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Dissertação de Mestrado em Biotecnologia Farmacêutica apresentada à Faculdade de Farmácia The pharmaceutical industry has been suffering from low success rates on the approval of new drugs. One of the main attrition is found in the early clinical development. This problem especially affects new CNS-active medicines. CNS biomarker techniques and inclusion of PD assessments in early clinical trials have a significant potential to reduce the drug development failure rate by providing more robust PK/PD data to support early “go, no-go” decisions to be made.It is extremely important to have well defined PD endpoints to support a certain drug development. Resourceful CNS test batteries are presented, including assessments such as eye tracking measurements, body sway and subjective tests. Pharmaco-EEG concerns the quantitative analysis of the effects of substances on the CNS by means of neurophysiological and electrophysiological methods. The importance of pharmaco-EEG requirements is detailed, namely data acquisition (equipment and procedure) and data processing. The study of this clinical biomarker is complex, as it is affected by a high variability and the translatability is not universal across the spectrum of CNS-active drugs. A comprehensive review of this method, with particular emphasis on psychotropic drugs, is needed for an accurate validation and standardization of this approach in early clinical research.The main area of interest will be the application of this tool in FIH clinical trials. EEG is still one of the cheapest methods that can be used to assess drug effects on brain activity and can easily be included in early-stage studies in healthy subjects. The application of this predictive biomarker is of high interest for early drug development, as it can be used to classify psychotropic drugs, evaluate drug-to-drug interactions, and monitor side effects. Moreover, the use of quantitative methods for data analysis provides a description of the PD effects of active compounds on brain functions, that may be used to study PK/PD relationships.The main objective of this thesis is to provide a state-of-the-art on CNS pharmacodynamic assessments and, specifically, pharmaco-EEG and its application in early-stage studies with CNS-active drugs. A indústria farmacêutica tem vindo a ser afetada pelas baixas taxas de sucesso na aprovação de novos medicamentos. Um dos principais atritos é encontrado na fase inicial de desenvolvimento clínico. Este problema afeta especialmente fármacos ativos no SNC. A inclusão de biomarcadores do SNC e de avaliações farmacodinâmicas na fase inicial de ensaios clínicos têm um potencial significativo para reduzir a taxa de insucesso, fornecendo dados de farmacocinética/farmacodinâmica robustos para suportar decisões acerca da continuação do estudo.É extremamente importante utilizar parâmetros farmacodinâmicos bem definidos para validar o desenvolvimento farmacêutico. Uma bateria de testes indicada para o SNC é apresentada, incluindo avaliações tais como métodos de rastreamento do movimento ocular, oscilação corporal e testes subjetivos. A fármaco-eletroencefalografia inclui a análise quantitativa dos efeitos de fármacos no SNC, através de métodos neurofisiológicos e eletrofisiológicos. A importância de cumprir requisitos específicos aquando da realização do fármaco-EEG é também detalhada, nomeadamente na aquisição de dados (equipamento e procedimento) e processamento de dados. O estudo deste biomarcador clínico é complexo, pois é afetado por uma elevada variabilidade individual e a compatibilidade não é universal em todo o espectro de fármacos direcionados para o SNC. Como tal, é necessária uma revisão abrangente deste método, com particular ênfase nos fármacos psicotrópicos, para uma validação e uniformização desta abordagem na investigação clínica.A principal área de interesse será a aplicação desta ferramenta em ensaios clínicos de entrada no Homem com voluntários saudáveis. O EEG é um método barato para avaliar o efeito de fármacos na atividade cerebral e pode ser integrado de forma viável nestes estudos. A aplicação deste biomarcador preditivo é de grande interesse para o desenvolvimento clínico, uma vez que pode ser utilizado para classificar fármacos psicotrópicos, avaliar interações entre estes, assim como monitorizar os efeitos secundários. Além disso, a utilização de métodos quantitativos para análise de dados fornece uma descrição dos efeitos farmacodinâmicos de fármacos nas funções cerebrais, que podem ser utilizados para estudar a sua farmacologia.O principal objetivo deste trabalho é fornecer um estado da arte sobre avaliações farmacodinâmicas no SNC e, especificamente, a fármaco-EEG e a sua aplicação em ensaios clínicos com fármacos ativos neste sistema.

Relatório de Estágio do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas apresentado à Faculdade de Farmácia A indústria farmacêutica tem vindo a enfrentar inúmeros desafios ao longo do tempo, tendo sempre demonstrado capacidade de se adaptar e desenvolver. Atualmente, a indústria está a atravessar uma fase de profunda transformação científica e tecnológica ao longo das diferentes fases do ciclo de vida do medicamento.Ao longo desta dissertação vão ser discutidas as principais forças impulsionadoras da atual revolução digital na indústria farmacêutica. Os principais tópicos de discussão serão em torno do impacto da inteligência artificial (IA) nas diferentes fases de investigação e desenvolvimento de novos fármacos, assim como as perspetivas do blockchain e do e-commerce nas cadeias de distribuição farmacêutica.Apesar de terem ocorrido vários avanços científicos ao longo dos anos, a investigação e desenvolvimento (I&D) de fármacos continua a ser um processo longo e dispendioso, com uma taxa de insucesso extremamente elevada. Deste modo, várias empresas, particularmente as startups de IA, encontram-se a desenvolver e a implementar modelos que visam a otimização de processos ao longo do desenvolvimento de fármacos.Nas cadeias de distribuição farmacêutica também estão a ser exploradas diferentes tecnologias digitais para fazer face aos problemas atuais. Alguns destes problemas estão relacionados com a falta de confiança e transparência entre os intervenientes. Assim, de forma a enfrentar estes desafios encontram-se atualmente em desenvolvimento diferentes estudos relativamente à aplicabilidade da tecnologia blockchain. Esta tecnologia visa monitorizar as cadeias de distribuição de forma segura e transparente, com o intuito de otimizar processos e minimizar custos operacionais, o erro humano, e práticas fraudulentas. De modo a fazer face às exigências desta transição digital, as empresas farmacêuticas terão de investir em recursos humanos com competências em tecnologias de informação, e encontrar estratégias para ultrapassar o apertado enquadramento regulamentar. Throughout time, the pharmaceutical industry has gone through multiple challenging circumstances and has consistently proven to be capable of adapting and prospering from them. Currently, the industry is going through substantial scientific and technological breakthroughs occurring at various stages of the medicine’s life cycle. The aim of this dissertation is to discuss the main driving forces behind the ongoing digital revolution occurring in the pharmaceutical industry. The main topics of discussion will be regarding the impact of artificial intelligence (AI) across different stages of drug discovery and development, as well as the prospects of blockchain technology and e-commerce in the pharmaceutical supply chain. Although there have been several scientific advances over the last years, the overall process of research and development (R&D) remains very lengthy and costly, with an extremely high failure rate. Therefore, multiple companies, particularly AI-based startups, are developing and applying models to optimize inefficient processes within the whole drug development cycle. In the supply chain, stakeholders are also exploring the use of digital technologies to address common issues. These comprise the lack of trust, transparency, and traceability between stakeholders. Thus, research on the use of blockchain technology is being conducted to address those challenges. The technology is prospected to monitor supply chains securely and transparently, optimizing workflows and reducing operational costs, human mistakes, and fraudulent practices. In order to cope with the demands of this digital transition, pharmaceutical companies will need to invest in IT expertise and find a strategy to overcome their strictly regulated and non-integrated environment.

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia Farmacêutica apresentada à Faculdade de Farmácia Ensaios de fase I são os primeiros estudos farmacológicos em humanos, sem objetivos terapêuticos e frequentemente incluem indivíduos saudáveis administrados com um medicamento experimental ou um placebo. A minimização do risco ao nível mais baixo possível implica a implementação de medidas de segurança, particularmente em estudos pioneiros em humanos com um novo composto sob investigação. O estado de saúde dos participantes e o cumprimento dos critérios de elegibilidade deve ser avaliado no início do estudo, durante o período de triagem, para garantir e proteger o bem-estar de todos os indivíduos. As avaliações de triagem incluem, em geral, a história médica, exame físico, sinais vitais, exames laboratoriais e eletrocardiograma. Em todas as circunstâncias, o investigador é responsável pela vigilância clínica e cuidados médicos. Atualmente, nenhuma diretriz define os intervalos aceitáveis para os principais parâmetros de segurança que permitem a participação de um sujeito saudável em ensaios clínicos de fase I. Pequenos desvios dos intervalos de referência podem ser aceites no contexto de elegibilidade para um ensaio, por não serem necessariamente patológicos. Os parâmetros de segurança escolhidos para elegibilidade e os valores definidos como aceitáveis dependerão sempre do risco do medicamento, considerando os órgãos alvo de toxicidade. Ao longo deste trabalho, será discutido um intervalo de aceitabilidade para sinais vitais e parâmetros do eletrocardiograma de um centro de fase I. Os dados recolhidos de 16 estudos serão utilizados para analisar anormalidades morfológicas do eletrocardiograma no mesmo coorte saudável, fornecendo informações fidedignas acerca da segurança dos participantes. Phase I trials are the first pharmacological studies in humans, without therapeutic objectives and often include healthy subjects administered either an active investigational drug or a placebo. Risk minimization to the lowest possible level implies the implementation of safety measures, particularly in first-in-human studies with a new compound under investigation. The health status of participants and the compliance with the eligibility criteria must be assessed at the beginning of the trial, during the screening period, to ensure and protect the well-being of all subjects. Screening assessments include, in general, medical history, physical examination, vital signs, laboratory tests and electrocardiogram. At all times, the investigator is responsible for the clinical surveillance and medical care. Currently, no guidelines define the acceptable ranges for the main safety parameters used for the participation of a healthy subject in a phase I clinical trial. Minor deviations from the reference ranges may be accepted in the context of eligibility for a trial as they are not necessarily pathological. The safety parameters chosen for eligibility and the values defined as acceptable will always depend on the risk of the drug, considering the target organs of toxicity. Throughout this work, an acceptability range for vital signs and electrocardiogram parameters in one phase I center will be discussed. Data collected from 16 studies will be used to analyze electrocardiogram morphological abnormalities in the same healthy cohort, providing reliable information on subjects’ safety.

Relatório de Estágio do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas apresentado à Faculdade de Farmácia O Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas (MICF) na Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra (FFUC) termina com a unidade curricular “Estágio Curricular”. Esta unidade curricular ocupa o segundo semestre do quinto ano, uma vez que visa a concretização de um ou dois estágios e de uma monografia. Deste modo, como optei pela realização de dois estágios curriculares, o presente documento inclui três partes: (1) relatório de estágio em farmácia comunitária; (2) relatório de estágio em indústria farmacêutica e (3) monografia.Primeiramente, é apresentado o relatório do estágio que realizei na Farmácia Cruz, em Cantanhede, sob orientação da Dra. Karina Custódio e com duração de 4 meses. Em seguida, a segunda parte é relativa ao estágio que realizei no departamento de Investigação e Desenvolvimento (I&D) dos Laboratórios Basi, em Mortágua, sob orientação da Dra. Cátia Augusto e com duração de 3 meses. Ambos os relatórios assumem a forma de uma análise SWOT (Strenghts, Weaknesses, Opportunities, Threats).Por último, é apresentada a monografia intitulada “Terapia Molecular na Infeção por HIV – Tendências e Desafios”, realizada sob orientação do Professor Doutor Sérgio Simões. Após contextualização do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) e análise da evolução da epidemia de HIV/SIDA (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida) até à atualidade, é realizada uma revisão da terapêutica anti-HIV existente e das estratégias terapêuticas em estudo e é feita uma análise crítica dos desafios à sua implementação nos países pouco desenvolvidos. The Integrated Master’s in Pharmaceutical Sciences (MICF) at the Faculty of Pharmacy of the University of Coimbra (FFUC) ends with the curricular unit “Curricular Internship”. This curricular unit takes place during the second semester of the fifth year, as it entails completing one or two internships and a monograph. Thus, as two curricular internships were carried out, this document includes three parts: (1) community pharmacy internship report; (2) pharmaceutical industry internship report and (3) monograph.First, the report concerning the internship at Farmácia Cruz, in Cantanhede, under the guidance of Ms. Karina Custódio and with a duration of 4 months, is presented. The document continues with the report on the internship carried out in the Research and Development (R&D) department of Laboratórios Basi, in Mortágua, under the supervision of Ms. Cátia Augusto and lasting 3 months. Both reports take the form of a SWOT analysis (Strenghts, Weaknesses, Opportunities, Threats).This thesis ends with the monograph entitled “Molecular Therapy in HIV Infection – Trends and Challenges”, carried out under the supervision of Professor Sérgio Simões. After contextualizing the Human Immunodeficiency Virus (HIV) and analyzing the evolution of the HIV/AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) epidemic to date, the thesis presents a review of the existing anti-HIV therapy and the therapeutic strategies under research and a critical analysis of the challenges for their implementation in developing countries.

Relatório de Estágio do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas apresentado à Faculdade de Farmácia O presente documento é o fruto do trabalho teórico e prático desenvolvido no âmbito da unidade curricular “Estágio”, integrada, no 2º semestre do 5º ano, no plano de estudos do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas (MICF) da Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra (FFUC). A apresentação, discussão pública e aprovação deste trabalho são condições necessárias para a conclusão do curso e consequente obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. O documento encontra-se dividido em três capítulos. No Capítulo I e no Capítulo II são apresentados, respetivamente, o Relatório de Estágio em Farmácia Comunitária e o Relatório de Estágio em Indústria Farmacêutica. Após uma breve contextualização sobre os locais de estágio e as principais atividades realizadas enquanto estagiária, ambos os relatórios tomam a forma de uma análise SWOT (do inglês, Strengths (Forças), Weaknesses (Fraquezas), Opportunities (Oportunidades), Threats (Ameaças)), sendo feita a apreciação crítica dos estágios. Ademais, no Relatório de Estágio em Farmácia Comunitária é apresentada, ainda, a descrição de três casos práticos ocorridos durante o estágio. Por último, o Capítulo III corresponde à Monografia, intitulada “Oral delivery of siRNA-containing lipid-based nanocarriers: challenges and recent advances”. Na monografia, são discutidas estratégias e abordagens recentemente publicadas na literatura relativas a sistemas nanocarregadores à base de lípidos para a administração oral de pequenas moléculas de RNA de interferência (siRNAs, do inglês small interfering RNAs). The present document is the result of the practical and theoretical work developed within the context of the curricular unit “Internship”, included, in the 2nd semester of the 5th year, in the study plan of the Integrated Master’s Degree in Pharmaceutical Sciences (MICF, from the Portuguese Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas) of the Faculty of Pharmacy of the University of Coimbra (FFUC, from the Portuguese Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra). The presentation, public discussion and approval of this work are required conditions for the completion of the course and consequent obtention of the Master’s degree in Pharmaceutical Sciences. The document is divided in three chapters. In Chapter I and Chapter II, the Community Pharmacy Internship Report and the Pharmaceutical Industry Internship Report are presented, respectively. Following a brief contextualization of the places where the internships took place and of the main activities developed as an intern, both reports take the form of a SWOT (Strengths, Weaknesses, Opportunities, Threats) analysis and a critical appreciation of the internships is made. Additionally, in the Community Pharmacy Internship Report, a description of three case studies which occurred during the internship is also presented. Lastly, Chapter III corresponds to the Monograph, entitled “Oral delivery of siRNA-containing lipid-based nanocarriers: challenges and recent advances”. In the monograph, strategies and approaches recently published in the literature in the field of lipid-based nanocarrier systems for the oral delivery of small interfering RNAs (siRNAs) are discussed.

Tese no âmbito do Doutoramento em Ciências Farmacêuticas, ramo de Tecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra. Solid dispersions are systems where one component is dispersed in a carrier, and the whole system is solid. The solubility, drug release, chemical and physical stability, and in vivo performance of these compositions vary depending on the chemical characteristics of the main components and the physical structure of the composition. Solid dispersions are considered one of the most complex pharmaceutical systems, and an in-depth understanding of their properties is essential to control and modulate product performance. The use of Hot-melt extrusion (HME) to prepare solid dispersions has made it a technology that changed the entire paradigm of the pharmaceutical industry research and manufacturing. It is recognizably able to overcome formulation barriers and tailor drug performance and has been used successfully for already marketed products and many others under development. The enhancement of solubility is the primary use of HME, but others include taste-masking, stabilization of amorphous drugs, and controlled drug delivery. In this work, HME technology was applied in three different scopes, particularly in the solubility enhancement of a poorly soluble compound, in the physical stabilization of an unstable amorphous drug, and in the controlled release of a highly soluble drug in low drug load. A combination of chromatographic (high and ultra performance liquid chromatography (HPLC and UPLC)), microscopic (optical microscopy, polarized light microscopy (PLM), scanning electron microscopy (SEM)), thermal (standard differential scanning calorimetry (DSC), modulated temperature DSC (mDSC), thermogravimetric analysis (TGA), and polarized light thermal microscopy (PLTM)), diffraction (X-ray powder diffraction (XRPD)), and spectroscopic techniques (Raman spectroscopy coupled to confocal microscopy, or in some cases to variable temperature) were used. Dissolution testing and stability studies were as well crucial for the in-depth characterization of the prepared systems. High-throughput screening methods, thermodynamic predictions, and statistical analysis were also of great importance. In this work, a systematic step-by-step methodology for the development of solid dispersions was presented, where thermodynamics, screening approaches, multivariate statistics, and process optimization were combined (Chapter I). It was focused on pharmaceutical development under the Quality by Design principles and practical methods from early development to regulatory approval. The technical and scientific specificities of HME-based formulations were discussed in line with the state of the art of product development and current regulatory guidance. Then, an amorphous solid dispersion (ASD) of Etravirine was prepared to enhance the solubility of this poorly soluble drug (Chapter II). An extensive investigation of the solubilization capacity and physical stability of different compositions was performed, where theoretical predictions, high-throughput screening, and Principal Components Analysis were combined. The dissolution rate was improved more than two times, and the ASD demonstrated to be physically and chemically stable for at least three months, even when stored at accelerated conditions. Although not expected, it was later explained by Raman spectroscopy, where molecular interactions affecting the CN groups of Etravirine were observed. Moreover, Raman's high potential to distinguish solid-state forms was demonstrated, including differentiating amorphous and crystalline states. A different aim of the investigation was described in the Ibrutinib research (Chapter III), where HME was applied to improve the physical stability of the amorphous drug. Although with a high tendency to convert into the most stable crystalline form, stability until at least six months at accelerated conditions was achieved through HME in a very high drug load of 50%. Intermolecular interactions characterized by thermal analysis and Raman spectroscopy involving the α, β unsaturated ketone of ibrutinib supported the physical strength of the prepared systems. This application of HME technology is not common but demonstrated a remarkable interplay between HME, drug loading, polymeric carriers, solid state, and intermolecular interactions that can also be applied to other drugs. Lastly, the well-known technological challenge of controlling the release of a highly soluble drug was overcome through an innovative platform involving HME (Chapter IV). The selected prototype is not standard in the field and consists of microtablets tableted into tablets, where HME is coupled with double compression as downstream processing. Its performance was exhaustively characterized, and near zero-order kinetics for 6 to 8 hours observed on dissolution. The mechanistic drug release was explored through the Weibull function and SEM, and revealed a combination of swelling, diffusion, and erosion. The research performed had several goals, but it is possible to stand out the overcome of formulation barriers, tailoring challenging drug properties through the use of the potentialities of HME. Also important is the contribution to an improved understanding of the complex solid-state characterization of solid dispersions, including physicochemical properties of drugs and formulated systems. However, further efforts and expertise are still required to achieve the purpose of this work. The research identified gaps, challenges, and future areas of study to, finally, take these products - better products - to market. As dispersões sólidas são sistemas em que um determinado componente está disperso num veículo, e o sistema existe no estado sólido. A solubilidade, dissolução do fármaco, estabilidade física e química, e comportamento in vivo destas formulações varia consoante as características químicas dos componentes principais e a estrutura física da composição. As dispersões sólidas são consideradas um dos tipos de sistemas farmacêuticos mais complexo, e a caracterização profunda das suas propriedades é essencial para controlar e modular o comportamento do produto. O uso da extrusão a quente fez com que o paradigma da investigação e fabrico na indústria farmacêutica fosse completamente alterado no que concerne à preparação de dispersões sólidas. Esta tecnologia é reconhecidamente capaz de ultrapassar barreiras de formulação e modular a performance de fármacos, e tem sido utilizada com sucesso em produtos já comercializados e muitos outros em desenvolvimento. A utilização principal da extrusão a quente é a melhoria da solubilidade, mas pode ser também aplicada para mascarar o sabor, estabilizar fármacos amorfos ou para a libertação controlada de substâncias ativas. Neste trabalho, a tecnologia de extrusão a quente foi aplicada em três contextos diferentes, nomeadamente, na melhoria de solubilidade de um fármaco pouco solúvel, na estabilização do estado físico de uma substância amorfa reconhecidamente instável, e na libertação controlada de um composto altamente solúvel e de baixa dosagem. Para isso, foi utilizada uma combinação de técnicas cromatográficas (cromatografia líquida de alta e ultra eficiência (HPLC e UPLC)), microscópicas (microscopia ótica, microscopia de luz polarizada (PLM), microscopia eletrónica de varrimento (SEM)), térmicas (calorimetria diferencial de varrimento convencional (DSC) e com modulação de temperatura (mDSC), análise termogravimétrica (TGA), e microscopia térmica com luz polarizada (PLTM)), difração (difração de raios X de pó (XRPD)), e espectroscópicas (espectroscopia Raman acoplada a microscopia confocal e combinada, em alguns casos, com variação de temperatura). Os ensaios de dissolução e estudos de estabilidade foram também críticos para a caracterização detalhada dos sistemas preparados. Os métodos de rastreio de alto rendimento, os cálculos termodinâmicos e a análise estatística foram também importantes para o sucesso da investigação. Neste trabalho, foi apresentada uma metodologia sistemática passo-a-passo para o desenvolvimento de dispersões sólidas, onde se combinou a termodinâmica, as estratégias de rastreio, a estatística multivariada e a otimização de processos (Capítulo I). O foco foi o desenvolvimento farmacêutico segundo os princípios de Quality by Design e abordagens práticas, desde os primeiros estudos de desenvolvimento até à aprovação regulamentar. As especificidades técnica e científica das formulações baseadas em extrusão a quente foram discutidas, em linha com o estado da arte do desenvolvimento de produtos farmacêuticos e atuais diretrizes regulamentares. Posteriormente, foi preparada uma dispersão sólida amorfa (ASD) de Etravirina, para melhorar a solubilidade deste fármaco considerado pouco solúvel (Capítulo II). Foi feita uma investigação extensiva da capacidade de solubilização e estabilidade física de composições diferentes, onde se combinaram cálculos termodinâmicos, com o rastreio de alto rendimento e a análise de componentes principais. A taxa de dissolução foi melhorada mais de duas vezes, e a dispersão amorfa demonstrou ser física e quimicamente estável por, pelo menos, três meses, mesmo quando armazenada em condições aceleradas de envelhecimento. Este resultado foi explicado posteriormente através da espectroscopia Raman, onde foram observados sinais de interações intermoleculares nos grupos CN da Etravirina. Foi ainda demonstrado o alto potencial da espectroscopia Raman para distinguir diferentes estados sólidos, nomeadamente para diferenciar o estado amorfo do cristalino. Na investigação aplicada ao Ibrutinib (Capítulo III), o alvo da análise foi distinto e a extrusão foi aplicada para melhorar a estabilidade física de um fármaco no estado amorfo. Apesar de apresentar uma tendência elevada para conversão para o estado cristalino mais estável, foi possível atingir seis meses de estabilidade em condições aceleradas através do uso da extrusão a quente, mesmo utilizando uma elevada quantidade de fármaco na formulação, 50%. A análise térmica e espectroscópica permitiu detetar interações intermoleculares na cetona α, β-insaturada do Ibrutinib, que justificam a resiliência física dos sistemas preparados. Esta aplicação da extrusão não é comum, mas permitiu estabelecer uma relação notável entre extrusão a quente, quantidade de fármaco, excipientes, estado físico e interações intermoleculares, que poderão ser aplicadas a outros compostos. Por último, um conhecido desafio da tecnologia farmacêutica - a libertação de um fármaco muito solúvel em baixa dosagem - foi também ultrapassado, através da criação de uma plataforma tecnológica inovadora baseada na extrusão a quente (Capítulo IV). O protótipo selecionado não é considerado padrão na área, e consiste em microcomprimidos num comprimido, onde a extrusão é acoplada a jusante a uma dupla compressão. O comportamento deste sistema foi exaustivamente caracterizado, tendo-se observado, em dissolução, uma cinética próxima de ordem-zero durante 6 a 8 horas. O mecanismo de libertação foi também explorado através da função de Weibull e SEM, revelando a combinação de intumescimento, difusão e erosão. A investigação realizada teve vários objetivos, destacando-se a transposição de barreiras de formulação, através da modulação de fármacos difíceis recorrendo às potencialidades da extrusão a quente. Não menos importante, contribuiu para uma melhor compreensão da caracterização complexa do estado sólido de dispersões sólidas, incluindo propriedades físico-químicas de fármacos e seus sistemas formulados. No entanto, ainda se verifica a necessidade de esforço e especialização adicionais, de modo que seja atingido o desígnio deste trabalho. Foi possível identificar lacunas, desafios e eventuais áreas de investigação futura para, finalmente, levar os produtos - melhores produtos - até ao mercado. Bluepharma - Indústria Farmacêutica, S.A. (Portugal)

Relatório de Estágio do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas apresentado à Faculdade de Farmácia The discovery of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), an adaptive defence system for bacteria against viral infections, allowed the creation of a technology called CRISPR/Cas9 system that came to revolutionize genome editing technologies. This system has stood out due to its versatility, simplicity and efficiency in genetic manipulation. Research carried out over the past few years has proven the usefulness and potential of this technology for therapeutic applications, particularly in gene therapy. The potential of the CRISPR/Cas9 system has been progressing thanks to the increasingly detailed knowledge of the mechanisms of this system and the genome editing strategies used. However, there are still many challenges that have to be overcome in order for this technology to be considered safe and effective in the treatment of many pathologies. The discovery of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), an adaptive defence system for bacteria against viral infections, allowed the creation of a technology called CRISPR/Cas9 system that came to revolutionize genome editing technologies. This system has stood out due to its versatility, simplicity and efficiency in genetic manipulation. Research carried out over the past few years has proven the usefulness and potential of this technology for therapeutic applications, particularly in gene therapy. The potential of the CRISPR/Cas9 system has been progressing thanks to the increasingly detailed knowledge of the mechanisms of this system and the genome editing strategies used. However, there are still many challenges that have to be overcome in order for this technology to be considered safe and effective in the treatment of many pathologies. A descoberta de Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), um sistema de defesa adaptativo de bactérias contra infeções virais, permitiu a criação de uma tecnologia denominada sistema CRISPR/Cas9 que veio revolucionar as tecnologias de edição do genoma. Este sistema tem-se destacado devido à sua versatilidade, simplicidade e eficiência na manipulação genética. As investigações realizadas ao longo dos últimos anos têm vindo a comprovar a utilidade e o potencial desta tecnologia para aplicações terapêuticas, particularmente na terapia génica. O potencial do sistema CRISPR/Cas9 tem vindo a progredir graças ao conhecimento cada vez mais pormenorizado dos mecanismos deste sistema e das estratégias de edição do genoma utilizadas. Existem, no entanto, ainda muitos desafios que têm de ser superados para que esta tecnologia possa ser considerada segura e eficaz no tratamento de muitas patologias. A descoberta de Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), um sistema de defesa adaptativo de bactérias contra infeções virais, permitiu a criação de uma tecnologia denominada sistema CRISPR/Cas9 que veio revolucionar as tecnologias de edição do genoma. Este sistema tem-se destacado devido à sua versatilidade, simplicidade e eficiência na manipulação genética. As investigações realizadas ao longo dos últimos anos têm vindo a comprovar a utilidade e o potencial desta tecnologia para aplicações terapêuticas, particularmente na terapia génica. O potencial do sistema CRISPR/Cas9 tem vindo a progredir graças ao conhecimento cada vez mais pormenorizado dos mecanismos deste sistema e das estratégias de edição do genoma utilizadas. Existem, no entanto, ainda muitos desafios que têm de ser superados para que esta tecnologia possa ser considerada segura e eficaz no tratamento de muitas patologias.

Relatório de Estágio do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas apresentado à Faculdade de Farmácia Vírus oncolíticos são agentes vivos e replicativos que são administrados em humanos com ointuito de infetar as células cancerígenas. Resultante da infeção podemos ter a morte celulardevido à replicação viral e/ou devido à eliminação pelo sistema imunológico. A grandevariedade de vírus representa uma oportunidade infinita de possíveis combinações de vírusoncolíticos geneticamente modificados. Nesta revisão é apresentada uma abrangente seleçãode algumas das modificações genéticas que têm sido empregues no desenvolvimento de vírusoncolíticos para fins terapêuticos contra o cancro. A aplicação desta terapêutica em ensaiosclínicos tem demonstrado resultados promissores à sua implementação como complementoà terapêutica contra o cancro. Apesar de inúmeros avanços da investigação na área do cancro,a necessidade de uma terapêutica eficaz e seletiva permanece como o objetivo de ouro parao doente. Razão pela qual os vírus oncolíticos despertaram o interesse, podendo colmatar asnecessidades existentes atualmente na terapêutica contra o cancro.Palavras-chave: vírus oncolíticos, cancro, engenharia genética, imunoterapia.Oncolytic viruses are living and replicative agents that are administered in humans to infectcancer cells. Resulting from the infection we may have cell death due to viral replication and/ordue to elimination by the immune system. The wide variety of viruses represents an endlessopportunity for possible genetically modified combinations of oncolytic viruses aiming atimproving their therapeutic effects in oncology. This review exposes a comprehensiveselection of some of the most frequent genetic modifications that have been used in thedevelopment of oncolytic viruses. The application of this therapy in clinical trials has shownpromising results for its implementation as a complement in the fight against cancer. Despitenumerous advances in cancer research, the need for effective and selective therapy remainsthe golden goal for the patient. That is why oncolytic viruses have raised the interest and mayfulfill the needs that exist today in cancer therapy.Keywords: oncolytic viruses, cancer, genetic engineering, immunotherapy. Vírus oncolíticos são agentes vivos e replicativos que são administrados em humanos com ointuito de infetar as células cancerígenas. Resultante da infeção podemos ter a morte celulardevido à replicação viral e/ou devido à eliminação pelo sistema imunológico. A grandevariedade de vírus representa uma oportunidade infinita de possíveis combinações de vírusoncolíticos geneticamente modificados. Nesta revisão é apresentada uma abrangente seleçãode algumas das modificações genéticas que têm sido empregues no desenvolvimento de vírusoncolíticos para fins terapêuticos contra o cancro. A aplicação desta terapêutica em ensaiosclínicos tem demonstrado resultados promissores à sua implementação como complementoà terapêutica contra o cancro. Apesar de inúmeros avanços da investigação na área do cancro,a necessidade de uma terapêutica eficaz e seletiva permanece como o objetivo de ouro parao doente. Razão pela qual os vírus oncolíticos despertaram o interesse, podendo colmatar asnecessidades existentes atualmente na terapêutica contra o cancro.Palavras-chave: vírus oncolíticos, cancro, engenharia genética, imunoterapia.Oncolytic viruses are living and replicative agents that are administered in humans to infectcancer cells. Resulting from the infection we may have cell death due to viral replication and/ordue to elimination by the immune system. The wide variety of viruses represents an endlessopportunity for possible genetically modified combinations of oncolytic viruses aiming atimproving their therapeutic effects in oncology. This review exposes a comprehensiveselection of some of the most frequent genetic modifications that have been used in thedevelopment of oncolytic viruses. The application of this therapy in clinical trials has shownpromising results for its implementation as a complement in the fight against cancer. Despitenumerous advances in cancer research, the need for effective and selective therapy remainsthe golden goal for the patient. That is why oncolytic viruses have raised the interest and mayfulfill the needs that exist today in cancer therapy.Keywords: oncolytic viruses, cancer, genetic engineering, immunotherapy.

Relatório de Estágio do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas apresentado à Faculdade de Farmácia Este trabalho está dividido em três partes: Dois relatórios de estágio (Parte I e II) ambos com uma análise SWOT identificativa dos pontos fortes, pontos fracos, ameaças e oportunidades encontradas ao longo do período de estágio. A primeira parte refere-se ao estágio em Assuntos Regulamentares de produtos cosméticos na BasePoint Consulting Services e a segunda parte refere-se ao estágio em farmácia comunitária, na Farmácia da Estação. Na terceira e última parte (Parte III) encontra-se a monografia intitulada “Células T CAR e novas abordagens terapêuticas: terapia combinada com vírus oncolíticos e células NK” que fala sobre: A capacidade de as células imunológicas atingirem e eliminarem organismos infeciosos e invasores é estudada há várias décadas. As terapias com células adotivas que expressam recetores de antigénio quiméricos (CAR) geraram muito interesse e investimento nos últimos anos devido aos resultados clínicos sem precedentes. No entanto, a natureza autóloga (específica do paciente) dessa terapia celular, os complexos processos de produção e o risco de doença do enxerto contra o hospedeiro (graft versus host disease (GVHD)) suscitaram preocupações sobre o seu custo e segurança. Da mesma forma, a obtenção de linfócitos suficientes de um doente, muitas vezes com linfodepleção pode representar uma barreira para garantir quantidades clinicamente relevantes de células T CAR. Devido a essas limitações, os investigadores estão a estudar os vírus oncolíticos em terapia combinada, especialmente o adenovírus (Ad) e as células natural killer (NK) como alternativas viáveis e que ofereçam mais segurança, resultados positivos e menos efeitos indesejáveis nos pacientes. This work is divided into three parts: Two internship reports (Part I and II) both with a SWOT analysis identifying the strengths, weaknesses,threats and opportunities found throughout the internship period. The first part refers to the internship in Regulatory Affairs of cosmetic products at BasePoint Consulting Services and the second part refers to the internship in community pharmacy, at Farmácia da Estação. In the third and last part (Part III) there is the monography entitled “CAR T cells and new therapeutic approaches: combined therapy with oncolytic viruses and NK cells” that talks about: The ability of immune cells to target and eliminate infectious and invading organisms has been studied for several decades. Adoptive cell therapies that express chimeric antigen receptors (CAR) have generated a lot of interest and investment in recent years due to unprecedented clinical results. However, the autologous (patient-specific) nature of this cell therapy, the complex production processes and the risk of graft versus host disease (GVHD) raised concerns about it cost and safety. Likewise, obtaining enough lymphocytes from a sick person, often with lymphodepletion, can represent a barrier to ensure clinically relevant amounts of CAR T cells. Because of these limitations, researchers are studying oncolytic viruses in combination therapy, especially adenovirus (Ad) and natural killer cells (NK) as viable alternatives that offer higher safety, improved efficacy and less undesirable effects on patients.

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia Farmacêutica apresentada à Faculdade de Farmácia Os medicamentos de terapia avançada são um tema de grande destaque da atualidade no setor da Indústria Farmacêutica. O seu caráter inovador tem sido relacionado com novas abordagens terapêuticas e patologias limitantes ou fatais, para as quais, não existia no mercado nenhum tratamento eficiente.Um exemplo são as células CAR-T (Chimeric Antigen Receptor T Cells). Estas surgem como uma abordagem disruptiva no tratamento de patologias com altas taxas de recidivas. Deste tipo foram já aprovados o Yescarta (Axicabtagene ciloleucel) e o Kymriah (Tisagenlecleucel). O Tisagenlecleucel foi o primeiro medicamento com células CAR-T a receber aprovação, em 2017, da U.S. Food & Drug Administration para o tratamento de Leucemia Linfoblástica Aguda percussora de células B refratária ou com mais do que duas recidivas em crianças e jovens adultos até aos 25 anos. Em 2018, este medicamento recebeu a segunda indicação, ao ter sido indicado para adultos com linfoma de grandes células B, refratário ou com recidiva após duas ou mais linhas de terapia sistémica. De igual forma, o Tisagenlecleucel também se encontra aprovado pela Agência Europeia do Medicamento (EMA), tendo obtido aprovação em 2018 para as mesmas duas indicações acima indicadas.Os medicamentos de terapia avançada consistem em medicamentos biológicos com base em células retiradas do doente e de seguida, estas são devidamente modificadas em laboratório, sendo posteriormente difundidas no mesmo doente, de modo a potenciar a resposta imune. Devido a sua complexidade, tanto no mecanismo de ação como no método de produção, é necessário existirem, a nível regulamentar, meios que permitam a sua correta produção e utilização assim como, metodologias que assegurem a segurança após Autorização de Introdução no Mercado (AIM).Recorrendo à informação existente, regulamentar e científica, no presente trabalho são apresentados orientações e requisitos de qualidade para a produção e controlo de medicamentos de terapia avançada com base em células T geneticamente modificadas. É dado especial relevo ao medicamento Kymriah embora quase em simultâneo tenha sido também autorizado o Yescarta. São abordados requisitos de qualidade, desde a adequada recolha de células do doente, a utilização de vetores virais recombinantes para a inserção de genes nas células T obtidas e o processo de apara a sua modificação. Inclui também a avaliação de risco ambiental no contexto específico da libertação deliberada de organismos geneticamente modificados (OGM).Inclui toda a informação relevante na caracterização dos riscos, nomeadamente na enumeração e análise de medidas de gestão e mitigação de risco que devem ser aplicadas com o objetivo de alcançar a qualidade, a segurança e eficácia de longo prazo. Os riscos identificados devem ser devidamente caracterizados e controlados devido à curta duração da sua Autorização de Introdução no Mercado e ao facto de ser um medicamento biológico, com características e propriedades específicas. Advanced therapy medicinal products (ATMP) are an important topic today for the Pharmaceutical Industry sector. Its innovative character has been related to new therapeutic approaches and limiting or fatal pathologies, for which no efficient treatment existed on the market.One ATMP example are those composed of CAR-T cells (Chimeric Antigen Receptor T Cells). These emerge as a disruptive approach in the treatment of pathologies with high relapse rates. Two CAR-T Cell ATMP, Yescarta (Axicabtagene ciloleucel) and Kymriah (Tisagencleucel), have already been approved. Tisagencleucel was the first CAR-T cell medicinal product to receive approval in 2017 from US Food & Drug Administration for the treatment of refractory B-cell percursor Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) with more than two relapses in children and young adults to 25 years. In 2018, this product received the second indication as it was extended to adults with refractory or relapsed B-cell Lymphoma after two or more lines of systemic therapy. Similarly, Tisagencleucel is also approved by the European Medicines Agency (EMA) in 2018.and was approved for the same indications as above.Advanced therapy medicinal products consist of biological products where T cells are taken from the patient and then appropriately modified in the laboratory and then diffuse into the same patient to enhance the immune response against the selected epitope. Due to their complexity, both in the mechanism of action and in the production method, it is necessary, at a regulatory level, to establish methodologies for its correct production and use, as well to ensure their continuous safety after marketing authorization (AIM).Using existing regulatory and scientific information, this master’s thesis presents guidelines and quality requirements for the production and control of advanced therapy medicinal products based on genetically modified autologous T-cells. Special emphasis is given to the drug Kymriah although almost simultaneously Yescarta has also been authorized. Quality requirements are addressed, from adequate collection of patient cells, their genetic modification, use of viral vectors for the transduction of the gene of interest. It also addresses the environmental risk assessment in the specific context of deliberate release of genetically modified organisms (GMOs). It covers all the relevant information on risk characterization, namely enumeration and analysis of risk management and mitigation measures that should be applied to achieve long-term quality, safety and efficacy. The identified risks must be properly characterized and controlled because of the limited experience of their post marketing surveillance and the fact that is a biological medicinal product with specific characteristics and properties.

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia Farmacêutica apresentada à Faculdade de Farmácia Pharmacokinetics is usually referred to as the study of the actions of the body on a drug. It includes four major processes: absorption, distribution, metabolism and excretion. It is highly influenced by several factors, of particular interest when considering the heterogeneity of the world population. This is the reason why pharmacokinetic studies are a critical requirement during drug’s development process. Liver plays an essential role on pharmacokinetics. It is greatly involved in its major processes and it is one of the main organs responsible for the metabolism and excretion of drugs. However, liver function is diminished in some diseases which makes these patients more susceptible to drug toxicity. Choosing an appropriate dosing regimen may be particularly difficult. Furthermore, there are different levels of hepatic impairment and various enzymes involved in the metabolism and excretion of specific drugs which leads to different types of impact on pharmacokinetics. Therefore, patients with hepatic impairment are an important subgroup of the population where pharmacokinetic studies should be thoroughly performed. There are specific guidelines for the conduction of clinical trials specific for this population of patients, aiming to understand and/or quantify that impact.As the burden of liver disease in the world increases and there is a lack of markers for characterizing hepatic function regarding the prediction of drug elimination, the need for scientific development in this field rises as well.The aim of this work is to review the involvement of the liver in the whole pharmacokinetics process and to understand the consequences of liver impairment in this process and its repercussion on drug development and clinical studies. In this context, the regulatory framework of this area will be analyzed both in the perspective of the European Medicines Agency and the Food and Drug Administration. A farmacocinética é normalmente descrita como o estudo das ações de um fármaco no organismo. Inclui quatro processos principais: absorção, distribuição, metabolism e excreção. É altamente influenciada por vários fatores, o que é particularmente interessante considerando a heterogeneidade da população mundial. Esta é a razão pela qual os estudos de farmacocinética representam uma necessidade crítica no desenvolvimento de um medicamento.O fígado tem um papel essencial na farmacocinética. Está envolvido nos seus processos mais importantes e é um dos órgãos principais responsáveis pelo metabolismo e excreção de fármacos. No entanto, a função do fígado encontra-se diminuída em algumas doenças, o que torna estes sujeitos mais suscetíveis a toxicidade medicamentosa. Escolher um regime de dose apropriado pode ser particularmente difícil. Além disso, existem vários níveis de insuficiência hepática e várias enzimas envolvidas no metabolismo e excreção de certos fármacos, o que resulta em diferentes níveis de impacto na farmacocinética. Assim, doentes com insuficiência hepática são um subgrupo importante a onde estudos farmacocinéticos devem ser conduzidos. Existem guidelines específicas para a realização deste tipo de ensaios e para esta população de doentes, cujo objetivo é compreender e/ou quantificar este impacto. Com o aumento do peso das doenças hepáticas no mundo e a falta de marcadores para a caracterização da função hepática com a capacidade de prever a eliminação de fármacos, uma necessidade de desenvolvimento científico também cresce. O objetivo deste estudo é rever o envolvimento do fígado em todo o processo da farmacocinética e compreender as consequências da insuficiência hepática no mesmo e a sua repercussão no desenvolvimento de fármacos e ensaios clínicos. Neste contexto, o enquadramento regulamentar também será analisado, tanto da perspetiva da European Medicines Agency como da Food and Drug Administration.

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia Farmacêutica apresentada à Faculdade de Farmácia A Doença Renal Crónica e a Doença Renal Aguda são um problema comum de saúde pública uma vez que são fatores de risco para doenças associadas que aumentam a morbilidade e mortalidade a nível mundial. O aumento do número de doentes com doenças renais continua a aumentar, consequentemente, os custos de saúde associados à deteção, prevenção e gestão da doença e de complicações subsequentes, tanto ao doente como aos sistemas de saúde também aumentam. A insuficiência renal afeta, de forma imprevisível, a farmacocinética dos fármacos em todos os processos, absorção, distribuição, metabolismo e excreção. Não obstante, há falta de evidência das alterações na farmacocinética tanto em pacientes com doença renal crónica como em pacientes com doença renal aguda. As doenças renais são muito heterogéneas, variando na causa, gravidade e outcomes clínicos nas estruturas renais. Cada condição apresenta diferentes tratamentos e diferentes métodos de otimização de dose. O desenho de doses adequadas para doentes com insuficiência renal constitui um desafio clínico uma vez que depende de uma caracterização correta do perfil farmacocinético do fármaco e da avaliação da função renal. Isto torna difícil o desenvolvimento de guidelines padrão para a modificação correta da dose. Um ajuste de dose incorreto expõe o doente a doses sub- ou supra-terapêuticas e, consequente, à falta de resposta terapêutica ou à acumulação tóxica do fármaco e/ou de seus metabolitos e consequentes reações adversas. Um ajuste de dose adequado visa maximizar o efeito terapêutico, minimizar efeitos tóxicos e evitar custos desnecessários ao doente e aos sistemas de saúde. As estratégias de ajuste de dose devem ser analisadas caso-a-caso devido à falta de informação específica sobre a variabilidade individual e à heterogeneidade da doença. A informação disponível relativa ao tratamento de doentes com insuficiência renal é limitada uma vez que a condução de ensaios clínicos nestes doentes é trabalhosa e dispendiosa. Por forma a aumentar a esperança média e a qualidade de vida doente através da medicina personalizada e da prescrição adequada de fármacos, é necessário preencher as lacunas existentes nesta área. Chronic Kidney Disease and Acute Kidney Injury are a worldwide problem of public health and represent major kidney-related diseases that contribute to increased mortality and morbidity. The growth in the number of patients with kidney disease increases healthcare costs related to the detection, prevention and management of the disease and associated comorbidities to patients, families and health systems. Kidney impairment may affect the pharmacokinetics of a drug in each of its processes: absorption, distribution, metabolism or excretion in an unpredictable way. Moreover, there is insufficient evidence of the changes that occur in drugs pharmacokinetics in patients with chronic or acute kidney disease. Kidney diseases are very heterogeneous, varying in cause, severity and effects on the kidney structures. Each condition has different treatments and, therefore, different preferential approaches to optimize drug therapy. Designing optimal doses for renal impaired patients is still a challenge because it depends of an accurate characterization of pharmacokinetic parameters and on the assessment of kidney function. This fact challenges the development of standardized guidelines to properly adjust drug dosage. Failure to accurately adjust a dosing regimen can predispose the individual to both under- or over-dosing leading to lack of therapeutic effects or accumulation of parent drug and/or its metabolites that may lead to the occurrence of toxicity and adverse drug reactions. Appropriate dosing in renal impaired patients is needed to maximize therapeutic effect, minimize toxic effects and avoid unnecessary expenses to the patient and to healthcare systems. Due to lack of specific information on individual variability and disease heterogeneity, strategies to dosage adjustment should be analyzed in a case-by-case basis. Available information regarding treatment of patients with renal impairment is limited because conducting clinical trials in these patients is challenging and costly. Nowadays, there is an urgent need to fill the gaps to better personalize medicine and drug prescription to improve patient’s life expectancy and quality of life.

Relatório de Estágio do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas apresentado à Faculdade de Farmácia Community Pharmacy, in what concerns to Europe, is a key part of the professional pathway of the pharmacist. In agreement with this concept, to graduate in Pharmaceutical Sciences one must complete a minimum of 810 hours of internship in a community pharmacy. After this internship, the first part of this document was developed reporting every experience, from the 3rd of January to the 1st of June 2018, according to the SWOT Analysis model in which the Strengths, Weaknesses, Opportunities and Threats experienced throughout this semester are compiled, adding a summary of the most common Clinical Situations faced in the same period.Lean Six Sigma is a path to improve processes with a very widespread implementation in manufacturing sectors. Currently, there are many articles available about the generic concept, as well as on the implementation of this strategy to several manufacturing sectors such as automobile and electric components production. However, when considering pharmaceutical manufacturing, literary sources on its methods and results are not so abundant and the ones available are detail focused without providing a global approach to the subject. Therefore, the purpose of this paper is to bring better understanding of Lean Six Sigma, approaching some key aspects such as: definition of Lean and Six Sigma as two originally independent methodologies; concept and reasons behind the merger of Lean with Six Sigma; the implementation of the three methods to drug manufacturing; some challenges for further implementation of Lean Six Sigma in the sector and other topics. Can Lean Six Sigma be the right way to reach better medicine production? A Farmácia Comunitária, no contexto europeu, faz parte do percurso natural do farmacêutico. A par desta realidade, a formação no Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas, ao nível nacional, inclui um estágio no seio da FC com duração mínima de 810 horas. Após a realização desse estágio, surge a primeira parte deste documento, uma compilação de todas as experiências somadas desde o dia 3 de Janeiro até ao dia 1 de Junho de 2018, sob a forma de Análise SWOT, ou seja uma análise que expõe as Forças (Strengths), as Fraquezas (Weaknesses), as Oportunidades (Opportunities) e as Ameaças (Threats), com a adição dos Exemplos Clínicos que surgiram mais frequentemente no decorrer do último semestre. Lean Six Sigma constitui uma filosofia de aperfeiçoamento de processos, cuja implementação já foi efetivada em múltiplos segmentos industriais. Atualmente, estão disponíveis vários artigos científicos sobre o seu conceito transversal, assim como a sua aplicação em casos particulares como a produção de automóveis e de componentes elétricos. Em contraste, a informação relativa à aplicação deste método na indústria farmacêutica é escassa e aquela que existe é centrada em casos particulares, não conferindo uma abordagem global da temática. Assim sendo, esta monografia tem como objetivo a revisão do estado da arte sobre a integração de Lean Six Sigma ao nível da indústria farmacêutica, o que implica a abordagem de tópicos essenciais, respetivamente: Lean e Six Sigma como conceitos inicialmente independentes, com posterior fusão; o estado atual da implementação na indústria farmacêutica, desafios a serem ultrapassados, entre outros. Poderemos, então, afirmar que a estratégia empregada pela Lean Six Sigma constitui a chave para uma melhor produção de medicamentos?

Relatório de Estágio do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas apresentado à Faculdade de Farmácia Within the scope of the curricular unit of Curricular Internship of the Master's Degree in Pharmaceutical Sciences of the Faculty of Pharmacy of the University of Coimbra, this document presents, in the form of a SWOT analysis (Strengths, Weaknesses, Opportunities and Threats), the internship report in pharmaceutical industry, regarding the internship at Farmalabor - Produtos Farmacêuticos, SA, from 8th January until 30th March, 2018, and the internship report on community pharmacy, related to the internship at São José Pharmacy, in the period of 2nd April until 5th July 2018. This document also includes the monograph entitled "Non-Biological Complex Drugs: Market and Regulatory Framework"Non-Biological Complex Drugs (NBCDs) are a group of drugs that have emerged as a topic of discussion in the scientific community recently. They differ from both chemically-derived drugs and biological drugs, as they have more difficult to characterize properties and are dependent on the manufacturing process, among other particularities. To date, a number of families have been described as belonging to this category, with the most commonly discussed, in the scientific community, being polymeric micelles, liposomes, glatiramoids, iron carbohydrates and nanocrystals.Currently there are a lot of original NBCDs on the market, and some follow-on products have already been approved. Despite their complexity, they have been approved using the pathway for generic drugs of chemical origin, a strategy that has proven inadequate, in the last years, due to evidence that these follow-on drugs have different efficacy and toxicity profiles. Consequently, different clinical outcomes are obtained when generics are used in substitution to the original, and, as such, this difference in biological behaviour is relevant. The regulatory challenge is to establish pharmaceutical equivalency and bioequivalence with the original drug, which, due to limitations in current analytical techniques, can’t be established as with other drugs. Although regulatory authorities are aware of these difficulties, several authors argue that their actuation has been insufficient, further supporting the existence of a separate approval procedure for these medicinal products, more inter-agency harmonization, among other measures. No âmbito da unidade curricular “Estágio Curricular” do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra, o presente documento apresenta, sob a forma de análise SWOT (Strengths, Weaknesses, Opportunities and Threats), o relatório de estágio em industria farmacêutica, relativo ao estágio na Farmalabor – Produtos Farmacêuticos, S.A., no período de 8 de Janeiro até 30 de Março de 2018, e o relatório de estágio em farmácia comunitária, relativo ao estágio na Farmácia São José, no período de 2 de Abril até 5 de Julho de 2018. Este documento inclui ainda a monografia intitulada “Non-Biological Complex Drugs: Market and Regulatory Framework”. Os ‘Non-Biological Complex Drugs’ (NBCDs) são um grupo de medicamentos que surgiram como tema de discussão na comunidade científica recentemente. Estes diferenciam-se tanto dos medicamentos de origem química como dos medicamentos biológicos, por possuirem propriedades de mais difícil caracterização e por estas serem dependentes do processo de fabrico, entre outras particularidades. Até à data, uma série de famílias têm sido descritas como pertencentes a esta categoria, sendo as mais faladas, na comunidade científica, as micelas poliméricas, os lipossomas, os glatiramoides, os carbohidratos de ferro e os nanocristais.Atualmente existem no mercado bastantes NBCDs originais, tendo também já sido aprovados alguns “genéricos”. Estes, apesar da sua complexidade têm sido aprovados usando a via para genéricos de medicamentos de origem química, estratégia que se tem demonstrado inadequada pelo surgimento, nos últimos anos, de evidências de que estes medicamentos imitadores possuem perfis de eficácia e toxicidade diferentes. Como consequência, resultados clínicos diferentes são obtidos quando são usados os genéricos em vez do original, pelo que esta diferença no comportamento biológico é relevante. O desafio regulamentar consiste em estabelecer equivalência farmacêutica e bioequivalência com o medicamento original, que devido a limitações nas técnicas analíticas atuais não é possível que sejam estabelecidas como com os outros medicamentos. Apesar das autoridades regulamentares estarem a par destas dificuldades, vários autores defendem que a atuação destas tem sido insuficiente, defendendo, adicionalmente, a existência de um procedimento de aprovação distinto para estes medicamentos, mais harmonização entre agências, entre outras medidas.

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia Farmacêutica apresentada à Faculdade de Farmácia Rare diseases have become a topic of substantial interest in recent years. These disorders are usually severe, have a genetic origin and their symptoms are generally expressed at a young age. In most cases, there is no effective treatment for patients with these conditions. Therefore, the search for new therapeutic solutions for these patients has been increasing. Medicinal products used to prevent, diagnostic or treat rare diseases are called orphan drugs. Regulatory authorities, pharmaceutical companies, academic researchers and international organizations have contributed with several efforts to facilitate the development process for these drugs.Despite those accomplishments, clinical research is particularly difficult in rare diseases, as researchers are faced with evident obstacles, such as low disease prevalence, small and heterogeneous patient populations, clinical trials recruitment difficulties and lack of scientific data on this kind of diseases.These demands require the development of novel and rigorous clinical study designs and analyses to assess treatment efficacy properly in small populations. Progresses in genetics and biotechnology can provide important tools to improve clinical trial evaluation methods. The preclinical and clinical development process, regulatory framework and market for orphan drugs will be discussed in this dissertation, as well as some therapeutic approaches for rare diseases. Relevant considerations about some rare diseases and possible future scenarios will be also given. As doenças raras tornaram-se um tópico de grande interesse nos últimos anos. Estas doenças são geralmente graves, têm origem genética e os seus sintomas manifestam-se habitualmente numa idade jovem. Na maioria dos casos, não existe um tratamento eficaz para os doentes com estas condições. Por isso, a procura por novas soluções terapêuticas para estes doentes tem vindo a aumentar. Os medicamentos utilizados para prevenir, diagnosticar ou tratar doenças raras designam-se medicamentos órfãos. As autoridades regulamentares, as empresas farmacêuticas, os investigadores académicos e as organizações internacionais têm feito vários esforços no sentido de agilizar o processo de desenvolvimento destes medicamentos. Apesar destes progressos, a investigação clínica em doenças raras continua a ser particularmente difícil, uma vez que os investigadores se deparam com obstáculos evidentes como a baixa prevalência da doença, uma população de doentes pequena e heterogénea, dificuldades no recrutamento dos ensaios clínicos e a falta de conhecimento cientifico neste tipo de doenças. Estas exigências requerem o desenvolvimento de ensaios clínicos com desenhos novos e rigorosos e métodos de análise que avaliem adequadamente a eficácia do tratamento em populações pequenas. Os avanços na área da genética e da biotecnologia podem oferecer ferramentas importantes para melhorar os métodos de avaliação dos ensaios clínicos. O processo de desenvolvimento pré-clínico e clínico, o enquadramento regulamentar e o mercado dos medicamentos órfãos será discutido nesta dissertação, assim como algumas abordagens terapêuticas para doenças raras. Considerações relevantes sobre algumas doenças raras e possíveis cenários futuros também serão abordados.

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia Farmacêutica apresentada à Faculdade de Farmácia Qualquer pessoa doente é vulnerável, mas existem grupos de doentes especialmente vulneráveis, nomeadamente os grupos etários extremos: crianças e idosos. Estes dois grupos etários são responsáveis por uma elevada dependência de dispositivos médicos em consequência das suas francas limitações. Devem, como tal, ser grupos alvo de investigação clínica, sem que de forma alguma a sua integridade seja comprometida. No entanto, atualmente, poucos dispositivos médicos possuem indicação específica para a população pediátrica, razão pela qual o uso off lable de dispositivos para adultos, sem informações para orientar o uso seguro e efetivo em doentes pediátricos, é muito comum.Para a aprovação de dispositivos médicos com uso pela população pediátrica, os dados provenientes de ensaios clínicos com o dispositivo médico na população adulta podem, em determinadas situações, ser usados na sua totalidade ou parcialmente, através de modelação estatística para suportar a segurança e/ou eficácia do dispositivo médico na população alvo de doentes pediátricos.A decisão sobre quando extrapolar ou não e em caso afirmativo, se a extrapolação é total ou parcial é tomada com base na análise da “árvore de extrapolação”. O processo de desenvolvimento de dispositivos médicos está bem definido desde os ensaios não clínicos e prototipagem, passando pelas duas fases de ensaios clínicos (piloto e pivotal) e terminando com os estudos pós – aprovação.Torna-se agora imperativo que os dispositivos médicos com provável uso na população pediátrica, durante o seu desenvolvimento clínico, sejam também testados nesta população alvo. Any sick person is vulnerable, but there are particularly vulnerable groups: children and elderly people. These two groups are responsible for a high dependence on medical devices because of their major limitations. Therefore, they must be target groups for clinical research, without compromise their own integrity.However, currently, relatively few medical devices are specifically indicated for pediatric population, reason why off label use of medical devices for adults, without information to guide a safe and effective use in pediatrics, is very common.For pediatrics’ medical devices approval, clinical data from adults’ clinical trials can, in certain situations, be used in whole or in part, through statistical modeling to support a safety and/or efficacy of the medical device in the target population.The decision about when to extrapolate or not and, in case of extrapolation, partially or totally, is made considering an analysis of an “extrapolation tree”.Medical devices development process is well defined from non-clinical trials (with animals) and prototyping, through both phases of clinical trials (pilot and pivotal), ending with post-approval studies. Medical devices are divided into 4 Classes: Class I, IIa, IIb, III according to potential risk of causing harm.Since an adult differs a lot from a child, it is imperative that during clinical development of medical devices with potential use in the pediatric population, this target population is also considered and tested.

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia Farmacêutica apresentada à Faculdade de Farmácia O processo de desenvolvimento de medicamentos tem-se tornado cada vez mais extenso, dispendioso e com um elevado número de moléculas a falharem em fases tardias do desenvolvimento clínico. Como consequência, a introdução de novas moléculas terapêuticas no mercado é cada vez menor. Nesse sentido, a farmacogenómica apresenta-se como uma ferramenta útil em investigação clínica, na medida em que permite reduzir o tempo e custo dos ensaios clínicos. Dessa forma, torna-se possível assegurar uma introdução mais rápida de medicamentos no mercado.A farmacogenómica é uma ferramenta que permite auxiliar na compreensão e caracterização, a nível molecular, dos mecanismos fisiopatológicos que levam a diferenças na resposta ao medicamento. A mesma permite estratificar os doentes em subgrupos baseados na sua suscetibilidade para o desenvolvimento de determinada patologia ou resposta à terapêutica. A estratificação de doentes permitirá a condução de ensaios clínicos com menor número de participantes, com simultâneo aumento da taxa de sucesso. Adicionalmente a estratificação permitirá classificar os doentes como tendo benefício clínico, ausência de benefício ou aumento de risco para desenvolvimento de reações adversas, permitindo a decisão sobre terapias mais direcionadas. A farmacogenómica revela-se uma abordagem moderna, mas num estádio ainda muito inicial, sendo necessárias pesquisas adicionais que permitam uma melhor compreensão e otimização do processo. Essencialmente, esta ferramenta poderá traduzir descobertas científicas em decisões terapêuticas assertivas, com consequente melhoria das condições de saúde pública à escala global. O presente trabalho pretende constituir uma revisão bibliográfica, com vista à caracterização do papel e potencial da farmacogenómica na investigação clínica de medicamentos. Adicionalmente, é também objetivo contextualizar o modelo de desenvolvimento clínico, identificando limitações e estratégias de resolução. Drug development is an extensive process which is becomingly increasingly expensive due in part, to the large incidence of molecules failing late in clinical development. The increasing cost has led to fewer novel therapeutic molecules being introduced into the market in recent years. To reverse this trend, the cost and time of clinical trial has to be reduced and to that end, pharmacogenomics appears to be an attractive tool for clinical research. Pharmacogenomics is a tool which is used to understand and characterize, at a molecular level, pathophysiological mechanisms that lead to differences in response to the drug. This allows for the stratification of patients into subgroups based on their susceptibility to the development of a particular pathology or response to therapy. Stratification will divide patients in responders, non-responders and adverse responders and then apply the most adequate therapy accordingly. This will allow clinical trials to be undertaken with fewer participants while achieving higher success rates. Pharmacogenomics can translate scientific findings into assertive therapeutic decisions, with consequent improvement of public health conditions on a global scale. It is therefore of great use for clinical trial, particularly at the early stages of development. Further research is needed to enable better understanding and interpretation of the process. The present work intends to constitute a bibliographical review, with a view to the characterization of the role and potential of pharmacogenomics in the clinical investigation of medicines. In addition, it is also objective to contextualize the clinical development model, identifying limitations and strategies to resolve them.

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia Farmacêutica apresentada à Faculdade de Farmácia Num cenário de crescente internacionalização das relações políticas, sociais e económicas, o setor farmacêutico, que desde há décadas atravessava um conjunto de transformações, contribuiu fortemente para a consolidação de um mercado global mundial. Na viragem para o século XXI, o setor farmacêutico adquiriu nova configuração, para não perder o mercado dos seus produtos cujas patentes já haviam expirado ou estavam em vias de expirar nos próximos anos. Esse processo de reestruturação abrangeu a ampliação do portfólio das indústrias farmacêuticas, que passou a englobar a área de saúde animal. De entre as principais tendências que marcam a atual concorrência e organização produtiva da indústria farmacêutica internacional é possível destacar a crescente pressão e competição dos medicamentos genéricos. Analisando o mercado de medicamentos de uso veterinário na Europa, vemos a possibilidade de introdução do conceito de medicamento genérico de uso veterinário e, em particular, de um medicamento biossimilar imunológico de uso veterinário.Já nos Estados Unidos da América, os animais de companhia, representaram em 2015, 43% do volume de negócios da saúde animal, enquanto os animais de produção representam 47% desse volume e os equinos os restantes 10%. A carne é a fonte de proteína com maior consumo nos EUA. Com base na análise destes dados, pretendemos destacar a importância da utilização de imunológicos nas espécies de animais de produção e abordar a utilização racional dos antibacterianos de uso animal. A utilização de antibióticos em animais pode ser reduzida pelo uso adequado e atempado de medicamentos veterinários imunológicos, resultando num benefício para a saúde animal e consequentemente para a saúde humana. Na perspetiva de introduzir os medicamentos genéricos e biossimilares de uso veterinário, foi feita uma análise regulamentar a nível nacional, europeu e norte-americano.Feita toda a análise regulamentar dos medicamentos veterinários, mostramos o caso específico da vacina da circovirose suína do tipo 2 (PCV2), fazendo uma revisão teórica sobre a doença e abordando aspetos como a história do PCV2, a infeção pelo Circovírus Porcino Tipo 2 e as doenças subjacentes (PCVD), a distribuição geográfica e temporal da doença, a taxonomia, morfologia e organização genómica, a variação genética, patogénese da infeção por PCV2, o diagnóstico, vacinação e produção da vacina, a importância das PCVD na segurança alimentar e na saúde pública. Depois desta exposição, analisamos a forma como introduzir no mercado o conceito de medicamento genérico, biossimilar e imunológico de uso veterinário, partindo das bases regulamentares e explorando as políticas europeias de incentivo à indústria farmacêutica e à vacinação. As vacinas veterinárias desempenham um papel importante na proteção da saúde animal através da prevenção e controlo de doenças epizoóticas graves. Elas também têm um impacto na saúde humana, garantindo alimentos seguros e evitando a transmissão de doenças infeciosas.Por outro lado, são uma ferramenta eficaz para reduzir a necessidade de usar antibióticos em animais, contribuindo assim para a luta contra a resistência antimicrobiana com que o mundo se tem vindo a deparar. Em conclusão, a introdução de medicamentos genéricos, biossimilares e imunológicos de uso veterinário, não só a nível nacional como europeu e mundial vem colmatar uma série de necessidades no âmbito da saúde animal. In a scenario of growing internationalization of political, social and economic relations, the pharmaceutical sector, which has been undergoing a series of transformations for decades, contributed strongly to the consolidation of a global market. At the turn of the 21st century, the pharmaceutical sector has acquired a new configuration so as not to lose the market for its products whose patents have already expired or are about to expire in the coming years. This restructuring process included the expansion of the portfolio of pharmaceutical industries, which now includes the animal health area. Among the main trends that mark the current competition and productive organization of the international pharmaceutical industry, it is possible to highlight the increasing pressure and competition of generic medicines. Analyzing the market for veterinary drugs, we see the possibility of introducing the concept of generic veterinary drug in Portugal and, in particular, a veterinary biosimilar immunological drug. In the United States of America, pet animals accounted for 43% of animal health turnover in 2015, while livestock represented 47% of that volume and equines the remaining 10%. Meat is the most important source of protein in the United States. Based on the analysis of these data, we intend to highlight the importance of the use of immunologics in the species of production animals and address the rational use of antibacterial medical products for animal use. The use of antibiotics in animals may be reduced by the appropriate and timely use of immunological veterinary medicinal products, resulting in a benefit to animal health and consequently to human health.After completing the regulatory analysis of veterinary drugs, we conducted the study on the type 2 porcine circovirus (PCV2) vaccine, doing a theoretical review about the disease and addressing aspects such as the history of PCV2, infection with Porcine Circovirus Type 2 (PCVD), the geographical and temporal distribution of the disease, taxonomy, morphology and genomic organization, genetic variation, pathogenesis of PCV2 infection, diagnosis and vaccination, production of the vaccine and the importance of PCVD in food safety and public health . After this presentation, we analyzed how to introduce the concept of generic, biosimilar and immunological veterinary drug, starting from the regulatory bases and exploring European policies to encourage the pharmaceutical industry and vaccination. Veterinary vaccines play an important role in protecting animal health through the prevention and control of severe epizootic diseases. They also have an impact on human health, ensuring safe food and preventing transmission of infectious diseases. On the other hand, they are an effective tool to reduce the need to use antibiotics in animals, thus contributing to the fight against the antimicrobial resistance that the world has come across. In conclusion, the introduction of generic, biosimilar and immunological veterinary medicines, not only in Portugal but in Europe and word wide is meeting a range of animal health needs.

Relatório de Estágio do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas apresentado à Faculdade de Farmácia Após a aprovação do primeiro inibidor do checkpoint imunitário, a imunoterapia para o cancro tem sido alvo de uma forte ascensão, com o desenvolvimento de diversas estratégias que intervêm na resposta imune anti-tumoral, sendo, hoje, considerada como um dos pilares da terapêutica para o cancro. O sucesso da imunoterapia tem tido como principais responsáveis os inibidores do checkpoint imunitário e distingue-se pela indução de respostas com uma grande durabilidade, para diversos tipos de tumores. Contudo, estes benefícios clínicos não se observam em todos os doentes, fruto da existência de vários mecanismos de resistência inata e adaptativa, que impedem uma resposta inicial à imunoterapia, ou de resistência adquirida, desenvolvida após uma resposta inicial e que conduz à recidiva do doente. Com o intuito de vencer as resistências do tumor ou do seu microambiente à imunoterapia, a imunoterapia combinada preconiza a combinação sinérgica de uma imunoterapia, geralmente um inibidor do checkpoint imunitário, com outra imunoterapia ou com outro tipo de terapêutica (quimioterapia, radioterapia, entre outras), para atuar em diferentes etapas do ciclo cancro-sistema imunitário e, assim, melhorar a sobrevivência de um maior número de doentes. Nesta monografia, irei expor os principais fatores que podem contribuir para a resistência à imunoterapia, qual o raciocínio subjacente às combinações de inibidores do checkpoint imunitário com outras estratégias terapêuticas, quais as combinações já aprovadas e abordarei, ainda, a necessidade da determinação de biomarcadores para a seleção da melhor imunoterapia ou combinação para cada caso, assim como o estabelecimento de parcerias entre empresas resultante do investimento empregue na área da imunoterapia combinada, que se apresenta como o futuro da imunoterapia para o cancro. Since the approval of the first immune checkpoint inhibitor, the cancer immunotherapy has grown strongly with the development of different strategies that act in the cycle cancer-immunity, and, today is considered, as one of the pillars of cancer care. The immune checkpoint inhibitors are the mainly responsible for the success of cancer immunotherapy, which can induce durable responses for a large range of tumour types. Despite of this clinical benefits, not all the patients can achieve them due to mechanisms of innate and adaptive resistance that prevent an initial response to the immunotherapy, or due to mechanisms of acquired resistance that lead to relapse of patients after a period of response. In order to overcome the tumour or the tumour microenvironment resistances, combined immunotherapy advocates the synergic combination between an immunotherapy, generally an immune checkpoint inhibitor, with another immunotherapy or with another cancer therapy (such as chemotherapy, radiotherapy, etc.), to act at different points of the cancer-immunity cycle and, therefore, to improve the survival of a major number of patients.In this monograph, I will expose the main factors that contribute to the resistance to immunotherapy, what is the rational underlying the immune checkpoint inhibitor combinations with other therapeutic strategies, what are the combined immunotherapies that are already approved, and I will also refer the crescent need of determine several biomarkers with the aim of selecting the best immunotherapy or combination for each individual case, as well as the establishment of partnerships between companies as a result of the investment made in the combined immunotherapy area, which is currently seen as the future of the cancer immunotherapy.

Relatório de Estágio do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas apresentado à Faculdade de Farmácia O melanoma constitui o mais raro tumor de pele. Não obstante, apresenta uma taxa demortalidade extremamente elevada com inúmeras dificuldades terapêuticas no que respeita àsatuais estratégias aplicadas no seu tratamento e remissão enumerando-se as de índolefarmacológica e cirúrgica. Decorrente de tal facto urge a necessidade de novos tratamentosque permitam uma superior eficácia relativamente à demonstrada pelas terapêuticasanteriormente evidenciadas.O presente projeto surge como tentativa de resposta a tal solicitação através doenquadramento de trabalhos anteriores nesta particular combinação entre patologia e terapiafotodinâmica. Assim sendo, aliando-se a experiência prévia do presente grupo de investigaçãono campo do conhecimento em referência, estudaram-se quatro novas moléculasfotossensibilizadoras, NAMP 103A, NAMP 103B, NAMP 263A, NAMP 263B, quimicamentedo tipo clorina.Os estudos efetuados foram exclusivamente realizados in vitro, tendo sido primeiramenteaveriguada a citotoxicidade de cada um dos fotossensibilizadores assim como a concentraçãoque em cada caso inibia em 50 % a proliferação celular. A fim de verificar a seletividade doscompostos em trato para as células tumorais efetuaram-se também verificações através da suaaplicação em células fibroblásticas humanas (linha celular não tumoral), HFF1, não se tendoapurado diferenças estatisticamente significativas. Através da aplicação destes compostos, ascélulas tumorais demonstraram diminuições significativas nas suas atividades metabólicas bemcomo de viabilidade, estando tais factos dependentes da concentração de cadafotossenssibilizador. Foi ainda demonstrado que estas ocorrências são consequência do tipode morte celular, fase do ciclo celular em que as células se encontram, alteração dahomeostase mitocondrial, e geração de espécies reativas de oxigénio a nível intracelular.Decorrente dos resultados obtidos é possível inferir que a terapia fotodinâmica constitui umaoportunidade terapêutica cujos efeitos poderão ser diferenciadores no que respeita aosresultados terapêuticos na patologia referida. Melanoma is the rarest skin tumor. Nevertheless, it is related with an extremely high mortalityrate and abundant therapeutic difficulties concerning the current strategies applied in itstreatment and remission, including those of pharmacological and surgical nature. Because ofthis, new treatments are required to allow a higher efficacy than the previously demonstratedtherapies.The present project emerges as an attempt to solve this problem through the framework ofprevious studies in this particular combination of pathology and photodynamic therapy.Therefore, merging the previous experience of the present research group in this field ofknowledge, four new photosensitizer molecules, chemically of the chlorine type were studied,NAMP 103A, NAMP 103B, NAMP 263A, NAMP 263B.The studies performed were only achieved in vitro, with the cytotoxicity of each of thephotosensitizers first being ascertained as well as the concentration which in each caseinhibited cell proliferation by 50 %. To ascertain the selectivity of each photosensitizer tomelanoma cells, each molecule was applied to HFF1 human fibroblast cell line (non-tumor cellline) and results showed that there was no significant difference. Through the application ofthese compounds, the tumor cells demonstrated significant decreases in their metabolicactivities as well as viability, being such facts dependent on the concentration of eachphotosensitizer and it has been shown that these occurrences are a consequence of the typeof cell death, cell cycle phase, the variation of mitochondrial homeostasis, and generation ofreactive oxygen species at the intracellular level.From the obtained results, it is possible to infer that photodynamic therapy constitutes atherapeutic opportunity whose effects may be differentiating with respect to the therapeuticresults in the mentioned pathology.

Relatório de Estágio do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas apresentado à Faculdade de Farmácia O processo de desenvolvimento de novas terapêuticas, cujo foco é o paciente, é desenhado de forma a que se obtenham medicamentos seguros, eficazes e que estes sejam disponibilizados aos doentes num espaço de tempo o mais curto possível. Na sequência da lacuna que se verifica, a nível mundial, entre o desenvolvimento do conhecimento científico e a sua aplicação clínica, os governos e comunidades académicas estão a unir esforços na criação de iniciativas que promovam a aplicação da inovação no desenvolvimento de novas terapêuticas. Visando a contextualização da necessidade de inovação, a primeira parte desta monografia consiste na descrição do processo de desenvolvimento de um medicamento, da legislação aplicada e do estado atual deste processo, abordando aspetos como o investimento realizado, pipelines, áreas de investigação mais desenvolvidas, empresas em destaque e em particular a situação dos ensaios clínicos. De seguida, serão apresentadas algumas das iniciativas estabelecidas para a aceleração do processo de inovação, nomeadamente a Critical Path Initiative, nos Estados Unidos da América, e a Innovative Medicines Initiative, na Europa. Ao longo do trabalho é ainda exposto o caso de uma iniciativa, a DELPhI Initiative, desenvolvida por uma empresa farmacêutica em particular, a Novartis. A abordagem destas iniciativas inclui a descrição do modo como surgiram, bem como a identificação das áreas de atuação definidas em cada uma. The development process of new therapies, whose focus is the patient, is designed to obtain more safe and effective products, that are made available to patients in the shortest time possible. Following the worldwide gap between scientific knowledge and it’s application in the clinical environment, governments and academic communities are combining efforts to create initiatives that promote the application of innovation in the development of new drugs ant therapies. Aiming at contextualizing the need for innovation, the first part of this monograph consists of a description of the development process of a new drug, the regulations associated and the current state of this process around the world, focusing aspects like the investments made by the industries, product pipelines, areas with more investment and the current situation of clinical trials. In the following part, there will be presented some of the initiatives for the implementation of innovation that were created by the regulatory and health authorities, like the Critical Path Initiative, in the United States of America and the Innovative Medicines Initiative in Europe. Throughout the work, is also exposed the particular case of DELPhI, an initiative created by a pharmaceutical company, Novartis. The approach to these initiatives includes the description of how they came about, as well as the identification of the areas of action defined in each one.

Tese de doutoramento em Ciências Farmacêuticas, no ramo de Tecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra Breast cancer remains a major public health care burden, with tremendous impact on society. Therapeutic intervention is often undermined by the intrinsic heterotypic nature of tumors, in which a multitude of cell types intertwine to foster new biological features that support tumor development. Among them, resistance to cornerstone chemotherapies remains pivotal. It has been postulated that cancer stem cells (CSC), a sub-population of stem-like cancer cells exhibiting self-renewal capability and high tumorigenic capacity, have a central role in tumor development, metastization, recurrence as well as drug resistance. In addition, the recent acknowledgement that CSC can originate from non-stem cancer cells (non-SCC) highlighted the need to develop strategies targeting both cell sub-populations. It has been recognized that success requires the identification of compounds that, when combined, lead to synergistic tumor inhibition. However, in vivo application of such protocols is dependent on the ability to deliver the appropriate drug ratio at the tumor level. In this respect, nanotechnology-based delivery platforms, like liposomes, offer an elegant solution for the in vivo translation of such strategy. Modifying drugs’ pharmacokinetics by the co-encapsulation into liposomes enables one to achieve the synchronous temporal and spatial delivery of a drug combination at tumor site. Additionally, the coating of nanoparticles with ligands targeting specific overexpressed receptors would enable the precise delivery of drug combinations into particular cellular sub-populations, such as the CSC, ultimately enabling a gain in terms of efficacy while simultaneously decreasing systemic toxicity. In the present work, it is described the development of a PEGylated liposomal formulation co-encapsulating a combination of doxorubicin (inner aqueous core) and the pro-apoptotic C6-ceramide (liposomal membrane bilayer), capable to target, by a ligand coupled at its surface, both putative breast CSC and non-SCC, besides other tumor cells. The ligand - F3 peptide - enables the specific binding to nucleolin (NCL), a protein overexpressed by cancer cells and endothelial cells of tumor angiogenic blood vessels, promoting active nanoparticle internalization. In addition, a pH-sensitive triggered release mechanism enabling burst release of the cargo upon intracellular delivery, upon endosomal acidification, has also been included. Drug screening has demonstrated that a combination of doxorubicin (DXR):C6-ceramide (C6-Cer) at 1:2 molar ratio interacted synergistically against drug resistant/triple negative MDA-MB-231 breast cancer cells, as well as drug sensitive MDA-MB-435S melanoma cells. F3 peptide-targeted liposomes encapsulating the DXR:C6-Cer 1:2 molar ratio performed similarly as targeted liposomal DXR, encapsulating twice the amount of DXR. Importantly, F3-targeted liposomes encapsulating DXR:C6-Cer 1:2 molar ratio enabled a cell death above 90% at 24 h of incubation against both DXR-resistant and sensitive cells, unattainable by the F3 peptide-targeted liposomal doxorubicin. Furthermore, a F3-targeted formulation encapsulating a mildly additive/antagonistic DXR:C6-Cer 1:1 molar ratio enabled an effect above 90% for an incubation period as short as 4 h, suggesting that delivery route, at the cell level, may shift the nature of drug interaction. Such activity induced a marked cell and nucleus swelling at similar extent, consistent with necrotic cell death. Moreover, it was demonstrated that F3 peptide-targeted liposomes associated with both breast non-SCC and putative CSC, but in higher extent with the latter (2.6- and 3.2-fold for triple negative MDA-MB-231 and luminal-like MCF-7 cells, respectively), in an energy-dependent process. Increased mRNA levels of NANOG and OCT4 transcription factors, paralleled by NCL, were found in putative breast CSC as compared to non-SCC, from triple negative breast cancer cells. Additionally, using mouse embryonic stem cells as stemness bona fide model, it was shown that both NCL mRNA levels and cellular association of F3 peptide-targeted liposomes were dependent on stemness status. In addition, it was demonstrated that triple negative breast NCL+ cells were more tumorigenic than NCL- cells, paralleling putative breast CSC behavior. Furthermore, F3 peptide-targeted triggered-release liposomes promoted the efficient and simultaneous delivery of DXR:C6-Cer combinations into triple negative breast CSCs, enabling extensive cell death. Altogether, the results presented in chapters 2 and 3 of this thesis demonstrated that F3 peptide-targeted intracellular delivery of different DXR:C6-Cer ratios, with diverse drug interactions, enabled a significant increase of efficacy against chemotherapy resistant cells. Additionally, the results suggested a clear link between NCL expression (including cell membrane NCL) and the stem cell-like phenotype, namely in triple negative breast cancer, enabling the simultaneous intracellular delivery of drug combinations-containing liposomes functionalized with the F3 peptide into both CSC and non-SCC. Provided the necessary accessibility to the CSC niche, this technology, combined with the established NCL-mediated targeting of tumor angiogenic blood vessels, has the potential to simultaneously debulk multiple cellular compartments of the tumor microenvironment, while decreasing tumor recurrence and systemic toxicity, ultimately providing long-term disease free survival. O cancro da mama representa um enorme problema de saúde pública com grande impacto na sociedade. A abordagem terapêutica é muitas vezes comprometida pela natureza heterotípica intrínseca dos tumores nos quais diferentes tipos celulares interagem conduzindo o ganho de novas funções biológicas que suportam o desenvolvimento do tumor. Entre outras, a resistência a quimioterapia permanece uma questão central. As células estaminais cancerígenas (CSC) representam uma subpopulação celular com características estaminais com elevada capacidade de renovação e elevado potencial tumorigénico. Estas têm um papel fundamental no desenvolvimento tumoral, metastatização, recorrência, assim como na resistência a fármacos. O facto reconhecido recentemente de que as células cancerígenas não-estaminais (non-SCC) podem dar origem a CSC sublinha a necessidade de se encontrarem estratégias terapêuticas direcionadas simultaneamente a estas subpopulações. O sucesso de uma intervenção terapêutica eficaz poderá estar dependente da identificação de combinações de fármacos capazes de inibir sinergicamente o crescimento tumoral. No entanto, a aplicação de protocolos desta natureza in vivo é dependente da entrega, ao nível do tumor, do rácio de fármacos adequado. Nesse sentido, plataformas nanotecnológicas de entrega de fármacos, como os lipossomas, representam uma abordagem adequada para a translação in vivo daquela estratégia. A alteração da farmacocinética, através da co-encapsulação em lipossomas, permite a entrega da combinação de fármacos de forma sincronizada, espacial e temporalmente, ao nível do tumor. A funcionalização destas nanopartículas com ligandos direcionados a recetores específicos poderia permitir a entrega de uma combinação de fármacos a subpopulações celulares particulares, como as CSC, levando a um aumento da eficácia e, simultaneamente, a uma diminuição de toxicidade sistémica. No âmbito do presente trabalho, é descrito o desenvolvimento de lipossomas PEGuilados, encapsulando uma combinação de doxorrubicina (núcleo aquoso) e C6-ceramida (bicamada lipídica) direcionados, através de um ligando à superfície, às CSC e non-SCC da mama, para além de outras células tumorais. O ligando – peptídeo F3 – reconhece especificamente a nucleolina (NCL), uma proteína abundante em células cancerígenas e células endoteliais de vasos angiogénicos de tumores, levando à internalização ativa da nanopartícula. Foi ainda incluindo um mecanismo de libertação de fármacos sensível ao pH, ativado após internalização seguida de acidificação dos endossomas. Após screening, demonstrou-se que a combinação doxorrubicina (DXR):C6-ceramide (C6-Cer) no rácio molar de 1:2 interagiu sinergicamente contra células cancerígenas da mama MDA-MB-231 (resistentes/triplas negativas), assim como em células de melanoma (MDA-MB-435S) sensíveis a fármacos. Os lipossomas direcionados pelo peptídeo F3, co-encapsulando o rácio molar 1:2 da combinação DXR:C6-Cer foram semelhantes, em termos de eficácia, à DXR lipossomal direcionada pelo mesmo peptídeo e encapsulando o dobro da quantidade desta. Não menos importante, os lipossomas direcionados pelo peptídeo F3 contendo a combinação DXR:C6-Cer 1:2 levaram a uma morte celular acima de 90% após 24 h de incubação em ambas a linhas, o que não se verificou para a lipossomas direcionados contendo apenas DXR. Por outro lado, lipossomas direcionados pelo peptídeo F3, encapsulando a combinação DXR:C6-Cer no ratio molar 1:1 (aditivo/antagonista) conduziram a uma morte celular superior a 90% para um período de incubação de 4 h, sugerindo que a natureza da interação entre fármacos pode mudar com a via de entrada na célula. Tal atividade levou a um aumento do tamanho celular e nuclear, consistente com morte celular por necrose. Adicionalmente foi demonstrado que os lipossomas direcionados pelo peptídeo F3 associavam ativamente com ambas non-SCC e CSC da mama, em maior extensão com estas últimas (2,6 e 3,6 vezes para as linhas MDA-MB-231 e MCF-7 (tipo luminal), respetivamente). Também foram encontrados níveis de mRNA dos fatores de transcrição NANOG e OCT4 aumentados, à semelhança da NCL, nas CSC triplas negativas quando comparadas com non-SCC. Usando células estaminais embrionárias de murganho como modelo bona fide de propriedades estaminais, foi demonstrado que o nível de mRNA da NCL assim como a associação celular de lipossomas direcionados pelo peptídeo F3 era dependente do estado estaminal. Demonstrou-se ainda que células cancerígenas da mama NCL+, triplas negativas, eram mais tumorigénicas do que células NCL-, um comportamento semelhante às CSC. Em paralelo, mostrou-se que os lipossomas direcionados pelo peptídeo F3 promoveram uma entrega eficiente da combinação DXR:C6-Cer em CSC da mama triplas negativas, levando a uma extensa morte celular. Em suma, os resultados apresentados nos capítulos 2 e 3 desta tese demonstraram que a entrega intracelular, direcionada pelo peptídeo F3, de diferentes ratios DXR:C6-Cer conduziu a um aumento relevante da eficácia contra células resistentes à quimioterapia. Ainda, os dados sugeriram uma ligação clara entre a expressão de NCL e o fenótipo estaminal, nomeadamente em cancro da mama triplo negativo, permitindo a entrega intracelular de lipossomas direcionados pelo peptídeo F3 encapsulando combinações de fármacos, a ambas CSC e non-SCC. Assegurada a acessibilidade ao nicho das CSC, esta tecnologia, aliada ao direcionamento para os vasos angiogénicos dos tumores mediado pela NCL já descrito, tem o potencial de atacar múltiplos compartimentos celulares do microambiente tumoral, levando a uma diminuição da recorrência e da toxicidade, potencialmente providenciando um aumento da esperança de sobrevivência a longo termo de doentes com tumores de mama. FCT - SFRH/BD/64243/2009

Relatório de estágio do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas apresentado à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra

Dissertação de mestrado em Biotecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra O principal tratamento para os doentes com esquizofrenia é a medicação psicotrópica, contudo os mecanismos de acção destes medicamentos ainda não são completamente compreendidos. Assim, neste projecto foi realizado o subfraccionamento do proteoma de amostras de cortex prefrontal de ratinhos cronicamente tratados com medicação psicotrópica (Haloperidol, Citalopram e Clozapina). A fracção solúvel foi primeiramente analisada por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa sequencial (LC-MS/MS) e aproximadamente 1500 proteínas foram identificadas no controlo e em cada condição de medicamento. Posteriormente, 489 proteínas foram quantificadas com elevada confiança usando um método quantitativo sem recurso a marcação (SWATH). A clozapina apresentou 39, o citalopram 23 e o haloperidol 19 proteínas diferencialmente reguladas (usando um p < 0.05 e/ou um aumento ou diminuição de 1.5× como limite) e isto pode explicar os diferentes efeitos observados pelos medicamentos revelando diferentes mecanismos de acção. Nas três condições foram encontradas 14 proteínas com p < 0.05 e 3 dessas apresentavam p < 0.01. A maioria das proteínas alteradas estão no metabolismo, embora outros processos relacionados com a esquizofrenia também foram identificados (via apoptótica, imune e homeostase do cálcio). A elevada expressão da proteína CaMKIIα por todos os medicamentos e da proteína EAAT2 em consequência da administração de clozapina, bem como, a diminuição da calretinina pelo uso da clozapina pode ser importante, uma vez que pode ser um mecanismo de compensação na doença. Todas estas descobertas podem abrir novos caminhos estratégicos para o tratamento e prevenção da progressão da esquizofrenia, uma vez que apontam para novas direcções no conhecimento das alterações relacionadas com a doença. Psychotic medication is the main treatment for schizophrenia (SCZ) patients, however their long-term mechanisms of action are not completely understood. Thus, in this project a subproteome fractionation was performed using prefrontal cortex samples of mice, chronic treated with psychotropic drugs (Haloperidol, Citalopram and Clozapine). The soluble fraction were firstly analyzed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and around 1500 proteins were identified in control and each drug condition. Then, 489 proteins were quantified with high confidence using a label free quantitative method (SWATH). The clozapine presented 39, the citalopram 23, and Haloperidol 19 differentially regulated proteins (using a p < 0.05 and/or 1.5 fold change as cut off) and this could explain the different effects observed by the drugs revealed different mechanisms of action. In the three drug conditions 14 proteins presented a p < 0.05 and 3 of them a p < 0.01. The majority of the changed proteins were involved in the metabolism, although other processes related with SCZ were identified (apoptotic, immune pathways and calcium homeostasis). The increased expression of the proteins CaMKIIα by all the drugs and the EAAT2 in consequence of clozapine administration, as well as, the down regulation of the Calretinin by the use of clozapine could be important, once it may be a compensatory mechanism of the regulation in the disease. Altogether, these findings can give new insights of future strategies for the treatment and prevention of the progression of SCZ once it shows new directions for recognizing diseaserelated changes.

Dissertação de mestrado em Biotecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra Drug addiction is a chronic disease which affects millions of people worldwide with critical social and economical impact, besides the health burden. Repetitive exposure to drugs of abuse induces long-lasting neuroadaptative changes that promote drug-seeking behaviors. The causes of vulnerability to addiction, although its complexity, have been pointed to be in association with environmental, social and/or genetic factors. Pharmacogenetics and more recently pharmacogenomics developments with technical genetic resources, such as candidate gene and genome-wide analysis approaches, have played an important role unraveling the possible responsible genetic variants, like SNP or VNTR that may influence the vulnerability or having a protective effect in chemical dependence. Since drug addiction is a complex disease spectrum, genetic results may be seen as contradictory in some studies, but some genetic variants have been proven to be consistently associated to disease. For example, 136A allele of ADH4 gene, coding for alcohol dehydrogenase, has been associated with increased susceptibility to alcohol dependency while the ADH1B*2 variant has shown to confer a protective effect for alcohol dependence. The use of Next Generation Sequencing (NGS) platforms allowing massively parallel sequencing for assessing entire genome in a few days will probably grow, with a widespread use for obtaining a huge amount of genetic information as a powerful tool for deeper understanding and for development of novel therapeutic approaches to drug addiction. A dependência de drogas é uma doença crónica que afecta milhões de pessoas em todo o mundo com impacto social e económico crítico, além do problema de saúde em si. A exposição repetida ao abuso de drogas induz alterações neuroadaptativas duradouras que promovem comportamentos de busca de drogas. As causas da vulnerabilidade para a dependência, apesar da sua complexidade, têm sido apontados para a associação com factores ambientais, sociais e / ou genéticas. A farmacogenética e, mais recentemente desenvolvimentos na farmacogenómica com recursos técnicos genéticos, como as abordagens de gene candidato e genome-wide analysis, têm desempenhado um papel importante para desvendar as possíveis variantes genéticas responsáveis, como SNP ou VNTR que podem influenciar a vulnerabilidade ou ter um efeito protector na dependência química. Como a dependência de drogas é uma doença complexa, os resultados genéticos podem ser considerados contraditória em alguns estudos, mas algumas variantes genéticas têm sido consistentemente associadas à doença. Por exemplo, o alelo 136A do gene ADH4, que codifica para a álcool-desidrogenase, tem sido associado com um aumento da susceptibilidade à dependência do álcool, enquanto a variante ADH1B * 2 demonstrou conferir um efeito protector para a dependência do álcool. O uso de sequenciamento de plataformas de próxima geração (NGS) permitindo sequenciamento paralelo em massa para avaliar o genoma inteiro em poucos dias, irá provavelmente crescer, com um uso generalizado para a obtenção de uma enorme quantidade de informação genética como uma ferramenta poderosa para a compreensão mais profunda e para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para dependência de drogas.

Dissertação de mestrado em Biotecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra O presente trabalho teve como objetivos desenvolver e validar métodos analíticos para quantificação do conteúdo de dois princípios ativos numa formulação tópica e determinação do seu perfil de impurezas. Os métodos analíticos foram desenvolvidos em Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC), com recurso a um método estatístico, desenho de experiências. O desenho de experiências permitiu estudar vários fatores em simultâneo, neste caso, as condições experimentais variáveis do método analítico, e respetivas interações entre esses fatores, bem como identificar os fatores ou interações de fatores que afetavam o cromatograma, facilitando a otimização do método analítico. Os parâmetros avaliados na validação dos métodos analíticos foram a linearidade, especificidade, gama de trabalho, estabilidade das soluções, limites de deteção e quantificação, precisão, exatidão e recuperação. Este trabalho permitirá, em análises futuras de Controlo de Qualidade, identificar e quantificar, simultaneamente, de forma exata e específica dois princípios ativos numa formulação tópica. The aim of this work was to develop and validate analytical methods for assay quantification of two active ingredients in a topical formulation and determination of the impurities profile. The analytical methods were developed in High-Pressure Liquid Chromatography (HPLC) using a statistical method, the design of experiments. The design of experiments allowed: a) the simultaneous study of the influence of several factors (the experimental conditions of the analytical method); b) the determination of the interactions between these factors allowing the identification of the factors or interactions that can affect the chromatogram, facilitating the optimization of the analytical method. The parameters evaluated in the validation of the analytical methods were the linearity, specificity, range, stability of solutions, limits of detection and quantification, precision, accuracy and recovery. This work will allow an accurate and selective identification of two different active ingredients as well as their quantification in a topical formulation, in future analysis of quality control.

Dissertação de mestrado em Biotecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra A cromatografia tornou-se no primeiro método de separação de espécies quimicamente muito semelhantes. Neste contexto, a aplicação da cromatografia líquida (HPLC) na indústria farmacêutica tem vindo a destacar-se pelas suas inúmeras vantagens. Não obstante, a rotina de um laboratório de controlo de qualidade requer análises complexas num curto intervalo de tempo. Desta forma, a transferência de método de quantificação de um produto de HPLC para UPLC tem vindo a destacar-se por esta técnica, UPLC, ser relativamente mais rápida e abranger um maior número de lotes para análise. Com o intuito de uma maior rentabilidade laboratorial, é necessário que os métodos sejam, então, transferidos em HPLC para UPLC. Posteriormente à transferência analítica, é necessário proceder a uma etapa de validação do método em questão. A validação do método analítico garante, através de estudos experimentais, que o mesmo tem a capacidade de desempenho consistente com a aplicação que requer. Desta forma, a validação de um método analítico é fundamental para implementar um sistema de controlo de qualidade em qualquer laboratório analítico. A validação de um método incluiu o estudo de diversos parâmetros definidos pela ICH e pela EP, nomeadamente a seletividade, linearidade, exatidão, precisão, ensaio de adequabilidade do sistema, robustez e estabilidade da amostra e do padrão. Deste modo, o presente trabalho teve como propósito a transferência de um método analítico de quantificação da Cefuroxima em HPLC para UPLC. Foram estudados quais os parâmetros que poderiam ser alterados para obter resoluções entre impurezas conforme os limites especificados. Após a obtenção das condições cromatográficas ideais em UPLC, procedeu-se à validação do método. Foram executados dois métodos analíticos em UPLC: um correspondente ao método de doseamento do princípio ativo e outro correspondente ao método de quantificação de compostos relacionados. Inicialmente avaliou-se se o equipamento utilizado estaria apto a gerar resultados com exatidão e precisão. Uma vez testado, confirmou-se que o sistema era capaz de fornecer dados de qualidade aceitáveis. VIII Os dois métodos demonstraram ser seletivos e específicos para a determinação da Cefuroxima e todos os seus compostos relacionados. Foi ainda demonstrado que, os dois métodos são capazes de gerar resultados linearmente proporcionais à concentração da substância presente na amostra com precisão e exatidão. Os limites de deteção e quantificação, no método de compostos relacionados, são adequados tendo em consideração o âmbito de utilização do mesmo. Assim, o método analítico apresentado demonstrou ser suficientemente sensível para a deteção e quantificação da Cefuroxima e de todas as impurezas a ela associadas. De realçar, também, que após a análise da estabilidade da amostra e do padrão, esta era garantida durante 24 horas e que, apesar de alterações que possam suceder nos parâmetros do método analítico de doseamento do princípio ativo, este é considerado como robusto. Chromatography became the first separation method of chemically similar species. In this context, high pressure liquid chromatography´s application in pharmaceutical industry has come to stand out for its numerous advantages. Nevertheless, the standard procedure of quality control laboratory requires complex analysis in a short period of time. Thus, the transference of HPLC quantification method for UPLC has to stand out since it’s relatively faster and reach a large number of lots for analysis. In order to have great profitability in laboratory, it’s worthwhile that methods are transferred from HPLC to UPLC. However, after analytical transference, a validation step is necessary. Method’s validation ensures that, through experimental studies, it’s capable of being performed with the application that is desired to. Thus, the validation of an analytical method is essential to implement a system of quality control in any analytical laboratory. A method validation included studies of various parameters defined by ICH and EP, namely selectivity, linearity, accuracy, precision, system suitability test, robustness and sample and standard’s stability. Therefore, this study was intended to a transference of an analytical method for Cefuroxime’s quantification from HPLC to UPLC. Parameters that could be changed in order to have impurities’ resolution in an acceptable criteria were studied. After obtaining optimal chromatographic conditions for UPLC, validation was proceeded. Two UPLC analytical methods were performed, a corresponding method of assaying the active and the other corresponding to the related compounds’ quantification method. Initially it was evaluated if the equipment in use would be able to generate results with accuracy and precision. Once tested, it was confirmed that the system was capable of providing acceptable data quality. Two methods proved to be specific and selective for the determination of Cefuroxime and all its related compounds. It has been shown that both methods are capable of generating results linearly proportional to the substance’s concentration in the sample, with precision and accuracy. X Detection and quantification limits of related compounds’ method are suitable, considering the intended use for it. Thus, the analytical method presented has proved to be sufficiently sensitive for Cefuroxime’s detection and quantification and all its related compounds. Noteworthy, after an analysis of standard and sample’s stability, it was assured for 24hours and, despite changes that may occur in analytical method parameters, this is considered robust

Mestrado em Biomedicina Farmacêutica The present report is intended to describe a ten-month internship for the master degree in Pharmaceutical Medicine in University of Aveiro performed in the pharmacovigilance sector of the pharmaceutical company Bluepharma – Indústria Farmacêutica, S.A. Pharmaceutical Medicine professionals, based on their background, have knowledge about theoretical and procedural concepts related to pharmacovigilance (the science responsible for the study of safety of medicinal products). The objectives of this internship forecasted the application of this knowledge, as well the acquisition and improvement of knowledge related to the pharmacovigilance and medicinal products’ safety in a professional setting. This report is divided in four sections. In section one a description of internship objectives and current state-of-art of pharmacovigilance is presented. The activities performed during this internship are described on section two, followed by their discussion on section three. Finally, section four presents a conclusion analysing the main skills and knowledge gained during this internship and their relevance for complementing academic experience. O presente relatório descreve um estágio curricular no âmbito do mestrado em Biomedicina Farmacêutica da Universidade de Aveiro realizado ao longo de dez meses no sector de farmacovigilância da empresa farmacêutica Bluepharma – Indústria Farmacêutica, S.A. Os profissionais da Biomedicina Farmacêutica, no âmbito da sua formação, desenvolvem conhecimentos de conceitos teóricos e processuais associados à farmacovigilância (ciência relacionada com a segurança de medicamentos). Os objetivos deste estágio previam a colocação em prática desses conhecimentos, bem como a aquisição e aprofundamento de conhecimentos relacionados com as matérias de farmacovigilância e segurança de medicamentos de uso humano em contexto profissional. O relatório encontra-se dividido em quatro partes. Numa primeira parte são descritos os objetivos deste estágio e o estado-de-arte da farmacovigilância. Uma descrição das atividades envolvidas neste estágio é apresentada na segunda parte, seguida da sua discussão na terceira parte. Por fim, é apresentada uma conclusão onde são discutidos os principais conhecimentos adquiridos e qual importância da experiência académica para complemento da formação.

Dissertação de mestrado em Biotecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra. Os anestésicos tópicos são muito importantes para tratamento da dor local em procedimentos cirúrgicos e cosméticos. No entanto, de forma a produzirem o seu efeito terapêutico estes têm que ser veiculados numa formulação apropriada que permita a sua administração e a sua chegada ao local de ação na dose certa. Por este motivo, o principal objetivo desta tese é o desenvolvimento e caracterização de uma formulação tópica de dois anestésicos locais com recurso a um método estatístico, o desenho de experiências. Foram testados diversos fatores (% de gelificante, % de neutralizante e presença das substâncias ativas) e foi determinada a sua influência na viscosidade, pH e condutividade das duas formulações estudadas, bem como na libertação inicial e final de lidocaína e prilocaína a partir dessas formulações. Através do desenho de experiências foi possível estudar vários fatores em simultâneo e respetivas interações, bem como otimizar as formulações, obtendo modelos estatísticos robustos. Os estudos realizados permitiram alcançar formulações que preenchessem os requisitos que foram definidos inicialmente no Target Product Profile. Topical anesthetics are very important for treating local pain and in cosmetic and surgical procedures. However, in order to produce their therapeutic effect they have to be conveyed in an appropriated formulation to allow its administration and its arrival at the site of action in the right dose. For this reason, the main objective of this thesis is the development and characterization of a topical formulation of two local anesthetics using a statistical method, the design of experiments. Several factors were evaluated (% of gelling agent, % of neutralizing agent and the presence of the drugs) and their influence on viscosity, pH and conductivity of the two formulations studied, as well as initial and final release of lidocaine and prilocaine from these formulations was determined. The design of experiments allowed the study of several factors and respective interactions simultaneously, the optimization of the formulation and the definition of robust statistical modes. In the end of this work it was possible to achieve formulations that met the requirements initially defined in the Target Product Profile.

In order to achieve maximum patient compliance, pharmaceutical companies have directed their research to the development of innovative delivery systems. As this matter, oral films have been claimed as one of the most promising approaches as a new drug delivery for oral administration, showing great interest and a market opportunity. As a relatively new pharmaceutical form, there is a lack of information and available studies concerning this technology. Therefore, it is extremely important to investigate the characteristics of commercially available oral films, which can provide essential information to the development of a new product. The main goal of this project was the chemical, thermal and mechanical characterization of two oral films available in the market: Listerine from Pfizer and Gas-X from Novartis. The characterization of the films was carried out using different techniques: chemical characterization, by FTIR analysis; thermal characterization by TGA, DSC and DMTA; mechanical properties, by tensile tests. Other important characteristics, such as disintegration time and water content were also evaluated. In order to understand the relationship between the composition, preparation procedures and the final properties of films, an attempt to reproduce Listerine and Gas-X was carried out. Throughout this work, methodologies for characterization of films were established and some relevant conclusions were taken. On the matter, it was possible to develop a formulation with higher similarity to commercial available film (Listerine), which is extremely relevant in the contribution to the development of new technologies for oral films. The results presented in Listerine revealed the importance of the formulation used in the properties of the oral films. Muitas indústrias farmacêuticas têm direcionado a sua área de investigação para o desenvolvimento de novos sistemas de entrega de fármacos inovadores. Desta forma, e devido às inúmeras vantagens inerentes a esta tecnologia, os filmes orais têm sido apontados como uma das abordagens mais promissoras como novo sistema para administração oral, revelando-se de grande interesse como oportunidade de mercado. Sendo uma nova forma farmacêutica, há uma falta de informação disponível e os estudos incidentes sobre este tema são muito limitados e pouco desenvolvidos. Deste modo, é extremamente importante procurar investigar as características dos filmes orais comercialmente disponíveis. Esta informação é fundamental para o desenvolvimento de novas aplicações e tecnologias de administração oral. O principal objectivo deste trabalho é a caracterização química, térmica e mecânica de dois filmes orais disponíveis actualmente no mercado: Listerine produzido pela Pzifer, e o Gas-X desenvolvido pela Novartis. A caracterização dos filmes foi realizada recorrendo a diversas técnicas. Caracterização química por análise de FTIR; caracterização térmica por TGA, DSC e DMTA; e caracterização mecânica por testes de tracção. Outras características importantes foram também avaliadas, nomeadamente, o tempo de desintegração dos filmes e o conteúdo de água residual. De forma a compreender a relação entre a composição, preparação e as propriedades finais dos filmes, procedeu-se a uma tentativa de reprodução dos filmes comerciais Listerine e Gas-X. Ao longo deste trabalho, foram desenvolvidas e estabelecidas metodologias para a caracterização de filmes orais, o que permitiu obter conclusões muito relevantes não só ao nível da influência de excipientes nas propriedades. Na verdade, conseguiu-se obter um filme com grande semelhança ao comercial (Listerine), o que se revela uma mais valia e contribuição para o desenvolvimento de novas tecnologias de filmes orais. Os resultados apresentados para o Listerine revelam a importância da formulação nas propriedades dos filmes orais.

Dissertação de mestrado em Biotecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra. A Leucemia Mieloide Crónica é uma neoplasia mieloproliferativa resultante da expressão da tirosina cinase bcr-abl. O Imatinib foi o primeiro inibidor de tirosina cinase utilizado na prática clínica e rapidamente se tornou a primeira linha de tratamento para LMC. No entanto, mais de 30% dos doentes adquire resistência ao fármaco, tornando-se fundamental identificar as suas causas, bem como desenhar estratégias que consigam ultrapassar os vários mecanismos de resistência descritos até então. Atualmente existe uma panóplia de estudos científicos que abordam este tema e já existem muitas estratégias que visam ultrapassar a resistência ao Imatinib em fase de investigação clínica. Espera-se que no futuro próximo algumas destas estratégias possam desempenhar um papel relevante na prática clínica. Este trabalho visa fazer o levantamento do estado da arte das estratégias que se encontram a ser desenvolvidas no âmbito do combate da resistência ao IM, nomeadamente estratégias de silenciamento do mRNA de bcr-abl, desenvolvimento de vacinas, de novos fármacos, associações de fármacos, bem como a identificação de novos alvos terapêuticos para a LMC presentes nas diversas vias de sinalização ativadas pela oncoproteína bcr-abl. Pretende-se efetuar uma revisão destas estratégias, bem como apontar algumas perspetivas futuras de evolução nesta área. Chronic Myeloid Leukemia is a myeloproliferative neoplasm that results from bcr-abl tyrosine kinase expression. Imatinib was the first tyrosine kinase inhibitor used in clinical practice and quickly became a first-line treatment for CML. However, over 30% of patients acquire drug resistance, becoming critical to identify its causes, as well as designing strategies that can overcome the multiple resistance mechanisms described so far. Currently there is a plethora of scientific studies that address this issue and there are many strategies to overcome Imatinib resistance undergoing clinical investigation. In the near future it is expected that some of these strategies may play an important role in clinical practice. This work aims to survey the state of the strategies that are being developed in order to combat resistance to IM, including strategies of silencing mRNA bcr-abl, vaccines iv development, new drugs, drugs combination, as well as identification of new CML therapeutic targets existing in several signaling pathways activated by bcr-abl oncoprotein. The purpose is making a revision of these strategies, as well as indicates some future perspectives of evolution in this area

Mestrado em Biomedicina Farmacêutica O presente relatório propõe relatar a minha experiência de 11 meses em farmacovigilância na Bluepharma - Indústria Farmacêutica, S.A. O estágio foi realizado no âmbito do mestrado em Biomedicina Farmacêutica e teve como objetivos a aquisição de competências técnicas e de experiência em farmacovigilância e a consolidação de conhecimentos. No primeiro capítulo é feita uma introdução ao estágio curricular, seguindo-se uma descrição do estado da arte da indústria farmacêutica, focando-se no mercado farmacêutico e no seu ambiente regulamentar na União Europeia, em especial na área da farmacovigilância. Neste capítulo é ainda apresentada a empresa de acolhimento e os objetivos do estágio. No capítulo seguinte são descritas as formações multidisciplinares, bem como as tarefas e atividades desempenhadas durante o período de estágio. No final é apresentada uma discussão e conclusão, incluindo uma análise das atividades desenvolvidas, principais dificuldades sentidas bem como das competências adquiridas durante esta experiência profissional. The present report intends to describe my 11-month experience in pharmacovigilance at Bluepharma - Indústria Farmacêutica, S.A. The internship was performed within the scope of the Master’s Degree in Pharmaceutical Biomedicine, aiming to acquire technical skills and experience in pharmacovigilance, as well as to consolidate previous knowledge. The first chapter introduces the internship and describes the state of the art in the pharmaceutical industry focusing on the pharmaceutical market and regulatory environment in the European Union, especially in the pharmacovigilance area. This chapter also includes a description of the host company and the internship objectives. The subsequent chapter presents a description of the multidisciplinary experience as well as the tasks and activities developed during the internship period. Finally, it is presented a discussion and conclusion, which include a critical analysis of the tasks developed, main difficulties and skills acquired during this professional experience.