Search

The rapid increase in lipidomic data has triggered a community-based movement to develop guidelines and minimum requirements for generating, reporting and publishing lipidomic data. The creation of a dynamic checklist summarizing key details of lipidomic analyses using a common language has the potential to harmonize the field by improving both traceability and reproducibility., Rychlý nárust lipidomických dat vyvolal komunitní posun pro vypracování pokynů a minimálních požadavků na tvorbu, vykazování a zveřejňování lipidomických dat. Vytvoření dynamického kontrolního seznamu, který shrnuje klíčové detaily lipidomických analýz za použití společného jazyka, má potenciál zlepšit sledovatelnost i reprodukovatelnost.

Tato práce byla zaměřena na vývoj nové derivatizační metody pro stanovení sterolů, prenolů a neutrálních lipidů pomocí kyseliny 3-(chlorsulfonyl)benzoové. Byla optimalizována metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie s obracenými fázemi spojenou s tandemovou hmotnostní spektrometrií (RP-UHPLC/MS/MS) pro detekci těchto tříd lipidů v režimu negativních iontů. Zoptimalizovaná metoda byla použita pro identifikaci sterolů, prenolů, monoacylglycerolů a diacylglycerolů v lidské plazmě., This thesis was focused on the development of novel derivatization method for sterols, prenols, and neutral lipids using 3-(chlorosulfonyl)benzoic acid. The method using reversed phase ultrahigh-performance chromatography coupled with tandem mass spectrometry (RP-UHPLC/MS/MS) was optimized for the detection of these lipid classes in the negative ion mode. The fully optimized method was applied for the identification of sterols, prenols, monoacylglycerols, and diacylglycerols in human plasma., Fakulta chemicko-technologická, Studentka přednesla výsledky své diplomové práce, poté byla seznámena s posudky vedoucího a oponenta diplomové práce. Studentka zodpověděla dotazy oponenta a členů komise., Dokončená práce s úspěšnou obhajobou

The applicability of ultrahigh-performance supercritical fluid chromatography coupled with mass spectrometry (UHPSFC/MS) for the qualitative analysis of metabolites with a wide polarity range (log P: -3.89-18.95) was evaluated using a representative set of 78 standards belonging to nucleosides, biogenic amines, carbohydrates, amino acids, and lipids. The effects of the gradient shape and the percentage of water (1, 2, and 5%) were investigated on the Viridis BEH column. The screening of eight stationary phases was performed for columns with different interaction sites, such as hydrogen bonding, hydrophobic, pi-pi, or anionic exchange type interactions. The highest number of compounds (67) of the set studied was detected on the Torus Diol column, which provided a resolution parameter of 39. The DEA column had the second best performance with 58 detected standards and the resolution parameter of 54. The overall performance of other parameters, such as selectivity, peak height, peak area, retention time stability, asymmetry factor, and mass accuracy, led to the selection of the Diol column for the final method. The comparison of additives showed that ammonium acetate gave a superior sensitivity over ammonium formate. Moreover, the influence of the ion source on the ionization efficiency was studied by employing atmospheric pressure chemical ionization (APCI) and electrospray ionization (ESI). The results proved the complementarity of both ionization techniques, but also the superior ionization capacity of the ESI source in the negative ion mode, for which 53% of the analytes were detected compared to only 7% for the APCI source. Finally, optimized analytical conditions were applied to the analysis of a pooled human plasma sample. 44 compounds from the preselected set were detected in human plasma using ESI-UHPSFC/MS in MS E mode considering both ionization modes. (C) 2022 Published by Elsevier B.V., Použitelnost vysokoúčinné superkritické kapalinové chromatografie ve spojení s hmotnostní spektrometrií (UHPSFC/MS) pro kvalitativní analýzu metabolitů s širokým rozsahem polarity (log P: -3,89-18,95) byla hodnocena pomocí reprezentativní sady 78 standardů patřících k nukleosidům, biogenním aminům, sacharidům, aminokyselinám a lipidům. Účinky sklonu gradientu a procentuálního podílu vody (1, 2 a 5 %) byly zkoumány na koloně Viridis BEH. Prověrka osmi stacionárních fází byla provedena pro kolony s různými místy interakce, jako jsou interakce typu vodíkové vazby, hydrofobní, pí-pí nebo aniontová výměna. Nejvyšší počet sloučenin (67) studované sady byl detekován na koloně Torus Diol, která poskytla parametr rozlišení 39. Sloupec DEA měl druhý nejlepší výkon s 58 zjištěnými standardy a parametrem rozlišení 54. Celkový výkon dalších parametrů, jako je selektivita, výška píku, plocha píku, stabilita retenčního času, faktor asymetrie a přesnost hmotnosti, vedl k volbě Diol kolony pro finální metodu. Srovnání přídatných látek ukázalo, že octan amonný dává vyšší citlivost než mravenčan amonný. Vliv iontového zdroje na účinnost ionizace byl navíc zkoumán využitím chemické ionizace atmosférického tlaku (APCI) a elektrosprejové ionizace (ESI). Výsledky prokázaly komplementaritu obou ionizačních technik, ale také vyšší ionizační kapacitu zdroje ESI v režimu záporných iontů, pro který bylo detekováno 53% analytů oproti pouhým 7% u zdroje APCI. Nakonec byly na analýzu směsného vzorku lidské plazmy aplikovány optimalizované analytické podmínky. 44 sloučenin z předem vybrané sady bylo detekováno v lidské plazmě pomocí ESI-UHPSFC/MS v režimu MS(E) s ohledem na oba ionizační režimy.

Pavel Jandera was a world-leading analytical chemist who devoted his entire professional life to research in the field of high-performance liquid chromatography. During his scientific career, he worked at the Department of Analytical Chemistry at the University of Pardubice, Czech Republic. His greatest contribution to the field of liquid chromatography was the introduction of a comprehensive theory of liquid chromatography with programmed elution conditions. He was also involved in the research of gradient elution techniques in preparative chromatography, modeling of retention and selectivity in various phase systems, preparation of organic monolithic microcolumns, and, last but not least, in the development of theory and practical applications of two-dimensional liquid chromatography, mainly in the comprehensive form. In this review article, we have tried to capture the highlights of his scientific career and provide the readers with a detailed overview of Pavel Jandera's contribution to the evolution of separation sciences., Pavel Jandera byl předním světovým analytickým chemikem, který celý svůj profesní život zasvětil výzkumu v oblasti vysokoúčinné kapalinové chromatografie. Během své vědecké kariéry působil na katedře analytické chemie Univerzity Pardubice. Jeho největším přínosem pro obor kapalinové chromatografie bylo zavedení ucelené teorie kapalinové chromatografie s programovanými elučními podmínkami. Dále se podílel na výzkumu gradientových elučních technik v preparativní chromatografii, modelování retence a selektivity v různých fázových systémech, přípravě organických monolitických mikrokolon a v neposlední řadě na rozvoji teorie a praktických aplikací dvourozměrné kapalinové chromatografie, především v komplexní podobě. V tomto přehledovém článku jsme se pokusili zachytit nejdůležitější momenty jeho vědecké kariéry a poskytnout čtenářům podrobný přehled o přínosu Pavla Jandery k rozvoji separačních věd.

RCC, the most common type of kidney cancer, is associated with high mortality. A non-invasive diagnostic test remains unavailable due to the lack of RCC-specific biomarkers in body fluids. We have previously described a significantly altered profile of sulfatides in RCC tumor tissues, motivating us to investigate whether these alterations are reflected in collectible body fluids and whether they can enable RCC detection. Methods: We collected and further analyzed 143 plasma, 100 urine, and 154 tissue samples from 155 kidney cancer patients, together with 207 plasma and 70 urine samples from 214 healthy controls. Results: For the first time, we show elevated concentrations of lactosylsulfatides and decreased levels of sulfatides with hydroxylated fatty acyls in body fluids of RCC patients compared to controls. These alterations are emphasized in patients with the advanced tumor stage. Classification models are able to distinguish between controls and patients with RCC. In the case of all plasma samples, the AUC for the testing set was 0.903 (0.844–0.954), while for urine samples it was 0.867 (0.763–0.953). The models are able to efficiently detect patients with early and late-stage RCC based on plasma samples as well. The test set sensitivities were 80.6% and 90%, and AUC values were 0.899 (0.832–0.952) and 0.981 (0.956–0.998), respectively. Conclusion: Similar trends in body fluids and tissues indicate that RCC influences lipid metabolism, and highlight the potential of the studied lipids for minimally-invasive cancer detection, including patients with early tumor stages, as demonstrated by the predictive ability of the applied classification models., Renální karcinom ledvin (RCC) je nejběžnějším typem rakoviny ledvin a je spojován s vysokou mortalitou. V tělních tekutinách nebyl doposud objeven žádný specifický biomarker pro RCC v tělních tekutinách, takže stále neexistuje žádný neinvazivní diagnostický test. Nedávno jsme popsali významně změněný profil sulfatidů v RCC nádorových tkáních, což nás motivovalo zjistit, zdali jsou tyto alterace specifických lipidů reflektovány i ve sbíraných tělních tekutinách pacientů, a zdali umožňují detekci RCC. Metoda: Pro tento účel jsme nasbírali a následně analyzovali 143 vzorků plazmy, 100 vzorků moči a 154 vzorků tkání od 155 pacientů s rakovinou a společně s tím jsme nasbírali dále 207 vzorků plazmy, 70 vzorků moči od 214 zdravých kontrol. Výsledky: V této práci poprvé popisujeme zvýšené koncentrace laktosylsulfatidů a snížené hladiny sulfatidů s hydroxylovanými mastnými acyly v tělních tekutinách pacientů s RCC ve srovnání s kontrolami. Tyto změny jsou vyšší u pacientů s pokročilým stádiem nádoru. Použité klasifikační modely dokáží rozlišit pacienty s RCC od kontrol. V případě všech měřených vzorků plazmy byla AUC pro testovací sadu 0,903 (0,844-0,954), zatímco u vzorků moči 0,867 (0,763-0,953). Na základě vzorků plazmy jsou modely schopny efektivně detekovat i pacienty s časným a pozdním stadiem RCC. Citlivost testovacího setu byla 80,6 % a 90 % a hodnoty AUC byly 0,899 (0,832–0,952) pro pacienty s časným stádiem, resp. 0,981 (0,956–0,998) pro pacienty s pokročilým stádiem rakoviny. Závěr: Podobné trendy v tělních tekutinách a tkáních naznačují, že RCC ovlivňuje metabolismus lipidů, a zdůrazňují potenciál studovaných lipidů pro minimálně invazivní detekci rakoviny, včetně pacientů s ranými stadii nádoru, jak dokazuje prediktivní schopnost aplikovaných klasifikačních modelů.

Diplomová práce se zabývá vývojem a optimalizací metody pro analýzu nepolárních lipidů, jmenovitě mastných kyselin, sterolů, cholesterolesterů a mono-, di- a triacylglycerolů, pomocí spojení ultravysokoúčinné superkritické fluidní chromatografie (UHPSFC) s hmotnostní spektrometrií (MS) v biologických vzorcích. V teoretické části jsou shrnuty základní informace o lipidech, lipidomické analýze, separačních technikách, zejména pak UHPSFC a MS. Cílem práce bylo zoptimalizovat metodu pro stanovení nepolárních lipidů a následně ji pak aplikovat na analýzu různých biologických vzorků a výsledná data mezi sebou porovnat., The diploma thesis focuses on the development and optimalization of method for determination of nonpolar lipids in biological samples, namely fatty acids, sterols, cholesterolesters and mono-, di- and triacylglycerols, by using ultrahigh-performance supercritical fluid chromatography (UHPSFC) with mass spectrometry (MS). The theoretical part summarises the basic information about lipids, lipidomic analysis, chromatographic techniques, mostly UHPSFC and MS. The aim of this work was to optimize the method for determination of nonpolar lipids, and the application of the optimized method for biological samples, and the comparison of the resulting data., Fakulta chemicko-technologická, Studentka přednesla výsledky své diplomové práce, poté byla seznámena s posudky vedoucího a oponenta diplomové práce. Studentka zodpověděla dotazy oponenta a členů komise., Dokončená práce s úspěšnou obhajobou

Tato diplomová práce je zaměřená na vývoj a optimalizaci metody ultravysokoúčinné kapalinové chromatografie hydrofilních interakcí s hmotnostně spektrometrickou detekcí (HILIC-UHPLC/MS) a jejím využitím pro identifikaci metabolitů v lidské plazmě. Teoretická část je rozdělena na čtyři časti. První část se zabývá obecnými informacemi o metabolitech a jejich funkcí v lidském organismu. Druhá část je zaměřena na hmotnostní spektrometrií a bližší vysvětlení instrumentace používané v metabolomice. V třetí části jsou shrnuty všeobecné informace o kapalinové chromatografii se zaměřením na HILIC separaci. Poslední teoretická část je zaměřena na metabolomickou analýzu. V experimentální části jsou shrnuty výsledné postupy a použité parametry při analýze lidské plazmy a v závěrečné diskuzi jsou poté zhodnoceny a diskutovány výsledky této diplomové práce., This thesis is focused on the development and optimization of the hydrophilic interaction ultrahigh-performance liquid chromatography with mass spectrometric detection (HILIC UHPLC/MS) and its use for the identification of metabolites in human plasma. The theoretical part is divided into four parts. The first part deals with general information about metabolites and their function in the human organism. The second part is focused on mass spectrometry and a closer explanation of the instrumentation used in metabolomics. The third part summarizes general information about liquid chromatography with a focus on HILIC separation. The last theoretical part is focused on the overall metabolomic analysis. In the experimental part, the resulting procedures and the parameters used in the analysis of human plasma are summarized, and in the final discussion, results of this diploma thesis are then evaluated and discussed., Fakulta chemicko-technologická, Studentka přednesla výsledky své diplomové práce, poté byla seznámena s posudky vedoucího a oponenta diplomové práce. Studentka zodpověděla dotazy oponenta a členů komise., Dokončená práce s úspěšnou obhajobou

Lipid metabolites, beyond triglycerides and cholesterol, have been shown to have vast potential for applications in clinical applications, with substantial societal and economical value. To successfully evolve from the current research-grade methods to assays suitable for routine clinical applications, a harmonization - if not standardization - of these mass spectrometry-based workflows is necessary. Input on clinical needs and technological capabilities must be obtained from all relevant stakeholders, including wet lab scientists, informaticians and data scientists, manufacturers, and medical professionals. In order to build bridges between this diverse group of professionals, the International Lipidomics Society and its Clinical Lipidomics Interest Group were created. This opinion article is intended to provide an overview of international efforts to tackle the issues of workflow harmonization, and to serve as an open invitation for others to join this growing community., Ukázalo se, že kromě triacylglycerolů a cholesterolu mají lipidové metabolity obrovský potenciál pro použití v klinických aplikacích. K úspěšnému vývoji od současných metod výzkumných stupňů k testům vhodným pro běžné klinické aplikace je nutná harmonizace těchto pracovních postupů založených na hmotnostní spektrometrii. Informace o klinických potřebách a technologických schopnostech musí být získány od všech příslušných zúčastněných stran, včetně vědců v laboratořích, informatiků a datových vědců, výrobců a zdravotnických odborníků. Za účelem vybudování mostů mezi touto různorodou skupinou profesionálů vznikla Mezinárodní lipidomická společnost a její zájmová skupina Klinická lipidomika. Tento článek má poskytnout přehled o řešení problematiky harmonizace pracovních postupů a sloužit jako otevřená výzva pro ostatní, aby se připojili k této rozrůstající se komunitě.

Lung cancer represents one of the leading worldwide causes of cancer death, but the pathobiochemistry of this disease is still not fully understood. Here we characterize the lipidomic and metabolomic profiles of the tumor and surrounding normal tissues for 23 patients with non-small cell lung cancer. In total, 500 molecular species were identified and quantified by a combination of the lipidomic shotgun tandem mass spectrometry (MS/MS) analysis and the targeted metabolomic approach using liquid chromatography (LC) – MS/MS. The statistical evaluation includes multivariate and univariate methods with the emphasis on paired statistical approaches. Our research revealed significant changes in several biochemical pathways related to the central carbon metabolism, acylcarnitines, dipeptides as well as the disruption in the lipid metabolism observed mainly for glycer- ophospholipids, sphingolipids, and cholesteryl esters., Rakovina plic představuje jednu z předních celosvětových příčin úmrtí na rakovinu, ale patobiochemie tohoto onemocnění stále není plně pochopena. Zde charakterizujeme lipidomické a metabolomické profily nádoru a okolních normálních tkání pro 23 pacientů s nemalobuněčným karcinomem plic. Celkem bylo identifikováno a kvantifikováno 500 molekulárních druhů kombinací shotgun lipidomické tandemové hmotnostní spektrometrie (MS/MS) a cíleného metabolomického přístupu s využitím kapalinové chromatografie (LC) – MS/MS. Statistické hodnocení zahrnuje vícerozměrné a jednorozměrné metody s důrazem na párové statistické přístupy. Náš výzkum odhalil významné změny v několika biochemických drahách souvisejících s centrálním metabolismem uhlíku, acylkarnity, dipeptidy, stejně jako narušení metabolismu lipidů pozorované hlavně u glykofosfolipidů, sfingolipidů a cholesterylesterů.

Ultrahigh-performance supercritical fluid chromatography/mass spectrometry (UHPSFC/MS) is one of the fastest analytical approaches for high-throughput lipidomic analysis covering a wide range of lipid categories and classes. Lipid class separation and lipid species separation are two main separation modes available for the UHPSFC analysis of lipids. The mechanism of the lipid class separation mode is com-parable to that of hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC). The direct comparison of HILIC -ultrahigh-performance liquid chromatography (HILIC-UHPLC) and UHPSFC shows the applicability of UHPSFC/MS for high-throughput quantitation of both nonpolar and polar lipid classes, the faster analysis time, and comparable reproducibility and sensitivity. The retention mechanism of the lipid species separation mode is comparable to reversed-phase UHPLC, but the nonpolar character of supercritical carbon dioxide (scCO(2)) provides a different selectivity compared to that of conventional RP-UHPLC. The introduction of various hyphenation interfaces to MS broadens the applicability and sensitivity range of UHPSFC/MS using scCO(2) as the main component of the mobile phase. The addition of ionic additives (volatile salts, acids, and bases) to the modifier improves the separation of medium to polar lipids. Furthermore, UHPSFC/MS has also a great potential in the chiral separation of lipids, but the field has not yet been fully explored., Ultravysoko-účinná superkritická fluidní chromatografie / hmotnostní spektrometrie (UHPSFC/MS) je jedním z nejrychlejších analytických přístupů pro vysoce výkonnou lipidomickou analýzu pokrývající širokou škálu kategorií a tříd lipidů. Separace tříd lipidů a separace lipidových druhů jsou dva hlavní separační režimy dostupné pro analýzu lipidů UHPSFC. Mechanismus režimu separace lipidů je srovnatelný s mechanismem hydrofilní interakce kapalinová chromatografie (HILIC). Přímé srovnání HILIC-UHPLC a UHPSFC ukazuje použitelnost UHPSFC/MS pro vysoce výkonnou kvantifikaci nepolárních i polárních lipidových tříd, rychlejší dobu analýzy a srovnatelnou reprodukovatelnost a citlivost. Retenční mechanismus režimu separace lipidových druhů je srovnatelný s reverzní fází UHPLC, ale nepolární charakter superkritického oxidu uhličitého (scCO(2)) poskytuje odlišnou selektivitu ve srovnání s konvenčním RP-UHPLC. Zavedení různých rozhraní dělení do MS rozšiřuje použitelnost a rozsah citlivosti UHPSFC/MS s využitím scCO(2) jako hlavní složky mobilní fáze. Přidáním iontových aditiv (těkavých solí, kyselin a zásad) do modifikátoru se zlepšuje separace středních a polárních lipidů. Dále má UHPSFC/MS také velký potenciál v chirální separaci lipidů.

Pancreatic cancer has the worst prognosis among all cancers. Cancer screening of body fluids may improve the survival time prognosis of patients, who are often diagnosed too late at an incurable stage. Several studies report the dysregulation of lipid metabolism in tumor cells, suggesting that changes in the blood lipidome may accompany tumor growth. Here we show that the comprehensive mass spectrometric determination of a wide range of serum lipids reveals statistically significant differences between pancreatic cancer patients and healthy controls, as visualized by multivariate data analysis. Three phases of biomarker discovery research (discovery, qualification, and verification) are applied for 830 samples in total, which shows the dysregulation of some very long chain sphingomyelins, ceramides, and (lyso) phosphatidylcholines. The sensitivity and specificity to diagnose pancreatic cancer are over 90%, which outperforms CA 19-9, especially at an early stage, and is comparable to established diagnostic imaging methods. Furthermore, selected lipid species indicate a potential as prognostic biomarkers., Rakovina slinivky má nejhorší prognózu ze všech nádorů. Screening nádorových onemocnění tělními tekutinami může zlepšit časovou prognózu přežití pacientů, kteří jsou často diagnostikováni příliš pozdě v nevyléčitelném stadiu. Několik studií uvádí dysregulaci metabolismu lipidů v nádorových buňkách, což naznačuje, že změny v krevním lipidomu mohou doprovázet růst nádoru. Zde ukazujeme, že komplexní hmotnostní spektrometrické stanovení širokého spektra sérových lipidů odhaluje statisticky významné rozdíly mezi pacienty s rakovinou pankreatu a zdravými kontrolami, jak je vizualizováno multivariační analýzou dat. Tři fáze výzkumu v oblasti objevování biomarkerů (objev, kvalifikace a verifikace) jsou aplikovány celkem na 830 vzorků, což prokazuje dysregulaci některých velmi dlouhých řetězců sfingomyelinů, ceramidů a (lyso)fosfatidylcholinů. Senzitivita a specificita k diagnostice karcinomu slinivky břišní je více než 90%, což překonává CA 19-9, zejména v raném stadiu, a je srovnatelná se zavedenými diagnostickými zobrazovacími metodami. Vybrané druhy lipidů navíc indikují potenciál jako prognostické biomarkery.

In the last 2 decades, lipidomics has become one of the fastest expanding scientific disciplines in biomedical research. With an increasing number of new research groups to the field, it is even more important to design guidelines for assuring high standards of data quality. The Lipidomics Standards Initiative is a community-based endeavor for the coordination of development of these best practice guidelines in lipidomics and is embedded within the International Lipidomics Society. It is the intention of this review to highlight the most quality-relevant aspects of the lipidomics workflow, including pre- analytics, sample preparation, MS, and lipid species identification and quantitation. Furthermore, this review just does not only highlights examples of best practice but also sheds light on strengths, drawbacks, and pitfalls in the lipidomic analysis workflow. While this review is neither designed to be a step-by-step protocol by itself nor dedicated to a specific application of lipidomics, it should nevertheless provide the interested reader with links and original publications to obtain a comprehensive overview concerning the state-of-the-art practices in the field., V posledních dvou desetiletích se lipidomika stala jednou z nejrychleji se rozšiřujících vědních disciplín v biomedicínském výzkumu. Vzhledem k rostoucímu počtu nových výzkumných skupin v této oblasti je ještě důležitější navrhnout pokyny pro zajištění vysoké kvality údajů. Pro tento účel se snaží lipidomická komunita v rámci Mezinárodní lipidomické společnosti vyvinout doporučení, která splňují nejlepší praktické nároky v lipidomice. Záměrem tohoto přezkumu je poukázat na kvalitativně nejrelevantnější aspekty pracovního lipidomického postupu, včetně preanalytických prací, přípravy vzorku, MS a identifikace a kvantifikace lipidů. Kromě toho tento přehled nejen upozorňuje na příklady osvědčených postupů, ale také osvětluje silné stránky, nevýhody a nástrahy v pracovním postupu lipidomické analýzy. I když tato recenze není sama o sobě koncipována jako postupný protokol, ani se nevěnuje konkrétní aplikaci lipidomiky, měla by přesto zainteresovanému čtenáři poskytnout odkazy a publikace, aby získal komplexní přehled o nejmodernějších postupech v dané oblasti.

Glycosphingolipids (GSL) represent a highly heterogeneous class of lipids with many cellular functions, implicated in a wide spectrum of human diseases. Their isolation, detection, and comprehensive structural analysis is a challenging task due to the structural diversity of GSL molecules. In this work, GSL subclasses are isolated from human plasma using an optimized monophasic ethanol–water solvent system capable to recover a broad range of GSL species. Obtained deproteinized plasma is subsequently purified and concentrated by C18-based solid-phase extraction (SPE). The hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to electrospray ionization linear ion trap tandem mass spectrometry (HILIC-ESI-LIT-MS/MS) is used for GSL analysis in the human plasma extract. Our results provide an in-depth profiling and structural characterization of glycosph- ingolipid and some phospholipid subclasses identified in the human plasma based on their retention times and the interpretation of tandem mass spectra. The structural composition of particular lipid species is readily characterized based on the detailed interpretation of mass spectrometry (MS) and tandem mass spectrometry (MS/MS) spectra and further confirmed by specific fragmentation behavior following predictable patterns, which yields to the unambiguous identification of 154 GSL species within 7 lipid subclasses and 77 phospholipids representing the highest number of GSL species ever reported in the human plasma. The developed HILIC-ESI-MS/MS method can be used for further clinical and biological research of GSL in the human blood or other biological samples., Glykosfingolipidy (GSL) představují vysoce heterogenní třídu lipidů s mnoha buněčnými funkcemi, implikovanými do širokého spektra lidských onemocnění. Jejich izolace, detekce a komplexní strukturní analýza je náročným úkolem vzhledem ke strukturní rozmanitosti molekul GSL. V této práci jsou podtřídy GLS izolovány z lidské plazmy pomocí optimalizovaného monofázického systému rozpouštědla ethanol-voda schopného obnovit širokou škálu GSL. Získaná deproteinizovaná plazma se následně čistí a koncentruje extrakcí na pevné fázi na bázi C18 (SPE). Hydrofilní interakční kapalinová chromatografie spojená s tandemovou hmotnostní spektrometrií s elektrosprejovou ionizací a lineání iontovou pastí (HILIC-ESI-LIT-MS/MS) se používá pro analýzu GSL v lidském extraktu plazmy. Naše výsledky poskytují hloubkové profilování a strukturní charakterizaci glykosfingolipidu a některých fosfolipidových podtříd identifikovaných v lidské plazmě na základě jejich retenčních časů a interpretace tandemových hmotnostních spekter. Strukturní složení jednotlivých lipidů je snadno charakterizováno na základě podrobné interpretace hmotnostně spektrometrických (MS) a tandemových hmotnostně spektrometrických (MS/MS) spekter a dále potvrzeno specifickým fragmentačním chováním podle předvídatelných vzorců, což vede k jednoznačné identifikaci 77 fosfolipidů a 154 GSL v rámci 7 lipidových podtříd představujících nejvyšší počet GSL, který byl kdy v lidské plazmě hlášen. Vyvinutá metoda HILIC-ESI-MS/MS může být použita pro další klinický a biologický výzkum GSL v lidské krvi nebo jiných biologických vzorcích.

The lipidomic research is currently devoting considerable effort to the harmonization that should enable the generation of comparable and accurate quantitative lipidomic data across different laboratories and regardless of the mass spectrometry-based platform used. In the present study, we systematically investigate the effects of the experimental setup on quantitative lipidomics data obtained by two lipid class separation approaches, hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) and ultrahigh-performance supercritical fluid chromatography (UHPSFC), coupled to two different quadrupole - time of flight (QTOF) mass spectrometers from the same vendor. This approach is applied for measurements of 268 human plasma samples of healthy volunteers and renal cell carcinoma patients resulting in four data sets. We investigate and visualize differences among these data sets by multivariate data analysis methods, such as principal component analysis (PCA), orthogonal partial least square discriminant analysis (OPLS-DA), box plots, and logarithmic correlations of molar concentrations of individual lipid species. The results indicate that even measurements in the same laboratory for the same samples using different analytical platforms may yield slight variations in the molar concentrations determined. The normalization to a reference sample with defined lipid concentrations can further diminish these small differences, resulting in highly homogenous molar concentrations of individual lipid species. This strategy indicates a potential approach towards the reporting of comparable quantitative results independent from the quantitative approach and mass spectrometer used, which is important for a wider acceptance of lipidomics data in various biomarker inter-laboratory studies and ring trials., Lipidomický výzkum v současné době věnuje značné úsilí harmonizaci, která by měla umožnit generování srovnatelných a přesných kvantitativních lipidomických údajů napříč různými laboratořemi a bez ohledu na použitou platformu založenou na hmotnostní spektrometrii. V současné studii systematicky zkoumáme účinky experimentálního nastavení na kvantitativní lipidomické údaje získané dvěma přístupy k oddělení lipidových tříd, hydrofilní interakční kapalinovou chromatografií (HILIC) a ultra-vysokoúčinnou superkritickou kapalinovou chromatografií (UHPSFC) spojenými se dvěma různými hmotnostními spektrometry kvadrupól – analyzátor dobry letu (QTOF) od stejného dodavatele. Tento přístup je aplikován na měření 268 vzorků lidské plazmy od zdravých dobrovolníků a pacientů s karcinomem ledvin, z nichž vyplývají čtyři soubory údajů. Zkoumáme a vizualizujeme rozdíly mezi těmito soubory dat pomocí multivariačních metod analýzy dat, jako je analýza hlavních komponent (PCA), ortogonální diskriminační analýza částečných nejmenších čtverců (OPLS-DA), krabicové grafy a logaritmické korelace molárních koncentrací jednotlivých druhů lipidů. Výsledky ukazují, že i měření v téže laboratoři pro stejné vzorky za použití různých analytických platforem mohou přinést mírné odchylky ve stanovených molárních koncentracích. Normalizace na referenční vzorek s definovanými koncentracemi lipidů může dále snížit tyto malé rozdíly, což vede k vysoce homogenním molárním koncentracím jednotlivých lipidů. Tato strategie naznačuje potenciální přístup k vykazování srovnatelných kvantitativních výsledků nezávislý na kvantitativním přístupu a použitém hmotnostním spektrometru, což je důležité pro širší přijetí lipidomických údajů v různých biomarkerových mezilaboratorních studiích a kruhových studiích.

Diplomová práca je zameraná na štúdium stability vybraných tried lipidov v ľudskej plazme spojením ultravysokoúčinnej superkritickej fluidnej chromatografie a hmotnostnej spektrometrie. V teoretickej časti je priblížená štruktúra, rozdelenie a funkcie lipidov. Popísaný je odber biologického materiálu, v tomto prípade najmä ľudskej plazmy a jeho následné spracovanie pre lipidomickú analýzu. Charakterizované sú tiež separačné techniky využívané pre analýzu lipidov rovnako ako techniky hmotnostnej spektrometrie. Cieľom práce bolo stanovenie koncentračných zmien vybraných tried lipidov vo vzorkách zmesi interných štandardov a plazmy pri rôznych skladovacích podmienkach a počte rozmrazovacích cyklov., The diploma thesis is focused on the stability study of chosen lipid classes of human plasma using ultra-high performance supercritical fluid chromatography coupled to the mass spectrometry. In the theoretical part, the structure, classification and functions of lipids are elucidated. Biological material sampling, in this case primarily human plasma and its treatment for lipidomic analysis is desribed. Characterised are also separation techniques and techniques of mass spectrometry used for lipid analysis. The aim of this work was to define concentration changes of chosen lipid classes in mixture of internal standards and plasma samples stored under different conditions and number of freeze-thawing cycles., Fakulta chemicko-technologická, Studentka přednesla výsledky své diplomové práce, poté byla seznámena s posudky vedoucího a oponenta diplomové práce. Studentka zodpověděla dotazy oponenta a členů komise, Dokončená práce s úspěšnou obhajobou

The chemical derivatization of multiple lipid classes was developed using benzoyl chloride as a nonhazardous derivatization agent at ambient conditions. The derivatization procedure was optimized with standards for 4 nonpolar and 8 polar lipid classes and measured by reversed-phase ultrahighperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The derivatization and nonderivatization approaches were compared on the basis of the calibration curves of 22 internal standards from 12 lipid classes. The new method decreased the limit of detection 9-fold for monoacylglycerols (0.9-1.0 nmol/mL), 6.5-fold for sphingoid base (0.2 nmol/mL), and 3-fold for diacylglycerols (0.9 nmol/mL). The sensitivity expressed by the ratio of calibration slopes was increased 2- to 10-fold for almost all investigated lipid classes and even more than 100-fold for monoacylglycerols. Moreover, the benzoylation reaction produces a more stable derivative of cholesterol in comparison to the easily in-source fragmented nonderivatized form and enabled the detection of fatty acids in a positive ion mode, which does not require polarity switching as for the nonderivatized form. The intralaboratory comparison with an additional operator without previous derivatization experiences shows the simplicity, robustness, and reproducibility. The stability of the derivatives was determined by periodical measurements during a one month period and five freeze/thaw cycles. The fully optimized derivatization method was applied to human plasma, which allows the detection of 169 lipid species from 11 lipid classes using the high confidence level of identification in reversed-phase (RP)-ultra high performance liquid chromatography (UHPLC)/mass spectrometry (MS). Generally, we detected more lipid species for monoacylglycerols, diacylglycerols, and sphingoid bases in comparison with previously reported papers without the derivatization., Chemická derivatizace několika lipidových tříd byla vyvinuta za použití benzoylchloridu jako nerizikového derivatizačního činidla za okolních podmínek. Procedura derivatizace byla optimalizována standardy pro 4 nepolární a 8 polárních lipidových tříd a měřena ultra-vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s reverzní fází spojenou s tandemovou hmotnostní spektrometrií. Přístupy derivatizace a nonderivatizace byly porovnávány na základě kalibračních křivek 22 vnitřních standardů z 12 lipidových tříd. Nová metoda snížila detekční limit 9krát u monoacylglycerolů (0,9-1,0 nmol/ml), 6,5krát pro sfingoidní bázi (0,2 nmol/ml) a 3krát pro diacylglyceroly (0,9 nmol/ml). Citlivost vyjádřená poměrem kalibračních sklonů byla u téměř všech zkoumaných lipidových tříd zvýšena 2krát až 10krát a u monoacylglycerolů dokonce více než 100krát. Navíc benzoylační reakce vytváří stabilnější derivát cholesterolu ve srovnání se snadno zdrojově fragmentovatelnou nonderivatizovanou formou a umožnila detekci mastných kyselin v pozitivním iontovém režimu, který nevyžaduje přepínání polarity jako u nonderivatizované formy. Intralaboratorní srovnání s dalším operátorem bez předchozích zkušeností s derivatizací ukazuje jednoduchost, robustnost a reprodukovatelnost. Stabilita derivátů byla stanovena pravidelným měřením během jednoho měsíce a pěti cykly zmrazení/tání. Optimalizovaná derivatizační metoda byla aplikována na lidskou plazmu, ve které bylo možno detekovat 169 lipidů z 11 lipidových tříd pomocí vysoké úrovně spolehlivosti identifikace v reverzní fázi (RP)-ultra vysokoúčinné kapalinové chromatografie (UHPLC)/hmotnostní spektrometrie (MS). Obecně jsme zjistili více lipidových druhů pro monoacylglyceroly, diacylglyceroly a sfingoidní báze ve srovnání s dříve publikovanými články bez derivatizace.

Automated lipid species annotation based on fragment ion mass spectra faces three major challenges; isobaric or isomeric lipid species from different classes often yield similar fragments and cannot be unambigiously matched; the abundance of lipid fragments strongly depends on the experimental conditions which compromises their similarity to reference spectra; fragmentation of co-isolated precursors often originating from different classes yields highly convoluted spectra., Automatizovaná anotace lipidů založená na fragmentových iontových hmotnostních spektrech čelí třem hlavním výzvám; izobarické nebo izomerní lipidy z různých tříd často poskytují podobné fragmenty a nelze je jednoznačně porovnat; množství lipidových fragmentů silně závisí na experimentálních podmínkách, které kompromitují jejich podobnost s referenčními spektry; fragmentace spoluizolovaných prekurzorů z různých tříd často poskytuje vysoce spletitá spektra.

Early detection of cancer is one of the unmet needs in clinical medicine. Peripheral blood analysis is a preferred method for efficient population screening, because blood collection is well embedded in clinical practice and minimally invasive for patients. Lipids are important biomolecules, and variations in lipid concentrations can reflect pathological disorders. Lipidomic profiling of human plasma by the coupling of ultrahigh-performance supercritical fluid chromatography and mass spectrometry is investigated with the aim to distinguish patients with breast, kidney, and prostate cancers from healthy controls. The mean sensitivity, specificity, and accuracy of the lipid profiling approach were 85%, 95%, and 92% for kidney cancer; 91%, 97%, and 94% for breast cancer; and 87%, 95%, and 92% for prostate cancer. No association of statistical models with tumor stage is observed. The statistically most significant lipid species for the differentiation of cancer types studied are CE 16:0, Cer 42:1, LPC 18:2, PC 36:2, PC 36:3, SM 32:1, and SM 41:1 These seven lipids represent a potential biomarker panel for kidney, breast, and prostate cancer screening, but a further verification step in a prospective study has to be performed to verify clinical utility., Včasná detekce rakoviny je jednou z nenaplněných potřeb klinické medicíny. Periferní analýza krve je preferovanou metodou pro efektivní populační screening, protože odběr krve je dobře zakotven v klinické praxi a je minimálně invazivní pro pacienty. Lipidy jsou důležité biomolekuly a odchylky v koncentracích lipidů mohou odrážet patologické poruchy. Lipidomická profilace lidské plazmy spojením ultra-vysokoúčinné superkritické kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie je zkoumána s cílem odlišit pacienty s karcinomem prsu, ledvin a prostaty od zdravých kontrol. Průměrná citlivost, specifičnost a přesnost při profilování lipidů byla 85 %, 95 % a 92 % u rakoviny ledvin; 91 %, 97 %, a 94 % pro rakovinu prsu; a 87 %, 95 % a 92 % pro rakovinu prostaty. Není pozorována žádná souvislost statistických modelů se stádiem nádoru. Statisticky nejvýznamnějšími druhy lipidů pro diferenciaci zkoumaných typů nádorů jsou CE 16:0, Cer 42:1, LPC 18:2, PC 36:2, PC 36:3, SM 32:1 a SM 41:1. Těchto sedm lipidů představuje potenciální biomarkerový panel pro screening rakoviny ledvin, prsu a prostaty, ale k ověření klinické užitečnosti musí být proveden další ověřovací krok v prospektivní studii.

We present the LipidQuant 1.0 tool for automated data processing workflows in lipidomic quantitation based on lipid class separation coupled with high-resolution mass spectrometry. Lipid class separation workflows, such as hydrophilic interaction liquid chromatography or supercritical fluid chromatography, should be preferred in lipidomic quantitation due to the coionization of lipid class internal standards with analytes from the same class. The individual steps in the LipidQuant workflow are explained, including lipid identification, quantitation, isotopic correc- tion and reporting results. We show the application of LipidQuant data processing to a small cohort of human serum samples., Představujeme LipidQuant 1.0 pro automatizované zpracování datových pracovních postupů v lipidomické kvantifikaci založené na oddělení lipidové třídy ve spojení s hmotnostní spektrometrií s vysokým rozlišením. Pracovní postupy separace lipidové třídy, jako je hydrofilní interakční kapalinová chromatografie nebo superkritická kapalinová chromatografie, by měly být preferovány v lipidomické kvantifikaci z důvodu koionizace vnitřních standardů lipidové třídy analyty ze stejné třídy. Jednotlivé kroky jsou v pracovním postupu LipidQuant vysvětleny, včetně identifikace lipidů, kvantifikace, izotopické korekce a vykazování výsledků. Ukazujeme aplikaci zpracování dat LipidQuant na malou kohortu vzorků lidského séra.