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Orientador: William Dias Belangero Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A Terapia por ondas de choque (TOC) é uma alternativa não invasiva utilizada como método de indução a formação óssea que consiste em pulsos sonoros de alta energia transmitidas de modo focal a um tecido específico. Artigos demonstram aumento de vascularização, que ativação de proteínas como BMP (bone morphogenic protein) e Erk (extracellular signal-regulated kinase) induzindo diferenciação osteogênica após sua utilização no tecido ósseo. O presente estudo visou avaliar os níveis das proteínas Erk e Akt (akutely transforming), envolvidas na cascata protéica responsiva a deformação celular gerada por estímulo mecânico e consequente transformação em estímulo bioquímico induzindo a osteogênese. Os animais selecionados para o estudo foram anestesiados e divididos em dois diferentes grupos, onde no dia 1, o primeiro grupo foi submetido a TOC em sessão única de 500 impulsos gerados por aparelho eletrohidráulico a 0,12mJ/mm²na tíbia intacta e o segundo não recebeu TOC. Na sequência, os animais foram divididos em 3 subgrupos para cada tempo de segmento de 7, 14 e 21 dias A determinação dos níveis das proteínas propostas foi realizada por meio de immunoblotting. A fosforilação das proteínas Erk e Akt dos tecidos ósseos das tíbias extraídas dos ratos aumentou nos grupos submetidos a TOC após 7, 14 e se manteve elevado até o 21° dia quando comparado ao controle Abstract: Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) is a non-invasive alternative used as a method for inducing bone formation that consists of high-energy acoustic pulses transmitted in a focal way to a specific tissue. Studies show increase in vascularization which activate proteins such as BMP and Erk inducing osteogenic differentiation after its use in the bone tissue. The present study aimed at evaluating the levels of Erk and AKT proteins involved in the protein cascade responsive to cell deformation in biochemical stimulus inducing osteogenesis. The animals selected for the study were under anesthesia and divided in two different groups where on day 1 the first group was submitted to ESWT in one 500 pulse-session generated by an electrohydraulic device at 0,12mJ/mm² in intact tibia and fibula and the second did not receive ESWT. Then the animals were divided into 3 sub-groups, one for each segment times of 7, 14 and 21 days. Immunoblotting analysis was performed to determine the levels of the proposed proteins. The Erk and Akt protein phosphorylation of the bone tissues of extracted tibia from the animals increased in the groups submitted to ESWT and kept elevated until the 21st day when compared to the control group Mestrado Fisiopatologia Cirúrgica Mestra em Ciências

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Orientador: William Dias Belangero Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Ondas acústicas, como ultrassom pulsado de baixa intensidade, ondas de choque e ondas de pressão radial interferem na osteogênese por meio da modulação da expressão e do perfil de atividade de Akt, BMP-2 (bone morphogenetic protein-2), ERK-2 (extracellular signal-regulated kinase-2), FAK (focal adhesion kinase) e TGF-?1 (transforming growth factor-?1). Apesar do uso habitual na prática médica, não está claro se as terapias acústicas aceleram o reparo de fraturas agudas. Ademais, nenhum estudo comparou o efeito do ultrassom, ondas de choque e de pressão radial na modulação da expressão e do perfil de atividade de Akt, BMP-2, ERK-2, FAK e TGF-?1 durante o reparo ósseo. A presente tese foi desenvolvida para determinar se o ultrassom, as ondas de choque e as de pressão radial modulam a expressão e o perfil de atividade de Akt, BMP-2, ERK-2, FAK e TGF-?1 durante o reparo de defeitos ósseos produzidos em tíbias de ratos; e, caso afirmativo, se a modulação proteica difere entre as terapias acústicas. Para tanto, defeitos ósseos nas tíbias de ratos foram expostos a uma sessão de 500 pulsos e 0.12mJ/mm2 de ondas de choque, uma sessão de 500 pulsos e 2.0 bar de ondas de pressão radial, ou sessões diárias de 20 minutos de ultrassom pulsado a 30mW/cm2. Após seguimento de 1, 3 e 6 semanas, o tecido ósseo foi coletado para análise da expressão e perfil de atividade de Akt, BMP-2, ERK-2, FAK e TGF-?1. Os animais expostos ao ultrassom foram acompanhados por até 3 semanas. Identificou-se que o ultrassom pulsado de baixa intensidade modulou a expressão de BMP-2 na terceira semana; as ondas de choque modularam, na primeira semana, a expressão de BMP-2 e TGF-?1, e o perfil de atividade de Akt e FAK; e as ondas de pressão radial modularam o perfil de atividade de FAK na terceira semana. Com base nesses achados, conclui-se que, durante o reparo de defeitos ósseos produzidos em tíbias de ratos, o ultrassom pulsado de baixa intensidade, as ondas de choque e as de pressão radial modularam, de maneira distinta, a expressão e o perfil de atividade de Akt, BMP-2, FAK e TGF-?1, mas não de ERK-2. Além disso, entre as terapias avaliadas, as ondas de choque exibiram o efeito mais expressivo na modulação proteica Abstract: Low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS), extracorporeal shockwaves (ESWT) and radial pressure waves (RPWT) influence osteogenesis via Akt, BMP-2 (bone morphogenetic protein-2), ERK-2 (extracellular signal-regulated kinase-2), FAK (focal adhesion kinase) and TGF-?1 (transforming growth factor-?1) modulation. In spite of that, it is not clear whether those acoustic waves are effective to accelerate fracture healing. Additionally, to our knowledge no study compared the effect of different acoustic therapies on Akt, BMP-2, ERK-2, FAK and TGF-?1 during bone healing. An experimental study was conducted to determine whether LIPUS, ESWT and RPWT modulate Akt, BMP-2, ERK-2, FAK and TGF-?1 during bone healing in rat tibial defects; and, if so, to compare the results between the different modalities of acoustic therapies. Rat tibial defects were exposed to 500 shots of ESWT delivered at 0.12mJ/mm2, 500 impulses of RPWT operated at 2.0 bar, or daily 20-minute 30mW/cm2 sonication. Following 1, 3 and 6 weeks, bones were harvested to determine the expression and activity of Akt, BMP-2, ERK-2, FAK and TGF-?1. Animals exposed to ultrasound were followed up to 3 weeks. It was demonstrated that LIPUS modulates BMP-2 expression at three weeks; ESWT modulate Akt and FAK activity profiles, and the expression of BMP-2 and TGF-?1 at one week; and RPWT modulate FAK activity profile at 3 weeks. In conclusion, LIPUS, ESWT and RPWT exhibit distinct mechanisms to modulate Akt, BMP-2, FAK and TGF-?1, but not ERK-2 ¿ which is not modulated ¿, during bone healing in rat tibial defects Doutorado Fisiopatologia Cirúrgica Doutor em Ciências CAPES 02-P-3369/2017 FAPESP 2014/26729-0

A ventilação mecânica é uma terapia importante, mas pode resultar em complicações. Uma das mais relevantes é a lesão pulmonar induzida por ventilador. Devido à hiperdistensão alveolar, o pulmão inicia um processo inflamatório, com infiltrado neutrofílico, formação de membrana hialina, fibrogênese e prejuízo de troca gasosa. Nesse processo, a mecanotransdução da hiperdistensão celular é mediada através do citoesqueleto da célula e de suas interações com a matriz extracelular e com as células vizinhas, de modo que o estímulo mecânico da ventilação se traduz em sinalização bioquímica intracelular, desencadeando ativação endotelial, permeabilidade vascular pulmonar, quimiotaxia leucocitária, produção de citocinas e, possivelmente, lesão de órgãos à distância. Estudos clínicos demonstram essa relação entre distensão pulmonar e mortalidade em pacientes com lesão pulmonar induzida por ventilador. Entretanto, apesar de o citoesqueleto ter um papel fundamental na patogênese da lesão pulmonar induzida por ventilador, a literatura carece de estudos utilizando modelos in vivo sobre as alterações do citoesqueleto e de suas proteínas associadas durante esse processo patológico. Although mechanical ventilation is an important therapy, it can result in complications. One major complication is ventilator-induced lung injury, which is caused by alveolar hyperdistension, leading to an inflammatory process, with neutrophilic infiltration, hyaline membrane formation, fibrogenesis and impaired gas exchange. In this process, cellular mechanotransduction of the overstretching stimulus is mediated by means of the cytoskeleton and its cell-cell and cell-extracellular matrix interactions, in such a way that the mechanical stimulus of ventilation is translated into an intracellular biochemical signal, inducing endothelial activation, pulmonary vascular permeability, leukocyte chemotaxis, cytokine production and, possibly, distal organ failure. Clinical studies have shown the relationship between pulmonary distension and mortality in patients with ventilator-induced lung injury. However, although the cytoskeleton plays a fundamental role in the pathogenesis of ventilator-induced lung injury, there have been few in vivo studies of alterations in the cytoskeleton and in cytoskeleton-associated proteins during this pathological process.

Na década de 80 descobriu-se que a exposição crónica ao ruído de baixa frequência pode causar a Doença Vibroacústica (DVA), uma patologia sistémica causada pela exposição prolongada (>10 anos) a ruído de grandes amplitudes de pressão (≥90 dB Sound Pressure Level) e baixa frequência (≤500 Hertz, incluindo os infrasons). Caracteriza-se pela proliferação anormal das matrizes extra-celulares (colagénio e elastina) em resposta à ‘agressão’ causada pelo impacto e propagação das vibrações acústicas sobre as células (mecanotransdução). Afecta preferencialmente as estruturas cardiovasculares (espessamento do pericárdio e válvulas cardíacas), o aparelho respiratório e o SNC. O RBF foi inicialmente identificado em ambientes de indústria pesada, mas com os avanços da investigação, demonstrou-se que está presente em áreas urbanas, algumas áreas rurais, numerosos locais de trabalho e numa grande variedade de outros locais e actividades de lazer, representando um problema de Saúde Pública. Pretende-se sistematizar a informação existente sobre a Doença Vibroacústica e estudos desenvolvidos em modelos animais e seres humanos, no sentido de explicar e demonstrar os efeitos deletérios/nocivos do RBF sobre os tecidos biológicos. Como o RBF não é ‘audível’, ainda não é oficialmente considerado um agente patológico e, como tal, as medições acústicas previstas pela lei raramente têm em conta as frequências abaixo de 500Hz. Desta forma/Nesta sequência, pretende-se também analisar a evolução da legislação nesta área de Saúde Pública, tendo como referência DVA, enquanto doença profissional e o RBF, como agente causador. A investigação detalhada da Doença Vibroacústica está dependente do reconhecimento do RBF como agente patológico. Quando forem conhecidos os efeitos específicos dose-frequência, poderão desenvolver-se estudos epidemiológicas em larga escala, que permitam conhecer o verdadeiro impacto do RBF sobre a humanidade. Só então poderá ser reavaliado o papel da DVA como doença profissional, equacionando novas estratégias de prevenção e tratamento. In the late 80’s it was found that chronic exposure to low frequency noise can cause Vibroacoustic disease, a systemic disease caused by long-term exposure (> 10 years) to large amplitude (≥ 90 dB) and low frequency noise (≤ 500 Hertz, including infrasound). It is characterized by abnormal proliferation of extra-cellular matrices (collagen and elastin) in response to the aggression caused by the impact and propagation of acoustic vibrations throughout the cells (mechanotransduction). It preferentially affects the cardiovascular structures (thickening of the pericardium and heart valves), respiratory tract and CNS. Low frequency noise was first identified in heavy industry environments, but with the advances in research, it was also demonstrated in other workplaces, urban areas, some rural areas and many leisure activities, representing a public health problem. The aim of this paper is to systematize the data on Vibroacoustic Disease, experiments in animal models and humans, in order to explain and demonstrate the effects of RBF on biological tissues. Since low frequency noise is not audible, it still has not been officially considered as a pathological agent. As such, noise measurements provided by Portuguese law rarely take into account the frequencies below 500Hz. Subsequently, this paper also intends to analyze the evolution of legislation in this area of Public Health, with reference to Vibroacoustic Disease as an occupational disease and low frequency noise as the causative agent. Further investigation upon Vibroacoustic Disease depends on the recognition of low frequency noise as a harmful agent. Further knowledge about the acoustical spectrum and specific dose-effects may provide the scientific basis to the development of wide-range epidemiological studies and better understanding of the true impact of low frequency noise on humanity. Only then the role of Vibroacoustic Disease as an occupational disease can be re-evaluated, new strategies for prevention and treatment can be re-equated.

Sob a influência da gravidade, o tecido ósseo sofre maior ou menor deformação de acordo com a intensidade das atividades da vida diária. Sabe-se que as atividades que resultam em impacto são as que mais estimulam a osteogênese e assim reduzem a perda de massa óssea. Conhecer como as células ósseas reconhecem a deformação mecânica imposta ao osso e iniciam uma série de reações bioquímicas em cadeia é de fundamental importância para o desenvolvimento de práticas terapêuticas e preventivas na atividade ortopédica. Ainda há um longo caminho para o entendimento de todo esse processo, mas o conhecimento atual progrediu bastante e há pesquisas com finalidade terapêutica. O sinal mecânico para ser transformado em biológico (mecanotransdução) deve ser amplificado no nível celular pela estrutura histológica do tecido ósseo, gerando tensões em proteínas da membrana celular (integrinas) e alterando a estrutura espacial dessas proteínas. Essa alteração ativa ligações entre elas e o citoesqueleto, originando as adesões focais, locais onde proteínas citoplasmáticas são recrutadas para facilitar as reações bioquímicas. A quinase de adesão focal (FAK) é a principal delas, sendo autoativada após sofrer alteração estrutural pelas integrinas. A FAK ativada incita reações em cascata, resultando na ativação da ERK-1/2 e da Akt, proteínas que, junto com a FAK, regulam a produção da massa óssea. Acredita-se que o osteócito seja a célula óssea responsável por reconhecer o estímulo mecânico e transmiti-lo aos osteoblastos e osteoclastos. Canais iônicos e gap junctions são cogitados como meios de comunicação intercelular para a transmissão bioquímica do estímulo mecânico. Esses eventos ocorrem continuamente no tecido ósseo e regulam a remodelação óssea. Influenced by gravidity, bone tissue experiences stronger or lighter deformation according to the strength of the activities of daily life. Activities resulting in impact are particularly known to stimulate osteogenesis, thus reducing bone mass loss. Knowing how bone cells recognize the mechanical deformation imposed to the bone and trigger a series of biochemical chain reactions is of crucial importance for the development of therapeutic and preventive practices in orthopaedic activity. There is still a long way to run until we can understand the whole process, but current knowledge has shown a strong progression, with researches being conducted focused on therapies. For a mechanical sign to be transformed into a biological one (mechanotransduction), it must be amplified at cell level by the histological structure of bone tissue, producing tensions in cell membrane proteins (integrins) and changing their spatial structure. Such change activates bindings between these and the cytoskeleton, producing focal adhesions, where cytoplasmatic proteins are recruited to enable easier biochemical reactions. Focal adhesion kinase (FAK) is the most important one being self-activated when its structure is changed by integrins. Activated FAK triggers a cascade of reactions, resulting in the activation of ERK-1/2 and Akt, which are proteins that, together with FAK, regulate the production of bone mass. Osteocytes are believed to be the mechanosensor cells of the bone and to transmit the mechanical deformation to osteoblasts and osteoclasts. Ionic channels and gap junctions are considered as intercellular communication means for biochemical transmission of a mechanical stimulus. These events occur continuously on bone tissue and regulate bone remodeling.

Various approaches have been taken to improve our knowledge of the microenvironmental regulation of limbal epithelial stem cells. Researchers have extensively investigated the roles of growth factors, survival factors, cytokines, enzymes, and permeable molecules secreted by the limbal cells. However, recent evidence suggests that stem cell fate (i.e., self-renewal or differentiation) can also be influenced by biophysical and mechanical cues related to the supramolecular organization and the liquid crystalline (mesophase) nature of the stromal extracellular matrix. These cues can be sensed by stem cells and transduced into intracellular biochemical and functional responses, a process known as mechanotransduction. The objective of this review is to offer perspectives on the supramolecular microenvironmental regulation of limbal epithelial stem cells and the differentiation of their progeny. RESUMO Muitas abordagens têm sido utilizadas para ampliar entendimentos sobre a regulação microambiental das células tronco epiteliais limbais. Neste contexto, pesquisadores têm exaustivamente investigado a participação de fatores de crescimento, fatores de sobrevida, citocinas, enzimas e moléculas permeáveis secretadas pelas células limbais. Entretanto, evidências recentes sugerem que o destino (ie. autorrenovação ou recrutamento para a via de diferenciação) das células tronco também sofre influência de estímulos biofísicos ou mecânicos relacionados à organização supramolecular e à natureza liquido-cristalina (mesofases) da matriz extracelular estromal. Esses estímulos podem ser percebidos e traduzidos pelas células tronco em sinais bioquímicos que geram respostas funcionais, através de um processo designado de mecanotransdução. Objetiva-se, com a presente revisão, oferecer ao leitor perspectivas supramoleculares sobre a regulação microambiental das células tronco epiteliais limbais e a diferenciação de sua progênie.