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A promising strategy to overcome multidrug resistance is the use of inhibitors of ABC drug transporters. For this reason, we evaluated the polyoxovanadates (POVs) ([V(10)O(28)](6−) (V(10)), [H(6)V(14)O(38)(PO(4))](5−) (V(14)), [V(15)O(36)Cl](6−) (V(15)) and [V(18)O(42)I](7−) (V(18)) as inhibitors of three major multidrug resistance-linked ABC transporters: P-glycoprotein (P-gp), ABCG2 and MRP1. All of the POVs selectively inhibited P-gp. V(10) and V(18) were the two most promising compounds, with IC(50) values of transport inhibition of 25.4 and 22.7 μM, respectively. Both compounds inhibited P-gp ATPase activity, with the same IC(50) value of 1.26 μM. V(10) and V(18) triggered different conformational changes in the P-gp protein with time-dependent inhibition, which was confirmed using the synthesized salt of V(10) with rhodamine B, RhoB-V(10).

ABCG2 transporter molecular dynamics simulation data with substrate/inhibitors PHE and POR (3 replicas of 1 microsecond each), in explicit membrane/water systems, description regarding execution is provided in the respective manuscript &nbsp

ABCG2 transporter molecular dynamics simulation data.

Resumo: O Carcinoma hepatocelular (CHC) está entre os tumores com pior prognóstico e a quimioterapia disponível não é eficaz. A quimoresistencia esta associada com o fenótipo MDR (resistência a múltiplas drogas), o qual envolve, principalmente, a superexpressão de transportadores ABC na membrana plasmática de células tumorais. Neste trabalho foram abordadas duas estratégias de investigação: (i) identificação de compostos naturais que induzem morte em células de hepatocarcinoma humano (HepG2) e (ii) identificação de inibidores de ABCG2 (um dos transportadores ABC envolvidos na resistência a quimioterapia) em células que superexpressam este transportador. Os efeitos das flavonas (flavona e apigenina) foram avaliados em células de hepatoma humano (HepG2). A flavona induziu morte em células HepG2 sem alteração dos níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) e ainda foi capaz de induzir um aumento na expressão das principais enzimas antioxidantes (CuZnSOD, MnSOD e Gred). O provável mecanismo de morte celular induzido pela flavona em células HepG2 também não envolve a via mitocondrial, pois não induziu liberação de citocromoc no citosol e nem alterou o potencial de membrana mitocondrial, sugerindo um mecanismo via receptor de morte. A apigenina, por sua vez, induziu morte celular com aumento dos níveis de EROs, sendo que a catalase teve um papel central neste efeito. O tratamento de células HepG2 com a apigenina levou a uma diminuição nos níveis de mRNA da catalase, que consequentemente resultou em diminuição na atividade enzimática. Quando realizado um co-tratamento de apigenina e catalase exógena foi observada uma proteção parcial da morte celular induzida pela apigenina, sugerindo o envolvimento de EROs (especialmente H2O2). Desta forma, os resultados indicam que flavonas hidroxiladas, como a apigenina, apresentam um mecanismo diferente na indução de morte celular que o induzido pela flavona (anel sem substituinte) e que esta classe de flavonóides é promissora para estudos adicionais visando o tratamento do CHC. Quanto ao transportador ABCG2, foi observado que a hispidulina (representante das flavonas) inibe o transporte de mitoxantrona por este transportador, porém apresentou baixa afinidade. Adicionalmente, foram identificadas três classes de potentes inibidores específicos de ABCG2: as chalconas, cromonas e estilbenos. De uma série de 44 chalconas (e análogos), foram identificados vários substituintes e posições importantes para inibição de ABCG2, permitindo fazer um modelo molecular de relação estrutura-atividade (3D-QSAR). Seis chalconas apresentaram um IC50 abaixo de 0,5 ?M e completa inibição de ABCG2. Dentre estas, duas apresentaram baixa citotoxicidade, tornando-se potencias candidatos para testes in vivo. Baseados em dados anteriores obtidos com as acridonas (outra classe de inibidores específicos de ABCG2) foi possível chegar as cromonas, as quais foram identificadas nesse trabalho como inibidores específicos de ABCG2. As cromonas não são transportadas por ABCG2, apresentam alta afinidade, além de baixa citotoxicidade (IC50 de 0,11 ?M para a cromona 6g). Essas características das cromonas (tendo como principal representante a cromona 6g) as tornam os melhores inibidores de ABCG2 já descrito em ensaios in vitro. A terceira classe identificada como inibidora de ABCG2 nesse trabalho foi a dos estilbenos, que também apresentaram uma alta afinidade para inibir ABCG2 (estilbeno 9 = IC50 de 0,16 ?M), entretanto, essa classe de compostos não apresentou uma inibição completa (máximo de inibição de 75%). Observou-se também diferenças no mecanismo de inibição quando comparado a inibidores de referência como o GF120918. Para finalizar, foi possível provar a existência de diferentes sítios de inibição em ABCG2 e que estes sítios são diferentes do sítio de transporte, sendo que o mecanismo de inibição é não-competitivo e promovido através de mudanças conformacionais. Com estes resultados, foi desenvolvido um modelo posicionando inibidores que bloqueiam parcialmente e completamente o transporte de substratos por ABCG2.

Orientadora : Profª Drª Maria Eliane Merlin Rocha Co-orientadora : Profª Drª Glaucia Regina Martinez Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 2008 Inclui bibliografia

Orientador: Prof. Dr. Geraldo Picheth. Coorientador: Prof. Dr. Glaucio Valdameri. Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa : Curitiba, 12/12/2018. Inclui referências: p. 110-121. Resumo: Introdução. Diabetes Mellitus Gestacional (DMG), intolerância à glicose se iniciada na gestação, tem alta prevalência no Brasil e no mundo. O DMG está associado a um significante aumento de morbidade materna e neonatal com efeito também transgeracional. Os critérios para o diagnóstico do DMG estão assentados na quantificação plasmática da glicemia de jejum e no TOTG.Objetivos. Dois objetivos centrais foram enfrentados. analisamos registros laboratoriais para estabelecer a prevalência do DMG no início da gestação, no período de 24-28 semanas e o intervalo de referência para a glicemia de jejum, em uma população da cidade de Curitiba, estado do Paraná, Sul do Brasil. Na sequência, foram desenvolvidos softwares para auxílio diagnóstico e um banco de dados dedicado com um sistema de geolocalização e notificação para os pacientes.Material e Métodos. Registros não identificados, obtidos no LMC, uma unidade de saúde terciária, foram utilizados. A mediana da idade das gestantes foi 25 (21-30) anos, com variação entre 12 a 47 anos. A glicêmica foi quantificada no plasma (NaF-EDTA) pelo método da hexoquinase-UV automatizado (Cobas c502; CVa

Orientador: Prof. Dr. Luciano F. Huergo. Coorientadores: Prof. Dr. Glaucio Valdameri, Drª Edileusa C. M. Gerhardt. Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Bioquímica. Defesa : Curitiba, 19/08/19. Inclui referências: p. 82-97. Resumo: O nitrogênio é um elemento necessário para a biossíntese de diversas biomoléculas, incluindo proteínas e ácidos nucléicos. Na ausência de nitrogênio, procariotos como Escherichia coli cessam imediatamente o crescimento. Amônio é a fonte de nitrogênio de preferência para E. coli e confere as maiores taxas de crescimento. Sob condições de limitação de amônio, E. coli é capaz de utilizar fontes alternativas de nitrogênio, sendo que esta reprogramação é conduzida através da indução do regulon NtrC. Neste trabalho foi utilizada a técnica de proteômica livre de marcação para determinar a dinâmica da expressão de proteínas de E. coli em resposta à privação de nitrogênio, tanto inicialmente (30 min) quanto tardiamente (60 min). A abundância de proteínas e modificações pós-traducionais confirmaram que a ativação do regulon NtrC atua como a primeira linha de defesa da célula contra a falta de nitrogênio. A poteína Rmf (ribosome modulation fator) foi induzida logo após a célula ser submetida à privação de amônio, seguido da expressão de outras proteínas que atuam inativando os ribossomos, como Hpf e RaiA, apoiando a hipótese de que a inativação dos ribossomos é um processo importante durante a limitação de nitrogênio. O promotor rmf foi estudado e contém um promotor sigma54 além do sítio de ligação sigma70. Os dados proteômicos revelaram que a parada do crescimento devido à falta de nitrogênio se correlaciona com o acúmulo de proteínas envolvidas na condensação do DNA, no catabolismo de RNA e proteína e com hibernação de ribossomo. Coletivamente, essas adaptações proteômicas resultam em células metabolicamente inativas que possivelmente exibem tolerância a múltiplas drogas. Abstract: Nitrogen is needed for the biosynthesis of biomolecules including proteins and nucleic acids. In the absence of fixed nitrogen, prokaryotes such as E. coli immediately ceases growth. Ammonium is the preferred nitrogen source for E. coli supporting the fastest growth rates. Under conditions of ammonium limitation, E. coli can use alternative nitrogen sources and this reprogramming is orchestrated by the induction of the NtrC regulon. We use label free proteomics to determine the dynamics of E. coli proteins expression in response to nitrogen starvation after both short (30 min) and long (60 min) term. Protein abundances and post-translational modifications confirmed that activation of the NtrC regulon acts as the first line of defense against nitrogen starvation. The ribosome inactivating protein Rmf was induced shortly after ammonium exhaustion and this was followed by induction of other ribosome inactivating proteins such as Hpf and RaiA. These data support the hypothesis that ribosome shut-down is a key process during nitrogen limitation stress. The rmf promoter was studied and it contains a sigma54 promoter in addition to the sigma70 binding site. The proteomic data revealed that growth arrest due to nitrogen starvation correlates with the accumulation of proteins involved in DNA condensation, RNA and protein catabolism and ribosome hibernation. Collectively, these proteome adaptations will result in metabolic inactive cells which are likely to exhibit multidrug tolerance.

Orientador: Prof. Dr. Glaucio Valdameri Coorientadora: Profa. Dra. Giovana Gioppo Nunes Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa : Curitiba, 26/08/2019 Inclui referências Resumo: A resistência a multidrogas (MDR) continua sendo um dos maiores desafios no tratamento do câncer. A superexpressão de transportadores ABC em células neoplásicas é considerada como principal responsável pela MDR. Neste trabalho foi avaliado o potencial de alguns polioxovanadatos (NaV10, NicoV10, IsoV10, V14, V15 e V18) como inibidores dos três principais transportadores ABC implicados na MDR: glicoproteína P (P-gp), ABCG2 e MRP1. Os polioxidovanadatos promoveram uma inibição específica do transporte de diferentes substratos mediado pela P-gp. NaV10, V14, V15 e V18 mostraram uma inibição completa (100%) na concentração de 50 ?M, diferente do NicoV10 e IsoV10, que mostraram uma inibição parcial (~50%) em 50 uM. Os melhores inibidores da P-gp foram o NaV10 e o V18, com valores de IC50 de 25,4 ± 7,9 e 22,7 ± 3,6 uM, respectivamente. A inibição da P-gp foi confirmada utilizando diferentes substratos, incluindo rodamina 123, mitoxantrona e Hoechst 33342. Um ensaio de viabilidade celular revelou que tanto o NaV10 como o V18 não são transportados pela P-gp. Este resultado foi confirmado por um ensaio de inibição realizado após lavar duas vezes as células com PBS para remoção dos compostos do meio de cultivo. Para ambos os compostos, NaV10 e o V18, a potência de inibição foi similar antes e após as etapas de lavagem. Além disso, a inibição da P-gp foi dependente do tempo, sugerindo que esses compostos atravessam a membrana celular lentamente. NaV10 e V18 mostraram uma inibição não competitiva e diferentes sítios de ligação, uma vez que o efeito promovido pelo NaV10 na ligação do anticorpo conformacional 17F9 foi diferente do efeito promovido pelo V18. Um polioxovanadato associado com a rodamina B (RhoBV10) foi utilizado para confirmar que estes compostos atravessam a membrana plasmática e se acumulam no interior das células. Estes resultados sugerem que os polioxovanadatos representam uma classe promissora de compostos solúveis em água que podem ser usados como inibidores seletivos da P-gp em futuros testes pré-clínicos. Abstract: Multidrug resistance (MDR) remains one of the greatest challenges in cancer treatment. Overexpression of ABC transporters in cancer cells has been shown to be the major responsible for MDR. Here, we evaluate the potential of polyoxovanadates compounds (NaV10, NicoV10, IsoV10, V14, V15 and V18) as inhibitors of the three main ABC transporters implicated in MDR: P-glycoprotein (P-gp), ABCG2 and MRP1. The polyoxovanadates were selective to inhibit Pgp- mediated transport of different substrates. NaV10, V14, V15 and V18 showed a complete inhibition (100%) at 50 ?M, differently of NicoV10 and IsoV10, that showed an incomplete inhibition (~50%) at 50 uM. The best P-gp inhibitors were NaV10 and V18, with IC50 of 25.4 ± 7.9 and 22.7 ± 3.6 uM, respectively. The P-gp inhibition was confirmed using different substrates, including rhodamine 123, mitoxantrone and Hoechst 33342. A cell viability assay revealed that both NaV10 and V18 are not transported by P-gp. This result was confirmed by an inhibition assay carried out after wash two times the cells with PBS for removal of compounds from culture media. For both NaV10 and V18 the inhibition potency was the same before and after the washing steps. In addition, the P-gp inhibition was time dependent, suggesting that these compounds cross the cell membrane slowly. NaV10 and V18 showed a non-competitive inhibition and different binding sites, since the effect promoted by NaV10 on binding of the conformational antibody 17F9 was different from the effect promoted by V18. A polyoxometalate compound containing rhodamine B (RhoBV10) was used to confirm that these compounds cross the membrane and accumulate inside the cells. These data suggest that polyoxovanadates-containing compounds are a promising class of water-soluble drugs that can be used as selective P-gp inhibitors in future pre-clinical tests.

Orientador: Prof. Dr. Glaucio Valdameri Coorientadores: Profa. Dra. Vivian Rotuno Moure Valdameri, Prof. Dr. Marc Le Borgne Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa : Curitiba, 29/03/2019 Inclui referências: p. 89-95 Resumo: O câncer é uma das doenças de maior índice mundial de mortalidade e o surgimento de neoplasias resistentes à quimioterapia convencional agrava ainda mais este problema. São descritos diversos mecanismos relacionados à resistência à múltiplas drogas (MDR), porém a superexpressão de transportadores ABC é considerada a principal causa deste preocupante quadro clínico. O genoma humano codifica 48 transportadores ABC, dentre os quais 3 destacam-se quanto aos seus respectivos envolvimentos no processo de MDR: Glicoproteína-P (P-gp), multidrug resistance associated protein-1 (MRP1) e breast cancer resistence protein (BCRP ou ABCG2). Estes três transportadores são capazes de reconhecer um amplo espectro de quimioterápicos e promover seu efluxo e, por esta razão, novos agentes vêm sendo estudados com o intuito de inibir o transporte mediado por estas proteínas. Apesar de ser um dos três transportadores ABC com maiores índices de envolvimento na MDR, o ABCG2 ainda não possui inibidores promissores o suficiente para serem direcionados às etapas clínicas do desenvolvimento de novos fármacos, tornando-se relevante a identificação e caracterização de novas moléculas que possam atuar como inibidores seletivos desta proteína. Neste contexto, foram testados 5 derivados de carbazoles - BAB67, BAB72, BAB74, BAB75 e BAB77 - quanto à capacidade de inibir o transportador ABCG2, os quais apresentaram capacidade inibitória frente ao transportador (valores de IC50 de 1,55; 3,39; 0,80; 0,49 e 0,60 MiM, respectivamente) e mostraram-se altamente seletivos para ABCG2 quando testados frente aos transportadores P-gp e MRP1. Além disso, foi demonstrado que os 5 compostos não são citotóxicos, apresentando valores de IG50 de citotoxicidade superiores a 100 MiM. Considerando a razão terapêutica (RT) (citotoxicidade/inibição), identificamos o composto BAB75 como o mais promissor da série testada, com uma RT superior a 200. Foi demonstrado que o BAB75 foi capaz de inibir o efluxo de diferentes substratos e reverter o fenótipo de resistência mediado pelo transportador ABCG2. No que diz respeito ao mecanismo de inibição, foi demonstrado que o BAB75 apresentou uma inibição do tipo não competitiva, não apresenta efeitos no reconhecimento do anticorpo conformacional 5D3 pelo transportador ABCG2 tampouco sobre a atividade ATPase da referida proteína. Por fim foi identificado por docking que o resíduo de fenilalanina 439 ligado aos anéis fusionados do BAB75 está majoritariamente envolvido com a ligação do composto na região transmembrana de ABCG2, ressaltando a importância do arcabouço hidrofóbico da molécula para que haja interação entre transportador e inibidor. Este conjunto de resultados demonstra que os derivados de carbazoles testados no presente estudo são promissores inibidores seletivos de ABCG2, capazes de reverter a resistência mediada pelo transportador em ensaios de longa duração e apresentam mínima citotoxicidade, características que possibilitam futuros ensaios pré-clínicos. Abstract: Cancer is one of the diseases with the highest mortality rate in the world and the emergence of neoplasms resistant to conventional chemotherapy exacerbates this problem. Several mechanisms related to multidrug resistance (MDR) have been described, however the overexpression of ABC transporters is considered the main cause of this worrying clinical condition. The human genome encodes 48 ABC transporters, among which 3 are highlighted for their involvements in the MDR phenomenon: P-glycoprotein, multidrug resistance associated protein-1 (MRP1) and breast cancer resistance protein (BCRP or ABCG2). These three transporters can recognize a broad spectrum of antineoplastic agents and promote their efflux; therefore, new compounds have been studied to inhibit the transport mediated by these proteins. Although ABCG2 is one of the three ABC transporters with the highest involvement in MDR, there are still no promising inhibitors to be forwarded to clinical steps of drug development, which makes the identification and characterization of new selective inhibitors of this protein very important. In this context, 5 carbazoles derivatives - BAB67, BAB72, BAB74, BAB75 e BAB77 - had their ability to inhibit the ABCG2 transporter tested and all compounds were capable to inhibit the protein (IC50 values of 1,55; 3,39; 0,80; 0,49 and 0,60 MiM, respectively) and were highly selective for ABCG2 when tested against the P-gp and MRP1 transporters. In addition, the 5 compounds have been shown to be non-cytotoxic, showing IG50 values of cytotoxicity higher than 100 MiM. Considering the therapeutic ratio (TR) (cytotoxicity / inhibition), we identified BAB75 as the most promising compound, with an TR higher than 200. BAB75 has been shown to inhibit the efflux of different substrates and to reverse the resistance phenotype mediated by the ABCG2 transporter. As for its inhibition mechanism, BAB75 has been shown to make a noncompetitive inhibition, showing no effects neither on recognizing the 5D3 conformational antibody by ABCG2 nor on the ATPase activity of the protein. Finally, it was identified by molecular docking that the bound between phenylalanine residue 439 and the fused rings of BAB75 is mostly involved with the interaction of the compound in the transmembrane region of ABCG2, emphasizing the importance its hydrophobic core. These results demonstrate that the carbazoles derivatives tested in this study are promising as selective inhibitors of ABCG2, can reverse de resistance mediated by ABCG2 in long-term trials and show minimal cytotoxicity, characteristics that enable future preclinical trials.

Orientador : Prof. Dr. Geraldo Picheth Coorientador : Prof. Dr. Glaucio Valdameri Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa : Curitiba, 28/02/2018 Inclui referências : p.87-104 Resumo : O diabetes mellitus tipo 1 (DM1) é uma doença autoimune com uma incidência crescente em todo o mundo. Os polimorfismos do gene da insulina têm uma forte associação com DM1. A interleucina 18 (IL-18) é uma potente citocina pró-inflamatória, que está envolvida nas respostas imunes inatas e adaptativas e na patogênese de várias doenças, incluindo DM1. O transportador de glicose 4 (GLUT4) é conhecido por ser um transportador de glicose responsivo a insulina e tem sido associado a várias doenças, incluindo diabetes mellitus. O objetivo deste estudo foi estudar variações genéticas e biomarcadores laboratoriais associados ao DM1 e suas complicações. Nós investigamos a associação dos polimorfismos, rs689 (INS), rs187238 (IL-18) e rs5435 (GLUT4) em um estudo caso-controle em euro-brasileiros com DM1 (N = 136) e indivíduos saudáveis (N = 144). A genotipagem foi realizada utilizando sondas fluorescentes (TaqMan, Applied Biosystems). Os indivíduos do grupo controle apresentaram maior IMC quando comparado ao grupo DM1. As concentrações séricas dos marcadores de controle glicêmico foram significativamente maiores no grupo DM1(P

Orientadora: Profa. Dra. Maria Eliane Merlin Rocha Coorientadores: Profa. Dra. Sheila Maria Brochado Winnischofer, Prof. Dr. Glaucio Valdameri Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Ciências – Bioquímica. Defesa : Curitiba, 30/10/2018 Inclui referências Resumo: Chalconas são compostos intermediários na via de síntese dos flavonoides. As chalconas possuem uma grande diversidade estrutural, o que contribui para as diferentes atividades biológicas que elas exercem. São conhecidos os efeitos de algumas chalconas hidroxiladas na posição 2' sobre células tumorais, contudo sabese pouco em relação aos efeitos citotóxicos sobre células tumorais promovidos com a adição de grupamento nitro na estrutura das chalconas. A presença do grupo nitro pode contribuir para aumentar a reatividade da região da carbonila ?,?-insaturada (sistema ceto-enona) das chalconas. Neste estudo foi avaliada a citotoxicidade da 2'- hidroxi-3-nitrochalcona (HNC) em células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2). A HNC foi capaz de induzir citotoxicidade de forma estatisticamente significativa a partir da concentração de 15 ?M após 24 horas de incubação pelo método do MTT e 20 ?M pelo método da LDH. A HNC (15 e 20 ?M) foi capaz de promover o aumento dos níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs), sendo esse aumento parcialmente revertido pela pré-incubacão com o antioxidante NAC na concentração de 20 ?M da HNC, sugerindo a participação de EROs no mecanismo citotóxico. O mecanismo de morte celular induzido pela HNC (15 e 20 ?M) foi investigado, utilizando marcação com anexina-V / iodeto de propídio e inibidores específicos de vias de sinalização de ferroptose, necroptose e autofagia, e os resultados mostram um possível processo apoptótico. Foi demonstrado através da avaliação da respiração celular que a HNC (15 e 20 ?M - 24 horas) provocou disfunção mitocondrial, diminuindo o consumo de oxigênio no estado basal e com a adição de substratos para o complexo I e II, porém essa diminuição não foi observada com a adição de substrato para o complexo IV. Também foi observada uma diminuição no potencial da membrana mitocondrial com a concentração de 20 ?M. Diante dos resultados, pode-se concluir que a HNC exerce atividade citotóxica por alterar os níveis de EROs, promover disfunção mitocondrial e possivelmente causar morte celular por apoptose Abstract: Chalcones are intermediate compounds in the synthesis pathway of flavonoids. Chalcones have great structural diversity, contributing to the different biological activities that they display. It is known that hydroxyl group in chalcones contributes to the cytotoxic effect in cancer cells. The nitro group is widely found in various pharmacological compounds. However, little is known about its effect on chalcones. In this study, the cytotoxicity of 2'-hydroxy-3-nitrochalcone was evaluated in human hepatocellular carcinoma cells (HepG2). HNC was able to induce cytotoxicity from the 15 ?M concentration assessed by the MTT method and 20 ?M by the LDH method in 24 hours of treatment. The effect of HNC (15 and 20 ?M) on the increase of reactive oxygen species (ROS) was evaluated, and an increase in ROS caused by both concentrations was observed. This increase was partially reversed with the preincubation of the antioxidant NAC at the concentration of 20 ?M, suggesting the participation of ROS in the cytotoxic mechanism. The results of the experiment using annexin-V/propidium iodide indicate that the possible mechanism of cell death induced by HNC (15 and 20 ?M) in 24 hours is apoptosis. Results from the cell viability assay using inhibitors of ferroptosis, necroptosis and autophagy suggested that these mechanisms are not involved in the cytotoxic effect caused by HNC. It was demonstrated by the cellular respiration evaluation that HNC (15 and 20 ?M - 24 hours) caused mitochondrial dysfunction, reducing the oxygen consumption in the basal state and with the addition of substrates for the complexes I and II, but this decrease was not observed with the addition of substrate for IV complex. A decrease in the mitochondrial membrane potential with the concentration of 20 ?M was also observed. Thus, we conclude that HNC exerts cytotoxic activity by altering ROS levels, mitochondrial function and possibly causing apoptosis cell death

Orientador: Prof. Dr. Marcelo Müller dos Santos Coorientadores: Profª Drª Leda Satie Chubatsu, Prof. Dr. Glaúcio Valdameri Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica) . Defesa : Curitiba, 26/03/2018 Inclui referências: p.158-178 Resumo: Herbaspirillum seropedicae é uma bactéria fixadora de nitrogênio, endofítica, promotora de crescimento vegetal e produtora de um polímero estocado internamente, denominado polihidroxibutirato (PHB). O PHB é produzido a partir da condensação de monômeros de ácido 3-hidroxibutírico e estocado na forma de grânulos insolúveis. Bactérias acumulam maior quantidade de PHB, geralmente, em situações de excesso de carbono ou falta de algum outro nutriente essencial como fosfato e nitrogênio. O PHB estocado pode ser utilizado como uma reserva energética, sendo mobilizado quando a bactéria se encontra em situações de estresse. A superfície dos grânulos de PHB é revestida por várias proteínas, principalmente aquelas envolvidas na síntese e na degradação do polímero. As proteínas de superfície mais abundantes são as fasinas, que têm um papel fundamental na manutenção do número e do tamanho dos grânulos no interior da célula. Além das fasinas, PHA sintases, PHA depolimerases e o regulador transcricional PhaR também são encontrados associados à superfície. Recentemente, o papel do PHB na interação planta-bactéria passou a ser novamente discutido, devido a alguns microrganismos mobilizarem os grânulos de PHB como forma de defesa antioxidante durante a colonização de raízes de plantas. Além disso, dados de análise transcriptômica apontam que a síntese e a degradação de PHB podem ocorrer durante a colonização de plantas por H. seropedicae e Azospirillum brasilense. Sendo assim, nesse trabalho de tese objetivou-se avançar no entendimento do papel do PHB para a proteção de H. seropedicae contra o estresse celular e para a colonização de plantas. Nessa tese serão apresentados resultados relacionados a (i) uma metodologia criada para uma rápida quantificação de PHB através da técnica de citometria de fluxo, (ii) a influência das fasinas na produção de PHB em H. seropedicae, (iii) o papel do PHB frente a diferentes tipos de estresse in vitro e (iv) a relevância do PHB durante o processo de colonização de plantas. Os resultados do Capítulo 1 mostram que é possível substituir a técnica laboriosa de quantificação de PHB baseada em metanólise e cromatografia a gás pela citometria de fluxo de células coradas com Vermelho Nilo. Desta forma o processo de quantificação de PHB pode ser realizado em intervalos curtos de 5 min, além de permitir a quantificação de concentrações diminutas do polímero, requerendo poucas células. Tal metodologia é de extrema importância para se determinar a quantidade de PHB em populações de bactérias colonizando a superfície de raízes, o que seria inviável utilizando a metodologia por cromatografia a gás devido ao grande número de plantas necessárias para se obter a quantidade de biomassa bacteriana necessária. No Capítulo 2, demonstrou-se o papel das fasinas para a síntese de PHB e a importância da redundância genética entre os genes phaP1 e phaP2, assegurando a síntese de PHB e o fitness de H. seropedicae. No Capítulo 3, os resultados mostram que durante o choque térmico, tanto a síntese quanto a degradação do polímero são importantes para a sobrevivência da bactéria. Sendo que, as bactérias que não produzem o grânulo possuem uma taxa de sobrevivência muito menor comparado à estirpe selvagem e o mesmo ocorre com as estirpes que não conseguem mobilizar os grânulos durante o estresse. No Capítulo 4, apresentam-se resultados que demonstram a importância do metabolismo de PHB para o processo de colonização de plantas pela bactéria H. seropedicae SmR1. Realizou-se ensaios de interação planta-bactéria utilizando as estirpes mutantes defectivas na produção e degradação do polímero, e novamente foram observados resultados significativos quanto ao desenvolvimento das raízes de plantas inoculadas, assim como uma significativa redução da população endofítica das bactérias incapazes de produzir ou degradar PHB adequadamente. Palavras-chave: Herbaspirillum seropedicae, polihidroxibutirato, fasinas, interação planta-bactéria, citometria de fluxo. Abstract: Herbaspirillum seropedicae is a nitrogen-fixing, endophytic, plant growth promoter and producer of an internally stored polymer, called polyhydroxybutyrate (PHB). This polymer is produced by the condensation of monomers of 3- hydroxybutyric acid and stored as insoluble granules. Bacteria accumulate more PHB in situations of excess carbon or lack of some other essential nutrients like phosphate and nitrogen. In this way, PHB can be used as an energy reserve and mobilized when the bacteria are in a stressful situation. On the surface of the PHB granules, there are many proteins involved in the synthesis and degradation of the polymer. The most abundant are the phasins, which play a key role in maintaining the number and size of the granules inside the cell. In addition to the phasins, PHA synthases, PHA depolymerases and the transcriptional regulator PhaR are also found associated with the surface. Recently, the role of PHB in plant-bacteria interaction has been actively discussed, because some bacteria mobilize PHB granules as a form of antioxidant defense during the colonization of plant roots. Also, data from transcriptomic analysis indicate that the synthesis and degradation of the PHB occur during the colonization of plants by H. seropedicae and Azospirillum brasilense. Thus, the objective of this thesis was to advance the understanding of the role of the PHB protecting H. seropedicae against stressful conditions and for the colonization of plants. This thesis will present results related to (i) the methodology established for a rapid quantification of PHB through the flow cytometry technique, (ii) the influence of the phasins on PHB production in H. seropedicae, (iii) the protecting role of PHB against different types of stress in H. seropedicae and (iv) the relevance of the polymer during the plant colonization process. The results of Chapter 1 showed that it is possible to replace the labour-intensive technique of quantification of PHB based on methanolysis and gas chromatography by flow cytometry of cells stained with Nile Red. In this way, the PHB quantification process can be performed at 5-min intervals, whilst allowing the quantification of PHB at low concentrations and applying a few number of cells. Such methodology is critical to determine the amount of PHB in bacterial populations colonising the root surface, which would be impracticable using the methodology by gas chromatography due to the high biomass content required (~ 5 mg of liophylized bacteria). In Chapter 2, the role of phasins for PHB synthesis and the importance of genetic redundancy between phaP1 and phaP2 genes were demonstrated, ensuring PHB synthesis and the fitness of H. seropedicae SmR1. In Chapter 3, the results show that during thermal shock, both the synthesis and the degradation of the polymer are essential for the survival of the bacterium. The bacteria that do not produce the granule have a much lower survival rate than the wildtype strain, and so do the strains that cannot mobilise the granules during stress. In Chapter 4, we present results that demonstrate the importance of PHB metabolism for the process of colonization of plants by H. seropedicae SmR1. Plantbacteria colonization assays were performed using mutants defective in the production and degradation of the polymer, and again significative results were determined for PHB-producing strains on the development of inoculated plant roots, while a significative reduction in the endophytic population of bacteria unable to produce or degrade PHB properly. Keywords: Herbaspirillum seropedicae, polyhydroxybutyrate, phasin, plant-bacteria interaction, flow cytometry.

Orientador: Emanuel Maltempi de Souza Coorientador: Glaucio Valdameri Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências - Bioquímica. Defesa : Curitiba, 17/12/2018 Inclui referências Resumo: O gênero Azospirillum inclui microrganismos de vida livre capazes de colonizar e promover o crescimento de gramíneas e cereais, como milho, sorgo, trigo, arroz e aveia. O Azospirillum é capaz de fixar nitrogênio e se associar às raízes dessas plantas, podendo transferir parte do nitrogênio fixado ao vegetal (aproximadamente 10% das necessidades da planta). Dentre as 16 espécies descritas para o gênero, Azospirillum brasilense é a mais estudada. O sistema ntr regula o metabolismo de nitrogênio em A. brasilense, incluindo os genes responsáveis pela fixação. Esse sistema é composto pelas proteínas codificadas pelos genes glnD, glnB, glnZ, ntrB e ntrC. A proteína GlnD é capaz de sensoriar a glutamina intracelular e agir como uridililtransferase (Utase/UR) em resposta aos níveis de nitrogênio. Em condições de limitação de nitrogênio, GlnD adiciona grupos uridilil (UMP) às proteínas PII, GlnB e GlnZ, na preseça de ATP e 2-oxoglutarato. GlnB uridililada não interage com a histidina kinase NtrB, que, na sua forma livre, fosforila NtrC. NtrC ativa a transcrição de genes em resposta aos níveis de nitrogênio de maneira dependente de sigma 54 (RpoN). NtrB e NtrC compõem um sistema de dois componentes, no qual NtrB é capaz de fosforilar NtrC quando o nitrogênio intracelular é baixo. Por outro lado, a presença de nitrogênio resulta na defosforilação e consequente inativação de NtrC. O regulon NtrC já foi estabelecido em estudos anteriores para diversos organismos, incluindo Escherichia coli, Sinorhizobium meliloti e Pseudomonas putida. Esses estudos mostraram a função global regulatória de NtrC nesses organismos e sugerem que esse ativador está envolvido na expressão de genes relacionados a transporte e catabolismo de compostos nitrogenados, assim como na regulação central de redes metabólicas. Em A. brasilense, NtrC atua como ativador transcricional de glnBglnA, glnZ e outros operons envolvidos em assimilação de nitrogênio. Em baixo nitrogênio, a transcrição de glnB aumenta em cinco vezes através da ação de NtrC e de maneira dependente do promotor sigma 54 de glnB. Além disso, GlnB é capaz de modular sua própria expressão, uma vez que controla a atividade de NtrB e, consequentemente, NtrC. GlnB uridililada é essencial para a atividade de NifA, ativador trancricional dos genes nif. Essa regulação é independente de NtrC, pois mutantes ntrC são capazes de fixar nitrogênio. NtrC também regula glnZ, que tem sua expressão aumentada sob limitação de nitrogênio. Em A. brasilense, GlnZ não está envolvido na atividade de NtrB-NtrC, contrário ao que ocorre em E. coli. O metabolismo geral do nitrogênio em A. brasilense compreende uma cascata complexa e não totalmente elucidada. O objetivo deste trabalho é utilizar uma abordagem proteômica e metabolômica para avaliar a resposta de A. brasilense FP2 e seu mutante ntrC cultivados em baixo e alto amônio, a fim de elucidar possíveis novos alvos de NtrC. Foi possível obter uma lista de proteínas que respondem ao baixo amônio na estirpe selvagem e mutante, possibilitando uma melhor compreensão da regulação do metabolismo de nitrogênio nesse organismo e também definir novos alvos de NtrC. Foi sugerida a participação de NtrC na resposta a estresse oxidativo e na capacidade de promoção de crescimento em plantas, especialmente para os parâmetros relacionados à raíz. Palavras-chave: Azospirillum brasilense. PII. Sistema ntr. Nitrogênio. NtrC. FP2. Abstract: The Azospirillum genus includes free-living microrganisms able to colonize and promote the growth of important cereals and grasses, such as maize, sorghum, wheat, rice and oat. Azospirillum is able to fix nitrogen in association with plant roots and transfer to plant part of the N fixed (about 10% of the plant needs). Among 16 Azospirillum species described, Azospirillum brasilense is the most studied. The ntr system regulates nitrogen metabolism in A. brasilense, including nitrogen fixation. This system is composed of the proteins encoded by the genes glnD, glnB, glnZ, ntrB and ntrC. The GlnD protein is able to sense intracellular glutamine and acts as an uridylyltransferase/uridylyl-removing enzyme (UTase/UR) in response to nitrogen levels. Under limiting nitrogen conditions, GlnD adds uridylyl groups (UMP) to the PII proteins, GlnB and GlnZ, in the presence of ATP and 2-oxoglutarate. Uridylylated GlnB cannot interact with the histidine kinase NtrB, which, in its free form, is able to phosphorylate NtrC. NtrC is an enhancer binding protein that controls the transcription of nitrogen regulated promoters, in a sigma 54 (RpoN) factor dependent manner. NtrB and NtrC compose a two-component system in which NtrB is capable of phosphorylating NtrC when nitrogen levels are low. On the other hand, the presence of nitrogen results in dephosphorylation and subsequent inactivation of NtrC. Previous studies defined the NtrC regulon for a number of organisms, including Escherichia coli, Sinorhizobium meliloti and Pseudomonas putida. These studies showed the global regulatory function of NtrC in these organisms and suggested that NtrC is involved in the expression of genes related to transport and catabolism of nitrogen compounds, as well as regulation of central metabolic networks. In Azospirillum brasilense, NtrC acts as a transcriptional activator of glnBglnA, glnZ and other operons involved in nitrogen assimilation. In a nitrogen limiting condition, transcription of glnB increased five-fold mediated by the action of phosphorylated NtrC acting at the glnB sigma 54 factor dependent promoter, thus GlnB is able to regulate its own expression, since it controls the activity of NtrB and, consequently, NtrC. Uridylylated GlnB is essential for the activity of NifA, the transcriptional activator of nif genes. This regulation is independent of NtrC, as evidenced by the fact that ntrC mutants are able to fix nitrogen. NtrC also regulates glnZ and its expression is increased under limiting nitrogen. In A. brasilense, GlnZ was not found to be involved in the activity of NtrB-NtrC, in contrast to what occurs in E. coli. The general nitrogen metabolism in A. brasilense comprises a complex and yet not fully elucidated regulatory cascade. The aim of this work was to contrast the proteomic and metabolomic responses in A. brasilense FP2 and its ntrC mutant when grown in high and low nitrogen. The goal was to better understand the nitrogen metabolism regulation in this organism and to also find new targets for the transcriptional activator NtrC. It was determined a list of proteins that respond the low ammonium condition in the wild type and in the mutant, leading to a better understanding of the nitrogen metabolism regulation in this organism and also define new targets for NtrC. It was suggested that NtrC participates in the oxidative stress response and in the ability to promote plant growth, especially for the parameters related to the root.

Orientador : Leonardo Magalhães Cruz Co-orientador : Glaucio Valdameri Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 22/03/2016 Inclui referências : f. 69-87 Resumo: O rápido aumento na população mundial seguido por um aumento de danos ao meio ambiente, traz como consequência uma produção insuficiente para alimentar toda a população. Dessa maneira é essencial que a produtividade agrícola aumente nos próximos anos, tentando reduzir os danos ao meio ambiente. O uso de bactérias promotoras do crescimento vegetal (PGPB) como A. brasilense é uma alternativa e uma realidade na agricultura nos dias de hoje. Entretanto dados moleculares sobre a interação de A. brasilense ainda são escassos. Para entender os mecanismos moleculares envolvidos na interação de A. brasilense e arroz cv. Nipponbare, foi utilizada uma abordagem proteômica livre de gel por LC-MS/MS, além de outras abordagens para caracterizar aspectos específicos dessa interação. A análise proteômica foi realizada em raízes de arroz inoculadas e não inoculadas com A. brasilense FP2, a análise possibilitou identificar um total de 6.158 proteínas, sendo 5.157 proteínas do arroz e 1.001 proteínas de A. brasilense. A colonização pela bactéria nas raízes do arroz modulou a expressão de 171 proteínas, entre essas proteínas de controle do ciclo celular, receptor do tipo quinase e um sensor de Ca2+, essas proteínas estão ligadas a um aumento na proliferação e crescimento celular. A. brasilense FP2 desencadeou uma resposta sistêmica que pode conferir a planta um sistema imune mais robusto, adicionalmente A. brasilense FP2 expressou proteínas ligadas a quimiotaxia, motilidade, biofilme síntese de PHB, auxina e fixação de nitrogênio. Dessa maneira, esse trabalho possibilitou caracterizar aspectos na interação de A. brasilense e arroz que podem proporcionar um melhor entendimento e uso dessa PGPB. Palavras chave - Análise proteômica, LC-MS/MS, arroz, A. brasilense FP2, Oryza sativa, PGPB, Nipponbare. Abstract: The rapid increase of the world’s population followed by increase in environmental damage, results in insufficient production to feed the entire population. Therefore, it is essential that agricultural productivity be increased in the coming years, trying to reduce the environmental damage. Crop inoculation with plant growth promoting bacteria (PGPB), such as A. brasilense, is one alternative applied in agriculture nowadays. However, molecular knowledge of A. brasilense -plant interaction are still scarce. To understand the molecular mechanisms involved in A. brasilense and rice cv. Nipponbare interaction, gel free proteomic approach by LC-MS/MS, and other approaches to characterize specific aspects of this interaction was used. The proteomic analysis was performed on inoculated and non-inoculated rice roots with A. brasilense FP2. The analysis allowed us to identify a total of 6,158 proteins, including 5,157 rice proteins and 1,001 A. brasilense proteins. The bacteria colonizing rice roots were capable to modulate the expression of 171 proteins, such as cell cycle control proteins, kinase receptor and a type Ca2+ sensor. These proteins have been reported to increase cell proliferation and root growth. Taken together, the results showed that A. brasilense FP2 triggered a systemic response that can give the plant a more robust immune system. Additionally, A. brasilense FP2 expressed proteins related to bacterial chemotaxis, motility, biofilm formation, PHB synthesis, auxin and nitrogen fixation. Thus, this work made it possible to characterize molecular aspects of A. brasilense and rice interaction helping better understand the use of this PGPB in agriculture. Keywords – Proteomic Analysis, LC-MS / MS, rice, A. brasilense FP2, Oryza sativa, PGPB, Nipponbare.

Orientador : Prof. Dr. Luciano Fernandes Huergo Co-orientador : Dr. Glaucio Valdameri Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 17/03/2015 Inclui bibliografia Resumo: As proteínas Dps (DNA-binding protein from starved cells) formam uma subfamília particular de ferritinas. Os membros deste grupo possuem uma estrutura tridimensional comum em forma de dodecâmeros esféricos com uma cavidade central oca. Estas proteínas são capazes de armazenar na sua cavidade central ~500 átomos de ferro por dodecâmero. O centro ferro-oxidase é a assinatura mais marcante deste grupo. Ele está localizado na interface entre as subunidades adjacentes e é composto por aminoácidos altamente conservados, onde ocorre a ligação e oxidação do Fe+2 para Fe+3, seguido por sua acomodação no interior da proteína em uma forma não reativa. A proteína Dps de Campylobacter jejuni (CjDps) tem sido relatada por suas inúmeras funções, mas principalmente, por proteger o DNA de radicais hidroxila altamente tóxicos e reativos. A fim de facilitar estudos de caracterização in vitro da proteína CjDps, foi importante estabelecer um protocolo simples e reprodutível para sua purificação. Neste trabalho, foi demonstrado que a temperatura de desnaturação da proteína CjDps nativa (CjDps wt) é de 94,2°C. Esta característica foi utilizada para auxiliar no processo de purificação, estabelecendo-se um protocolo com um prévio tratamento térmico a 80°C seguido de dois passos cromatográficos. Com objetivo de melhor entender o funcionamento da CjDps, também foi utilizada a proteína CjDps H25G/H37G que possui alterações em resíduos conservados localizados no centro ferro-oxidase. Foi observado que a proteína CjDps H25G/H37G tem menor atividade de oxidação de ferro e menor capacidade de ligar metais em relação à proteína selvagem. A proteína CjDps H25G/H37G não apresentou capacidade de ligar DNA nas condições testadas sugerindo que as histidinas H25 e H37 podem ser importantes para ligação ao DNA. Abstract: The Dps (DNA-binding protein from starved cells) proteins form a particular subfamily of ferritins. All members of this group share a commum three-dimensional structure assembled forming spherical dodecamers with a hollow central cavity. These proteins are capable of storing ~500 iron atoms per dodecamer. The ferroxidase center (FOC) is the most remarkable signature of these proteins. The FOC is located at the interface between the subunits and is composed by highly conserved aminoacids that bind Fe+2 and oxidize to Fe+3, followed by the storage of the latter ion into the central cavity of the dodecamer. The Campylobacter jejuni Dps protein is related to various cellular functions, including DNA protection against the highly toxic and reactive hydroxyl radicals. In order to facilitate in vitro characterization studies of CjDps, it is important to stablish a simple and reprodutive protocol for its purification. In this study, it was determined that CjDps has a high melting temperature (94.2°C). This thermal stability was used to facilitate the purification process by the introduction of a thermal treatment at 80°C followed by two chromatographic steps. In order to better understand the function of CjDps, we employed a CjDps H25G/H37G variant, where the conserved histidines at the FOC were substituted to glycines. It was observed that the CjDps H25G/H37G variant had iron oxidation and metal binding activities reduced in comparison to the wild-type protein. This protein variant was not able to bind DNA under the conditions tested suggesting that the histidines H25 and H37 might be important for the CjDps DNA-binding activity.