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For a long time viroids have been detected by bioassay. Electrophoretic assay was introduced in 1976 for Potato spindle tuber. In the past months we developed this technique for Chrysanthemum stunt. Till now, the second Chrysanthemum viroid, Chrysanthemum chlorotic mottle was still detected by bioassay. Even under the best environmental conditions and especially high temperature and illumination the test is long (4-8 weeks) and not reliable. We demonstrate here that the electrophoretic assay is also very suitable for the detection of CChMV. When carried with slab gels stained with ethidium bromide it exhibits a high sensitivity and presents the same advantages, reliability and versatility, as observed with PSTV and CSV., Le Chrysanthème peut être infecté par deux viroïdes, le rabougrissement (CSV) et les marbrures chlorotiques (CChMV). L’indexage classique consiste en une transmission par greffe sur des variétés indicatrices sensibles : les variétés utilisées sont le plus généralement « Mistletoe » d’une part, « Deep Ridge » ou « Yellow Delaware » d’autre part, pour le rabougrissement et les marbrures chlorotiques respectivement. Dans les meilleures conditions d’environnement (28-30 °C, 15 000 lux et 85 p. 100 d’humidité), les symptômes caractéristiques n’apparaissent que plusieurs semaines après inoculation et le pourcentage des plantes inoculées développant des symptômes est faible notamment dans le cas du CChMV. Dans les dernières années, une technique d’électrophorèse a été développée d’abord pour l’indexage du viroïde des tubercules fusiformes de la Pomme de terre (PSTV), puis pour celui du rabougrissement du Chrysanthème. La technique utilisée pour le CSV a été appliquée au CChMV : elle est fondée sur l’extraction des acides nucléiques de la plante, l’élimination des gros RNA par LiC1 2M et la séparation des petits RNA par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 5 p. 100 en plaque. La coloration des acides nucléiques par le bromure d’éthidium confère une grande sensibilité à cette technique qui peut détecter moins de 10 ng de RNA viroïdal. Ainsi le CChMV a pu être mis en évidence dans des échantillons végétaux très réduits : il suffit en effet d’un échantillon de 12 mg de jeunes feuilles ou de racines pour détecter le viroïde qui peut être également observé dans des échantillons de 100 mg de feuilles âgées ou de tiges. La technique électrophorétique d’indexage est également applicable à des jeunes plantes issues de cultures in vitro. Par ailleurs, l’indexage électrophorétique est plus faible que l’indexage biologique ; en effet, le viroïde est régulièrement mis en évidence dans des plantes inoculées par CChMV et ne présentant pas de symptômes. Les deux viroïdes, CSV et CChMV, qui ont en gel de polyacrylamide à 5 p. 100 la même mobilité, ne peuvent être différenciés par la technique électrophorétique qui, en contre-partie, présente l’avantage de pouvoir, dans les mêmes conditions, déceler dans un contrôle de routine aussi bien le CSV que le CChMV.

Les effets du PSTV ont été étudiés sur plusieurs cultivars de pomme de terre infectés artificiellement et maintenus en serre isolée. Dans ces conditions de culture, l’infection a peu d’effet sur les organes aériens ; en revanche, on observe un effet très marqué sur la taille et les facultés germinatives des tubercules de certaines variétés, notamment « Belle de Fontenay ». L’évolution de l’infection dans la plante a été suivie tout au long du cycle végétatif, dans les feuilles, puis dans les tubercules. Le PSTV a été recherché par la technique d’hybridation moléculaire utilisant une sonde constituée d’un plasmide contenant une copie complète de PSTV et marquée au 3P2 par « nick translation ». La présence du PSTV peut être mise en évidence très précocement après l’inoculation et il existe une parfaite corrélation entre les résultats des tests effectués sur les parties aériennes et sur les tubercules. Cependant, une certaine hétérogénéité de la distribution du PSTV pose le problème de l’échantillonnage. L’intérêt et la sensibilité de la technique d’hybridation moléculaire (qui permet de détecter régulièrement 15 à 30 pg de viroïde) ont été confirmés. Cette méthode apparaît particulièrement adaptée à une détection précoce du viroïde aussi bien dans les organes aériens que dans les tubercules., Several potato cultivars were artificially inoculated. Under our culture conditions in an isolated greenhouse, PSTV appeared to have little effect on the above-ground part of the plant ; by contrast, it has marked effect on tuber production and quality : the size and germination of tubers of some cultivars were particularly affected (Belle de Fontenay). Spread of PSTV in the plant from the inoculation point was followed by sampling of leaves during the vegetation period, and subsequently of tubers. PSTV was detected by a molecular hybridization technique using a 32P-labelled probe consisting of a plasmid containing a full-length copy of PSTV. Presence of PSTV was detected as early as 9 days after inoculation and the results point to a good correlation between the results of the tests carried out on leaves and on tubers. Nevertheless uneven distribution of the viroid in leaves and tubers was observed, which poses the problem of sampling. The reliability and sensitivity of the molecular hybridization technique (which detects as low as 15-30 pg viroid) were confirmed : this technique appears to be perfectly adapted to early detection of PSTV in leaves and tubers of infected potato plants.

Candresse, T., Cambra, M., Dallot, S., Lanneau, M., Asensio, M., Gorris, M. T., Revers, F., Macquaire, G., Olmos, A., Boscia, D., Quiot, J. B., and Dunez, J. 1998. Comparison of monoclonal antibodies and polymerase chain reaction assays for the typing of isolates belonging to the D and M serotypes of plum pox potyvirus. Phytopathology 88:198-204. Plum pox potyvirus (PPV) isolates may be divided into four groups separated by serological, molecular, and epidemiological differences. Monoclonal antibodies specific for the two major groups of isolates, represented by the D and M serotypes of the virus, have been obtained. Polymerase chain reaction (PCR)-based assays allowing the direct detection and differentiation of PPV isolates have also been developed. We now report on a large-scale comparison of these two typing approaches. The results obtained show an overall excellent correlation between the results obtained in indirect double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay using PPV-D‐ and PPV-M‐specific monoclonal antibodies and those derived from either specific PCR assays or restriction fragment length polymorphism analysis of PCR fragments. Without exception, all isolates reacting positively with the PPV-M‐specific m onoclonal antibody were found to belong to the M serotype using the PCRbased assays, while 51 out of 53 isolates recognized by the D-specific monoclonal antibodies belonged to the D serotype according to the PCR typing results. However, failure to react with a specific m onoclonal antibody did not prove as effective a predictor of the serotype of the isolate analyzed. In a few cases, the results obtained with the various techniques diverged, indicating low level variability of the epitopes rec ognized by the serotype-specific monoclonal antibodies. Isolates belonging to the two minor groups of PPV (El Amar and Cherry) also gave divergent results, indicating that the current typing assays are not suited for the analysis of such isolates.