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The axon enables long distance travel of electrical and chemical information between neurons, a process at the basis of neuronal communication and brain function. This information is transported in part by vesicles. Membrane-bound molecular motors propel these vesicles along the axon’s cytoskeleton by consuming ATP. The lab has shown previously that the ATP required for this transport is produced by on-board glycolytic enzymes, thus creating an energetically autonomous microenvironment for vesicular transport. What is more, the transport of BDNF is significantly reduced in Huntington’s disease (HD), a genetic disease caused by an abnormal CAG repeat expansion in the huntingtin (HTT) gene. This leads to insufficient trophic support of BDNF to the striatum where it plays a crucial role in cell survival. HTT is known to scaffold and mediate molecular motors on vesicles. The objectives of this PhD project were therefore to, design an approach to measure glycolytic activity on vesicles in order to understand the intricacies of glycolytic activity on vesicles as well as to identify the link between vesicular glycolysis and insufficient transport in HD.To do so, we first wanted to describe the differences in metabolic rates and efficiency between cytosolic and vesicular glycolysis. To measure glycolytic activity, we decided to split the pathway into two segments: the first was determined through the NADH production, the product of GAPDH; and the second segment was measured through the ATP production, produced by PGK and PK. Through these measurements, we found that vesicular glycolysis has a greater affinity for its substrates than the cytosol, making the vesicle more efficient at producing NADH and ATP than cytosolic equivalents.This then led us to question the importance of NAD recycling on vesicles. Here we showed, through immunofluorescence and western blot, that LDH, the enzyme responsible for converting pyruvate into lactate and oxidizing NADH in the process, is a vesicle-bound enzyme. Furthermore, we demonstrated that this LDH-dependent NAD recycling is crucial for overall glycolytic activity on vesicles and required for BDNF transport in cultured cortical neurons. Hence, axonal vesicles produce ATP via aerobic glycolysis, similarly to the Warburg effect in certain cancer cells.Finally, we studied the link between vesicular glycolysis and BDNF transport in HD. We showed that HTT interacts more strongly on vesicles with at least two glycolytic enzymes, GAPDH and PFK, and that glycolytic enzyme quantity and activity on vesicles is affected in HD. Based on these results we used previously described TM-GAPDH to artificially stimulate glycolysis specifically on vesicles to demonstrate that this approach was sufficient to restore transport in vitro. This provides evidence of the importance of vesicular glycolysis in BDNF transport and HD pathogenesis., L'axone permet le déplacement électriques et chimiques sur de longues distances d'informations entre les neurones, un processus qui est à la base de la communication neuronale et de la fonction cérébrale. Cette information est transportée en partie par des vésicules. Les moteurs moléculaires liés à la membrane propulsent ces vésicules le long du cytosquelette de l’axone en consommant de l’ATP. Le laboratoire de Frédéric Saudou a montré précédemment que l'ATP nécessaire à ce transport est produit par des enzymes glycolytiques liées à ces membranes, créant ainsi un microenvironnement énergétiquement autonome pour le transport vésiculaire. De plus, le transport de BDNF est considérablement réduit dans la maladie de Huntington (MH), une maladie génétique causée par une expansion anormale de répétition de CAG dans le gène de la huntingtine (HTT). Cela conduit à un support trophique insuffisant du BDNF au striatum où il joue normallement un rôle crucial dans la survie cellulaire. La HTT est connu pour être une protéine d’échaffaudage pour les moteurs moléculaires sur les vésicules. Les objectifs de ce projet étaient donc de concevoir une approche permettant la mesure de l'activité glycolytique sur les vésicules afin de comprendre les subtilités de l'activité glycolytique sur les vésicules ainsi que d'identifier le lien entre glycolyse vésiculaire et transport insuffisant charactéristique de la MH.Pour ce faire, nous avons d'abord voulu décrire les différences de taux métaboliques et d'efficacité entre la glycolyse cytosolique et vésiculaire. Pour mesurer l'activité glycolytique, nous avons décidé de scinder la voie en deux segments: le premier a été déterminé par la production de NADH, le produit de GAPDH; et le deuxième segment a été mesuré par la production d'ATP, produite par PGK et PK. Grâce à ces mesures, nous avons constaté que la glycolyse vésiculaire a une plus grande affinité pour ses substrats que le cytosol, ce qui rend la vésicule plus efficace pour produire du NADH et de l'ATP que ses équivalents cytosoliques.Cela nous a alors conduit à nous interroger sur l'importance du recyclage de NAD sur les vésicules. Ici, nous avons montré, par immunofluorescence et western blot, que la LDH, enzyme responsable de la conversion du pyruvate en lactate et de l'oxydation du NADH, est également liée aux vésicules. En outre, nous avons démontré que ce recyclage NAD-dépendant de la LDH est crucial pour l'activité glycolytique globale sur les vésicules et requis pour le transport du BDNF dans des neurones corticaux en culture. Par conséquent, les vésicules axonales produisent de l'ATP par glycolyse aérobie, de manière similaire à l'effet Warburg décrit dans les cellules cancéreuses.Enfin, nous avons étudié le lien entre la glycolyse vésiculaire et le transport de BDNF dans la MH. Nous avons montré que le HTT interagit plus fortement sur les vésicules avec au moins deux enzymes glycolytiques, GAPDH et PFK, et que la quantité et l'activité de l'enzyme glycolytique sur les vésicules sont affectées dans la MH. Sur la base de ces résultats, nous avons utilisé la construction TM-GAPDH décrite précédemment pour stimuler artificiellement la glycolyse spécifiquement sur les vésicules ce qui nous a permis de démontrer que cette approche était suffisante pour restaurer le transport in vitro. Ceci est une prevue de l'importance de la glycolyse vésiculaire dans le transport du BDNF et la pathogenèse de la MH.

The pathogenic yeast Candida albicans is both a powerful commensal and pathogen of humans that can infect a wide range of organs and body sites. Metabolic flexibility promotes infection and commensal colonization by this opportunistic pathogen. Yeast cell survival depends upon assimilation of fermentable and non-fermentable locally available carbon sources. Physiologically relevant sugars like glucose and fructose are present at low level in host niches. However, because glucose is the preferred substrate for energy and biosynthesis of structural components, its efficient detection and metabolism are fundamental for the metabolic adaptation of the pathogen. We explored and characterized the C. albicans hexose kinase system composed of one hexokinase (CaHxk2) and two glucokinases (CaGlk1 and CaGlk4). Using a set of mutant strains, we found that hexose phosphorylation is mostly performed by CaHxk2, which sustains growth on hexoses. Our data on hexokinase and glucokinase expression point out an absence of cross regulation mechanisms at the transcription level and different regulatory pathways. In the presence of glucose, CaHxk2 migrates in the nucleus and contributes to the glucose repression signaling pathway. In addition, CaHxk2 participates in oxidative, osmotic and cell wall stress responses, while glucokinases are overexpressed under hypoxia. Hexose phosphorylation is a key step necessary for filamentation that is affected in the hexokinase mutant. Virulence of this mutant is clearly impacted in the Galleria mellonella and macrophage models. Filamentation, glucose phosphorylation and stress response defects of the hexokinase mutant prevent host killing by C. albicans. By contributing to metabolic flexibility, stress response and morphogenesis, hexose kinase enzymes play an essential role in the virulence of C. albicans. In a second time, we explored the regulatory role of hexokinase 2 involved in glucose signalling, a regulatory pathway developed by microorganisms to promote the use of glucose. In C. albicans, the glucose repression system has been maintained overall, but the role of the various actors and more particularly of hexokinase 2 has never been specified. Our work showed that in the presence of glucose, hexokinase 2, CaHxk2, is relocated in the nucleus and negatively regulates the expression of alternative carbon metabolism genes.�� Targeted deletion experiments have shown that the catalytic function of hexokinase 2 is required to enable the enzyme to perform its regulatory function. In parallel, we conducted a transcriptomic study by digital droplet PCR, as part of a technical project focused on the analysis of the transcription of metabolic genes during the very early phases of phagocytosis. Our work revealed a strong induction of genes belonging to alternative carbon metabolism pathways (ß-oxidation, neoglucogenesis, glyoxylic cycle), La levure Candida albicans, constituant de la microflore pathogène et commensale de l’homme colonise et infecte de nombreux organes. Cette colonisation est permise par la flexibilité métabolique de ce pathogène, dont la survie dépend de l’assimilation de sources carbonées fermentescibles ou non, localement disponibles. Parmi ces ressources, le glucose est présent en faible quantité dans certains sites du corps humain. Cette source de carbone étant préférentiellement utilisée par les microorganismes, sa détection et sa métabolisation optimales sont de première importance pour la survie du pathogène. Les travaux effectués au cours de cette thèse ont été focalisés sur la première étape irréversible de la glycolyse, la conversion du glucose en glucose-6-phosphate par les hexoses kinases, jamais décrites chez C. albicans. Le système des hexose kinases chez C. albicans est constitué d’une hexokinase (CaHxk2) et de deux glucokinases (CaGlk1 et CaGlk4). La construction de différentes combinaisons de mutants de délétion, nous a permis de constater que la phosphorylation des hexoses était principalement assurée par l’hexokinase 2. L’analyse de l’expression des gènes codant pour l’hexokinase et les glucokinases a révélé une absence de régulation transcriptionnelle croisée et des mécanismes de régulation différents. Tandis que l’hexokinase est impliquée dans les réponses aux stress oxydant, osmotique et de paroi, les glucokinases sont surexprimées en condition hypoxiques. La phosphorylation des hexoses est une étape clé nécessaire à la transition filamenteuse qui est affectée chez le mutant hexokinase. L’analyse de la virulence des mutants de délétion conduite dans deux pathosystèmes différents (le modèle insecte Galleria mellonella et le modèle macrophage de souris (J774)), a révélé l’hypovirulence du mutant hexokinase 2, alors que la délétion des glucokinases ne conduit à aucun phénotype remarquable, posant la question du rôle physiologique de ces enzymes.Nos travaux ont ensuite exploré le rôle régulateur de l’hexokinase 2 impliquée dans la signalisation glucose, voie de régulation élaborée par les microorganismes pour privilégier l’utilisation du glucose. Chez C. albicans, le système de répression glucose a été globalement conservé mais le rôle des différents acteurs et plus particulièrement de l’hexokinase 2 n’a jamais été précisé. Nos travaux ont permis de démontrer qu’en présence de glucose, l’hexokinase 2, CaHxk2, est relocalisée dans le noyau et régule négativement l’expression des gènes du métabolisme carboné alternatif. Des expériences de délétion ciblées ont permis de mettre en évidence que la fonction catalytique de l’hexokinase 2 était requise pour permettre à l’enzyme d’exercer sa fonction régulatrice. Parallèlement nous avons mené une étude de transcriptomique par digital droplet PCR, dans le cadre d’un projet technique ciblé sur l’analyse de la transcription des gènes du métabolisme, au cours des phases très précoces de la phagocytose par les macrophages. Nos travaux ont mis en évidence une induction forte des gènes appartenant aux voies du métabolisme carboné alternatif (ß-oxydation, néoglucogenèse, cycle glyoxylique)

Control of cell migration is highly conserved between embryo and metastasis formation from primary tumors. The neural crest (NC) is a multipotent cell population defined by its migratory properties, giving rise to multiple derivatives as bones and cartilages of the face or melanocytes which are pigmented cells of the skin. Cellular and molecular properties of NC make of it a very good physiological model helping to understand the development of metastasis. Monsoro-Burq team identified a new regulator of NC in vivo, known to regulates glycolysis, called PFKFB4. The team demonstrated that PFKFB4 is essential for NC induction, in a glycolysis independent manner, via PI3K/AKT signaling (Pegoraro et al., 2015). The aim of this thesis is to establish if this new link between PFKFB4 and AKT activation is important during NC migration and in an invasive cancer context, as well as defining what are the underlying molecular mechanisms. First, we have shown that PFKFB4 is playing a double role, both on glycolysis and PI3K/AKT signaling to control NC cell migration (Figueiredo et al., 2017). Secondly, we chose to study this regulation in human melanoma cell line, a model of neural crest derived cancer, where PFKFB4 is overexpressed. We have shown that PFKFB4 control cell migration independently of its role in glycolysis, as during NC development. In melanoma and in NC, we found that PFKFB4 act indirectly on AKT. We looked for a partner of PFKFB4 with mass spectrometry and identified ICMT, a regulator of RAS subcellular localization. Finaly, we explored the importance of this interaction in AKT activation and melanoma cell migration (Sittewelle et al., 2020). This thesis work allowed to explore the molecular detail by which PFKFB4, a cell metabolism regulator, also control the response of cells to signals from their environment and their migration, by a non-canonical mechanism. Our results allow us to describe a new fundamental link in the coordination of cell migration in the physiological context of embryonic cell migration and pathological context of metastasis., Le contrôle de la migration cellulaire est un processus essentiel fortement conservé chez l'embryon et lors de la formation des métastases à partir de tumeur primaires. La crête neurale (CN) est une population cellulaire embryonnaire multipotente, définie par sa capacité à migrer à travers l’embryon et donnant naissance à de nombreux dérivés tels que les os et cartilages craniofaciaux ou les mélanocytes, cellules pigmentées de la peau. Ses caractéristiques cellulaires et moléculaires font de la CN un très bon modèle physiologique permettant de comprendre le développement de métastases. L’équipe Monsoro-Burq a identifié un nouveau régulateur de la transition épithélium-mésenchyme et la migration de la CN in vivo, connu pour réguler la glycolyse, appelé PFKFB4. Contrairement à l'hypothèse initiale d'un contrôle de PFKFB4 sur la glycolyse l’équipe démontré que PFKFB4 est indispensable pour la mise en place de la CN, en activant la signalisation PI3K/AKT, indépendamment de son rôle de régulateur de la glycolyse (Pegoraro et al. 2015). L’objectif de cette thèse consiste à établir si ce lien nouveau entre PFKFB4 et l'activation de la signalisation AKT est important au cours de la migration de la CN et dans un contexte de cancer invasif ainsi que de définir quels en sont les mécanismes moléculaires. Dans un premier temps, nous avons montré que PFKFB4 joue un double rôle, à la fois sur la glycolyse et sur la voie PI3K/AKT pour le contrôle de la migration des cellules de la CN (Figueiredo et al. 2017). Dans un second temps, nous avons choisi d’étudier cela dans des cellules humaines de mélanomes, un modèle de cancer dérivé de la crête neurale, où PFKFB4 est surexprimé. Nous avons montré que PFKFB4 contrôle la migration de cellules de mélanome indépendamment de son rôle sur la glycolyse, comme dans l’embryon. Dans le mélanome et la CN, nous avons montré que PFKFB4 agit indirectement sur AKT. Nous avons recherché un partenaire de PFKFB4 par spectrométrie de masse et identifié ICMT, un régulateur de la localisation de RAS. Enfin, nous avons pu explorer l’importance de cette interaction dans le contrôle de la voie AKT et de la migration des cellules de mélanome (Sittewelle et al., 2020). Ce travail de thèse a permis d’explorer le détail moléculaire par lequel PFKFB4, régulateur du métabolisme cellulaire, contrôle également par un mécanisme non conventionnel, la réponse des cellules aux signaux de leur environnement et la migration cellulaire. Nos résultats permettent de décrire un nouveau lien fondamental de la coordination de la migration dans le contexte physiologique des migrations embryonnaires et celui pathologique des métastases.

The Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex is an epigenetic regulator of gene expression that includes two mutually exclusive ATPase subunits CHD3 and CHD4. Our results show that NuRD associates with essential melanoma cell transcription factors namely MITF and SOX10. However, despite their physical association and genomic co-localization, CHD4-NuRD does not appear to act as a cofactor for MITF or SOX10 regulated gene expression. Nevertheless, CHD4 silencing leads to a slow growth phenotype and de-represses the expression of PADI1 (Protein Arginine DeIminase 1) and PADI3, two enzymes involved in converting arginines to citrullines in melanoma and multiple types of cancer cells. Increased expression of PADI1 and PADI3 enhances citrullination of arginines within the key glycolytic regulatory enzyme PKM2 then promoting excessive glycolysis, lowering ATP levels and slowing down proliferation. PKM2 citrullination lowers its sensitivity to allosteric inhibitors thus shifting equilibrium towards allosteric activators thereby bypassing the normal physiological regulation of glycolysis. Overall, our results lead to describe a novel pathway linking, epigenetic regulation of PADI1 and PADI3 expression by CHD4/NuRD and reprogramming of PKM2 allosteric regulation through arginines citrullination, to glycolytic flux and cancer cell proliferation., Le complexe de remodelage de la chromatine NuRD, composé des sous-unités catalytiques CHD3 et CHD4, est un régulateur épigénétique de l’expression génique. Nos résultats montrent que NuRD s’associe avec les facteurs de transcription essentiels du mélanome que sont MITF et SOX10. Cependant, malgré une association physique et une co-localisation génomique, CHD4/NuRD ne semble pas agir comme un cofacteur important pour MITF ou SOX10. Néanmoins, la répression de CHD4 conduit à un ralentissement de la prolifération et déréprime l’expression des enzymes PADI1 et PADI3 dans les cellules de mélanome ainsi que dans de nombreux types de cellules cancéreuses. Ainsi, l’induction de ces enzymes, responsables de la conversion des arginines en citrullines, entraîne la citrullination spécifique de PKM2, une enzyme glycolytique essentielle, diminuant ainsi sa sensibilité aux inhibiteurs allostériques, et donc altérant l’équilibre physiologique entre activateurs et inhibiteurs de l’enzyme. L’ensemble de ce travail de thèse a permis de mettre en évidence une nouvelle voie reliant, d’une part la régulation épigénétique de l’expression de PADI1 et PADI3 par CHD4/NuRD ainsi que la reprogrammation de la régulation allostérique de PKM2 via la citrullination d’arginines, au flux glycolytique et au contrôle de la prolifération des cellules cancéreuses d’autre part.

International audience; Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) is recognized as a typical “glucose-intolerant” fish, and the limits of dietary carbohydrate utilization have been investigated for many years. In this study, the objective was to test the molecular effects of dietary carbohydrates on intermediary metabolism in two major metabolic tissues, liver and muscle. Another objective was also to study if the response to carbohydrate intake depended on the genetic background. We fed two isogenic lines of rainbow trout (named A22h and N38h) with high carbohydrate diet (carbohydrate, 22.9%) or low carbohydrate diet (carbohydrate, 3.6%) for 12 weeks. Carbohydrates were associated with higher feed utilization owned by the well-known protein-sparing effect, with better fish growth performance. However, atypical regulation of glycolysis and gluconeogenesis in liver and absence of hk and glut4 induction in muscle, were also observed. Regarding the effects of carbohydrates on other metabolism, we observed an increased, at a molecular level, of hepatic cholesterol biosynthesis, fatty acid oxidation and mitochondrial energy metabolism. Genetic variability (revealed by the differences between the two isogenic lines) was observed for some metabolic genes especially for those involved in the EPA and DHA biosynthetic capacity. Finally, our study demonstrates that dietary carbohydrate not only affect glucose metabolism but also strongly impact the lipid and energy metabolism in liver and muscle of trout.

Expression of the Vnn1 pantetheinase by sarcomas is tumor suppressive by limiting the use of aerobic glycolysis for growth and rescuing mitochondrial activity through CoA regeneration., Like other tumors, aggressive soft tissue sarcomas (STS) use glycolysis rather than mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) for growth. Given the importance of the cofactor coenzyme A (CoA) in energy metabolism, we investigated the impact of Vnn1 pantetheinase—an enzyme that degrades pantetheine into pantothenate (vitamin B5, the CoA biosynthetic precursor) and cysyteamine—on tumor growth. Using two models, we show that Vnn1+ STS remain differentiated and grow slowly, and that in patients a detectable level of VNN1 expression in STS is associated with an improved prognosis. Increasing pantetheinase activity in aggressive tumors limits their growth. Using combined approaches, we demonstrate that Vnn1 permits restoration of CoA pools, thereby maintaining OXPHOS. The simultaneous production of cysteamine limits glycolysis and release of lactate, resulting in a partial inhibition of STS growth in vitro and in vivo. We propose that the Warburg effect observed in aggressive STS is reversed by induction of Vnn1 pantetheinase and the rewiring of cellular energy metabolism by its products.

We used the yeast Crabtree (+) model to study the relationships between the energy metabolism pathways during the implementation of the Warburg effect. The effect of glucose on S. cerevisiae energetic metabolism results initially in a kinetic inhibition of the oxidative metabolism (Crabtree effect). Rapidly after the addition of glucose, we found an accumulation of F1, 6bP. This induces a drastic reduction in the ratio G6P / F1,6bP. Moreover, it has been shown that G6P stimulates and F1,6bP inhibits the activity of the respiratory chain "in-vitro". Mutants and the modulation of this ratio allowed us to show that the induction of the Crabtree effect is due to a decrease in the G6P / F1,6bP ratio. In parallel with the implementation of the Crabtree effect, glucose induces a genetic rearrangement that leads to a Warburg effect. We showed a decrease over time of mitochondrial enzymatic equipment by dilution effect, due to a halt of mitochondrial biogenesis (transcriptional repression of HAP4). We have been able to show that this decrease in respiratory capacity has no effect on the cellular capacity for ATP synthesis. This is due to the increase in glycolytic ATP synthesis flux. Furthermore, the use of mutants where there is no repression of mitochondrial metabolism upon glucose addition allowed us to show that there is no simple link between OXPHOS activity and cell proliferation. i.e. Mitochondrial metabolism repression/high glycolytic flux is not mandatory to allow a rapid cell proliferation. This is a rare example where energetic metabolism and cell proliferation are uncoupled., Nous avons étudié les relations entre les différentes voies du métabolisme énergétique lors de la mise en place des effets Crabtree et Warburg. L’effet du glucose sur le métabolisme énergétique de S. cerevisiae se traduit dans un premier temps par une inhibition cinétique du métabolisme oxydatif (effet Crabtree). Après l’ajout de glucose aux cellules, nous avons mis en évidence l’accumulation d’un intermédiaire de la glycolyse, le F1,6bP. Ceci induit une diminution drastique du rapport G6P/F1,6bP. Or, il a été montré que le G6P stimule et le F1,6bP inhibe l’activité de la chaine respiratoire mitochondriale « in-situ ». L’utilisation de mutants et la modulation de ce rapport nous a permis de montrer que l’induction de l’effet Crabtree chez la levure Saccharomyces cerevisiae est dû à une diminution du rapport G6P/F1,6bP. Parallèlement, le glucose induit un réarrangement génétique qui à terme conduit à un effet Warburg. Nous avons mis en évidence une diminution, au cours du temps du contenu mitochondrial par effet de dilution, suite à un arrêt de la biogenèse mitochondriale (répression de HAP4). Nous avons pu montrer que cette diminution quantitative des OXPHOS est sans effet sur la synthèse d’ATP cellulaire. Ceci est dû à une augmentation du flux de synthèse d’ATP glycolytique. L’utilisation de mutants HAP4", nous a permis de montrer qu’il n’y a pas de lien simple entre prolifération et répression des OXPHOS. Bien que le flux glycolytique diminue dans les conditions de maintien des OXPHOS, ceci est sans effet notoire sur la vitesse de prolifération. Ceci est un rare exemple d’une situation biologique ou l’on observe un découplage entre métabolisme énergétique et prolifération.

During my thesis, I focused on the neocortical pyramidal cells in normal and pathological condition. The early alteration of glucose metabolism is an invariant feature of Alzheimer's disease ( AD) which might lead to the late synaptic dysfunctions and neuronal loss related to the pathology. To better understand the AD pathogenesis, I sought to clarify the mechanisms responsible for the early glucose hypometabolism observed in the pathology. This work has highlighted alterations in glucose fluxes at a juvenile presymptomatic stage in a mouse model of AD. The cellular imaging data revealed an increase of the glycolytic pathway associated with a reduction in the PPP in pyramidal neurons of 3xTg-AD mice without any alteration of glucose transport. The noradrenergic system has a significant influence on cognitive processes. A part of my thesis has been devoted to highlight the effect of noradrenaline on pyramidal cells' excitability in the mouse somatosensory cortex. My results show that α1 and β noradrenergic agonists inhibit the currents responsible for sAHP and suggest a cooperative effect of α1 and β noradrenergic receptors. The RA-α1 involvement in the genesis of a slow After Depolarization has yet to be determined. Those two phenomena will lead to an increased depolarization of neuronal membrane, facilitating a novel action potential discharge., Mes travaux de thèse se sont portés sur les cellules pyramidales du néocortex de rongeur, en condition normale et pathologique. L'altération précoce du métabolisme du glucose est une caractéristique fonctionnelle invariante de la maladie d'Alzheimer (MA) qui pourrait être à l'origine des dysfonctionnements synaptiques et de la neurodégénerescence tardive associés à la maladie. Pour mieux comprendre la pathogenèse de la MA, j'ai cherché à clarifier les mécanismes responsables de l'hypométabolisme précoce du glucose observé dans la maladie. Mes travaux ont mis à jour des altérations des flux métaboliques du glucose chez un modèle murin de la MA à un stade asymptomatique juvénile. Les données d'imagerie cellulaire révèlent une augmentation du flux glycolytique associée à une diminution de l'activité de la voie des Pentoses Phosphates dans les cellules pyramidales néocorticales des souris 3xTg-AD sans altération du transport du glucose. Le système noradrénergique exerce une profonde influence sur les processus cognitifs. Une partie de ma thèse a été consacrée à éclaircir les effets de la NA sur la modulation de l'excitabilité des cellules pyramidales dans le cortex somatosensoriel de souris. Mes résultats montrent que les agonistes α1 et β noradrénergiques inhibent les courants responsables de l'hyperpolarisation lente qui suit les potentiels d'actions et suggèrent un effet coopératif des récepteurs α1 et β noradrénergiques. L'implication des récepteurs α1 dans la genèse d'une dépolarisation lente post PA reste à déterminer. Ces deux phénomènes convergeraient vers une dépolarisation accrue de la membrane du neurone, facilitant une nouvelle décharge de PA.

The enzyme fructose-bisphosphate aldolase occupies a central position in glycolysis and gluconeogenesis pathways. Beyond its housekeeping role in metabolism, fructose-bisphosphate aldolase has been involved in additional functions and is considered as a potential target for drug development against pathogenic bacteria. Here, we address the role of fructose-bisphosphate aldolase in the bacterial pathogen Francisella novicida. We demonstrate that fructose-bisphosphate aldolase is important for bacterial multiplication in macrophages in the presence of gluconeogenic substrates. In addition, we unravel a direct role of this metabolic enzyme in transcription regulation of genes katG and rpoA, encoding catalase and an RNA polymerase subunit, respectively. We propose a model in which fructose-bisphosphate aldolase participates in the control of host redox homeostasis and the inflammatory immune response., The enzyme fructose-bisphosphate aldolase (FBA) plays central roles in glycolysis and gluconeogenesis. Here, Ziveri et al. show that FBA of the pathogen Francisella novicida acts, in addition, as a transcriptional regulator and is important for bacterial multiplication in macrophages.

Despite having the same "purpose", the uncontrollable cellular growth to the detriment of the organism, cancer presents itself in humans in great variety of forms. This variety makes developing effective treatments a highly challenging task. Nevertheless, cancer has a handful of hallmarks that are present almost ubiquitously in all types of tumours. Among them is the upregulated glucose uptake, known as the Warburg effect. However, there has yet to be a drug or treatment that makes use of this aberrant cancer metabolism. This is due to the lack of potent glucose uptake inhibitors. The identification of small molecules that efficiently target the glucose uptake is hence of high value. Through an in-house established glucose uptake assay, new scaffolds were identified as glucose uptake inhibitors, such as the Glupins. This novel identified scaffold presented a natural product-like structure and a high potency. In the present work, a synthetic route towards the Glupin core was established. The structure-activity relationships of the Glupin class was extensively studied by the synthesis of a library of analogues. The analogue, (+)-Glupin-1, was discovered as one of the most potent glucose uptake and was therefore selected for further biological studies.The splicing process, the process by which premature messenger RNA is transformed into a mature form ready to be translated, is performed by a highly complex machinery, the spliceosome. The splicing process occurs in a series of steps, each of them catalysed by a different spliceosome complex constituted by many proteins and ribozymes. Decades of research on the spliceosome complex have provided an understanding of the process but much remains to be discovered. The in-house identification of a novel splicing inhibitor, cp028, enabled the isolation of a previously unknown spliceosome stage. In this work, the cp028 compound was studied with the synthesis of a library of analogues around its core. The library of analogues was assayed as splicing inhibitors yielding a SAR analysis of this novel class. Furthermore, efforts towards the identification of the cp028 target were made. Cp028 joins a short list of powerful splicing inhibitor that have allowed for a deeper study of the splicing process and opens the door for the identification of novel key protein players of this highly complex process.

[version 2]; International audience; Nucleoside triphosphate (NTP)s, like ATP (adenosine 5'-triphosphate) and GTP (guanosine 5'-triphosphate), have long been considered sufficiently concentrated and diffusible to fuel all cellular ATPases (adenosine triphosphatases) and GTPases (guanosine triphosphatases) in an energetically healthy cell without becoming limiting for function. However, increasing evidence for the importance of local ATP and GTP pools, synthesised in close proximity to ATP-or GTP-consuming reactions, has fundamentally challenged our view of energy metabolism. It has become evident that cellular energy metabolism occurs in many specialised 'microcompartments', where energy in the form of NTPs is transferred preferentially from NTP-generating modules directly to NTP-consuming modules. Such energy channeling occurs when diffusion through the cytosol is limited, where these modules are physically close and, in particular, if the NTP-consuming reaction has a very high turnover,. is i.e very processive. Here, we summarise the evidence for these conclusions and describe new insights into the physiological importance and molecular mechanisms of energy channeling gained from recent studies. In particular, we describe the role of glycolytic enzymes for axonal vesicle transport and nucleoside diphosphate kinases for the functions of dynamins and dynamin-related GTPases. Keywords

Background Aedes albopictus is a vector of arboviruses that cause severe diseases in humans such as Chikungunya, Dengue and Zika fevers. The vector competence of Ae. albopictus varies depending on the mosquito population involved and the virus transmitted. Wolbachia infection status in believed to be among key elements that determine viral transmission efficiency. Little is known about the cellular functions mobilized in Ae. albopictus during co-infection by Wolbachia and a given arbovirus. To decipher this tripartite interaction at the molecular level, we performed a proteome analysis in Ae. albopictus C6/36 cells mono-infected by Wolbachia wAlbB strain or Chikungunya virus (CHIKV), and bi-infected. Results We first confirmed significant inhibition of CHIKV by Wolbachia. Using two-dimensional gel electrophoresis followed by nano liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry, we identified 600 unique differentially expressed proteins mostly related to glycolysis, translation and protein metabolism. Wolbachia infection had greater impact on cellular functions than CHIKV infection, inducing either up or down-regulation of proteins associated with metabolic processes such as glycolysis and ATP metabolism, or structural glycoproteins and capsid proteins in the case of bi-infection with CHIKV. CHIKV infection inhibited expression of proteins linked with the processes of transcription, translation, lipid storage and miRNA pathways. Conclusions The results of our proteome profiling have provided new insights into the molecular pathways involved in tripartite Ae. albopictus-Wolbachia-CHIKV interaction and may help defining targets for the better implementation of Wolbachia-based strategies for disease transmission control. Electronic supplementary material The online version of this article (doi:10.1186/s12864-017-3985-y) contains supplementary material, which is available to authorized users.

1- Introduction: Propionibacterium freudenreichii is an Actinobacterium widely used in the dairy industry as a ripening culture for Swiss-type cheeses, for vitamin B12 production and some strains display probiotic properties. It is reportedly a hardy bacterium, able to survive the cheese-making process and digestive stresses. 2- Objectives : The aim of the study was to decipher metabolic adaptations of P. freudenrechii responsible for long-term survival under gradual nutritional shortage. 3- Materials & methods: For 11 days, in a non-nutrient supplemented culture medium, eight strains were monitored by measuring their optical density, counting colony-forming units (CFU) and using LIVE/DEAD staining and microscopy observation. The strain with the highest survival rate was incubated for 11 days (9 days after entry into stationary phase) in Yeast Extract Lactate medium at 30 °C under microaerophilic conditions, without any adjunct during the incubation. Its physiological adaptation was investigated by RNA-seq analysis. The carbon and free amino acids sources available in the medium, and the organic acids produced by the strain, were monitored throughout growth and survival. 4- Results: Under these conditions, the eight studied strains displayed high survival rates, their culturability reaching more than 9 log 10 CFU/ml after 2 days. After 11 days, this value ranged from 7.8 to 8.2 log 10 CFU/ml depending on the strain, and at least 50% of the P. freudenreichii population displayed an intact envelope. P. freudenreichii with the highest survival rate was CIRM-BIA 138 (alias ITG P9). Although lactate (the preferred carbon source for P. freudenreichii) was exhausted three days after inoculation, the CIRM-BIA 138 strain sustained a high population level of 9.3 log 10 CFU/mL and revealed a complete disruption of metabolism at the entry into stationary phase as compared to exponential phase. 5- Conclusions: P. freudenreichii adapts its metabolism during entry into stationary phase by down-regulating oxidative phosphorylation, glycolysis, and the Wood-Werkman cycle, by exploiting new nitrogen (glutamate, glycine, alanine) sources, by down-regulating the transcription, translation and secretion of protein. Utilization of polyphosphates was suggested.

La relocalisation et la dégradation médiée par ubiquitination sont utilisées par la cellule pour contrôler la localisation et l’expression de ses protéines. L’E3 ubiquitine ligase MARCH1 est impliqué dans la régulation post-traductionnelle de CMH-II et de CD86. Dans ce mémoire, on propose un rôle additionnel à MARCH1. Nos résultats expérimentaux nous portent à croire que MARCH1 pourrait moduler le métabolisme cellulaire en favorisant la relocalisation et la dégradation d’enzymes impliquées dans la glycolyse. La grande majorité des cellules utilise la phosphorylation oxydative pour générer de l’ATP en présence d’oxygène. Dans un environnement hypoxique, cette dernière est non fonctionnelle et la cellule doit utiliser la glycolyse anaérobique pour produire son ATP. Une cellule cancéreuse à des besoins énergétiques supérieurs en raison de l’augmentation de sa biomasse et de sa prolifération incontrôlée. Pour subvenir à ces besoins, elle maximise sa production d’énergie en modifiant son métabolisme; c’est l’effet Warburg. On retrouve dans les cellules immunitaires des modifications similaires au métabolisme cellulaire suite à un signal d’activation. Ici, nous montrons que la respiration mitochondriale maximale, la réserve respiratoire et la glycolyse maximale sont diminuées dans les cellules présentatrice d’antigènes qui expriment MARCH1. Nous avons montré que MARCH1 était localisable au niveau de la mitochondrie, ce qui lui permet d’interagir avec les enzymes de la glycolyse. Finalement, nous avons quantifié l’expression de Eno1 et de LDHB par Western Blot, pour montrer une augmentation de l’expression de ces enzymes en absence de MARCH1. À la lumière de ces résultats, nous discutons des avantages que procure la diminution de l’expression de MARCH1 dans un contexte inflammatoire, suite à l’activation des cellules présentatrices d’antigènes. Ce phénomène permettrait une présentation antigénique plus efficace, une augmentation de la production d’énergie et une meilleure résistance aux ROS produits lors de la réponse inflammatoire., Relocation and degradation mediated by ubiquitination are used by the cell to control the localization and the expression of proteins. E3 ubiquitin ligase MARCH1 is known to be involved in post-translational regulation of MHC-II and CD86. In this thesis, we suggest an additional role to MARCH1. Our experimental results lead us to believe that MARCH1 may modulate cellular metabolism by promoting the relocation and degradation of enzymes involved in glycolysis. The vast majority of cells generate ATP from oxidative phosphorylation in presence of oxygen. In a hypoxic environment, the latter is non-functional and the cell must use the anaerobic glycolysis to produce ATP. A cancerous cell requires more energy due to increased biomass and its uncontrolled proliferation. To meet these needs, it maximizes its energy production regardless of oxygen concentrations. Many studies have shown that aerobic glycolysis is preferred to oxidative phosphorylation in cancer cells, even if the two pathway are used simultaneously; it is described as the Warburg effect. Similar modification of the cellular metabolism is also found in immune cells after an activation signal to fulfill the cell functions. Here we show that the maximal mitochondrial respiration, the respiratory reserves and the maximal glycolysis are reduced in antigen-presenting cells that express MARCH1. Furthermore, we showed that MARCH1 can be localized on the mitochondria to interact with it’s target. Finally, we quantified the expression of Eno1 and LDHB by Western blot to show an increased expression of these enzymes in the absence of MARCH1. Thus, we discuss the benefits of the expression reduction of MARCH1 in an inflammatory context, following the activation of antigen presenting cells. This phenomenon would allow a better antigen presentation, an increased energy production and a greater resistance to ROS, produced during the inflammatory response.

Dans les pays industrialisés, les rétinopathies ischémiques proliférantes telles que la rétinopathie diabétique et la rétinopathie du prématuré sont les principales causes de cécité chez les individus en âge de travailler et la population pédiatrique. Ces pathologies sont caractérisées par une dégénérescence microvasculaire initiale suivie d’une hyper-vascularisaton compensatoire disproportionnée et pathologique. Les sirtuines constituent une importante famille de protéines impliquées dans le métabolisme et la réponse au stress. Plus particulièrement, sirtuine 3 (SIRT3) est une déacétylase mitochondriale primordiale qui agit au cœur du métabolisme énergétique et de l’activation de nombreuses voies métaboliques oxydatives. Nos résultats démontrent pour la première fois qu’une déficience en SIRT3 diminue la sévérité des lésions vasculaires dans le modèle murin de rétinopathie induite par l’oxygène (OIR). En plus de stimuler l’angiogénèse, l’absence de SIRT3 est aussi associée à une augmentation de la glycolyse, possiblement en activant la famille de gènes 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase (PFKFB). Nous suggérons que le manque de SIRT3 est impliqué dans l’effet Warburg et procure ainsi un avantage prolifératif et protecteur dans l’OIR. La présente étude propose SIRT3 comme nouvelle cible thérapeutique potentielle dans la rétinopathie du prématuré, une maladie dont les complications désastreuses persistent tout au long de la vie., Proliferative ischemic retinopathies such as proliferative diabetic retinopathy and retinopathy of prematurity (ROP) are the leading causes of blindness in working age and pediatric populations in industrialized countries. These pathologies are characterized by an initial microvascular degeneration followed by a disproportionate compensatory but pathological hyper-vascularization mounted by the hypoxic and energy deficient retina in an attempt to reinstate metabolic equilibrium. Sirtuins are an important family of protein involved in metabolism and stress response. Sirtuin 3 (SIRT3) in particular is a major mitochondrial deacetylase central to energy metabolism and the regulation of many oxidative pathways. For the first time, our results show that a lack of SIRT3 decreases the severity of vascular lesions in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model. Deficiency in SIRT3 not only stimulates angiogenesis, but also increases glycolysis, possibly through indirect activation of the gene family 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase (PFKFB). We suggest that a lack of SIRT3 is involved in the Warburg effect and therefore confers a proliferative advantage that is protective in OIR. The present study puts forward SIRT3 as a new potential therapeutic target for ROP, a disease leading to life-long vision complications.

International audience; Global demand for vegetable oils is increasing at a dramatic rate, while our understanding of the regulation of oil biosynthesis in plants remains limited. To gain insights into the mechanisms that govern oil synthesis and fatty acid (FA) composition in the oil palm fruit, we used a multilevel approach combining gene coexpression analysis, quantification of allele-specific expression and joint multivariate analysis of transcriptomic and lipid data, in an interspecific backcross population between the African oil palm, Elaeis guineensis, and the American oil palm, Elaeis oleifera, which display contrasting oil contents and FA compositions. The gene coexpression network produced revealed tight transcriptional coordination of fatty acid synthesis (FAS) in the plastid with sugar sensing, plastidial glycolysis, transient starch storage and carbon recapture pathways. It also revealed a concerted regulation, along with FAS, of both the transfer of nascent FA to the endoplasmic reticulum, where triacylglycerol assembly occurs, and of the production of glycerol-3-phosphate, which provides the backbone of triacylglycerols. Plastid biogenesis and auxin transport were the two other biological processes most tightly connected to FAS in the network. In addition to WRINKLED1, a transcription factor (TF) known to activate FAS genes, two novel TFs, termed NF-YB-1 and ZFP-1, were found at the core of the FAS module. The saturated FA content of palm oil appeared to vary above all in relation to the level of transcripts of the gene coding for b-ketoacyl-acyl carrier protein synthase II. Our findings should facilitate the development of breeding and engineering strategies in this and other oil crops.

International audience; Protein alterations of turkey breast muscles (Pectoralis major) were investigated at 20 min and 24 h post mortem. Specific activities, quantities and kinetic parameters of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and aldolase A were also determined at 20 min post mortem. Based on the pH values at 20 min post mortem, two groups of samples were classified as rapid glycolysis group (RG; pH20 min = 5.80 ± 0.07, n = 20) and normal glycolysis group (NG; pH20 min = 6.21 ± 0.01, n = 20). RG had lower specific activities of GAPDH and aldolase A than NG while Vm and Km values of both enzymes were not different between groups. RG showed lower high ionic strength (HIS) and pellet protein extractabilities at 20 min post mortem. It also had lower low ionic strength (LIS) and HIS protein extractabilities at 24 h post mortem. Besides pellet protein, muscular protein extractabilities at 24 h post mortem were higher than at 20 min post mortem. From SDS-PAGE of samples at 24 h post mortem, RG exhibited lower band intensities at 45 and 200 kDa, which were further identified as actin and myosin heavy chain (MHC), respectively. Western blots revealed that relative amounts of actin and MHC at 20 min post mortem were not different between groups. However, RG muscles had less relative amount of actin at 24 h post mortem. It also indicated that amounts of actin and MHC increased with regard to post mortem time.

Originally identified as dietary lipid detergents, bile acids (BA) are now recognized as signaling molecules which bind to the transmembrane receptor TGR5 and the nuclear receptor FXR (Farnesoid X Receptor). Upon binding to TGR5 at the surface of enteroendocrine L cells, bile acids (BA) promote the secretion of the incretin GLP-1 which potentiates the glucose-induced insulin secretion by pancreatic beta-cells. More than 50% of the insulin secretion in response to glucose is mediated by GLP-1 and the other incretin Glucose-dependent Insulinotropic Polypeptide (GIP). Once secreted, GLP-1 is rapidly (2-3 minutes) degraded by the endothelial enzyme Dipeptydil Peptidase 4 (DPP4). GLP-1 analogues and DPP4 inhibitors are successfully used for the treatment of T2D. FXR is a ligand-activated nuclear receptor highly expressed in the liver and in the distal intestine. FXR controls BA, lipid and glucose metabolism. Whether FXR is expressed, functional in intestinal enteroendocrine L cells and in which extend its activation affects GLP-1 production are not yet reported. Encouraging data were obtained during my M2 training course. The aim of my thesis was thus to assess whether FXR in enteroendocrines cells could participate in the control of the deregulation of glucose homeostasis. Multiple in vitro, ex vivo and in vivo human and murine models allowed us to show that FXR is present and functional in L cells. FXR activation decreases GLP-1 production and secretion in L cells by inhibiting glycolysis pathway through an interference with the carbohydrate responsive transcription factor ChREBP. Finally, I identified an additional mechanism of action of the bile acid sequestrant Colesevelam, a molecule currently successfully used in USA for treating type 2 diabetic patients., L’homéostasie énergétique ou ‘balance énergétique’ est l’équilibre qui s’établit chez l’Homme et l’animal adulte entre la prise quotidienne de nutriments sous la forme de glucides, de lipides ou de protéines et leur oxydation pour ne produire que la quantité énergétique strictement nécessaire. Pour maintenir cette balance l’organisme doit recueillir en permanence des signaux nerveux, métaboliques ou hormonaux de la part de cellules spécifiques. Ces senseurs des besoins énergétiques transmettent alors à des centres régulateurs leurs informations qui en retour, par voie hormonale ou nerveuse, informent les organes effecteurs des mesures à prendre pour stocker, produire ou consommer l’énergie. Les trois principaux centres de cette balance sont 1/ le cerveau, centre intégrateur de l’information ; 2/ un groupe d’organes effecteurs parmi lesquels le foie, le tissu adipeux, les muscles squelettiques, le pancréas et 3/ un centre senseur de la qualité et de la quantité des aliments, le tractus gastrointestinal (Migrenne 2006). En plus d’être la source d’énergie nécessaire à la vie des cellules, les nutriments tels que les acides gras, le cholestérol ou encore le glucose sont aussi des molécules de signalisation cellulaire à la fois par leur fixation à des récepteurs membranaires mais aussi via des récepteurs nucléaires. Un déséquilibre dans l’homéostasie énergétique dû à une alimentation déséquilibrée, à un manque d’exercice physique ou à des facteurs génétiques est une caractéristique de l’obésité et de complications telles que le diabète de type 2 et les maladies cardiovasculaires (Hill, 2006). Au cours de ma thèse je me suis intéressé à l’intestin pour son rôle de régulateur de l’homéostasie énergétique dans un contexte physiologique ou physiopathologique d’obésité via sa capacité à sécréter l’incrétine Glucagon-Like Peptide-1 (GLP-1) en réponse au glucose et aux acides biliaires. J’ai étudié plus particulièrement le rôle du récepteur nucléaire en tant que senseurs moléculaires des acides biliaires FXR dans les cellules sécrétrices de cette incrétine car à l’heure actuelle rien n’était connu quant à son rôle ni même quant à son expression dans la cellule L. Pour cela, j’ai utilisé des lignées cellulaires murines et humaines où j’ai mis au point les conditions expérimentales pour répondre aux questions posées. Grâce à des ARN d’intestins issus de différents modèles de souris la relevance chez le rongeur a été testée. La relevance de ces résultats sur des biopsies intestinales humaine a également été testée. Grâce à ces outils, j'ai pu montré que FXR dans les cellules L était fonctionnel et que son activation interférait avec la voie de la glycolyse entrainant moins de synthèse et de sécrétion de GLP-1. Cela nous a permis de proposer un nouveau mécanisme moléculaire par lequel les séquestrants des acides biliaires exercent leur effets bénéfiques chez des patients atteints de diabète de type 2.

Originally identified as dietary lipid detergents, bile acids (BA) are now recognized as signaling molecules which bind to the transmembrane receptor TGR5 and the nuclear receptor FXR (Farnesoid X Receptor). Upon binding to TGR5 at the surface of enteroendocrine L cells, bile acids (BA) promote the secretion of the incretin GLP-1 which potentiates the glucose-induced insulin secretion by pancreatic beta-cells. More than 50% of the insulin secretion in response to glucose is mediated by GLP-1 and the other incretin Glucose-dependent Insulinotropic Polypeptide (GIP). Once secreted, GLP-1 is rapidly (2-3 minutes) degraded by the endothelial enzyme Dipeptydil Peptidase 4 (DPP4). GLP-1 analogues and DPP4 inhibitors are successfully used for the treatment of T2D. FXR is a ligand-activated nuclear receptor highly expressed in the liver and in the distal intestine. FXR controls BA, lipid and glucose metabolism. Whether FXR is expressed, functional in intestinal enteroendocrine L cells and in which extend its activation affects GLP-1 production are not yet reported. Encouraging data were obtained during my M2 training course. The aim of my thesis was thus to assess whether FXR in enteroendocrines cells could participate in the control of the deregulation of glucose homeostasis. Multiple in vitro, ex vivo and in vivo human and murine models allowed us to show that FXR is present and functional in L cells. FXR activation decreases GLP-1 production and secretion in L cells by inhibiting glycolysis pathway through an interference with the carbohydrate responsive transcription factor ChREBP. Finally, I identified an additional mechanism of action of the bile acid sequestrant Colesevelam, a molecule currently successfully used in USA for treating type 2 diabetic patients., L’homéostasie énergétique ou ‘balance énergétique’ est l’équilibre qui s’établit chez l’Homme et l’animal adulte entre la prise quotidienne de nutriments sous la forme de glucides, de lipides ou de protéines et leur oxydation pour ne produire que la quantité énergétique strictement nécessaire. Pour maintenir cette balance l’organisme doit recueillir en permanence des signaux nerveux, métaboliques ou hormonaux de la part de cellules spécifiques. Ces senseurs des besoins énergétiques transmettent alors à des centres régulateurs leurs informations qui en retour, par voie hormonale ou nerveuse, informent les organes effecteurs des mesures à prendre pour stocker, produire ou consommer l’énergie. Les trois principaux centres de cette balance sont 1/ le cerveau, centre intégrateur de l’information ; 2/ un groupe d’organes effecteurs parmi lesquels le foie, le tissu adipeux, les muscles squelettiques, le pancréas et 3/ un centre senseur de la qualité et de la quantité des aliments, le tractus gastrointestinal (Migrenne 2006). En plus d’être la source d’énergie nécessaire à la vie des cellules, les nutriments tels que les acides gras, le cholestérol ou encore le glucose sont aussi des molécules de signalisation cellulaire à la fois par leur fixation à des récepteurs membranaires mais aussi via des récepteurs nucléaires. Un déséquilibre dans l’homéostasie énergétique dû à une alimentation déséquilibrée, à un manque d’exercice physique ou à des facteurs génétiques est une caractéristique de l’obésité et de complications telles que le diabète de type 2 et les maladies cardiovasculaires (Hill, 2006). Au cours de ma thèse je me suis intéressé à l’intestin pour son rôle de régulateur de l’homéostasie énergétique dans un contexte physiologique ou physiopathologique d’obésité via sa capacité à sécréter l’incrétine Glucagon-Like Peptide-1 (GLP-1) en réponse au glucose et aux acides biliaires. J’ai étudié plus particulièrement le rôle du récepteur nucléaire en tant que senseurs moléculaires des acides biliaires FXR dans les cellules sécrétrices de cette incrétine car à l’heure actuelle rien n’était connu quant à son rôle ni même quant à son expression dans la cellule L. Pour cela, j’ai utilisé des lignées cellulaires murines et humaines où j’ai mis au point les conditions expérimentales pour répondre aux questions posées. Grâce à des ARN d’intestins issus de différents modèles de souris la relevance chez le rongeur a été testée. La relevance de ces résultats sur des biopsies intestinales humaine a également été testée. Grâce à ces outils, j'ai pu montré que FXR dans les cellules L était fonctionnel et que son activation interférait avec la voie de la glycolyse entrainant moins de synthèse et de sécrétion de GLP-1. Cela nous a permis de proposer un nouveau mécanisme moléculaire par lequel les séquestrants des acides biliaires exercent leur effets bénéfiques chez des patients atteints de diabète de type 2.

During my doctoral study, we used rainbow trout, a representative carnivorous fish and relevant diabetic model, to study the mechanisms underlying the regulation of hepatic intermediary metabolism by nutrients (amino acids (AAs) and glucose), and determine the potential involvement of insulin/Akt and mTORC1 signaling pathways in these regulations. Using acute administration of rapamycin, a pharmacological inhibitor of TOR, we first identified that mTORC1 activation promotes the expression of genes related to fatty acid biosynthesis, glycolysis and amino acid catabolism, while Akt negatively regulates gluconeogenic gene expression in rainbow trout liver and primary hepatocytes. Furthermore, we demonstrated hepatic fatty acid biosynthetic gene expression is more responsive to dietary protein intake/AAs than dietary carbohydrate intake/glucose during acute stimulations in vivo and in vitro. Moreover, we further showed that high levels of AAs up-regulate hepatic fatty acid biosynthetic gene expression through an mTORC1-dependent manner, while excessive AAs attenuate insulin-mediated repression of gluconeogenesis through elevating IRS-1 Ser302 phosphorylation, which in turn impairs Akt phosphorylation and dampens insulin action. Finally, using glucose tolerance test and acute inhibition of rapamycin, we concluded that hepatic gluconeogenesis probably plays a major role in controlling glucose homeostasis, which maybe account for the prolonged hyperglycemia and glucose intolerance phenotype of carnivorous fish. The present thesis brings forward our understandings about the roles of protein/AAs in the regulation of hepatic intermediary metabolism in trout and identifies relevant cellular signaling pathways mediating the action of amino acids on metabolism. It also clarifies some nutritional characteristics of the trout., Au cours de ma thèse, nous avons utilisé la truite arc-en-ciel, un poisson carnivore et modèle potentiellement pertinent du diabète, pour étudier des mécanismes de régulation du métabolisme intermédiaire hépatique par les nutriments (acides aminés (AA) et le glucose). Nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux voies de signalisation de l'insuline et des acides aminés (Akt et mTORC1). Grâce à l'utilisation de rapamycine, un inhibiteur pharmacologique de mTORC1, nous avons montré que l'activation de mTORC1 stimule l'expression de gènes de la lipogenèse, de la glycolyse et du catabolisme des acides aminés, tandis que la voie de signalisation Akt inhibe celle des gènes impliqués dans la néoglucogenèse. Ces études ont été conduites dans le foie de truite ou en culture primaire d'hépatocytes de truite arc-en-ciel. En outre, nous avons démontré lors de stimulations à court terme in vivo et in vitro que l'expression hépatique des gènes de la lipogenèse est plus sensible à l'apport de protéines alimentaires ou d'AA qu'à l'apport de glucides ou de glucose. De plus, nous avons observé que des taux élevés d'AA conduisent, par le biais de l'activation de la voie de signalisation mTORC1, à une augmentation de l'expression des gènes lipogéniques mais surtout à une répression de l'inhibition de l'expression des gènes de la néoglucogenèse induite par l'insuline. Cet effet s'accompagne d'une augmentation de la phosphorylation de IRS-1 sur le résidu Ser302 qui pourrait être responsable de la baisse de phosphorylation d'Akt et par conséquent d'une inhibition de l'action de l'insuline. Enfin, en réalisant un test de tolérance au glucose chez des truites préalablement traitées avec de la rapamycine, nous avons conclu que la néoglucogenèse hépatique joue un rôle probablement majeur dans le contrôle de l'homéostasie glucidique chez la truite. Ainsi, une absence d'inhibition de la néoglucogenèse pourrait contribuer au maintien de l'hyperglycémie prolongée et au phénotype d'intolérance au glucose caractéristique des poissons carnivores. Cette thèse met en avant le rôle des protéines/AA dans la régulation du métabolisme intermédiaire de la truite et identifie certaines voies de signalisation cellulaire sollicités par les acides aminés pour réguler le métabolisme. Elle permet ainsi d'éclaircir certaines particularités nutritionnelles de la truite

Yeasts are unicellular eukaryotic organisms which prefer glucose as energy source. The yeast model Kluyveromyces lactis has two glucose permeases. The expression of one of its permeases, RAG1, is induced by extracellular glucose. The glucose signaling pathway responsible for RAG1 expression regulation is dependent upon glucose sensing through a specific membrane glucose sensor, Rag4. However, RAG1 expression is also dependent upon glucose metabolism by glycolysis. Indeed, in glycolytic mutants RAG1 expression is strongly affected even when glucose is present. During these doctoral studies, we characterized mechanisms involved in glycolytic control on glucose signaling. Using glycolytic mutant or glycolysis chemical inhibitors, we have demonstrated that, in K. lactis, glycolysis targets the stability of the glucose sensor Rag4, controlling glucose signaling and RAG1 expression. This glycolytic control appears to be conserved in the yeast model Saccharomyces cerevisiae. We have shown that the C-terminal cytoplasmic tail of glucose sensor Rag4 is necessary for glucose signaling and forms a protein interaction platform. Rag4 protein contains several domains controlling Rag4 stability in response to different destabilization signals: glycolytic signal or carbon source signal. Finally, the nature of the glycolytic signal was studied considering two hypotheses: protein nature (e.g. glycolytic enzyme) or metabolic nature (e.g. glycolysis metabolic intermediate). This doctoral thesis underlines a new role of glycolysis in controlling membrane glucose sensor stability in K. lactis and S. cerevisiae, Chez les levures, organismes eucaryotes unicellulaires, le glucose est la source d'énergie préférée. La levure modèle Kluyveromyces lactis possède deux perméases au glucose. L'expression d'une de ces deux perméases, codée par le gène RAG1, est induite par la présence de glucose extracellulaire et cette régulation transcriptionnelle dépend de la détection du glucose par un senseur membranaire spécifique, Rag4. Cependant, la régulation de l'expression de RAG1 dépend également de la capacité des cellules à métaboliser le glucose via la glycolyse. En effet, l'expression de RAG1 est fortement affectée dans des mutants glycolytiques malgré la présence de glucose extracellulaire. Au cours de cette thèse, nous nous sommes attachés à déterminer les mécanismes via lesquels la glycolyse contrôle l'expression de RAG1. Grâce à l'utilisation de mutants glycolytiques ou d'inhibiteurs chimiques de la glycolyse chez K. lactis, nous avons démontré que la glycolyse régule la stabilité du senseur Rag4 à la membrane plasmique et contrôle ainsi la voie de signalisation du glucose et l'expression de RAG1. De plus, ce mécanisme de contrôle est conservé chez la levure modèle Saccharomyces cerevisiae. L'étude plus approfondie de Rag4 nous a permis de déterminer que la transmission du signal glucose requiert la queue C-terminale cytoplasmique de Rag4, qui sert de plateforme d'interaction protéique. La caractérisation fonctionnelle de Rag4 nous a permis de mettre en évidence que la protéine contient plusieurs domaines impliqués dans le contrôle de sa stabilité en fonction du type de signal induisant la déstabilisation: signal glycolytique ou changement de source de carbone. Enfin, la nature du signal issu de la glycolyse qui cible le senseur membranaire Rag4 a été étudiée en testant deux hypothèses : le signal est protéique (enzyme de la glycolyse) ou métabolique (métabolite intermédiaire de la glycolyse). Ces travaux de thèse ont permis de mettre en évidence un rôle inédit de la glycolyse dans le contrôle de la stabilité des senseurs membranaires du glucose chez les levures K. lactis et S. cerevisiae

Growing evidence support the idea that impairments in Fast Axonal Transport (FAT) play a crucial role in Neurodegenerative Diseases (NDs). Huntington’s Disease is neurodegenerative disorder caused by an abnormal polyglutamine expansion in the N-Terminal part of huntingtin (HTT), a large scaffold protein implicated in transport regulation. Both the presence of the mutated HTT as the loss of HTT leads to transport defects in mammals. In the fruit fly overexpression of the mutant HTT recapitulates the phenotype observed in mammals. However, it is still unclear whether HTT’s function is conserved in D. melanogaster. Here, we show that D. melanogaster HTT (DmHTT) associates with vesicles, microtubules, and interacts with dynein. In rat cortical neurons, DmHTT partially replaces mammalian HTT in fast axonal transport, and DmHTT KO flies show axonal transport defects in vivo. These results suggest that HTT function in transport is conserved in D. melanogaster.FAT is a process that requires a constant supply of energy. Mitochondria are the main producers of ATP in the cell. However, we have demonstrated that FAT does not depend on this source of energy, as previously thought, but it depends on glycolytic ATP produced on vesicles. Perturbing GAPDH or PK, the two ATP generating glycolytic enzymes, slows down vesicular transport. However, knocking down GAPDH does not affect mitochondrial transport. Furthermore, all of the glycolytic enzymes are associated with dynamic vesicles, and are capable of producing their own ATP. Finally, we show that this ATP production is sufficient to sustain their own transport, demonstrating the energetical autonomy of vesicles for transport., De plus en plus de preuves montrent que le transport axonal rapide (FAT) joue un rôle crucial au cours des maladies neurodégénératives (NDs). La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative causée par une expansion anormale de polyglutamines dans la partie Nterminale de la protéine huntingtine (HTT) : une grande protéine d’échafaudage impliquée dans la régulation du transport. La présence de HTT mutante comme l’absence de la HTT induisent des défauts de transport chez les mammifères. Chez la Drosophile, la HTT mutante reproduit le phénotype observée chez les mammifères, cependant la fonction conservée de la HTT chez la Drosophile melanogaster (DmHTT) n’est pas encore clairement établie. Ici nous mettons en évidence que DmHTT s’associe aux vésicules, aux microtubules et intéragit avec la proteine dynéine. Dans les neurones corticaux de rat, DmHTT remplace partiellement la HTT de mammifère dans le transport axonal rapide, et les drosophiles invalidées pour la HTT montrent des défauts de transport axonal in vivo. Ces résultats suggèrent que la fonction de la HTT est conservée dans le modèle Drosophile.Le FAT est un processus qui requiert un apport constant d’énergie. Les mitochondries sont les principales sources de production d’ATP de la cellule. Cependant nous avons démontré que le FAT ne dépend non pas de cette source d’énergie là, contrairement à ce que l’on pensait, mais de l’ATP glycolytique produit par les vésicules. La dérégulation de GAPDH ou de PK, les deux enzymes glycolytiques productrices d’ATP, ralentit le transport vésiculaire. Néanmoins, l’invalidation de GAPDH n’affecte pas le transport mitochondrial. En outre, toutes les enzymes glycolytiques sont associées à des vésicules dynamiques et sont capables de produire leur propre ATP. Enfin nous montrons que l’ATP produit est suffisant pour assurer leur propre transport, prouvant l’autonomie énergétique des vésicules pour le transport.

Cells of solid tumors are often exposed to an environment deficient in oxygen, i.e. hypoxic. The Hypoxia-Inducible Factor-1 (HIF-1) is the major transcription factor involved in cellular adaptation to hypoxia. HIF-1 regulates a wide array of genes involved in angiogenesis, cellular metabolism or pH regulation. My thesis is organized into three axes around HIF-1 and metabolic reprogramming in hypoxia. I first studied Factor-Inhibiting HIF-1 (FIH), one of two oxygen sensors regulating HIF-1. We showed that FIH is essential for tumor development through inhibition of the HIF-1 transcriptional activity as well as through the suppression of the p53-p21 axis. I then studied the HIF-1-induced « shift » in cellular metabolism toward glycolysis, which generates a type of “glucose addiction”. We showed that paradoxically, tumor cells store glycogen in hypoxia through a HIF-1 dependant mechanism. Glycogen served as a reservoir of intracellular glucose, which allows hypoxic cells to survive periods of glucose starvation. Finally, I studied AMPK «the guardian of energy », and showed that surprisingly, this kinase is not necessary in maintaining a viable level of ATP when glycolysis is inhibited (by blockade of lactate export). However, as expected, AMPK protected cells during glucose starvation. Moreover, combined inhibition of the lactate transporter MCT4 and of AMPK reduced dramatically tumor development in a xenograft model, suggesting a crucial role for these two actors in the context of growth of tumor cells in a hostile environment. Taken together these results identified several potential drug targets involved in the metabolic plasticity of hypoxic cells., Les tumeurs solides sont souvent confrontées à un environnement déficient en oxygène, dit hypoxique. Hypoxia-Inducible Factor 1 (HIF1) est le facteur de transcription clé de l’adaptation cellulaire à l’hypoxie, régulant de nombreux gènes impliqués dans l’angiogenèse, le métabolisme cellulaire ou la régulation du pH. Ma thèse s’articule en trois axes autour de HIF1 et de la reprogrammation métabolique hypoxique. J’ai d’abord étudié Factor-Inhibiting HIF1 (FIH), l’un des deux senseurs d’oxygène régulant HIF1. Nous avons montré que FIH est essentiel dans le développement tumoral en inhibant à la fois l’activité transcriptionnelle de HIF1 et la voie p53-p21. J’ai ensuite étudié le « shift » du métabolisme cellulaire vers la glycolyse induit par HIF1, générant une addiction pour le glucose. Nos travaux ont montré que paradoxalement, les cellules hypoxiques synthétisent du glycogène via HIF1 constituant ainsi une réserve de glucose intracellulaire. Le glycogène confère alors une résistance accrue des cellules tumorales suite à une carence en glucose. Enfin, j’ai pu montrer que l’AMPK, « gardien de la balance énergétique », n’est pas nécessaire au maintien d’un niveau viable d’ATP suite à l’inhibition de la glycolyse, via le blocage de l’export de lactate, mais exerce, un effet protecteur en absence de glucose. Cependant, l’inhibition conjointe du transporteur de lactate, MCT4, et de l’AMPK réduit fortement le développement tumoral dans un modèle de xénogreffes chez la souris, suggérant un rôle crucial de ces deux acteurs dans ce contexte. L’ensemble de ces travaux a permis d’identifier plusieurs cibles potentielles impliquées dans la plasticité métabolique en hypoxie.

International audience; Background MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory molecules which post-transcriptionally regulate mRNA stability and translation. Several microRNAs have received attention due to their role as key metabolic regulators. In spite of the high evolutionary conservation of several miRNAs, the role of miRNAs in lower taxa of vertebrates has not been studied with regard to metabolism. The liver-specific and highly abundant miRNA-122 is one of the most widely studied miRNA in mammals, where it has been implicated in the control of hepatic lipid metabolism. Following our identification of acute postprandial, nutritional and endocrine regulation of hepatic miRNA-122 isomiRNA expression in rainbow trout, we used complementary in silico and in vivo approaches to study the role of miRNA-122 in rainbow trout metabolism. We hypothesized that the role of miRNA-122 in regulating lipid metabolism in rainbow trout is conserved to that in mammals and that modulation of miRNA-122 function would result in altered lipid homeostasis and secondarily altered glucose homeostasis, since lipogenesis has been suggested to act as glucose sink in trout. Results Our results show that miRNA-122 was functionally inhibited in vivo in the liver. Postprandial glucose concentrations increased significantly in rainbow trout injected with a miRNA-122 inhibitor, and this effect correlated with decreases in hepatic FAS protein abundance, indicative of altered lipogenic potential. Additionally, miRNA-122 inhibition resulted in a 20% decrease in plasma cholesterol concentration, an effect associated with increased expression of genes involved in cholesterol degradation and excretion. Conclusions Overall evidence suggests that miRNA-122 may have evolved in early vertebrates to support liver-specific metabolic functions. Nevertheless, our data also indicate that metabolic consequences of miRNA-122 inhibition may differ quantitatively between vertebrate species and that distinct direct molecular targets of miRNA-122 may mediate metabolic effects between vertebrate species, indicating that miRNA-122 - mRNA target relationships may have undergone species-specific evolutionary changes

Agressive cancers often harbor an exacerbated glycolytic metabolism with overexpression of proteins that maintain intracellular pH by extruding metabolic acid waste (via CAIX, CAXII, MCT1 and MCT4 among others). The "triple-negative" breast cancers (with no expression of estrogen, progesteron and Her-2 receptors) have an increased consumption of glucose and worse prognosis in comparison with other breast cancers. Immunohistochemical analysis of glycolytic proteins among 159 patients with TNEG breast cancer, showed that MCT4 was predictive for metastasis and death occurence. In vitro targeting of MCT4 by Zinc Finger Nuclease (ZFN) technique demonstrated an anti-proliferative effect. However, the maximal anti-proliferative effect was observed with the combination of MCT4/MCT1 (by pharmacological inhibition) and mitochondrial respiration by phenformine in the Hs578t TNEG cell line. This study demonstrated that targeting glycolytic protein could have a therapeutic effect in TNEG breast cancers. Another study also use targeting of glycolytic protein such as CAIX and CAXII to increase in vitro and in vivo radiosensitivity of colorectal cell lines while demonstrating an original mechanism of radiosensitization by increasing intracellular acidosis. Finally we demonstrated that the hypoxamiR miR210 was involved in the radioresistance of lung cancer cell line with a stronger impact than the oxygen effect., Les cancers agressifs se caractérisent par un métabolisme glycolytique exacerbé avec surexpression de protéines assurant le contrôle du pH intracellulaire par l’export efficace des déchets métaboliques acides (par CAIX, CAXII, MCT1 et MCT4 entre autres). Les cancers du sein dit "triple négatif" (sans expression des récepteurs à l'estrogène, progestérone et Her-2) présentent une consommation augmentée de glucose et un plus mauvais pronostic en comparaison avec les autres cancers du sein. L'analyse immunohistochimique de l'expression des protéines glycolytiques d'une cohorte de 159 patientes TNEG a montré que MCT4 était prédictif de la survenue de métastases et de décès. Le ciblage in vitro de MCT4 par la technique des Zinc Finger Nucléases (ZFN) a eu un effet anti-prolifératif. L'efficacité était toutefois maximale lors du ciblage combiné de MCT1 (inhibiteur pharmacologique), MCT4 et de la respiration mitochondriale par la phenformine dans la lignée de cancer TNEG Hs578t. Cette étude montre donc que le ciblage des protéines glycolytiques pourrait être une piste intéressante dans le traitement des cancers du sein TNEG. Un autre travail a permis d'exploiter le ciblage des protéines glycolytiques, notamment CAIX et CAXII, pour augmenter in vitro et in vivo la radiosensibilité de lignées de cancer colorectal tout en démontrant un mécanisme original de radiosensibilisation, via l'acidification intracellulaire. Enfin, nous avons mis en évidence l'importance de l'hypoxamiR miR210 dans la radiorésistance de lignées de cancer du poumon, avec une radiorésistance semblant dépasser l'effet oxygène.

Une diète faible en sodium donnée à des rates lors de la dernière semaine de gestation induit une diminution de l’expansion volumique, du diamètre des artères utérines et du poids des placentas comparativement à des rates témoins. Ces perturbations suggèrent une diminution de la perfusion placentaire affectant l’apport foetal en nutriments. Les ratons naissent avec une restriction de croissance intra-utérine (RCIU). Chez le foetus, le substrat énergétique cardiaque principal est le glucose via la glycolyse. À la naissance, la source principale d’énergie est l’utilisation des acides gras par la β-oxydation. Nous émettons l’hypothèse que dans ce modèle de RCIU, le coeur foetal répond à la diminution d’apport nutritionnel due à une atteinte maternelle en adaptant son métabolisme énergétique cardiaque à la baisse. Les rates gestantes (témoins et recevant la diète faible en sodium) sont sacrifiées au jour 22 de gestation (sur 23). Les coeurs foetaux sont prélevés afin de caractériser les protéines dites « limitantes » in vitro des voies de la glycolyse et de la β-oxydation. Les expressions protéiques de GLUT1, GLUT4, HK1, HK2, CPT2, CPT1β, cytochrome c, PFK1, PKM1/2, mesurées par immunobuvardage de type Western, sont similaires entre les coeurs des foetus RCIU et témoins, mâles et femelles. L’expression protéique de CPT1α est diminuée dans les coeurs des femelles RCIU seulement. Il n’existe aucune différence significative entre les différents groupes quant à l’activité enzymatique de PKM1/2. Nos résultats dressent un profil métabolique général suggérant que le sexe du foetus peut avoir un effet sur la réponse cardiaque foetale à une atteinte du volume sanguin maternel causée par la diète restreinte en sodium. Ce profil métabolique semble démontrer une atteinte du catabolisme des lipides. Afin de bien caractériser cette réponse du mécanisme énergétique, l’activité enzymatique des autres enzymes principales de la glycolyse (HK1, HK2, PFK1), le flux intra-mitochondrial d’acyl CoA à travers les CPTs ainsi que la quantité totale d’acétyl CoA devront être quantifiés., A low sodium diet was given to pregnant rats during the last week of gestation. This diet diminished the maternal expansion of blood volume, the uterine arteries diameter, and placental weight, when compared to their controls. Together, these results suggest a lower placenta perfusion and a decreased output of nutrients to the fetus. The offspring of these pregnant rats were born with an intra-uterine growth retardation (IUGR). The fetal heart utilizes glucose through glycolysis as the major cardiac energy substrate. At birth, the principal source of energy switches to the oxidation of fatty acids, through β-oxydation. We hypothesized that within our IUGR model, the fetal heart could respond to a diminished nutritional intake due to the maternal input when a decreased cardiac energy metabolism was present. The pregnant rats of both groups (controls and on the low sodium diet) were sacrificed on day 22 of a 23 day gestation. The fetal hearts were then analyzed looking for signs of the limiting proteins glycolysis and β-oxidation. The GLUT1, GLUT4, HK1, HK2, CPT2, CPT1β, cytochrome c, PFK1, PKM1/2 proteins obtained through a Western immunoblot method were similar between the hearts of the IUGR and their control fetuses, whether they were male or female. The protein expression of CPT1α was lower only in female IUGR fetal hearts. There was no significant difference between the groups with respect to the enzymatic activity of PKM1/2. Our results suggest that the metabolic profile changes with regards to the fetus gender and could affect the fetal cardiac metabolism, due to a lower maternal blood flow caused by a sodium controlled diet, by diminishing its lipid metabolism and sparing glucose metabolism. To characterize the energy metabolism, the enzymatic activity of the other principal limiting enzymes glycolysis (HK1, HK2, PFK1), the intra-mitochondrial flux of acyl CoA through the CPTs and the total quantity of acetyl CoA must also be analyzed.

Mathematische Modellierung ist ein wichtiges Werkzeug biologischer Forschung geworden, was sich in der Entstehung von Systembiologie widerspiegelt. Eine erfolgreiche Anwendung mathematischer Methoden auf biologische Fragen erfordert die Zusammenarbeit zwischen experimentell und theoretisch arbeitenden Wissenschaftlern, auch um sicherzustellen, dass die Biologie im Modell adäquat dargestellt wird. Ich präsentiere hier zwei Untersuchungen zur Anpassung von Saccharomyces cere- visae an hyperosmotische Bedingungen: Eine biologisch detailgetreue Beschreibung der Signaltransduktion zur Aktivierung von Hog1 und ein Model, das Anpassung an osmotischen Stress in zellulärem Zusammenhang beschreibt. Die Studie zur Osmoadaptation in zellulären Kontext impliziert, dass Hog1 und Fps1, zwei wichtige Bausteine dieses Adaptationsvorgangs, miteinander in Wechselwirkung treten und dies zur Anpassung beiträgt. Dieses Ergebnis wird durch die Integration verschiedener Hefestämme mit zum Teil gegensätzlich wirkenden Mutationen ermöglicht. Diese Studie offenbart des weiteren, dass die Rolle von Glycerol in der langfristigen Anpassung bisher überschätzt wurde. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen, dass Glycerol als ’Not’-Osmolyt eingesetzt wird und andere Stoffe, z.B. Trehalose, erheblich zu dauerhafter Osmoadaptation beitragen. Durch die Betrachtung des Zustands mehrerer zellulärer Mechansimen wird deutlich, dass Osmoadaptation stark vom Kontext abhängig ist und nicht perfekt ist. Der Preis schlägt sich in langsamerem Wachstum nieder. Zeitabhängige Sensitivitätsanalyse des Modells untermauert diese Hypothese. Die gewählte Perspektive ermöglicht die Betrachtung von intrazellulären Signaltransduktionskomponenten, Metaboliten und des Wachstums. Der Vergleich mit einer Studie, die Anpassung an osmotischen Stress als perfekte Adaptation auf Grund eines vereinfachten Modells beschreibt, hebt die Rolle der gewählten Perspektive zum Verständnis biologischer Systeme hervor. Mathematical modeling has become an important tool in biology, reflected in the emergence of systems biology. Successful application of mathematical methods to biological questions requires collaboration of experimental and theoretical scientists to identify and study the problem at hand and to ensure that biology and model match. In this thesis, I present two studies on adaptation to hyperosmotic conditions in the yeast Saccharomyces cerevisae: A biologically faithful description of the signaling pathways activating Hog1 and a model integrating the effects of Hog1-activity and cellular metabolism, describing osmoadaptation in cellular context. The study of osmoadaptation in cellular context suggests that Hog1 and Fps1, two crucial components of adaptation, interact upon hyperosmotic stress. This finding is facilitated by incorporating multiple strains with mutations leading to partly oppositional phenotypes. This study further reveals that the role of glycerol in long term adaptation has been overestimated so far. According to the results presented here, glycerol is utilized as an ’emergency’ osmoprotectant and other compounds, e.g. trehalose, contribute significantly to osmoadaptation. Accounting for the state of multiple cellular mechanisms (Hog1-activity, glycolysis, growth) shows that adaptation to hyperosmotic stress and the impact of the individual mechanisms of adaptation is context dependent and that adaptation to sustained osmostress is not perfect, the expense reflected in a reduced growth rate in hyperosmotic medium. Time-dependent sensitivity analysis supports the notion of context. The perspective chosen allows observations on intracellular signaling components, metabolites and growth speed. Comparison with a study that describes osmoadaptation as perfect adaptation highlights the role of this perspective for the conclusions drawn, thus emphasizing the importance of an integrative perspective for understanding biological systems.

L'exposition à la lumière des solutions de nutrition parentérale (NP) génère des peroxydes tels que l'H2O2 et l'ascorbylperoxyde (AscOOH). Cette absence de photo-protection provoque une augmentation des triglycérides (TG) plasmatique chez les enfants prématurés et chez un modèle animal, ayant un stress oxydatif et une stéatose hépatique indépendante de l’exposition au H2O2. Nous pensons que l'AscOOH est l'agent actif conduisant à l'élévation des TG. Le but est d'investiguer le rôle de l'AscOOH sur les métabolismes du glucose et des lipides à l'aide d'un modèle animal néonatal de NP., The light exposure of parenteral nutritive solutions generates peroxides such as H2O2 and ascorbylperoxide. This absence of photo-protection is associated with higher plasma triacylglycerol concentration (TG) in premature infants and, in animals, with oxidative stress and a H2O2 independent hepatic steatosis. We hypothesized that ascorbylperoxide is the active agent leading to high TG. The aim was to investigate the role of ascorbylperoxide on glucose and lipid metabolism in an animal model of neonatal parenteral nutrition.

Chloroacetaldehyde (CAA), one of the main products of ifosfamide (IFO) hepatic metabolism, is considered as responsible of IFO nephrotoxicity. The mechanisms of this nephrotoxicity are not completely known. In the first part of this study, we tried to clarify the pathophysiological mechanisms of CAA toxicity using precision-cut rat renal cortical slices, then, in the second part, we looked for a possible anticancerous effect of CAA on human breast cancer cells (MCF-7). Using clinically-relevant concentrations (0-75 µM), CAA nephrotoxicity was demonstrated by the depletion of ATP and glutathione and by the inhibition of lactate metabolism. Some of the gluconeogenic enzymes, mainly glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, were inhibited by CAA. The complex I of the mitochondrial respiratory chain as well as lactate oxidation were also inhibited by CAA. On the other hand, CAA (10 and 25 µM) inhibited MCF-7 cell proliferation which was not accompanied by cellular ATP depletion. Glucose transport and metabolism as well as some of the glycolytic enzymes were also inhibited by CAA. Hexokinase seems to be the rate-limiting enzyme of glycolysis. In conclusion, CAA is implied in the mechanisms of IFO-induced nephrotoxicity; furthermore, it could, via the inhibition of the glycolytic pathway, contribute to the therapeutic effect of IFO., Le chloroacétaldéhyde (CAA), un des principaux produits du métabolisme hépatique de l’ifosfamide (IFO), est considéré comme responsable de la néphrotoxicité de ce médicament. Les mécanismes exacts de cette néphrotoxicité ne sont pas complètement élucidés. Dans la première partie de cette étude, nous avons essayé de préciser les mécanismes physiopathologiques de la toxicité du CAA sur un modèle de tranches de cortex rénal de rat, puis, dans la deuxième partie, nous avons recherché un effet anticancéreux éventuel du CAA sur des cellules de cancer du sein humain (MCF-7). La néphrotoxicité du CAA, utilisé à des concentrations proches de celles mesurées chez les patients traités par l’IFO, soit 0 - 75 µM, s’est manifestée par une chute d’ATP et du glutathion ainsi que par une inhibition du métabolisme du lactate. Certaines enzymes de la néoglucogenèse, notamment la glyceraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase, ont été inhibées par le CAA. Le complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale ainsi que l’oxydation du lactate ont été également inhibées par le toxique. D’autre part, le CAA (10 et 25 µM) a inhibé la prolifération des cellules MCF-7 sans que cette inhibition soit accompagnée d’une chute d’ATP cellulaire. Le transport cellulaire et le métabolisme du glucose ainsi que certaines enzymes de la glycolyse ont été également inhibés par le CAA. Parmi celles-ci, l’hexokinase semble être l’enzyme qui catalyse l’étape limitante de la voie de la glycolyse. En conclusion, le CAA est bien impliqué dans les mécanismes de la néphrotoxicité de l’IFO, mais de plus, il pourrait, via l’inhibition de la glycolyse, contribuer à l’effet thérapeutique de l’IFO.

Deux groupes de dinde sont sélectionnés selon leur valeur du pH20min post mortem du muscle Pectoralis major. Les modifications des protéines sont étudiées dans des muscles du groupe glycolyse rapide (GR, pH20min = 5,80 + 0,07, n = 20) et ceux du groupe glycolyse normale (GN, pH20min = 6,21 + 0,01, n = 20) à 20 min et à 24 h post mortem. La viande GR exhibe les qualités technologiques plus faibles (plus pertes à la conservation et moins aptitudes aux transformations) que la viande GN par contre la valeur de L* n'est pas différente entre ces deux groupes de viande. Les résultats de teneur en glycogène et en ses métabolites confirment la vitesse plus élevée de glycolyse de viande GR. Les faibles extractabilités des protéines myofibrillaire (fraction HIS) et cytosquelletiques (fraction culot) à 20 min post mortem du groupe GR peuvent être un résultat de la combinaison bas pH – température élevée conduisant à la dénaturation des protéines musculaires. Cependant, la viande GR semble avoir une maturation plus faible que la viande GN. Après une séparation des protéines par SDS-PAGE, quelques animaux du groupe GR présentent une forte baisse d'intensité des bandes situées autour de 45 kDa et 200 kDa. Ces protéines sont identifiées comme l'actine et la chaîne lourde de la myosine (MHC), respectivement. Leurs quantités relatives ne diffèrent pas entre les deux groupes à 20 min post mortem. Par contre, les viandes GR ont une moins de quantité relative de l'actine à 24 h post mortem. Toutefois, les quantités relatives d'actine et de MHC sont augmentées avec le temps post mortem. Les activités de la phosphofructokinase, de l'aldolase A et de la GAPDH sont inférieures pour la viande GR. Cependant, les paramètres cinétiques d'aldolase A et de GAPDH, la quantité relative de GAPDH ainsi que l'expression du gène codant pour l'aldolase A ne sont pas différents entre la viande des groupes GR et GN.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thermostable proteins can resist temperature stress whilst keeping their integrity and functionality. In many cases, thermostable proteins originate from hyperthermophilic microorganisms that thrive in extreme environments. These systems are generally located close to geothermal (volcanic) activity, such as in smoking vents on the bottom of the ocean or hot springs at the earth’s surface. Thermostable proteins, especially enzymes, have found extensive use in various biotechnological processes as their stability makes them ideal catalysts at a variety of temperatures and in harsh solvents. Carbohydrates are one of the main sources of energy for many living organisms. To gain insight into the carbohydrate metabolism of hyperthermophilic organisms, as well as the potential applications of thermostable proteins, several proteins involved in different aspects of carbohydrate metabolism were selected for detailed molecular genetic and biochemical analysis, as described below. The glycolytic enzyme phosphoglucose isomerase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus was overproduced, purified, crystallized and biochemically characterized. Several structures together with electron paramagnetic resonance data, nuclear magnetic resonance spectroscopy data and enzyme inhibition analysis were used to elucidate the reaction mechanism of this enzyme. Computational analysis of the cupin superfamily, to which this protein belongs, allowed the essential residues for this protein’s integrity to be predicted. Subsequently, these predictions were verified by testing the activity of several generated mutants. To study regulation of carbohydrate metabolism in two related hyperthermophilic organisms; P. furiosus and Thermococcus kodakaraensis, the transcription initiation sites of glycolytic genes in P. furiosus were mapped and analysed. The obtained promoters were compared computationally to upstream regions of non-glycolytic genes. This allowed for the identification of a potential palindromic transcription factor binding site present in many genes involved in glycolysis and starch metabolism (Thermococcales-Glycolytic-Motif, TGM). Subsequently, two putative regulators of this regulon were selected for further analysis. One of them, the sugar fermentation stimulation protein SfsA, appeared to be an endonuclease. SfsA from both the thermophilic archaeon P. furiosus and the mesophilic bacterium E. coli were further characterized. Both SfsAs appeared to bind nucleotides with a distinct specificity with the P. furiosus SfsA appearing to bind RNA while the E. coli SfsA appeared to bind DNA. The P. furiosus SfsA showed hydrolytic activity on dsDNA. Genomic context analysis together with Histidine-tag pull-downs of E. coli SfsA indicated a possible role in RNA/DNA/nucleotide turnover. The other putative regulator of glycolytic genes in P. furiosus and T. kodakaraensis, Tgr, was over-expressed, purified and binding to the Thermococcales glycolytic promoter motif (TGM) by gel retardation assays was established. Furthermore, whole-genome DNA microarray analysis of T. kodakaraensis and an isogenic tgr knockout of this organism revealed that transcriptional regulation of genes containing a TGM in their promoter region in the knockout of tgr was severely affected, indicating that Tgr was regulating these genes in vivo. Co-factor analysis with several maltooligosaccharides proved that maltotriose was the effector of Tgr. To study the applicability of thermostable proteins, a biosensor was constructed based on the maltotriose binding protein from the ABC-transporter of P. furiosus. Several amino acids of this binding protein were mutated to cysteines and tagged with a fluorescent probe. Addition of maltotriose resulted in a change in fluorescence intensity in some of the biosensors. Tests at 20 and 60 degrees Celsius indicated that the affinity of the sensor was dependent on the temperature of the environment, and proved that the protein could be used at higher temperatures. The work described in this thesis is a contribution to the understanding of how thermostable proteins function in vivo, and how these proteins can be employed in a practical setup. The presented studies have revealed molecular details on enzymatic performance, transcription factor dependent regulation of glycolysis and the use of a thermostable protein in a biosensor setup.

Thermostable proteins can resist temperature stress whilst keeping their integrity and functionality. In many cases, thermostable proteins originate from hyperthermophilic microorganisms that thrive in extreme environments. These systems are generally located close to geothermal (volcanic) activity, such as in smoking vents on the bottom of the ocean or hot springs at the earth’s surface. Thermostable proteins, especially enzymes, have found extensive use in various biotechnological processes as their stability makes them ideal catalysts at a variety of temperatures and in harsh solvents. Carbohydrates are one of the main sources of energy for many living organisms. To gain insight into the carbohydrate metabolism of hyperthermophilic organisms, as well as the potential applications of thermostable proteins, several proteins involved in different aspects of carbohydrate metabolism were selected for detailed molecular genetic and biochemical analysis, as described below. The glycolytic enzyme phosphoglucose isomerase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus was overproduced, purified, crystallized and biochemically characterized. Several structures together with electron paramagnetic resonance data, nuclear magnetic resonance spectroscopy data and enzyme inhibition analysis were used to elucidate the reaction mechanism of this enzyme. Computational analysis of the cupin superfamily, to which this protein belongs, allowed the essential residues for this protein’s integrity to be predicted. Subsequently, these predictions were verified by testing the activity of several generated mutants. To study regulation of carbohydrate metabolism in two related hyperthermophilic organisms; P. furiosus and Thermococcus kodakaraensis, the transcription initiation sites of glycolytic genes in P. furiosus were mapped and analysed. The obtained promoters were compared computationally to upstream regions of non-glycolytic genes. This allowed for the identification of a potential palindromic transcription factor binding site present in many genes involved in glycolysis and starch metabolism (Thermococcales-Glycolytic-Motif, TGM). Subsequently, two putative regulators of this regulon were selected for further analysis. One of them, the sugar fermentation stimulation protein SfsA, appeared to be an endonuclease. SfsA from both the thermophilic archaeon P. furiosus and the mesophilic bacterium E. coli were further characterized. Both SfsAs appeared to bind nucleotides with a distinct specificity with the P. furiosus SfsA appearing to bind RNA while the E. coli SfsA appeared to bind DNA. The P. furiosus SfsA showed hydrolytic activity on dsDNA. Genomic context analysis together with Histidine-tag pull-downs of E. coli SfsA indicated a possible role in RNA/DNA/nucleotide turnover. The other putative regulator of glycolytic genes in P. furiosus and T. kodakaraensis, Tgr, was over-expressed, purified and binding to the Thermococcales glycolytic promoter motif (TGM) by gel retardation assays was established. Furthermore, whole-genome DNA microarray analysis of T. kodakaraensis and an isogenic tgr knockout of this organism revealed that transcriptional regulation of genes containing a TGM in their promoter region in the knockout of tgr was severely affected, indicating that Tgr was regulating these genes in vivo. Co-factor analysis with several maltooligosaccharides proved that maltotriose was the effector of Tgr. To study the applicability of thermostable proteins, a biosensor was constructed based on the maltotriose binding protein from the ABC-transporter of P. furiosus. Several amino acids of this binding protein were mutated to cysteines and tagged with a fluorescent probe. Addition of maltotriose resulted in a change in fluorescence intensity in some of the biosensors. Tests at 20 and 60 degrees Celsius indicated that the affinity of the sensor was dependent on the temperature of the environment, and proved that the protein could be used at higher temperatures. The work described in this thesis is a contribution to the understanding of how thermostable proteins function in vivo, and how these proteins can be employed in a practical setup. The presented studies have revealed molecular details on enzymatic performance, transcription factor dependent regulation of glycolysis and the use of a thermostable protein in a biosensor setup.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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