thus associated with the stem cells make it possible, after implantation, to increase the survival and maintain the state of differentiation of the cells they carry, reinforcing their tissue repair effects. These PAMs can also release encapsulated growth factors and to enhance the release of encapsulated proteins a new polymer combination: PLGA-Poloxamer188 (P188) -PLGA has been developed in our laboratory. It has also been shown that PLGA-P188-PLGA PAMs functionalized with fibronectin and poly-Dlysineinduce better proliferation of mesenchymal stem cells than PLGA PAMs. These cells are very widely used in regenerative medicine because they are easy to collect, found in the bone marrow, and able to differentiate towards the chondrogenic lineage, osteogenic and under certain conditions,neuronal. We are working with a subpopulation of these cells called MIAMI cells (marrow isolated adult multilineage inducible) that engage in neuronal cell differentiation after treatment with 2growth factors (EGF / bFGF) and on a laminin matrix support. Recently, it has been demonstrated that the physicochemical properties of polymeric supports also regulate the behavior of stem cells (adhesion, survival and differentiation). The objective of this study is to study the effect of physicochemical and mechanical properties of surfaces i) MS on laminin and poly-D-lysineadsorption and ii) PAMs on adhesion and neuronal differentiation of MIAMI cells. We have shown that the presence of the hydrophilic "poloxamer 188" block in the PLGA-P188-PLGA polymer composition decreases the adsorption of adhesion molecules by forming a layer on these surfaces.On PLGA PAMs, the adhesion molecules adsorb well regardless of the overall charge of the molecules. These two PAMs have a positive overall charge and allow the attachment of cells to their surface. However, in short-term cell adhesion is stronger on PLGA PAMs compared to PLGA-P188-PLGA PAMs, but in the long-term the cells eventually adhere to both supports. PLGA-P188-PLGAhas a high free surface energy and these PAMs have a less rigid surface than PLGA PAMs. Our results suggest that these surface characteristics allow cells to adhere despite the low amount of laminin on these supports. In the long-term the cells exhibit the same behavior whatever the type of PAMs. They differentiate into neuronal cells expressing mature neuron markers such as the neurofilament-M and we find the same number of cells adhered to their surface. Furthermore, we have shown that cells are able to secrete extracellular matrix molecules in the same way on both types of PAMs, probably explaining the similarity of the behavior in long-term., Une approche de la médecine régénérative du système nerveux consiste à développer des substituts biologiques avec une fonction réparatrice en utilisant des cellules souches et des biomatériaux qui peuvent être recouverts des molécules de la matrice extracellulaire. Nous avons ainsi développé des microcarriers pharmacologiquements actifs, MPA. Ce sont des microsphères (MS) polymériques à base de PLGA, biodégradables et biocompatibles, recouvertes des molécules d’adhérence qui fournissent un support en 3-dimensions aux cellules. Les microcarriers ainsi associés aux cellules souches permettent, après implantation, d’augmenter la survie et de maintenir l’état de différenciation des cellules qu’ils portent,renforçant leurs effets de réparation tissulaire. Ces MPA peuvent également libérer des facteurs de croissance encapsulés et afin d’améliorer le relargage de protéines encapsulées une nouvelle combinaison de polymère : PLGA-Poloxamer188 (P188) -PLGA a été développé dans notre laboratoire. Il a aussi été montré que les MPA de PLGA-P188-PLGA fonctionnalisées avec de la fibronectine et poly-D-lysine induisaient une meilleure prolifération de cellules souches mésenchymateuses que les MPA de PLGA.Ces cellules sont très largement utilisées en médecine régénérative car elles sont faciles à prélever, se trouvant dans la moelle osseuse, et capables de se différencier vers le lignage chondrogénique, ostéogénique et dans certaines conditions, neuronale. Nous travaillons avec une sous population de ces cellules appelées cellules MIAMI (marrow isolated adult multilineage inducible) qui s’engagent vers une différenciation en cellule neuronale après un traitement avec 2 facteurs de croissance (EGF/ bFGF) et sur un support matriciel de laminine. Dernièrement, il a été mis en évidence que les propriétés physicochimiques des supports polymériques régissent également le comportement des cellules souches(adhésion, survie et différenciation). L’objectif de cette étude est d’étudier l’effet des propriétés physicochimiques et mécaniques des surfaces i) des MS sur l’adsorption de laminine et poly-D-lysine et ii) des MPA sur l’adhérence et la différenciation neuronale des cellules MIAMI. Nous avons montré que la présence du bloc hydrophile « poloxamère 188 » dans la composition du polymère PLGA-P188-PLGAdiminue l’adsorption de molécules d’adhérence en formant une couche sur ces surfaces. Sur les MPA de PLGA, les molécules d’adhérence s’adsorbent bien quelle que soit la charge globale des molécules. Cesdeux MPA ont une charge globale positive et permettent l’attachement de cellules à leur surface. Cependant, l’adhérence à court terme de cellules est plus forte sur les MPA de PLGA comparé aux MPA de PLGA-P188-PLGA mais à la longue les cellules finissent par adhérer aux deux supports. Le PLGAP188-PLGA présente une forte énergie libre de surface et ces MPA présentent une surface moins rigide que les MPA de PLGA. Nos résultats suggèrent que ces caractéristiques de surface permettent aux cellules d’adhérer malgré la faible quantité de laminine sur ces supports. A long terme les cellules présentent le même comportement quel que soit le type du support. Elles se différencient en cellule de type neuronal exprimant des marqueurs de neurone mature comme le neurofilament et nous trouvons le même nombre de cellules adhérées à leur surface. En outre, nous avons montré que les cellules sont capables de sécréter de la même manière des molécules de la matrice extracellulaire sur les deux types de MPA expliquant probablement la similitude de comportement à long terme.

Traumatic spinal cord injury (SCI) is a devastating condition resulting in permanent loss of neural functions. The objective of this thesis is to develop pharmacologically active microcarriers (PAMs) with a fibronectin (FN) surface that deliver biologically active brain derived neurotrophic factor (BDNF) in a controlled manner. We want to combine this system with adult mesenchymal stem cells (MSCs) for SCI repair. The nanoprecipitated BDNF was encapsulated in FN-PAMs and the in vitro release profile was evaluated. It showed a prolonged, bi-phasic, release of bioactive BDNF, without burst effect. We combined human marrow-isolated adult multilineage-inducible (MIAMI) stem cells and FN-PAMs with an injectable non-toxic silanized-hydroxypropylmethylcellulose (Si-HPMC) hydrogel. We demonstrated that FN-PAMs and the Si-HPMC hydrogel increased the expression of neural/neuronal differentiation markers of MIAMI cells after 1 week. Moreover, the 3D environment (FN-PAMs or hydrogel) enhanced the therapeutic MIAMI cell secretome. To have a clinically translatable system, we chose to use stem cells of the apical papilla (SCAP) and FNPAMs releasing or not BDNF for SCI therapy. More than 90% of SCAP complexed with FN-PAMs (releasing or not BDNF) remained viable for 7 days and an increased neuronal-oligodendroglial gene expression in vitro. The recovery of locomotor function was significantly improved after transplantation of SCAP complexed with FN-PAMs-BDNF with frequent to consistent forelimb-hindlimb coordination after 28 days of treatment., Un traumatisme de la moelle épinière (TME) est une condition dévastatrice entraînant la perte permanente de fonctions neuronales. L’objectif de cette thèse est de formuler de microsupports pharmacologiquement actif (MPAs) avec une surface de fibronectine (FN), libérant le« brain-derived neurotrophic factor » (BDNF) de façon controlée. Nous voulons combiner ce système avec des cellules souches mésenchymateuses (CSMs) pour la réparation de TME. Le BDNF nanoprécipité a été encapsulé dans les FN-MPAs et le profil de libération in vitro a été évaluée. Elle a montré une libération biphasique et prolongée de BDNF bioactifs. Nous avons combinés des cellules souches humaines mésenchymateuse issues de la moelle osseuse adulte (cellules MIAMI) et FN-MPAs avec un hydrogel non-toxique silanisés-hydroxypropylméthylcellulose (Si-HPMC). Nous avons démontré que les FN-MPAs et le Si-HPMC augmentait l'expression de marqueurs neuraux/neuronaux de cellules MIAMI après 1 semaine. En outre, l'environnement 3D (hydrogel ou FN-MPAs) a augmenté le sécrétome thérapeutique de cellules MIAMI. Pour avoir un système facile à appliquer en clinique, nous avons choisi d’utiliser les cellules souches de la papille apicale (SCAP) et FN-MPAs libérant ou non du BDNF pour la thérapie du TME. Plus de 90 % du SCAP complexée avec FN-MPAs (libérant ou pas BDNF) demeurent viables pendant 7 jours et il y a augmentation de l'expression des gènes neuronaux/oligodendrogliaux in vitro. La récupération de la fonction locomotrice a été significativement améliorée après la transplantation du SCAP complexée avec FN-MPAs-BDNF avec une coordination cohérente du membre postérieur après 28 jours de traitement.

The Iaboratory discovered the presence of tubulin binding sites (TBS) on intermediate filaments, like on the neurofilaments (NF) that are specifically expressed by neurons. The NFL-TBS.40-63 peptide, which corresponds to the sequence of TBS on the light subunit of NF, has showed an anti-glioblastoma property in vitro and in vivo, without effect on surrounding healthy cells (neurons and astrocytes). Moreover, it induces the differentiation and maturation of oligodendrocyte precursors without impacting the viability of these cells. Our studies during the PhD, allowed us to exploit the NFL-TBS.40-63 peptide as a possible therapeutic agent for regenerative medicine. Indeed, we showed that the peptide penetrates passively in neural stem cells (NSCs) in vitro and in vivo, and it is not toxic for cells. After several days with the peptide, the "stem" cell properties of cells, including the capacity to proliferate and self-renew, diminish and the cells differentiate into more mature cells.These data indicate that the NFL-TBS.40-63 peptide could be a promising therapeutic agent to target endogenous brain NSCs in neurodegenerative disorders to stimulate the differentiation of these cells., Les travaux menés au laboratoire ont mis en évidence des sites de liaison de la tubuline (TBS pour Tubulin Binding Site) sur les filaments intermédiaires, tels que les neurofilaments (NFs), qui sont spécifiquement exprimés par les neurones. Le peptide NFL-TBS.40-63 qui correspond à la séquence en acide aminés du TBS situé sur la sous unité légère des NFs, a montré des propriétés anti-glioblastomes in vitro et in vivo, sans effet sur les cellules saines environnantes (neurones et astrocytes). De plus, Il est aussi capable d’induire la différenciation et la maturation des précurseurs d’oligodendrocytes sans affecter la viabilité de ces cellules.Les travaux menés au cours de cette thèse ont permis de valoriser le peptide NFL-TBS.40-63 comme agent thérapeutique possible pour la médecine régénérative. En effet, nous avons montré que le peptide est capable de pénétrer dans les cellules souches neurales (CSNs) in vitro de manière passive et in vivo, et n’est pas toxique pour les cellules. Après plusieurs jours en présence du peptide, les propriétés dites « souches » des cellules, telle que la capacité à proliférer et à s’auto-renouveler diminuent, et les cellules se différencient en cellules plus matures. Ces résultats indiquent que le peptide pourrait être un agent thérapeutique intéressant pour cibler les CSNs endogènes du cerveau dans le cas de maladies neurodégénératives afin de stimuler la différenciation de ces cellules.

The Iaboratory discovered the presence of tubulin binding sites (TBS) on intermediate filaments, like on the neurofilaments (NF) that are specifically expressed by neurons. The NFL-TBS.40-63 peptide, which corresponds to the sequence of TBS on the light subunit of NF, has showed an anti-glioblastoma property in vitro and in vivo, without effect on surrounding healthy cells (neurons and astrocytes). Moreover, it induces the differentiation and maturation of oligodendrocyte precursors without impacting the viability of these cells. Our studies during the PhD, allowed us to exploit the NFL-TBS.40-63 peptide as a possible therapeutic agent for regenerative medicine. Indeed, we showed that the peptide penetrates passively in neural stem cells (NSCs) in vitro and in vivo, and it is not toxic for cells. After several days with the peptide, the "stem" cell properties of cells, including the capacity to proliferate and self-renew, diminish and the cells differentiate into more mature cells.These data indicate that the NFL-TBS.40-63 peptide could be a promising therapeutic agent to target endogenous brain NSCs in neurodegenerative disorders to stimulate the differentiation of these cells., Les travaux menés au laboratoire ont mis en évidence des sites de liaison de la tubuline (TBS pour Tubulin Binding Site) sur les filaments intermédiaires, tels que les neurofilaments (NFs), qui sont spécifiquement exprimés par les neurones. Le peptide NFL-TBS.40-63 qui correspond à la séquence en acide aminés du TBS situé sur la sous unité légère des NFs, a montré des propriétés anti-glioblastomes in vitro et in vivo, sans effet sur les cellules saines environnantes (neurones et astrocytes). De plus, Il est aussi capable d’induire la différenciation et la maturation des précurseurs d’oligodendrocytes sans affecter la viabilité de ces cellules.Les travaux menés au cours de cette thèse ont permis de valoriser le peptide NFL-TBS.40-63 comme agent thérapeutique possible pour la médecine régénérative. En effet, nous avons montré que le peptide est capable de pénétrer dans les cellules souches neurales (CSNs) in vitro de manière passive et in vivo, et n’est pas toxique pour les cellules. Après plusieurs jours en présence du peptide, les propriétés dites « souches » des cellules, telle que la capacité à proliférer et à s’auto-renouveler diminuent, et les cellules se différencient en cellules plus matures. Ces résultats indiquent que le peptide pourrait être un agent thérapeutique intéressant pour cibler les CSNs endogènes du cerveau dans le cas de maladies neurodégénératives afin de stimuler la différenciation de ces cellules.

Traumatic spinal cord injury (SCI) is a devastating condition resulting in permanent loss of neural functions. The objective of this thesis is to develop pharmacologically active microcarriers (PAMs) with a fibronectin (FN) surface that deliver biologically active brain derived neurotrophic factor (BDNF) in a controlled manner. We want to combine this system with adult mesenchymal stem cells (MSCs) for SCI repair. The nanoprecipitated BDNF was encapsulated in FN-PAMs and the in vitro release profile was evaluated. It showed a prolonged, bi-phasic, release of bioactive BDNF, without burst effect. We combined human marrow-isolated adult multilineage-inducible (MIAMI) stem cells and FN-PAMs with an injectable non-toxic silanized-hydroxypropylmethylcellulose (Si-HPMC) hydrogel. We demonstrated that FN-PAMs and the Si-HPMC hydrogel increased the expression of neural/neuronal differentiation markers of MIAMI cells after 1 week. Moreover, the 3D environment (FN-PAMs or hydrogel) enhanced the therapeutic MIAMI cell secretome. To have a clinically translatable system, we chose to use stem cells of the apical papilla (SCAP) and FNPAMs releasing or not BDNF for SCI therapy. More than 90% of SCAP complexed with FN-PAMs (releasing or not BDNF) remained viable for 7 days and an increased neuronal-oligodendroglial gene expression in vitro. The recovery of locomotor function was significantly improved after transplantation of SCAP complexed with FN-PAMs-BDNF with frequent to consistent forelimb-hindlimb coordination after 28 days of treatment., Un traumatisme de la moelle épinière (TME) est une condition dévastatrice entraînant la perte permanente de fonctions neuronales. L’objectif de cette thèse est de formuler de microsupports pharmacologiquement actif (MPAs) avec une surface de fibronectine (FN), libérant le« brain-derived neurotrophic factor » (BDNF) de façon controlée. Nous voulons combiner ce système avec des cellules souches mésenchymateuses (CSMs) pour la réparation de TME. Le BDNF nanoprécipité a été encapsulé dans les FN-MPAs et le profil de libération in vitro a été évaluée. Elle a montré une libération biphasique et prolongée de BDNF bioactifs. Nous avons combinés des cellules souches humaines mésenchymateuse issues de la moelle osseuse adulte (cellules MIAMI) et FN-MPAs avec un hydrogel non-toxique silanisés-hydroxypropylméthylcellulose (Si-HPMC). Nous avons démontré que les FN-MPAs et le Si-HPMC augmentait l'expression de marqueurs neuraux/neuronaux de cellules MIAMI après 1 semaine. En outre, l'environnement 3D (hydrogel ou FN-MPAs) a augmenté le sécrétome thérapeutique de cellules MIAMI. Pour avoir un système facile à appliquer en clinique, nous avons choisi d’utiliser les cellules souches de la papille apicale (SCAP) et FN-MPAs libérant ou non du BDNF pour la thérapie du TME. Plus de 90 % du SCAP complexée avec FN-MPAs (libérant ou pas BDNF) demeurent viables pendant 7 jours et il y a augmentation de l'expression des gènes neuronaux/oligodendrogliaux in vitro. La récupération de la fonction locomotrice a été significativement améliorée après la transplantation du SCAP complexée avec FN-MPAs-BDNF avec une coordination cohérente du membre postérieur après 28 jours de traitement.

The combination of biomaterials and stem cells aims to protect damaged cells and slow the progression of neurodegenerative diseases such as Huntington's disease(HD). Mesenchymal stem cells, particularly a subpopulation known as MIAMI cells, have already demonstrated their effectiveness in Parkinson's disease. However, it is essential to improve their neuronal differentiation, survival, and to assess their secretome. The main objective of this work was to propose an innovative regenerative medicine strategy for HD by combining stemcells, micro and nano medicines. To perform this assessment, a new ex vivo animal model of HD has been set up. We then developed and optimized two nanovectors,lipid nanocapsules and solid SPAN nanoparticles,carrying an inhibitor of REST a transcription factor, which prevents neuronal differentiation. The transfection of this siREST showed an improvement in the neuronal phenotype. These modified cells were then induced into a GABAergic phenotype through growth factors. They were then associated with a 3D support, the pharmacologically active microcarriers (PAM) allowing a high rate of engraftment. The PAM are microspheres which have a biomimetic surface of laminin and release a trophic factor BDNF, brain derived neurotrophic factor (inducer of a neural phenotype and neuroprotective) in a controlled manner. Promising results were obtained, further encouraging continuing the evaluation of this strategy in vivo in genetic models of HD., La combinaison de biomatériaux et cellules souches, a pour but de protéger des cellules endommagées et de ralentir la progression des maladies neurodégénératives, comme la maladie de Huntington (MH). Les cellules souches mésenchymateuses et particulièrement une sous-population, les cellules MIAMI, ont déjà démontré leur efficacité dans la maladie de Parkinson. Il est cependant essentiel d’améliorer leur différenciation neuronale, leur survie et évaluer leur sécrétome. L’objectif principal de ce travail fut de proposer une stratégie innovante de médecine régénératrice pour la MH associant cellules souches, nano et micro médecines. Pour l’évaluer, un nouveau modèle animale ex vivo de la MH a été mis en place. Nous avons ensuite développé et optimisé deux nano-vecteurs, des nanocapsules lipidiques et des nanoparticules solides de SPAN, et les avons associés à un inhibiteur de REST qui est un facteur de transcription qui empêche la différenciation neuronale. La transfection de ce siREST a montré une amélioration du phénotype neuronal. Ces cellules ainsi modifiées furent ensuite induites vers un phénotype GABAergic grâce à des facteurs de croissance. Puis elles ont été associées à un support 3D, les microcarriers pharmacologiquement actif (MPA) permettant une meilleure intégration des cellules après greffe. Les MPA sont des microsphères ayant une surface biomimétique de laminine et libérant de façon contrôlée un facteur trophique le « brain derived neurotrophic factor » (inducteur d’un phénotype neuronal et neuro-protecteur). Des résultats prometteurs ont été obtenus, encourageant à continuer l’évaluation de cette stratégie in vivo dans des modèles génétiques de la MH.