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El ácido ascórbico es un compuesto muy abundante en las plantas. Las funciones de este metabolito son muy diversas y se puede destacar su función como antioxidante, su participación en la optimización de la fotosíntesis, como así también en procesos de crecimiento y división celular. También cumple un papel importante como cofactor de enzimas dioxigenasas que participan de la síntesis de polisacáridos y de la síntesis de hormonas como giberelinas, etileno y ácido abscísico. La principal vía de síntesis de ácido ascórbico en plantas es la ruta de la galactosa o ruta de Smirnoff–Wheeler. En esta ruta, la enzima GDP-L-galactosa fosforilasa es la primera enzima exclusivamente implicada en la síntesis de ácido ascórbico y un punto clave de regulación en la síntesis de este metabolito. El uso de mutantes de Arabidopsis deficientes en la actividad de distintas enzimas que participan en la síntesis de ácido ascórbico ha permitido el estudio de las funciones de este metabolito principalmente en hojas. La obtención reciente de dos líneas independientes (slggp1) de plantas de tomate de la variedad Micro-Tom, con mutaciones que generan la pérdida de función de la enzima GDP-L-galactosa fosforilasa, permitió estudiar en esta tesis la participación del ácido ascórbico en la maduración de los frutos. Se midió el contenido de ascórbico en hojas, raíces, flores y frutos. La deficiencia de esta enzima no afectó por igual el contenido de ácido ascórbico en los distintos órganos de la planta. Se observó una reducción del 65% en hojas, 55% en frutos, 48% en raíz, y 45% en flores, del contenido de ascórbico con respecto al genotipo silvestre. Sin embargo, no se observó un efecto de la deficiencia de esta enzima sobre el balance redox del pool de ácido ascórbico en ningún órgano. Se realizó una caracterización fenológica y morfológica de las plantas mutantes. Se observó que la deficiencia en GDP-L-galactosa fosforilasa produce alteraciones morfológicas, como una mayor longitud del tallo; y alteraciones en el desarrollo, como un retraso en la floración y en el tiempo de maduración de los frutos en planta. Además, los mutantes slggp1 presentaron una disminución del cuajado de frutos y un menor rendimiento que la línea silvestre. Por otro lado, se observó un mayor tamaño de los frutos en los mutantes slggp1, que aumentó en compensación a la reducción del número, pero no lo suficiente como para alcanzar el rendimiento de plantas silvestres. También, se llevó a cabo un análisis del efecto de la deficiencia en GDP-L-galactosa fosforilasa en la actividad fotosintética. Los mutantes slggp1 presentan una reducción del 50% en la tasa de asimilación de CO2 asociada a una reducción del 65% en la conductancia estomática. La tasa fotosintética de transporte electrónico, medida por fluorescencia modulada de la clorofila y la fotosíntesis potencial, medida como producción de O2 en concentraciones saturantes de CO2 mostraron una menor reducción, 10 y 19% respectivamente. Estos resultados sugieren que la conductancia estomática limita la fotosíntesis en las plantas mutantes. Para determinar si la reducción de la fotosíntesis impacta en el rendimiento se realizaron experimentos con distintas relaciones fuente-destino. Los resultados obtenidos en estos ensayos indican que el suministro de asimilados no constituye un factor limitante para el rendimiento ya que la reducción de la fuente no genera un impacto sobre el porcentaje de cuajado de frutos. Se observó que la disminución en el cuajado de frutos en los mutantes slggp1 es causada directamente por la deficiencia de ácido ascórbico, dado que esto puedo ser revertido parcialmente mediante la suplementación de este antioxidante de forma exógena. A partir de la determinación del contenido de hormonas en flores se observó una reducción del contenido de giberelinas en los mutantes deficientes en ácido ascórbico. Esta modificación hormonal podría ser la causa de la menor eficiencia en el cuajado de frutos de los genotipos. Se caracterizó el efecto de la mutación durante la maduración en planta y durante la maduración en postcosecha de los frutos. Se observaron efectos de la deficiencia en GDP-L-galactosa fosforilasa en la producción de etileno, la tasa de ablandamiento y la acumulación de azúcares durante la maduración. A partir de un análisis de expresión génica se observó que la deficiencia en GDP-L-galactosa fosforilasa aumenta la expresión de genes cuesta arriba en la vía de síntesis de ácido ascórbico y en genes que codifican enzimas que vinculan la ruta de síntesis de ácido ascórbico con el metabolismo de pared celular. Además, se observó una mayor expresión de genes del reciclado del ácido ascórbico en los mutantes slggp1 y de la isoenzima GDP-L-galactosa fosforilasa 2, lo que podría indicar una compensación ante la deficiencia en GDP-L-galactosa fosforilasa 1. Por otro lado, se analizó la expresión de genes que codifican receptores de etileno. Se observó una mayor expresión de estos genes tanto en hojas como en frutos de los mutantes slggp1, indicando que la deficiencia de GDP-L-galactosa fosforilasa o particularmente la deficiencia de ácido ascórbico tienen un efecto tanto sobre la síntesis como sobre los mecanismos de percepción de etileno en plantas de tomate. En conjunto estos resultados indican que las deficiencias de GDP-L-galactosa fosforilasa y de ácido ascórbico, provocan un impacto sobre el desarrollo fenológico, el proceso de cuajado y la maduración de los frutos, posiblemente a través de alteraciones hormonales., Facultad de Ciencias Naturales y Museo

Ascorbic acid (AsA) and gluthathione (GSH) are two key components of the antioxidant machinery of eukaryotic and prokaryotic cells. The cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 presents both compounds in different concentrations (AsA, 20-100 μM and GSH, 2-5 mM). Therefore, it is important to have precise and sensitive methods to determine the redox status in the cell and to detect variations in this antioxidants. In this protocol, we describe an improved method to estimate the content of both antioxidants (in their reduced and oxidized forms) from the same sample obtained from liquid cultures of Synechocystis sp. PCC 6803., Instituto de Fisiología Vegetal

The oxidant/antioxidant balance affects the ripening time of tomato fruit. Ripening of tomato fruit is associated with several modifications such as loss of cell wall firmness and transformation of chloroplasts to chromoplasts. Besides a peak in H2O2, reactive oxygen species (ROS) are observed at the transition stage. However, the role of different components of oxidative stress metabolism in fruit ripening has been scarcely addressed. Two GDP-l-galactose phosphorylase (GGP) Solanum lycopersicum L. cv Micro-Tom mutants which have fruit with low ascorbic acid content (30% of wild type) were used in this work to unravel the participation of ascorbic acid and H2O2 in fruit maturation. Both GGP mutants show delayed fruit maturation with no peak of H2O2; treatment with ascorbic acid increases its own concentration and accelerates ripening only in mutants to become like wild type plants. Unexpectedly, the treatment with ascorbic acid increases H2O2 synthesis in both mutants resembling what is observed in wild type fruit. Exogenous supplementation with H2O2 decreases its own synthesis delaying fruit maturation in plants with low ascorbic acid content. The site of ROS production is localized in the chloroplasts of fruit of all genotypes as determined by confocal microscopy analysis. The results presented here demonstrate that both ascorbic acid and H2O2 actively participate in tomato fruit ripening., Instituto de Fisiología Vegetal

Blueberries are a perishable fruit that loses its firmness and weight rapidly after harvest. High concentrations of ascorbic acid (AA) and phenolic compounds such as anthocyanins are important attributes contributing to the quality of the fruit. The aim of this work is to extend the postharvest life of three blueberries cultivars; ‘Mistý and ‘Blue Cuinex́, firm and soft cultivars respectively and ‘Blue Chiṕ with intermediate firmness. The fruit was treated separately or in combination with a nitric oxide donor, S-nitrosoglutathione (GSNO) and 1-methylcyclopropene (1-MCP) and stored at 4 °C for 14 d. The best treatment for ‘Blue Cuinex́ was the combination of 1- MCP and GSNO, while ‘Mistý softened slower when treated with 1-MCP, and ‘Blue Chiṕ was not affected by treatment. The 1-MCP+ GSNO treatment maintained higher concentrations of AA and GSH in ‘Blue Cuinex́. AA concentrations declined in ‘Mistý but did not respond to GSNO. The combination of 1-MCP and GSNO extended the postharvest life of ‘Blue Cuinex́ by improving the concentrations of AA and glutathione in the berries but not for ‘Mistý. These results demonstrate that blueberry cultivars respond differentially to 1-MCP and nitric oxide, and that the sequence of application could be used to slow fruit softening and maintain antioxidant properties., Instituto de Fisiología Vegetal

Reduced GDP-l-galactose phosphorylase expression and deficiency of ascorbic acid content lead to decreased fruit set and yield in tomato plants. Reduced GDP-l-galactose phosphorylase expression and deficiency of ascorbic acid content lead to decreased fruit set and yield in tomato plants. GDP-l-galactose phosphorylase (GGP) catalyzes the first step committed to ascorbic acid synthesis. The participation of GDP-l-galactose phosphorylase and ascorbate in tomato fruit production and quality was studied in this work using two SlGGP1 deficient EMS Micro-Tom mutants. The SlGGP1 mutants display decreased concentrations of ascorbate in roots, leaves, flowers, and fruit. The initiation of anthesis is delayed in ggp1 plants but the number of flowers is similar to wild type. The number of fruits is reduced in ggp1 mutants with an increased individual weight. However, the whole fruit biomass accumulation is reduced in both mutant lines. Fruits of the ggp1 plants produce more ethylene and show higher firmness and soluble solids content than the wild type after the breaker stage. Leaf CO2 uptake decreases about 50% in both ggp1 mutants at saturating light conditions; however, O2 production in an enriched CO2 atmosphere is only 19% higher in wild type leaves. Leaf conductance that is largely reduced in both mutants may be the main limitation for photosynthesis. Sink-source assays and hormone concentration were measured to determine restrictions to fruit yield. Manipulation of leaf area/fruit number relationship demonstrates that the number of fruits and not the provision of photoassimilates from the source restricts biomass accumulation in the ggp1 lines. The lower gibberellins concentration measured in the flowers would contribute to the lower fruit set, thus impacting in tomato yield. Taken as a whole these results demonstrate that ascorbate biosynthetic pathway critically participates in tomato development and fruit production., Instituto de Fisiología Vegetal

Ferroptosis is an oxidative iron-dependent form of cell death recently described in eukaryotic organisms like animals, plants and parasites. Here we report that a similar process takes place in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 in response to heat stress. After a heat shock, Synechocystis cells undergo a cell death pathway that can be suppressed by canonical ferroptosis inhibitors or by external addition of calcium, glutathione or ascorbic acid. Moreover, as described for eukaryotic cells ferroptosis, this pathway is characterized by an early depletion of antioxidants, and by lipid peroxidation. As in general prokaryotes membranes contain poorly oxidizable saturated or monounsaturated lipid molecules, it was thought that they were not susceptible to ferroptosis. Interestingly, cyanobacteria contain thylakoid membranes that are enriched in polyunsaturated-fatty-acid-containing phospholipids, which might explain their sensitivity to ferroptosis. These results indicate that all of the hallmarks described for eukaryotic ferroptosis are conserved in photosynthetic prokaryotes and suggest that ferroptosis might be an ancient cell death program., Instituto de Fisiología Vegetal

Ferroptosis is an oxidative and iron-dependent form of regulated cell death (RCD) recently described in eukaryotic organisms like animals, plants, and parasites. Here, we report that a similar process takes place in the photosynthetic prokaryote Synechocystis sp. PCC 6803 in response to heat stress. After a heat shock, Synechocystis sp. PCC 6803 cells undergo a cell death pathway that can be suppressed by the canonical ferroptosis inhibitors, CPX, vitamin E, Fer-1, liproxstatin-1, glutathione (GSH), or ascorbic acid (AsA). Moreover, as described for eukaryotic ferroptosis, this pathway is characterized by an early depletion of the antioxidants GSH and AsA, and by lipid peroxidation. These results indicate that all of the hallmarks described for eukaryotic ferroptosis are conserved in photosynthetic prokaryotes and suggest that ferroptosis might be an ancient cell death program. Fil: Aguilera, Anabella. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología; Argentina Fil: Berdun, Federico Juan. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología; Argentina Fil: Bartoli, Carlos Guillermo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Fisiología Vegetal. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Naturales y Museo. Instituto de Fisiología Vegetal; Argentina Fil: Steelheart Molina, Maria Charlotte. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Fisiología Vegetal. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Naturales y Museo. Instituto de Fisiología Vegetal; Argentina Fil: Alegre, Matías. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Fisiología Vegetal. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Naturales y Museo. Instituto de Fisiología Vegetal; Argentina Fil: Bayir, Hülya. University of Pittsburgh; Estados Unidos Fil: Tyurina, Yulia Y.. University of Pittsburgh; Estados Unidos Fil: Kagan, Valerian E.. University of Pittsburgh; Estados Unidos Fil: Salerno, Graciela Lidia. Fundación para Investigaciones Biológicas Aplicadas; Argentina Fil: Pagnussat, Gabriela Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina Fil: Martin, María Victoria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología; Argentina