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Endothelial mechanisms underlying the vascular effects of estrogen modulated by the G protein-coupled estrogen receptor (GPER) are not well understood, especially in gonadal sex hormone deprivation. Thus, we investigated vascular function and endothelial signaling pathways involved in the selective activation of GPER in resistance arteries of gonadectomized rats.Gonadectomy was performed in Wistar rats of both sexes. After 21 days, the animals were euthanized. Concentration-response curves were obtained by cumulative additions of G-1 in third-order mesenteric arteries. The vasodilatory effects of G-1 were evaluated before and after endothelium removal or incubation with pharmacological inhibitors. Tissue protein expression was measured by western blotting. Assays with 4-amino-5-methylamino-2',7'-difluorofluorescein diacetate (DAF-FM) and 2',7' dichlorodihydrofluorescein-diacetate (H2DCF-DA) were performed in the arteries investigated. Immunolocalization was assessed by immunofluorescence.G-1 induced partially endothelium-dependent relaxation in both sexes. The three isoforms of the enzyme nitric oxide synthase contributed to the production and release of nitric oxide in both gonadectomized groups, but the role of inducible nitric oxide synthase is more expressive in males. The mechanistic pathway by which endothelial nitric oxide synthase is phosphorylated appears to differ between sexes, with the rapid signaling pathway phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B/endothelial nitric oxide synthase (PI3k-Akt-eNOS) being identified for males and mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase/endothelial nitric oxide synthase (MEK-ERK-eNOS) for females. The contribution of hydrogen peroxide as an endothelial relaxation mediator seems to be greater in females.These results provide new insights into the effects of estrogen-induced responses via GPER on vascular function in gonadal sex hormone deprivation.

Stimulation of neuropeptide Y (NPY) Y2 receptors induced an intracellular free Ca2+ ([Ca2+]i) increase in a human neuroblastoma cell line, CHP-234. When NPY in a Ca(2+)-free solution was applied, this increase was abolished. Depolarization with high KCl evoked no response, suggesting that the responses were not mediated by voltage-gated Ca2+ channels. There was no evidence that the NPY response consisted of a capacitative Ca2+ entry sensitive to internal Ca2+ store levels. The [Ca2+]i elevation was diminished by Ni2+, a blocker of Ca2+ entry. Mn2+ induced a quench of the fura-2 fluorescence, which ceased promptly upon the removal of NPY, indicating that Ca2+ entry was linked tightly to receptor activation. Although thapsigargin- and ryanodine-sensitive Ca2+ stores were present, NPY-induced responses were not impaired by pretreatment with either drug. Furthermore, NPY had no effect on the thapsigargin-sensitive store. Pertussis toxin did not affect the NPY-stimulated [Ca2+]i increase, although it abolished the NPY-dependent inhibition of cAMP production. It is concluded that the Y2 receptors couple directly to receptor-operated Ca2+ channels without the involvement of intracellular Ca2+ stores. The results also indicate that Y2 receptors can activate both pertussis toxin-sensitive and -insensitive mechanisms in the same cell.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Os receptores colinérgicos são basicamente de dois tipos: nicotínicos (nAChRs), que formam canais iônicos ativados por ligante e os muscarínicos (mAChRs), que são acoplados à proteína G. Até o momento, é bem aceito que o relaxamento vascular induzido pela acetilcolina (ACh) é mediado pela ativação de mAChRs, presentes no endotélio vascular, principalmente do subtipo M3. Alguns estudos têm demonstrado a presença dos componentes de síntese, transporte e degradação da ACh em vários tecidos não-neuronais. Dados bastante consistentes do nosso grupo, em aorta de camundongos, apontam para um importante papel dos nAChRs α7 na vasodilatação dependente do endotélio mediada pela ACh. No entanto, a existência dos componentes do sistema colinérgico não neuronal em vasos, o mecanismo pelo qual o nAChR participa da resposta vasodilatadora e se esses receptores são funcionais em vasos humanos, ainda não são conhecidos. Portanto, este trabalho propôs estudar a presença do sistema colinérgico não-neuronal em vasos humanos, bem como, avaliar a participação dos nAChRs no relaxamento vascular dependente de endotélio e a sinalização intracelular desencadeada por essa resposta. Foram utilizados segmentos de artéria mamária e veia safena humana de pacientes, de ambos os sexos, submetidos a cirurgias de revascularização cardíaca . Para avaliar a expressão gênica dos componentes do sistema colinérgico foi utilizada a técnica de RT-PCR. A expressão proteica dos receptores mAChR M3 e nAChR α7 foi avaliada por Western blot. Co-imunoprecipitação, seguida de Western blot foi utilizada para avaliar a possibilidade de uma interação física entre os nAChRs e mAChRs. A participação dos nAChRs na resposta vasodilatadora induzida pela ACh foi avaliada utilizando um sistema de banho de órgãos. Para avaliar o mecanismo envolvido na resposta vasodilatadora foi utilizada aorta de camundongo. A determinação da [Ca+2]i foi feita na linhagem de célula endotelial humana EA-hy926 por microscopia de fluorescência. Foi identificado a expressão gênica do transportador de colina de alta eficiência (SLC5A7), das enzimas butirilcolinesterase (BChE) e acetilcolinesterase (AChE), responsáveis pela degradação da ACh, da enzima colina acetil-transferase (CHAT), que realiza a síntese de ACh, além de mAChRs M3 e nAchRs α7. Foi demonstrada também a expressão proteica dos mAChRs M3 e nAChRs α7 no endotélio. Esses dados são consistentes com a presença de um sistema colinérgico não-neuronal (SCNN) em artéria mamária e veia safena de humanos. A ACh induziu um efeito vasodilatador concentração-dependente que foi dependente da presença de um 16 endotélio funcional e abolido pela atropina, um antagonista dos receptores muscarínicos, tanto na artéria mamária como na veia safena de humanos. A estimulação direta dos nAChRs, com um agonista não-seletivo (DMPP) e um agonista seletivo dos nAChRs α7 (PNU-282987), não induziu efeito vasodilatador. Curiosamente, o bloqueio farmacológico com dois antagonistas dos nAChRs mecamilamina e D-tubocurarina, reduziu a resposta vasodilatadora em cerca de 40%. Nossos dados sugerem que o efeito vasodilatador mediado pela estimulação dos mAChRs é, em parte, dependente da ativação dos receptores nAChRs, já que o bloqueio desses receptores diminuiu a resposta vasodilatadora. No entanto, a ativação dos nAChRs é dependente da ativação prévia dos mAChRs. Foi demonstrado a formação de um imunocomplexo ou uma proximidade muito grande entre o mAChRs M3 e o nAChRs α7. Foi possível observar que já na condição basal, esses receptores parecem estar ligados fisicamente no endotélio vascular de aorta de camundongos, e que após estímulo com ACh ou muscarina, na presença e na ausência de atropina, a formação do complexo não é alterada. O mesmo acontece na condição basal em humanos. Esses dados sugerem que o mAChRs M3 e o nAChRs α7 parecem estar ligados fisicamente e/ou muito próximos para co-imuprecipitarem juntos. O bloqueio da pequena proteína G Rho-A com Rhosin (inibidor do domínio de ligação Rho GEF de Rho-A), diminuiu a resposta vasodilatadora induzida pela muscarina na aorta de camundongo. Ainda, o bloqueio farmacológico dos receptores de potencial transitório (TRPs) com bloqueadores não seletivos e seletivos para o subtipo do receptor de potencial transitório vanilóide 4 (TRPV-4), a resposta vasodilatadora foi reduzida em 40%. Esses achados indicam que Rho-A e os TRPs também estar envolvidos na resposta vasodilatadora da ACh. Dessa forma, os dados deste trabalho, em conjunto, mostram que existe um sistema colinérgico não-neuronal na veia safena e na artéria mamária de humanos. Mais importante, estes dados sugerem que os nAChRs α7 participam da resposta vasodilatadora dependente de endotélio mediada pela ACh. O mecanismo parece não envolver uma ativação direta dos nAChR α7, mas sim a ativação do mAChRs M3 que fariam parte de um complexo formado pela heterodimerização com os nAChR α7.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Dados do ministério da saúde e da organização mundial de saúde mostram atualmente uma tendência mundial de maior prevalência de sobrepeso e obesidade. A obesidade é fator de risco para diversas doenças como hipertensão, diabetes, dislipidemias, depressão e outros, devido a uma série de desequilíbrios fisiológicos que podem se estabelecer em indivíduos obesos, como uma resposta inflamatória crônica, por exemplo. Esta resposta inflamatória oriunda do tecido adiposo está ainda relacionada ao estabelecimento de resistência insulínica, diabetes e problemas cardiovasculares. O tratamento farmacológico da obesidade envolve fármacos que apresentam diversos efeitos adversos e limitações em promover perda de peso significativa e sustentada. Estes fatores destacam a necessidade de se desenvolver novos fármacos para o tratamento da obesidade. O receptor metabotrópico de glutamato do tipo 5 (mGluR5) é expresso em áreas chave de regulação do metabolismo e alimentação como o hipotálamo, sistema de recompensa, núcleo do trato solitário e também na periferia em leucócitos, hepatócitos e células pancreáticas. Trabalhos prévios já apontaram para o potencial terapêutico destes receptores no contexto da obesidade. O presente trabalho utilizou o modulador alostérico negativo de mGLuR5, VU, jamais testado em modelos de obesidade. Foi verificado que camundongos C57BL/6J obesos apresentaram elevado peso corporal, adiposidade, nível sérico de leptina e colesterol total, e também uma resposta inflamatória no tecido adiposo branco, evidenciada por níveis elevados de citocinas e quimiocinas inflamatórias. O tratamento com VU na dose de 7,5 mg/Kg promoveu redução do peso corporal e da alimentação, redução do nível sérico de insulina e redução dos níveis de citocinas inflamatórias apenas em animais obesos. Além disso, foi demonstrado que camundongos transgênicos, que não expressam o receptor mGLuR5 (knockout), apresentam menor peso e adiposidade em relação à camundongos selvagens. Estes dados reforçam o papel do receptor mGluR5 como potencial alvo terapêutico para o tratamento da obesidade. Além disso, foi demonstrado a eficácia do composto VU em promover perda de peso, redução do apetite e atenuar a resposta inflamatória associada à obesidade em camundongos, que constituem fatores de risco para o desenvolvimento de resistência à insulina, diabetes e síndrome metabólica, dentre outros problemas. Mais estudos podem elucidar os mecanismos e vias pelos quais o VU promoveu melhora destes parâmetros. Concluímos com os resultados deste trabalho que o VU e possivelmente outros moduladores negativos de mGluR5, podem ser importantes compostos para o tratamento da obesidade. Data from world health organization and Brazil health ministry shows a worldwide tendency for increased obesity and overweight prevalence. Obesity is a risk factor for several diseases including hypertension, diabetes, dyslipidemia, depression and others, due a series of physiological imbalances that can be stablished on obese individuals, such as a chronic inflammatory response for example. This inflammatory response derived from the adipose tissue is associated to the onset of insulin resistance, diabetes and cardiovascular problems. Obesity pharmacotherapy is based on drugs associated with several adverse effects and limitations regarding efficacy in promoting significant and sustained weight loss. All these factors highlight the importance of developing novel agents for obesity treatment. The metabotropic glutamate receptor 5 (mGluR5) is expressed in key areas that regulate metabolism, such as the hypothalamus, the mesolimbic reward system, the nucleus of the solitary tract and also at the periphery in leucocytes, hepatocytes and pancreatic cells. Previous works showed the therapeutic potential of this receptor in obesity. The present work used a negative allosteric modulator of mGLuR5, VU, never tested on obesity models. It was observed that obese C57BL6/J mice had elevated body weight, adiposity, serum leptin and cholesterol levels, and also developed an inflammatory response on white adipose tissue evidenced by higher levels of inflammatory cytokines. Treatment with 7,5 mg/Kg of VU promoted weight loss and decreased appetite only in obese mice. Furthermore, only obese mice treated with the compound had decreased serum insulin and inflammatory cytokines levels. It was also demonstrated that transgenic mice that do not express mGLuR5 (knockout) have reduced body weight and adiposity compared to their wild-type littermates. Collectively these results reinforce the role of mGluR5 receptors as potential therapeutic targets for treating obesity. It was also demonstrated the efficacy of VU to promote weight loss, reduce feeding and ameliorate the inflammatory response associated with the development of obesity, all risk factors for conditions such as insulin resistance, diabetes, metabolic syndrome and other pathologies. Further studies should clarify the mechanisms and pathways by which VU improved these parameters. Based on these results we conclude that VU, and possibly other negative allosteric modulators of mGluR5, could be important compounds for the treatment of obesity.

Esta tese avaliou a função em artérias de resistência do músculo esquelético (ARME) e em coronárias septais (CS) de ratos com disfunção ventricular esquerda leve (LDV) e severa (SDV) pós-infarto do miocárdio (IM). As ARME e as CS foram montadas em miógrafo de arame. O relaxamento dependente do endotélio, mediado pela acetilcolina (ACh), foi reduzido nas ARME dos SDV e preservado nos LDV. A resposta à ACh foi reduzida na CS dos SDV e aumentada nos LDV. O relaxamento mediado pelo doador de óxido nítrico (NO) foi preservado em todas as artérias. Utilizando-se a sonda DAF-2 em cortes de CS, antes e após estimulação com ACh, detectou-se menor produção de NO nos SDV e maior produção de NO nos LDV. Na CS observou-se aumento das espécies reativas de oxigênio nos SDV e redução destas nos LDV. Detectou-se maior expressão protéica da sintase de NO endotelial e neuronal e das isoformas da superóxido dismutase na CS dos LDV em relação ao SHAM. Conclui-se que a função nas ARME e nas CS é modulada diferentemente na dependência do estado da função cardíaca pós-IM. This study assessed the reactivity in skeletal muscle resistance arteries (SMRA) and in septal coronary arteries (SC) from rats with slight (sliLVD) and severe (sevLVD) left ventricular dysfunction after myocardial infarction (MI). SMRA and the SC were mounted on a wire myograph. The endothelium-dependent relaxation by acetylcholine (ACh) was reduced in SMRA from sevLVD; but it was preserved in sliLVD. The ACh-relaxation was reduced in SC from sevLVD; while it was increased in sliLVD. The nitric oxide (NO) donor relaxation was unchanged in all arteries. Using DAF-2 probe in SC, before and after ACh stimulation, it was observed NO production decreased in SC from sevLVD, while it was increased in sliLVD. Reactive oxygen species was increased in SC from sevLVD and it was reduced in sliLVD. Neuronal and endothelial NO synthase and superoxide dismutase isoforms protein expression were greater in SC from sliLVD as compared to SHAM. In conclusion, SMRA and SC function is differentially modulated on the dependency of the cardiac function after MI.