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Orientadores: Andreas Karoly Gombert, Thiago Olitta Basso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Tem sido debatido se a levedura Saccharomyces cerevisiae cresce em plena anaerobiose apenas se os fatores de crescimento anaeróbicos (FCA) ácido oleico e ergosterol forem adicionados ao meio de cultura, visto que a biossíntese de um mol de ergosterol requer 12 moles de oxigênio molecular e cada insaturação em um ácido graxo requer uma molécula de oxigênio. No presente trabalho, foram conduzidos cultivos em quimiostato com as linhagens de Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D e PE-2, nas condições de oferta de oxigênio mais restritas possíveis. Após a transição de crescimento aeróbio para anaeróbio, em meio sem oferta de FCA, com glicose como nutriente limitante e a uma vazão específica de 0,1 h-1, um estado estacionário com crescimento celular ainda pode ser observado. Quando comparadas com células cultivadas em aerobiose, a fração de ácidos graxos insaturados em células cultivadas em anaerobiose foi significativamente menor. Por outro lado, a fração de ácidos graxos saturados, foi maior. Quanto à composição de esteróis, a extrema limitação de oxigênio levou a um acúmulo de esqualeno e lanosterol, em detrimento da síntese de ergosterol. Por outro lado, células cultivadas em aerobiose sintetizaram ergosterol e acumularam muito pouco esqualeno e lanosterol. Apesar da necessidade de oxigênio, as células ajustaram a sua composição lipídica de modo a acumular mais espécies lipídicas não dependentes de oxigênio para sua síntese, de forma a sustentar o crescimento, ao custo de robustez e tolerância a fatores de estresse. Quando células cultivadas em anaerobiose foram expostas a condições de estresse ácido ou etanólico, foi possível observar uma perda de viabilidade mais acentuada, quando comparada a células retiradas de estados estacionários em aerobiose, expostas aos mesmos fatores de estresse. O presente trabalho documenta o impacto da extrema limitação de O2 em células de S. cerevisiae cultivadas em quimiostato Abstract: It has been debated whether Saccharomyces cerevisiae can grow under complete anaerobiosis only if the anaerobic growth factors (AGF) oleic acid and ergosterol are added to the medium since the biosynthesis of one mole of ergosterol requires 12 moles of molecular oxygen, and each unsaturation in a fatty acid moiety requires one molecule of oxygen. Chemostat cultivations with the Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D and PE-2 strains were performed, under the most stringent oxygen-excluded conditions. After a shift from aerobic to anaerobic growth in a defined medium devoid of AGF, with glucose as the limiting nutrient, and at a dilution rate of 0.1 h-1, a steady-state with growing cells could still be observed. When compared with aerobically grown cells, the unsaturated fatty acid content of anaerobically grown cells decreased significantly. On the other hand, the saturated fraction increased. Regarding sterol composition, extreme oxygen limitation led to an accumulation of squalene and lanosterol at the expense of ergosterol. Contrarily, aerobically grown cells predominantly synthesized ergosterol with very little accumulation of squalene and lanosterol. Although O2 starved, cells diligently adjusted their lipid composition to accumulate moieties that are not dependent on oxygen for sustaining growth, at expense of cellular fitness. When anaerobically grown cells were exposed to ethanolic or acidic stress conditions, we observed a sharp decrease in cell viability, when compared to aerobic steady-state cells exposed to the same stressors. Overall, this work documents the impact of extreme O2 limitation in continuously-grown S. cerevisiae cells Doutorado Bioenergia Doutor em Ciências CAPES 001

CAPES O interesse pela levedura Dekkera bruxellensis tem aumentado na última década pela sua capacidade de instalação e manutenção no processo fermentativo industrial de produção de etanol combustível, chegando a superar a população de Saccharomyces cerevisiae, a principal levedura usada como fermento. Essa capacidade está relacionado a assimilação de nutrientes presentes no caldo de cana, como por exemplo as fontes de nitrogênio, sendo indispensáveis para o crescimento celular. Diante desse desempenho competitivo e fermentativo demonstrado pela D. bruxellensis, há um interesse em esclarecer de que forma acontece o sucesso dessa levedura no ambiente industrial. Este trabalho tem como objetivo avaliar a inflluência de diferentes fontes de nitrogênio na taxa específica de crescimento, bem como na fisiologia e expressão de genes de células de D.bruxellensis cultivadas na presença ou ausência de oxigênio. Para isso, foram feitos cultivos na presença de aminoácidos, nitrato ou amônio como fonte de nitrogênio em condições aeróbicas e anaeróbicas, aliados a análise fisiológica feitas em HPLC e genética através de expressão gênica por PCR em tempo real. Os resultados gerados nesse trabalho relatam que a disponibilidade de oxigênio influência a preferência de assimilação de cada um dos aminoácidos bem como, a expressão de genes e permeases envolvidos no metabolismo central do nitrogênio da levedura D. bruxellensis. A glutamina é o aminoácido preferencial independente da concentração de oxigênio, no entanto em anaerobiose aspartato e glutamato também foram consideradas preferências. Os dados também mostram que a maquinaria catabólica no meio contendo todos aminoácidos e no meio contendo nitrato é mais eficiente na ausência de oxigênio. Além disso, apontam para a importância do nitrato como aceptor de elétrons na ausência de oxigênio, tal como observado em processos de fermentação industrial. Por fim, os resultados contribuem para uma melhor descrição de aspectos fisiológicos relacionados as fontes de nitrogênio pela levedura D. bruxellensis e revelam a influência negativa do oxigênio sobre a assimilação do nitrato, além de oferecer estratégias que ajudam a favorecer o seu crescimento, contribuindo para uma futura aplicação biotecnológica dessa levedura. The interest in the Dekkera bruxellensis yeast has increased in the last decade due to its capacity of installation and maintenance in the industrial fermentation process of ethanol fuel production, surpassing the population of Saccharomyces cerevisiae, the main yeast used as ferment. This capacity is related to the assimilation of nutrients present in sugarcane juice, such as nitrogen sources, which are indispensable for cell growth. Given this competitive and fermentative performance demonstrated by D. bruxellensis, there is an interest in clarifying the success of this yeast in the industrial environment and how it happens. This work aims to evaluate the influence of different nitrogen sources on the specific growth rate, as well as on the physiology and expression of D.bruxellensis cells grown in the presence or absence of oxygen. For this, cultures were made in the presence of amino acids, nitrate or ammonia as a source of nitrogen under aerobic and anaerobic conditions, allied to the physiological analysis done in HPLC and genetics through gene expression by real-time PCR. The results generated in this work report that the oxygen availability influences the assimilation preference of each of the amino acids as well as the expression of genes and permeases involved in the central nitrogen metabolism of the D. bruxellensis yeast. Glutamine is the preferred amino acid regardless.The oxygen concentration, however, there were also preferences considered in anaerobic aspartate and glutamate. The data also shows that the catabolic machinery in the medium containing all amino acids and in the medium containing nitrate is more efficient in the absence of oxygen. In addition, they point to the importance of nitrate as an electron acceptor in the absence of oxygen, as observed in industrial fermentation processes. Finally, the results contribute to a better description of the physiological aspects related to nitrogen sources by the D. bruxellensis yeast and reveal the negative influence of oxygen on the assimilation of nitrate, besides offering strategies that help to promote its growth, contributing to biotechnological application of this yeast.

FACEPE Dekkera bruxellensis pertence à família Saccharomycetaceae e é considerado um parente distante de Saccharomyces cerevisiae. Esta levedura, principalmente na sua forma anamorfa Brettanomyces bruxellensis, é um importante contaminante da produção de vinho. O objetivo deste estudo foi comparar a fisiologia de linhagens da levedura Dekkera bruxellensis isoladas da produção de vinho e de álcool combustível quanto ao metabolismo de diferentes açúcares potencialmente utilizados como substrato industrial. Para isso, 30 isolados de Dekkera bruxellensis foram avaliados quanto à habilidade de assimilação respiratória e fermentativa de monossacarídeos e dissacarídeos, a diversidade fenotípica relacionada à repressão catabólica pela glicose, e a assimilação de diferentes açúcares, tais como glicose, sacarose e celobiose sob condição anaeróbica. Diferenças entre os perfis de assimilação respiratória foram observadas para cada isolado. As mais altas velocidades de crescimento foram encontradas em meio com glicose, frutose e sacarose 0,32 h⁻¹, 0,30 h⁻¹ e 0,30 h⁻¹, respectivamente, em aerobiose pelos isolados de destilaria. Em maltose e galactose, as maiores taxas de crescimento foram respectivamente, 0,21 h⁻¹ e 0,27 h⁻¹, alcançadas por isolados de destilaria e de vinícola, e em celobiose e lactose, as maiores taxas foram respectivamente, 0,20 h⁻¹e 0,15 h⁻¹, alcançados pelos isolados de destilaria. A presença do repressor catabólico 2-deoxiglicose no meio com galactose e maltose inibiu o crescimento de todos os isolados de vinho, diferentemente de alguns isolados de etanol que apresentaram resistência a este composto. A adição de Antimicina A nos meios de cultura alterou o crescimento apenas dos isolados de vinícola. Em anaerobiose estrita, os isolados de destilaria alcançaram velocidades de crescimento iguais a 0,44 h⁻¹; 0,40 h⁻¹e 0,26 h⁻¹ em glicose, sacarose e celobiose, respectivamente. A capacidade de assimilação de diferentes açúcares pelos isolados de D. bruxellensis frente às diversas condições testadas mostram a diversidade fenotípica encontrada dentro desta espécie. Além disso, os dados podem colaborar para explicação da capacidade adaptativa dessa espécie em diferentes ambientes industriais cujas fontes alternativas de carbono estejam presentes. Do ponto de vista biotecnológico, estudos com isolados de D. bruxellensis podem ser voltados para a produção de etanol de segunda geração, cujo um dos substratos é a celobiose, açúcar dos quais linhagens selvagens de S. cerevisiae não são capazes de assimilar. Dekkera bruxellensis belongs to the family Saccharomycetaceae and is considered a distant relative of Saccharomyces cerevisiae. This yeast, mainly in its anamorphic form Brettanomyces bruxellensis, is an important contaminant of wine production. The aim of this study was to compare the physiology of strains Dekkera bruxellensis yeast isolated from wine production and ethanol on the metabolism of different sugars potentially used as industrial substrate. To this, 30 isolates of Dekkera bruxellensis were assessed for fermentative and respiratory assimilation ability monosaccharides and disaccharides, phenotypic diversity related to catabolite repression by glucose and the assimilation of different sugars, such as glucose, sucrose and cellobiose under anaerobic conditions. Differences between the profiles of respiratory assimilation were observed for each isolate. The highest growth rates were found in glucose, fructose and sucrose 0.32 h⁻¹, 0.30 h⁻¹and 0.30 h⁻¹, respectively, in aerobiosis by distillery isolates. In maltose and galactose, the highest growth rates were respectively 0.21 h⁻¹ and 0.27 h ⁻¹, reached by distillery and wine isolates, and in cellobiose and lactose, the highest rates were 0, 20 h⁻¹ and 0.15 h⁻¹, reached by distillery isolates. The presence of the 2-deoxyglucose catabolic repressor in the medium with galactose and maltose inhibited the growth of all the wine isolates, unlike some ethanol isolates were resistant to this compound. The addition of Antimycin A in the culture media altered the growth of only the wine isolates. In strict anaerobiosis the isolates of distillery reached growth rates equal to 0.44 h ⁻¹; 0.40 h ⁻¹ and 0.26 h ⁻¹ in glucose, sucrose and cellobiose, respectively. The capacity of assimilation of different sugars by D. bruxellensis isolates against the different conditions tested shows the phenotypic diversity found within this species. Moreover, the data can corroborate to explain the adaptive capacity of this species in different industrial environments whose alternative carbon sources are present. In biotechnological point of view, studies with isolated D. bruxellensis may be facing a second-generation ethanol, which one of the substrates is a cellobiose, sugar from which wild strains of S. cerevisiae are not able to assimilate

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2016-06-28T15:38:58Z No. of bitstreams: 1 Ruthanna Isabelle de Oliveira.pdf: 1718096 bytes, checksum: a4d22f15c18485f26846b44759e72e61 (MD5) Made available in DSpace on 2016-06-28T15:38:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ruthanna Isabelle de Oliveira.pdf: 1718096 bytes, checksum: a4d22f15c18485f26846b44759e72e61 (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq The Gypsum Pole of Araripe is responsible for about 97% of the national production of plaster and has the wood coming from the Caatinga as the main component of the energy matrix of this productive chain, causing a severe impact on native vegetation. As the areas of forest management in the region are insignificant in relation to demand, the introduction of alternative sources of biomass for power generation is necessary, as the gramineae sugarcane and elephant grass. However, for these cultures to achieve higher productivity is necessary to develop more studies on suitable soils, nutrition, energy indicators and their impact on the semi-arid environment, predominantly occupied by native vegetation of the Caatinga. Thus, this study aimed to evaluate the potential of the mineral plaster Araripe and how it can influence changes in soil chemical properties due to its application; assess nutritional status, content, efficient use of nutrients and indicators of energy sugarcane and elephant grass grown in the presence and absence of mineral plaster; and finally evaluate the soil CO2 efflux and the influence of soil moisture and temperature that efflux in Caatinga areas preserved in the areas of cultivation of exotic grasses in the region and eucalyptus forests in the Araripe in Pernambuco. The experiment was conducted at the Experimental Station of the Agronomic Institute of Pernambuco (IPA) in Araripina, in a Oxisol. They used three varieties of sugarcane: : two Cuban origin (C90-176 and C90-178), called energy cane; one improved by the Genetic Improvement Program RIDESA (RB962962), and two varieties of elephant grass (Cameroon and Venezuela) in the presence and absence of mineral plaster. At 320 days after the application of gypsum, soil samples were collected separately in the depths 0.0-0.2; 0.2-0.4 and 0.4-0.6 m. All samples proceeded to determine the pH (H2O) Ca2+, Mg2+, K+, Al3+ and SO42-. At 120 and 180 days after planting (DAP) it was collected of +3 leaf to assess the nutritional status of grasses. At 320 DAP was carried out the harvest of the gramineae and the shoots were separated into leaf and stalk.In the compartments evaluated the levels of nutrients, extracted quantity and efficiency of biological utilization of these nutrients. energy indicators as fiber content, lignin and the gross calorific value (PCS) were evaluated in four different periods: at three months, six months, nine months and a half and ten and a half months of plant growth . To evaluate the soil CO2 efflux in Caatinga areas preserved, gramineae cultivation and eucalyptus forests were conducted five evaluations, two in the dry season and three in the rainy season. The application of mineral plaster did not increase the levels of Ca2+ in the soil subsurface, but increased the sulfate content of up to 0.6 m deep and reduced the Al saturation. Mg2+ and K+ levels did not change with the application of plaster. There was a difference in Ca2+ and Mg2+ levels in soil under different types of gramineae. The content of K, Ca and Mg in the shoot was influenced by the use of gypsum, regardless of the cultivated grass. Except the variety of sugarcane RB962962 the gramineae extracted more S when the plaster was applied. The efficiency of biological utilization of N, P, K, Ca and Mg of the grass was not influenced by the application of plaster. The varieties of sugarcane Cuban C90-176 and C90-178 and variety of Cameroon elephant grass showed lower efficiency of biological utilization of S when the plaster was applied. There was little variation in energy indicators in the stalk and leaf of different gramineae in evaluation periods. The increase in lignin content in elephant grass stalk Cameron suggests that cutting this grass for energy use must not take place before 200 after planting. The application of plaster increased the dry matter production in increments of up to 9 Mg ha-1 for the variety of elephant grass Venezuela. The overall average CO2 soil efflux was 2.07; 2.73 and 1.67 μmol m-2 s-1 for the areas of Caatinga, grasses and eucalyptus, respectively. Areas had the same CO2 soil efflux behavior. In dry periods the emissions were lower than in the rain periods. There was a correlation among CO2 soil efflux with temperature and soil moisture. O Pólo Gesseiro do Araripe é responsável por cerca de 97% da produção nacional de gesso e tem a lenha oriunda do bioma Caatinga como o principal componente da matriz energética dessa cadeia produtiva, causando um impacto severo na vegetação nativa. Como as áreas de manejo florestal da região são insignificantes em relação à demanda, se faz necessária a introdução de fontes alternativas de biomassa vegetal para geração de energia, como as gramíneas cana-de-açúcar e capim elefante. No entanto, para que essas culturas alcancem elevadas produtividades é necessário o desenvolvimento de estudos sobre solos mais adequados, nutrição, indicadores energéticos e o impacto delas no ambiente semi-árido, predominantemente ocupado pela vegetação nativa da Caatinga. Desta forma, neste trabalho se objetivou avaliar o potencial do gesso mineral do Araripe e como ele pode influenciar mudanças nas características químicas do solo em função de sua aplicação; avaliar o estado nutricional, conteúdo, eficiência do uso de nutrientes e indicadores energéticos de cana-de-açúcar e capim elefante cultivadas na presença e ausência de gesso mineral; e por fim avaliar o efluxo de CO2 do solo e verificar a influência da umidade e temperatura do solo nesse efluxo em áreas de Caatinga preservada, nas áreas de cultivo das gramíneas exóticas na região e de florestas de eucalipto na Chapada do Araripe, em Pernambuco. O experimento foi conduzido na Estação Experimental do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA) em Araripina, em um Latossolo Amarelo. Foram utilizadas três variedades de cana-de-açúcar: duas de origem cubana (C90-176 e C90-178), denominadas canas energéticas; uma melhorada pelo Programa de Melhoramento Genético da RIDESA (RB 962962), além de duas variedades de capim elefante (Cameroon e Venezuela) na presença e ausência de gesso mineral. Aos 320 dias após a aplicação de gesso, amostras de solo foram coletadas separadamente nas profundidades 0,0-0,2; 0,2-0,4, e 0,4-0,6 m. Nas amostras procedeu-se a determinação do pH (H2O), Ca2+, Mg2+, K+, Al3+, e SO42-. Aos 120 e 180 dias após o plantio (DAP) realizou-se coleta da folha +3 para avaliação do estado nutricional das gramíneas. Aos 320 DAP foi realizado o corte das gramíneas e a parte aérea foi separada nos compartimentos folha e colmo. Nos compartimentos foram avaliados os teores dos nutrientes, quantidade extraída e eficiência de utilização biológica desses nutrientes. Os indicadores energéticos como, teor de fibras, lignina e o poder calorífico superior (PCS) foram avaliados em quatro diferentes períodos: aos três meses, seis meses, nove meses e meio e dez meses e meio de crescimento das plantas. Para avaliar o efluxo de CO2 do solo em áreas de Caatinga preservada, cultivo de gramíneas e florestas de eucalipto foram realizadas cinco avaliações, duas no período de seca e três no período chuvoso. A aplicação de gesso mineral não elevou os teores de Ca2+ do solo em subsuperfície, porém incrementou os teores de sulfato até 0,6 m de profundidade e reduziu a saturação por Al. Os teores de Mg2+ e K+ não alteraram com a aplicação de gesso. Houve diferença nos teores de Ca2+ e Mg2+ no solo cultivado sob os diferentes tipos de gramíneas. O conteúdo de K, Ca e Mg na parte aérea foi influenciado pelo uso do gesso, independente do tipo de gramínea cultivada. Com exceção da variedade de cana-de-açúcar RB962962 as gramíneas extraíram mais S quando o gesso foi aplicado. A eficiência de utilização biológica de N, P, K, Ca e Mg das gramíneas não sofreu influência da aplicação de gesso. As variedades de cana-de-açúcar cubanas C90-176 e C90-178 e a variedade de capim elefante Cameroon apresentaram menor eficiência de utilização biológica de S quando o gesso foi aplicado. Houve pouca variação nos indicadores energéticos no colmo e na folha das diferentes gramíneas nos períodos avaliados. O incremento dos teores de lignina no colmo do capim elefante Cameron sugere que o corte dessa gramínea para uso energético não deve ocorrer antes dos 200 após o plantio. A aplicação de gesso aumentou a produção de matéria seca com incrementos de até 9 Mg ha-1 na variedade de capim elefante Venezuela. A média geral do efluxo de CO2 do solo foi de 2,07; 2,73 e 1,67 μmol m-2 s-1, para as áreas de Caatinga, gramíneas e eucalipto, respectivamente. As áreas tiveram o mesmo comportamento para o efluxo de CO2. Nos períodos de seca houve menores emissões e nos períodos de chuva maiores. Houve correlação entre o efluxo de CO2 do solo com a temperatura e a umidade do solo.

FACEPE A levedura Dekkera bruxellensis tem sido identificada como principal contaminante do processo industrial de produção de álcool combustível e em vinícolas, mas estudos recentes mostraram que linhagens desta espécie podem apresentar rendimentos em etanol comparáveis aos mostrados por Saccharomyces cerevisiae, o principal microrganismo fermentador. Apesar de ter se mostrado um microrganismo bastante atrativo para aplicações industriais, poucos trabalhos têm sido dedicados ao estudo de sua fisiologia. Este trabalho teve por objetivo descrever a fisiologia da linhagem industrial da levedura D. bruxellensis GDB 248 quanto ao seu metabolismo de açúcares e o efeito repressor que a glicose exerce sobre o metabolismo do carbono. Foram realizados cultivos em frascos em diferentes fontes de carbono e em quimiostatos limitados em glicose ou sacarose. Nos experimentos em frascos com hexoses ou dissacarídeos, valores para taxas de crescimento e rendimentos em etanol e acetato foram calculados e nenhuma formação de piruvato, succinato ou glicerol foi observada. A análise elementar da biomassa de D. bruxellensis resultou na composição elementar CH1.754O0.583N0.149e o grau de redução (Nox) para esta biomassa se mostrou muito próximo ao descrito para a biomassa de S. cerevisiae. Nos experimentos em regime de quimiostato, o metabolismo desta levedura foi completamente respiratório e todo o açúcar consumido (glicose ou sacarose) foi convertido em apenas biomassa atingindo rendimento cerca de 25% maior que o observado para S. cerevisiae. Além disso, pulsos de glicose foram aplicados aos quimiostatos limitados em glicose ou sacarose e os resultados mostraram que as células de D. bruxellensis apresentam o efeito Crabtree observado pela rápida produção de etanol, mesmo em presença de oxigênio. No pulso de glicose aplicado ao quimiostato limitado em sacarose, foi observado o acúmulo de sacarose no reator, indicando a presença de mecanismo de repressão catabólica por glicose nestas células. Para avaliar o efeito repressor da glicose, a expressão relativa do gene DbFBP1 foi analisada por PCR em tempo real e foi observado que este gene está sujeito a uma forte regulação repressora exercida pela proteína quinase A em resposta a disponibilidade de glicose. Os dados deste trabalho possibilitaram uma melhor compreensão acerca da capacidade de conversão de diferentes açúcares a etanol, apesar da tendência ao metabolismo respiratório apresentado pelas células de D. bruxellensis e ainda foram gerados os primeiros dados a cerca do efeito repressor da glicose sobre o metabolismo destas fontes de carbono. Por fim, diante da escassez de dados genômicos para esta espécie, foi realizado um estudo para validar genes de referência para normalização de dados de ensaios de expressão gênica por PCR em tempo real. Os resultados mostraram que os genes DbEFA1, DbEFB1 e DbYNA1 são suficientemente estáveis para esta aplicação e que o método geNorm é, de fato, o mais adequado para esta análise.