Search

Mesenchymal stromal cells (MSC) are a potential tool for cell-based therapies subject to intensive investigation. MSCs display immunomodulatory functions and a broad differentiation capacity, and thus have several potential therapeutic applications, such as treatment of immunological disorders and correction of tissue defects. MSCs have been widely studied and utilized in treatment of Graft-versus-Host disease, a severe complication of stem cell transplantation, and have also been evaluated in treatment of Crohn’s disease, multiple sclerosis, and chronic inflammation. The repair of bone and cartilage defects is another application of significant interest. MSCs are classified as advanced therapy medicinal products (ATMPs), which are manufactured under supervision by regulatory authorities. The aim of regulation is to produce safe and effective medicinal products, and therefore safety risks and sources of alterations or impairment of functionality should be evaluated carefully. MSCs are somatic cells, which can be isolated from various sources, such as from bone marrow, adipose tissue, or umbilical cord. For production of medicinal products, MSCs are usually expanded extensively in cell cultures. Culture conditions are known to affect to the characteristic and functionality of MSCs. Animal-derived components during culture such as bovine serum are to be avoided if possible, due to risks of immune reactions and zoonotic infections. Therefore, animal serum-free culture medium is considered safe option for MSC cultures. This thesis focuses on determining optimal expansion and differentiation conditions for clinical-grade bone marrow-derived MSCs by using platelet-derived culture medium supplements to replace bovine serum. This study also aimed to improve quality of MSCs products by introducing an imaging-based screening method to detect aging-related morphological changes in MSC cultures. Finally, we investigated how additional freezing steps during the manufacturing process affect the basic manufacturing parameters and alter the cellular aging process. We found in this study that platelet lysate with two freeze-thaw cycles effectively supported MSC expansion and maintained their functionality in ambient oxygen concentration. Platelet lysate also promoted osteogenic differentiation at least equally with bovine serum in two-dimensional plate culture and slightly better if a three-dimensional matrix was used. We were able to detect and quantify aging-related morphological changes from MSCs cultures and found that a rapid increase in cell size reflects the expression of aging markers. We found that freezing at early phases of cell cultures did not alter the characteristics or functionality of the MSC. This study has yielded insights into the establishment and scaling up of animal-serum free MSC cultures. In addition, our screening method for aged cells could be implemented into the clinical-grade manufacturing of MSCs to monitor cell quality during processing. Mesenkymaaliset stroomasolut (MSC) ovat olleet vilkkaan tutkimuksen kohteina johtuen niiden kyvystä vaimentaa immuunireaktioita ja erilaistua erilaisiksi solutyypeiksi, kuten luu- ja rustosoluiksi. MSC:n ominaisuudet tekevät niistä merkittävän potentiaalisen työkalun erilaisten sairauksien, kuten immunologisten häiriöiden tai kudospuutosten, hoitoon. MSC:ja on laajasti käytetty ja tutkittu akuutin käänteishyljinnän, Crohnin taudin ja kroonisten tulehdustilojen yhteydessä sekä luu- ja rustopuutosten hoidossa. MSC:t luokitellaan kehittyneen terapian lääkevalmisteiksi, joiden tuotantoa säädellään tiukasti lailla ja joiden valmistusta valvovat lääkevalvontaviranomaiset. Sääntelyn tarkoituksena on taata potilaalle turvallinen ja tehokas lääkevalmiste. MSC:t ovat somaattisia soluja, joita voidaan eristää erilaisista lähteistä, kuten terveen luovuttajan luuytimestä, rasvakudoksesta tai napanuorasta. Eristettyjä soluja on viljeltävä laboratoriossa laajamittaisesti soluvalmistetta varten. Viljelyolosuhteiden tiedetään muokkaavan solujen ominaisuuksia ja toimintaa. Hoitoon tarkoitettujen soluvalmisteiden tuotannossa tulisi myös pyrkiä eroon eläinperäisten materiaalien kuten nautaseerumin käytöstä niihin liittyvien taudinaiheuttajien ja immuunireaktioiden riskin vähentämiseksi. Tämän vuoksi MSC:n viljelyssä tulisi käyttää ihmisperäisiä rikasteita, kuten verihiutaleista valmistettua lysaattia. Tässä väitöstutkimuksessa keskityttiin kehittämään optimaalisia nautaseerumivapaita viljelyolosuhteita MSC:n laajamittaista viljelyä ja luuksi erilaistamista varten. Tutkimuksessa selvitettiin myös keinoja tunnistaa MSC ikääntymiseen liittyviä morfologian muutoksia kuvantamistekniikkaan perustuvaa seulontamenetelmää hyödyntäen. Tutkimme myös, miten MSC:n viljelyprosessin aikana tehtävät solujen pakastusvaiheet vaikuttavat niiden ominaisuuksiin ja ikääntymiseen. Havaitsimme, että kahdesti pakastettu ja sulatettu verihiutalelysaatti tuki MSC:n jakautumista ja erilaistumista luuksi ja ylläpiti solujen toiminnalliset piirteet viljelyn ajan. Verihiutalelysaatin havaittiin myös tukevan luuksi erilaistumista vähintään samalla tavoin kuin nautaseerumilla kaksiulotteisessa maljaviljelmässä ja hieman paremmin silloin, kun soluja viljeltiin käyttämällä kolmiulotteista matriisia. Onnistuimme havaitsemaan solujen ikääntymiseen liittyviä muutoksia solujen muodossa ja osoitimme, että solujen koon nopea muutos heijastaa myös ikääntymismarkkerien esiintymistä soluissa. Lopuksi havaitsimme, että tuotantoprosessin aikana tehdyt pakastamisvaiheet eivät vaikuta solujen toimintaan haitallisesti eivätkä muuta solujen normaalia ikääntymisprosessia. Tämä väitöstutkimus on tuottanut uutta tietoa eläinseerumivapaan MSC viljelmän optimoinnista ja laajentamisesta sekä esittää kuvantamiseen perustuvan menetelmän, jolla solujen laatua voitaisiin tutkia tuotantoprosessin aikana.

Supplemental methods. Methods used for analysis of MSC phenotypic markers and differentiation. (DOCX 20 kb)