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In order to clarify the origin of the haptoglobin (Hp) quantified in saliva and meat juice samples, the extrahepatic localization of Hp in salivary gland and in diaphragmatic muscle, as part of the systemic acute phase response in pigs, was studied by immunohistochemistry. For this purpose a specific monoclonal antibody (mAb) produced by immunising mice with purified porcine Hp was used. Reactivity of the mAb was assessed by direct ELISA and by western blot, which showed the ability and specificity of the mAb to identify porcine haptoglobin as a purified antigen or in porcine serum in a native or denatured but non-reduced state. Five healthy and five diseased pigs were sampled at slaughter for serum and tissue procurement. Hepatic immunohistochemical analysis was used as control of the acute phase reaction status. In the liver, cell immunostaining revealed a perinuclear, cytoplasmic localization of Hp within hepatocytes, following mainly a periacinar pattern. Extrahepatic immunohistochemical analysis revealed positive cells in the glandular acini and duct epithelial cells of the salivary gland and intrasarcoplasmic immunolabelling of random diaphragmatic myofibers. A possible role of both salivary gland and diaphragmatic muscle on local Hp production could be postulated based on the present immunohistochemical study, which supports the concept that other cells besides hepatocytes may have the potential to produce Hp in the pig

Las células presentadoras de antígeno son aquellas células encargadas de capturar, procesar y presentar antígenos con la finalidad de lograr una respuesta inmune efectiva por parte del organismo. Su papel, como centinelas, es crucial durante el transcurso de diversas enfermedades infecciosas. El estudio de estas células tras la infección con el virus del Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino nos da información para abordar nuevas estrategias de control frente a esta enfermedad. Antigen presenting cells are able to capture, process and present antigens in order to develop an effective immune response. The role of these cells during infectious diseases is crucial to control the disease. Thus, the study of these cells after the infection with Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus gives us useful information on how to control this disease.

El Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino representa uno de las enfermedades más importantes de la industria porcina. Este síndrome se caracteriza por inducir una neumonía interstiticial en cerdos de transición y de engorde, así como fallo reproductivo en cerdas gestantes. El PRRS está causado por un virus ARN, conocido como virus del PRRS (VPRRS), perteneciente a la familia Arteriviridae, orden Nidovirales. Entre los principales aspectos que quedan por conocer de la enfermedad se encuentra la alteración de la respuesta inmune y el papel que las citoquinas desempeñan en la patogenia del PRRS. Así, el objetivo general de esta tesis consistió en evaluar los cambios de la expresión sérica y tisular de diferentes citoquinas y su relación con la respuesta inmune desarrollada frente al VPRRS. Veintiocho cerdos, libres del VPRRS, fueron inoculados intramuscularmente con el aislado de campo 2982 del VPRRS. Otros cuatro cerdos, de idénticas características, fueron utilizados como control, sacrificándose al final del estudio. De estos animales se tomaron muestras de sangre y de diferentes órganos a los 0, 3, 7, 10, 14, 17, 21 y 24 días post-inoculación (dpi) para la determinación de las subpoblaciones de linfocitos y la expresión de proteínas de fase aguda (PFAs) y citoquinas. En nuestro estudio, el recuento de células CD21+ aumentó tanto en células mononucleares de sangre periférica (CMSPs) como en el nódulo linfático traqueobronquial entre los 17 y los 24 dpi, coincidiendo con un incremento del título de anticuerpos específicos. Asimismo se observó un aumento de las células T CD4-CD8high y CD4+CD8+. El recuento de células T CD4-CD8low estaba disminuido en todos los órganos examinados, mientras que las células T CD4+CD8- disminuyeron únicamente en el bazo. La disminución de la viremia se correlacionó con un aumento de las células T CD4-CD8high, y con una mayor expresión de la interleuquina-10 (IL-10) y de la interleuquina-12 p40 (IL-12 p40). Durante la fase temprana de la infección no se detectó una respuesta eficiente de interferón gamma (IFN¿) y la expresión de interferón alfa (IFN¿) fue tardía. Estos resultados sugieren que la IL-10 e IL-12 y las células T CD4-CD8high serían importantes mediadores en la respuesta inmune frente al VPRRS. La concentración sérica de haptoglobina (Hp) y pig-major acute protein (Pig-MAP) mostró un aumento moderado a los 10 dpi, mientras que los niveles de proteína C reactiva (PCR) y amiloide A sérica (AAS) presentaron un incremento retardado y altamente variable. Las citoquinas proinflamatorias fueron detectadas en niveles bajos en suero, observándose sólo un aumento moderado de la interleuquina-1 beta (IL-1ß). Aunque el factor de necrosis tumoral alfa (TNF¿) se expresó en niveles bajos, se observó una correlación positiva con la viremia, y con los niveles de IL-6 y Hp. Por todo, el TNF¿ podría desempeñar un papel importante en la modulación de la respuesta inmune frente al VPRRS. En el pulmón, la expresión tisular de citoquinas proinflamatorias estaba correlacionada con el grado de lesión histopatológica de lesión pulmonar y con la cinética de los macrófagos, desarrollando estas citoquinas un papel importante en la patogenia de la neumonía intersticial observada en la enfermedad. Una correlación significativa fue observada entre los niveles de expresión del virus y de la expresión de IL-10, y entre la expresión de IL-12 p40 y TNF¿ con respecto de IFN¿, pero no entre IFN¿ e IFN¿. Nuestros resultados sugieren que el VPRRS modula la respuesta inmune a través de la expresión de IL-10, lo cual podría inducir niveles más bajos de otras citoquinas implicadas en la eliminación del virus, como IFN¿, IFN¿, IL-12 p40 y TNF¿. Las citoquinas estudiadas fueron expresadas principalmente por macrófagos del septo del pulmón, de forma que estos estarían implicados fundamentalmente en la síntesis y liberación de citoquinas, mientras que los MAPs representaron la célula diana involucrada en la replicación del VPRRS.

A cat was presented with right head tilt and circling. The lack of expression of virus antigens did not support the postmortem diagnosis of encephalomyelitis pointing to a diffuse primary central nervous system T-cell lymphoma on the basis of CD3 and CD45R co-expression with absence of CD79α staining.

Forty years after its appearance, Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) continues being a major hazard for the economy of the porcine sector, due to the lack of fully effective tools for its diagnosis and control. This scenario, together with the re-emergence of virulent strains, has increased the interest of the scientific community in the study of the immunopathogenesis of the plethora of PRRSV strains. Virulent PRRSV strains cause more severe signs and more striking lesions, together with high viraemia and viral loads in different organs as well as an aberrant and erratic immune response. Recently, in 2018, the established genetic and antigenic differences between the former European genotype or PRRSV-1 and the American genotype or PRRSV-2 have led to classify them into two different viral species Betaarterivirus suid 1 (for PRRSV-1) and Betaarterivirus suid 2 (for PRRSV-2). One of the main characteristics of PRRSV, regardless of its virulence, is its ability to modulate the host immune response, facilitating viral distribution, replication and latency in the body. The following doctoral thesis entitled “Regulation of the host immune response by PRRSV-1 strains of different virulence” delves into until know underexplored processes modulated during the early stage of infection with PRRSV in target organs of infected piglets, carrying out a comparative study between two PRRSV-1 strains of different virulence, the low virulent 3249 strain and the virulent Lena strain. The thymus, as the source of development and maturation of T lymphocytes, has a key role in the proper establishment of the immune response. Of note, thymic atrophy is one of the characteristic lesions of PRRSV, especially described in animals infected by virulent strains of the virus. In this sense, the induction of cell death phenomena such as apoptosis has been one of the postulated mechanisms able to induce this thymic atrophy during PRRSV infection, modulating the host immune response. Thus, the objective of the first work of this doctoral thesis was the assessment of the lesional picture and the evaluation of the cell death phenomena in the thymus of infected piglets with the two strains of the virus above mentioned. Animals infected with the virulent Lena strain showed evident thymus atrophy in comparison with thymi from animals of either control or 3249-infected groups. This increase in the degree of injury in the animals infected with the virulent strain was related to a rise in the viral load and the expression of nucleocapsid protein (N protein) of the virus in this organ. Thymi from animals infected with 3249 strain, on the contrary, exhibited a mild to moderate degree of injury with lower levels of N protein and PRRSV viral load in the thymus. Additionally, in the thymus from animals infected with Lena strain, an increase in the expression of the generic marker of cell death TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling) and the protein cleaved caspase-3 (cCasp3), an executioner caspase in which converge extrinsic and intrinsic pathways of apoptosis, were observed by immunohistochemical labelling, coinciding with the enhancement in the severity of the lesion. In the thymus from both infected groups, a greater induction of the extrinsic pathway of apoptosis was observed, evidenced by an increase in the cleaved caspase-8 (cCasp8) and fas cell death receptor (Fas) proteins. This increase in cell death phenomena, especially in Lena strain-infected animals, may cause a lower number of viable and mature T lymphocytes and, consequently, an impairment in the host immune response. This finding helps to explain, at least in part, the increase in fever and the greater clinical signs, such as apathy, lethargy, anorexia, and respiratory signs, as well as the greater intensity of the lesions, for instance, suppurative bronchopneumonia, observed in these animals. In addition to induction of apoptosis in the thymus, improper T lymphocytes activation also constitutes a mechanism for modulating the immune response during infection with PRRSV. During antigen presentation by antigen-presenting cells (APCs) to T lymphocytes, the interplay of certain stimulatory and inhibitory signals, among others, is required. Under physiological conditions, inhibitory signals act as a brake for the immune system, modulating the inflammatory response and inducing immunotolerance. However, in pathological situations, such as cancer or chronic infections, these molecules, known as immune checkpoints, act as an escape mechanism, causing inadequate T-cell activation. In addition, some of these molecules may also affect T-cell development in the thymus as well as the activation and proliferation of T-cells in target organs and secondary lymphoid organs. Under this context, the second and third studies of this doctoral thesis aimed to evaluate the expression as well as the role of immune checkpoints in target organs (thymus, lung and tracheobronchial lymph node) of pigs infected with the two PRRSV-1 strains of different virulence. In the second study, focused on the thymus, several coinhibitory immune checkpoints [programmed cell death/programmed death-ligand 1 (PD1/PDL1), cytotoxic T-Lymphocyte antigen-4 (CTLA4), T-cell immunoglobulin domain and mucin domain 3 (TIM3), lymphocyte activating 3 (LAG3), CD200 receptor 1 (CD200R1) and indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1)], related to the development and maturation of T lymphocytes, were evaluated using real-time quantitative PCR (qRT-PCR) and immunohistochemistry. The results showed an overexpression of the immune checkpoints PDL1, CTLA4, TIM3, LAG3 and IDO1, especially in the thymus of Lena-infected piglets, from the first week post-infection. The co-expression of these molecules may affect T lymphocytes development, maturation, and selection in the thymus and, in addition, in our study was associated with disease progression and apoptosis phenomena in infected pigs. The third study, focused on the lung and the tracheobronchial lymph node, comprised both coinhibitory [CTLA4, T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains (TIGIT), PD1/PDL1, TIM3, LAG3 and IDO1] and costimulatory [CD28, CD226, tumour necrosis receptor superfamily member 9 (TNFRSF9), L-selectin (SELL or CD62L), inducible T-cell costimulator (ICOS) and CD40] immune checkpoints. Our results highlighted a mild increase of costimulatory molecules together with an earlier and stronger upregulation of coinhibitory molecules in target organs from PRRSV-1 infected animals, especially in the lung from virulent Lena strain. Simultaneous expression of coinhibitory immune checkpoints suggests a synergistic effect of these molecules most probably oriented to control the exacerbated inflammatory response during the early stage of PRRSV infection. In addition, the sustained expression of some immune checkpoints, particularly during late stages of PRRSV infection, might also impact the activation and proliferation of T cells impairing the onset of an efficient host immune response. During the process of antigen presentation and polarisation of T lymphocytes, they undergo a series of divisions and differentiations that will give rise to effector T lymphocytes, capable of producing specific cytokines and inducing cytolytic activity by proteins such as Fas/FasL. This event is determined by the action of different transcription factors (TFs), proteins that regulate cellular gene expression. Thus, the expression of the TF T-box transcription factor 21 (T-bet) will result in a polarisation towards a Th1 type response, forkhead box P3 (FOXP3) in a differentiation towards a regulatory response by regulatory T lymphocytes (Tregs), GATA binding protein 3 (GATA3) will be related to Th2 response and the TF eomesodermin (EOMES) will lead towards a cytotoxic response in charge of CD4 cytotoxic T lymphocytes (CTLs). Despite the importance of TFs in the onset of the adaptive immune response, their study in the context of PRRSV infection is scarce. Therefore, the third objective of this doctoral thesis was to evaluate the expression by qRT-PCR of different TFs (T-bet, GATA3, FOXP3 and EOMES) as well as the expression of the different effector cytokines [interferon gamma (IFNG), tumour necrosis factor alpha (TNFA) and interleukin (IL)-10 (IL10)] and FASL in target organs (lung, tracheobronchial lymph node and thymus) of pigs infected with two PRRSV-1 strains of different virulence. Organs from animals belonging to both infected groups, but especially those infected with Lena strain, showed an overexpression of the TFs T-bet, EOMES and FOXP3 together with an increase in the cytokine IFNG at the end of the study. These results show a polarisation of T cells towards a response of Th1 type, Tregs and CD4 CTLs, particularly after infection with the virulent Lena strain. Altogether, this doctoral thesis analyses different mechanisms which underlie PRRSV immunopathogenesis and serves as a basis for future functional studies addressed to better understand the disease. Cuarenta años después de su aparición, el Virus del Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRSV, del inglés Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus) sigue siendo uno de los agentes patógenes con mayor repercusión económica en el sector porcino, debido a la falta de herramientas totalmente eficaces para su diagnóstico y control. Esto unido a la reemergencia de cepas virulentas ha aumentado el interés por parte de la comunidad científica en el estudio de la inmunopatogenia de las diferentes cepas del virus. Las cepas virulentas del PRRSV producen una sintomatología y lesiones más graves que las cepas clásicas o de baja virulencia, y se asocian con una elevada carga viral tanto en suero como en tejidos. Además, la respuesta inmune frente a la enfermedad es aberrante y errática. Debido a sus diferencias biológicas y a su aislamiento en los dos continentes, a principios de los 90 se designaron dos genotipos distintos del virus, genotipo europeo o PRRSV-1 y genotipo americano o PRRSV-2. Recientemente, en 2018, las diferencias genéticas y antigénicas estudiadas han permitido clasificarlo en dos especies víricas distintas Betaarterivirus suid 1 (o PRRSV-1) y Betaarterivirus suid 2 (o PRRSV-2). Una de las principales características de este virus, independientemente de su virulencia, es su capacidad para modular la respuesta inmune del hospedador. Así pues, el PRRSV, es capaz de regular diversos procesos biológicos del sistema inmune para favorecer su distribución, replicación y latencia en el organismo. En la siguiente tesis doctoral titulada “Regulación de la respuesta inmune en cepas de distinta virulencia del PRRSV-1” se profundiza en procesos pobremente estudiados que pueden ser modulados durante la etapa temprana de la infección con PRRSV en órganos diana de lechones infectados, realizándose un estudio comparativo entre dos cepas de distinta virulencia del PRRSV-1, una de baja virulencia, cepa 3249, y otra de elevada virulencia, cepa Lena. El timo es un órgano linfoide primario de importancia crucial en el correcto desarrollo de la respuesta inmune ya que es el órgano donde se produce el desarrollo y maduración de los linfocitos T. La atrofia tímica es una de las lesiones características del PRRSV, especialmente descrita en los animales infectados por cepas virulentas del virus. En este sentido, la inducción de los fenómenos de muerte celular como la apoptosis ha sido uno de los mecanismos postulados como causante de la atrofia tímica durante la infección por este virus, con una repercusión especial en la modulación de la respuesta inmune del hospedador. El objetivo del primer trabajo de esta tesis doctoral fue la valoración del cuadro lesional del timo de lechones infectados con las dos cepas anteriormente mencionadas del PRRSV-1, así como la evaluación de los fenómenos de muerte celular en los mismos. Los animales infectados con la cepa virulenta Lena mostraron una evidente atrofia del timo en comparación con los timos de los animales del grupo control y del grupo infectado con la cepa 3249 de baja virulencia. Este aumento en el grado de lesión de los animales infectados con la cepa virulenta se relacionaba con un aumento de la carga viral y de la expresión de la proteína N (proteína de la nucleocápside) del virus. El timo de los animales infectados con la cepa 3249, por el contrario, presentaron un grado de lesión leve a moderado con niveles más bajos de proteína N y carga viral de PRRSV en el timo. En el timo de los animales infectados con la cepa Lena se observó mediante inmunomarcaje un aumento del marcador genérico de muerte celular TUNEL (del inglés terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick-end labeling), así como un aumento de la proteína caspasa-3 activa (cCasp3, del inglés cleaved caspase-3), caspasa ejecutora en la que convergen las vías extrínseca e intrínseca de la apoptosis, que coincidía con el aumento del grado de lesión. En el timo de ambos grupos infectados se observó una mayor inducción de la vía extrínseca de la apoptosis, dado el aumento de la proteína caspasa-8 activa (cCasp8, del inglés cleaved caspase-8) y el receptor de muerte celular Fas (del inglés fas cell death receptor). Este incremento de los fenómenos de muerte celular, especialmente en los animales infectados con la cepa Lena, provocaría un menor número de linfocitos T viables y maduros y como consecuencia un deterioro en la respuesta inmune del hospedador. Este hallazgo ayuda a explicar el aumento de la fiebre y de signos clínicos más marcados (apatía, letargia, anorexia y signos respiratorios, entre otros), así como la mayor intensidad de las lesiones (por ejemplo, bronconeumonía supurativa) observadas en los animales infectados con la cepa virulenta Lena. Además de una inducción de la apoptosis en el timo, una incorrecta activación de los linfocitos T constituye también un mecanismo de modulación de la respuesta inmune durante la infección con PRRSV. Durante la presentación antigénica por parte de las células presentadoras de antígeno (APCs, del inglés antigen presenting cells) a los linfocitos T se requiere, entre otros, la interacción de ciertas señales estimuladoras e inhibidoras. En condiciones fisiológicas estas señales actúan como freno para el sistema inmune, modulando la respuesta inflamatoria e induciendo inmunotolerancia. Sin embargo, en situaciones patológicas como el cáncer o infecciones crónicas, estas moléculas conocidas como “puntos de control inmunitario” (o immune checkpoints en inglés) actúan como mecanismo de escape, provocando una incorrecta activación de los linfocitos T. Además, algunas de estas moléculas también interfieren durante el desarrollo de esta población en el timo. Bajo este contexto, el segundo y tercer trabajo de esta tesis doctoral tienen el objetivo de evaluar la expresión, así como el papel que podrían estar jugando los immune checkpoints en órganos diana (timo, pulmón y nódulo linfático traqueobronquial) de cerdos infectados con dos cepas de PRRSV-1 de diferente virulencia. En el segundo trabajo, centrado en el timo, se evaluaron varios immune checkpoints inhibitorios [PD1/PDL1 (del inglés programmed cell death/ programmed death-ligand 1), CTLA4 (del inglés cytotoxic T-lymphocyte Antigen-4), TIM3 (del inglés T-cell immunoglobulin domain and mucin domain 3), LAG3 (del inglés lymphocyte activating 3), CD200R1 (del inglés CD200 receptor 1) e IDO1 (del inglés indoleamine 2,3-dioxygenase 1)] mediante RT-PCR cuantitativa (RT-qPCR, del inglés qRT-PCR, real-time quantitative PCR) e inmunohistoquímica, que podrían estar afectando al desarrollo y maduración de los linfocitos T. Los resultados mostraron una sobreexpresión de los immune checkpoints PDL1, CTLA4, TIM3, LAG3 e IDO1 sobre todo en el timo de los lechones infectados con la cepa virulenta Lena desde la primera semana post-infección. La co-expresión de estas moléculas afecta al desarrollo, maduración y selección de los linfocitos T en el timo, lo que se asoció con una progresión de la enfermedad en los cerdos infectados y con los fenómenos de apoptosis en el órgano. El tercer estudio, se centró en el pulmón y en el nódulo linfático traqueobronquial y se evaluaron tanto immune checkpoints coestimulatorios [CD28, CD226, TNFRSF9 (del inglés tumour necrosis receptor superfamily member 9), SELL (del inglés l-sectin o CD62L), ICOS (del inglés inducible T-cell costimulator) y CD40] como coinhibitorios [(CTLA4, TIGIT (del inglés T cell immunoreceptor with Ig and IMIT domains), PD1/PDL1, TIM3, LAG3 e IDO1)]. Nuestros resultados mostraron un leve aumento de moléculas coestimuladoras junto con una temprana e intensa sobreexpresión de moléculas coinhibitorias en órganos diana de animales infectados con ambas cepas del PRRSV-1, especialmente en el pulmón de los animales infectados con la cepa virulenta Lena. La co-expresión de distintos immune checkpoints coinhibitorios sugiere un efecto sinérgico de estas moléculas orientadas probablemente a controlar la respuesta inflamatoria exacerbada durante la etapa temprana de la infección con PRRSV. Además, la expresión mantenida de algunos immune checkpoints, en particular durante etapas más tardías de la infección por PRRSV, también podría afectar a la activación y proliferación de linfocitos T, lo cual afecta al inicio de una respuesta inmune eficaz por parte del hospedador. Durante la presentación antigénica, los linfocitos T sufren una serie de divisiones y diferenciaciones que darán lugar a linfocitos T efectores, capaces de producir citoquinas específicas y de inducir actividad citolítica a cargo de proteínas como Fas/ FasL. Este acontecimiento viene determinado por la acción de diferentes factores de transcripción (FTs), proteínas que regulan la expresión de genes en las células. Así la expresión del FT T-bet (del inglés t-box transcription factor 21) resultará en una diferenciación hacia una respuesta de tipo Th1, la expresión del FT FOXP3 (del inglés forkhead box P3 gene) en una diferenciación hacia respuesta reguladora a cargo de las células T reguladoras (Tregs, del inglés regulatory T cells), el FT GATA3 (del inglés GATA binding protein 3) en una polarización de tipo Th2 y el FT EOMES (del inglés eomesodermin) hacia una respuesta citotóxica a cargo de linfocitos T citotóxicos CD4 (CTLs, del inglés cytotoxic T lymphocytes). A pesar de la importancia de los FTs en el inicio de la respuesta inmune adaptativa, su estudio en el contexto de la infección por PRRSV es escaso. Por tanto, el tercer objetivo de la presente tesis doctoral fue evaluar la expresión mediante RT-qPCR de diferentes FTs (T-bet, GATA3, FOXP3 y EOMES) así como la expresión de las diferentes citoquinas efectoras [IFNG (del inglés interferon gamma), TNFA (del inglés tumour necrosis factor alpha) e IL10 (del inglés interleukin 10)] y FASL en órganos diana (pulmón, nódulo linfático traqueobronquial y timo) de cerdos infectados con dos cepas de PRRSV-1 de distinta virulencia. Los órganos de los animales pertenecientes a los dos grupos infectados, pero especialmente de aquellos infectados con la cepa virulenta Lena, mostraron una sobreexpresión de los FTs T-bet, EOMES y FOXP3 junto con un incremento de la citoquina IFNG al final de estudio. Estos resultados muestran una polarización de las células T hacia una respuesta de las células de tipo Th1, Tregs y CD4 CTLs particularmente en respuesta de la cepa virulenta Lena. En resumen, esta tesis doctoral analiza diferentes mecanismos que hay detrás de la inmunopatogenia del PRRSV y sirve de base para futuros estudios funcionales dirigidos a aumentar el conocimiento de la enfermedad.

Premio extraordinario de Trabajo Fin de Máster curso 2020/2021. Máster en Química Aplicada El síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS) afecta a las granjas de producción porcina a nivel mundial, causando anorexia, fiebre y dificultad respiratoria en cerdos en crecimiento; mientras que en cerdas adultas se caracteriza por la disfunción reproductiva y abortos. Las vacunas comerciales disponibles actualmente sólo son capaces de proporcionar una protección parcial frente al virus del PRRS (PRRSV) debido a su capacidad de mutación y la amplia variedad de cepas existente. Por ello se ha planteado la administración de vacunas encapsuladas en nanopartículas (NPs) que puedan favorecer su aplicación por vía mucosal consiguiendo así potenciar la respuesta inmune en el hospedador. El ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA) es un copolímero ampliamente utilizado para la síntesis NPs poliméricas con aplicaciones biomédicas debido a sus propiedades de biocompatibilidad y biodegradabilidad. En este trabajo se encapsuló una vacuna viva atenuada frente al PRRSV en NPs de PLGA mediante el método de coprecipitación. Las NPs fueron caracterizadas por diversas técnicas como microscopía electrónica de barrido (SEM), dispersión de luz dinámica (DLS) y espectroscopía ultravioleta-visible. Debido a que la célula diana del virus es el macrófago alveolar pulmonar, para realizar los experimentos in vitro se aislaron monocitos de sangre periférica para su posterior diferenciación a macrófagos. Estas células fueron infectadas con NPs y con virus vacunal. Los resultados mostraron una eficiencia de encapsulación del virus cercana al 70%. Se obtuvieron NPs de tamaño en el rango de 100 a 450 nm que permitieron la encapsulación del virus y su posterior fagocitosis por los macrófagos. Aunque se confirmó que las NPs eran exitosamente fagocitadas por lo macrófagos derivados de monocitos utilizando NPs cargadas con el colorante Rojo de Nilo, mediante citometría de flujo se observó un porcentaje de infección bajo a partir de las NPs cargadas con el virus vacunal, probablemente asociado al uso de un virus atenuado. Asimismo, se caracterizaron las propiedades citotóxicas de las NPs en la aplicación en cultivo celular. Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is an economically important viral disease for the pig industry worldwide. In growing pigs it causes anorexia, fever, respiratory distress, while in pregnant sows it is characterized by reproductive dysfunction and abortions. Current vaccines fail to completely prevent PRRS outbreaks since new variants are constantly emerging. Microencapsulation of vaccine agents is seen as an attractive alternative as it allows it mucosal administration as well as to enhance the host immune response. Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a copolymer widely used for the synthesis of polymeric NPs with biomedical applications as it is biocompatible and biodegradable. In the present work, we entrapped attenuated PRRSV within PLGA nanoparticles by the coprecipitation technique. The NPs were characterized by a number of techniques, including scanning electron microscope (SEM), dynamic light scattering (DLS) and ultraviolet-visible spectroscopy. For in vitro studies, monocytes were isolated from porcine peripheral blood for further differentiation into macrophages. The vaccine virus, either encapsulated in NPs or unencapsulated, was inoculated into macrophages. The results showed that the entrapment efficiency of PRRSV loaded NPs was about 70% with NPs presenting a size that allows the virus to be encapsulated and phagocytosed by macrophages. Although NPs were confirmed to be successfully phagocytosed by using Nile Red dye loaded NPs, a low infection rate was observed by flow cytometry using vaccine virus loaded NPs, probably associated to the use of an attenuated virus. Furthermore, toxicity of the NPs was detected in cell culture.

13 Pág., Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) plays a key role in porcine respiratory disease complex modulating the host immune response and favouring secondary bacterial infections. Pulmonary alveolar macrophages (PAMs) are the main cells supporting PRRSV replication, with CD163 as the essential receptor for viral infection. Although interstitial pneumonia is by far the representative lung lesion, suppurative bronchopneumonia is described for PRRSV virulent strains. This research explores the role of several immune markers potentially involved in the regulation of the inflammatory response and sensitisation of lung to secondary bacterial infections by PRRSV-1 strains of different virulence. Conventional pigs were intranasally inoculated with the virulent subtype 3 Lena strain or the low virulent subtype 1 3249 strain and euthanised at 1, 3, 6 and 8 dpi. Lena-infected pigs exhibited more severe clinical signs, macroscopic lung score and viraemia associated with an increase of IL-6 and IFN-γ in sera compared to 3249-infected pigs. Extensive areas of lung consolidation corresponding with suppurative bronchopneumonia were observed in Lena-infected pigs. Lung viral load and PRRSV-N-protein+ cells were always higher in Lena-infected animals. PRRSV-N-protein+ cells were linked to a marked drop of CD163+ macrophages. The number of CD14+ and iNOS+ cells gradually increased along PRRSV-1 infection, being more evident in Lena-infected pigs. The frequency of CD200R1+ and FoxP3+ cells peaked late in both PRRSV-1 strains, with a strong correlation between CD200R1+ cells and lung injury in Lena-infected pigs. These results highlight the role of molecules involved in the earlier and higher extent of lung lesions in piglets infected with the virulent Lena strain, pointing out the activation of routes potentially involved in the restraint of the local inflammatory response., This work was supported by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (AGL2016-76111-R). J. Gómez-Laguna is supported by a “Ramón y Cajal” contract of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (RyC-2014-16735).

El síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS, del inglés Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) es una de las enfermedades víricas más importantes para el sector porcino a nivel mundial debido a las enormes pérdidas económicas que genera. El virus del PRRS (PRRSV, del inglés Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus), agente etiológico del PRRS, juega un papel importante en el complejo respiratorio porcino (PRDC, del inglés Porcine Respiratory Disease Complex) provocando una modulación de la respuesta inmune que favorece su persistencia en el organismo, así como infecciones bacterianas secundarias.La replicación del PRRSV tiene lugar principalmente en el pulmón, siendo los macrófagos alveolares pulmonares (PAMs, del inglés Pulmonary Alveolar Macrophages) la célula diana del virus y el receptor scavenger CD163, el cual se expresa mayoritariamente en los PAMs, esencial para que ocurra una infección productiva. EL PRRSV provoca una neumonía intersticial de moderada a grave, así como una modulación y detrimento de las poblaciones de macrófagos pulmonares, lo que complica este cuadro respiratorio favoreciendo el desarrollo de una bronconeumonía purulenta. Desde el año 2006, se han descrito diferentes brotes asociados a cepas de elevada virulencia del PRRSV-1 a lo largo del continente europeo. Estos brotes presentan un cuadro clínico lesional muy particular caracterizado por una tasa de mortalidad elevada, fi ebre y una sintomatología respiratoria grave asociada con una respuesta inflamatoria más intensa y temprana, así como un marcado daño a nivel pulmonar y de los órganos linfoides. Además, el PRRSV induce una respuesta inflamatoria que varía en función de la cepa del virus y del órgano infectado, por lo que la evaluación in situ de cada uno de los órganos diana del virus es esencial para descifrar la inmunopatogenia de la infección con cepas de diferente virulencia del PRRSV. Teniendo en cuenta estos antecedentes, la presente tesis doctoral se centra en la valoración del cuadro lesional, la evaluación de la muerte celular y la expresión de diferentes marcadores inmunológicos de potencial interés, especialmente el receptor scavenger CD163, a nivel pulmonar, así como la respuesta inmune a nivel sistémico. Por tanto, el principal objetivo de esta tesis consiste en profundizar en la inmunopatogenia de la forma respiratoria del PRRSV-1 con cepas de diferente virulencia durante la fase aguda de la infección. El primer estudio de esta tesis evalúa la expresión, distribución y cinética de células PRRSV-N-protein+, CD163+ y CD107a+ en el pulmón y la tonsila de cerdos infectados experimentalmente con 3 cepas del PRRSV-1: la cepa virulenta del subtipo 3 SU1-bel, y dos cepas de baja virulencia del subtipo 1, LV y 215-06. Los animales fueron eutanasiados a los 3, 7 y 35 días post-inoculación (dpi). La cepa SU1-bel se replicó de forma más eficiente en el pulmón y la tonsila. El número de células CD163+ disminuyó tanto en la tonsila como en el pulmón de todos los animales infectados a los 7 dpi seguido por un incremento al final del estudio, destacando una correlación negativa con la frecuencia de células PRRSV-N-protein+. Además, se observó un incremento en el número de células CD107a+ en todos los grupos infectados a los 35 dpi sin diferencias entre grupos. Mientras que la disminución inicial en el número de células CD163+ parece estar asociada tanto a la replicación del virus como a la activación de procesos de muerte celular, la recuperación de la población de macrófagos CD163+ al final del estudio podría deberse tanto al influjo de células CD163 inmaduras, al reclutamiento de células CD163+ en la zona de infección, o a ambos procesos. Estos resultados sugieren que el hospedador es capaz de restaurar esta subpoblación de macrófagos, así como sus potenciales funciones biológicas después de un mes tras la infección con cepas del PRRSV-1, con una especial relevancia en los animales infectados con la cepa virulenta SU1-bel. En el segundo estudio, nuestro objetivo se centra en comparar los signos clínicos, las lesiones macroscópicas y microscópicas, así como la expresión del receptor CD163 dentro de la subpoblación de PAMs vivos del lavado broncoalveolar (BALF, del inglés BronchoAlveolar Lavage Fluid). Para ello, cerdos convencionales libres de PRRSV se inocularon por vía intranasal con dos cepas del PRRSV-1 de diferente virulencia, la cepa virulenta Lena perteneciente al subtipo 3, o la cepa de baja virulencia 3249, perteneciente al subtipo 1, y que se sacrificaron consecutivamente a los 1, 3, 6, 8 y 13 dpi. Los signos clínicos más graves, así como el mayor grado de lesión a nivel macroscópico y microscópico se observaron en los lechones infectados con la cepa virulenta Lena, en comparación con el grupo 3249. Asimismo, se detectó un descenso temprano en la frecuencia de PAMs en el BALF, asociado a una disminución de la frecuencia y la intensidad de fluorescencia media (MFI, del inglés Median Fluorescence Intensity) del CD163 dentro de estos PAMs que fueron mucho más bajas en los cerdos infectados con Lena que en los cerdos infectados con la cepa 3249. Estos resultados podrían deberse a distintos factores como el efecto de la replicación del PRRSV, la inflamación inducida por el propio virus, la llegada de macrófagos inmaduros para restaurar la homeostasis pulmonar y/o la presencia de células CD163low tras la disminución sufrida por la subpoblación de células CD163+ en el BALF. En el tercer estudio, nos centramos en evaluar los eventos de muerte celular regulada (RCD, del inglés Regulated Cell Death) mediante la expresión de una serie de caspasas tras la infección por ambas cepas del PRRSV-1, Lena y 3249. Las muestras de tejido pulmonar se seleccionaron a partir del experimento anterior. La cepa virulenta Lena indujo una frecuencia signifi cativamente mayor de células TUNEL+ comparado con la frecuencia de las células cCasp3+ durante la primera semana post-infección. Además, ambas cepas de PRRSV-1 activaron la cCasp8 y, en menor medida, la cCasp9 después de la primera semana post-infección junto con un restablecimiento de la frecuencia de macrófagos pulmonares CD163+. Estos resultados evidencian la inducción de diferentes vías de RCD además de la apoptosis, como la necroptosis y la piroptosis, durante la primera semana post-infección, junto con una activación posterior de la vía extrínseca de la apoptosis principalmente durante la segunda semana post-infección. Además, el restablecimiento de los macrófagos CD163+ durante la segunda semana postinfección representa un intento de restaurar las subpoblaciones perdidas de macrófagos pulmonares durante las primeras etapas de la infección. El objetivo del cuarto estudio es explorar el papel de varios marcadores inmunes potencialmente involucrados en la regulación de la respuesta inflamatoria y en la sensibilización del pulmón a infecciones bacterianas secundarias durante la primera semana post-infección con dos cepas del PRRSV-1 de diferente virulencia, Lena y 3249. Para ello se recogieron muestras de suero y tejido pulmonar, que posteriormente fueron procesados para sus correspondientes análisis. Los títulos de viremia y los signos clínicos fueron significativamente más altos en los lechones infectados con la cepa Lena, junto con un aumento en los niveles séricos de IFN-γ e IL-6 en comparación con los cerdos infectados con la cepa 3249. Lena provocó la aparición de las lesiones pulmonares de forma mucho más temprana e intensa, como consecuencia de extensas áreas de consolidación en los lóbulos pulmonares apical y medial, las cuales se correspondieron microscópicamente con focos de bronconeumonía catarro purulenta. La carga viral y la frecuencia de células PRRSV-N-protein+ a nivel pulmonar siempre fueron superiores en los animales infectados con la cepa Lena, que se asociaron a una marcada disminución en la frecuencia de macrófagos CD163+. El número de células CD14+ e iNOS+ aumentó gradualmente durante la infección por PRRSV-1, siendo este incremento mucho más intenso en los cerdos infectados con Lena. La frecuencia de las células CD200R1+ y FoxP3+ alcanzó su pico a los 8 dpi en los animales infectados con ambas cepas del PRRSV-1, observándose además una fuerte correlación entre el número de células CD200R1+ y la lesión pulmonar en los cerdos infectados con Lena. Estos resultados ponen en evidencia el papel que estas moléculas parecen jugar en el desarrollo más temprano de las graves lesiones pulmonares observadas en los animales infectados con la cepa virulenta Lena, sugiriendo la activación de rutas potencialmente involucradas en la restricción de la respuesta inflamatoria a nivel local. Finalmente, nuestro quinto estudio consiste en una aproximación a la histopatología molecular mediante MALDI-MS Imaging con el objetivo de identificar nuevos péptidos involucrados en la inmunopatogénesis del PRRSV-1 así como diferentes patrones de lesión pulmonar. Los análisis se realizaron en 3 animales de cada grupo seleccionados a los 6 y 8 dpi utilizando como criterios la gravedad de los signos clínicos, el grado de lesión pulmonar a nivel macroscópico y microscópico, así como la carga viral en cerdos infectados con las cepas Lena y 3249, en base a los estudios previos. El estudio MALDI-MS Imaging detectó un perfil de 54 péptidos sobreexpresados diferencialmente, así como las proteínas putativas asociadas al comparar ambos grupos infectados con PRRSV-1 con el grupo control a los 6 y 8 dpi. Algunas de estas potenciales proteínas se han descrito previamente en la infección por PRRSV, como la proteína de choque térmico beta-1, la proteína de choque térmico 72, la proteína de unión a GTP inducida por interferón Mx1, la variante de proteína proapoptótica BAKM, la apolipoproteína A-IV, la anexina A6, matrix metalopeptidasa 9, vimentina, complemento C3, filamina A, anexina IV o la proteína asociada al citoesqueleto 4. Además, otras proteínas potenciales sobreexpresadas como la apolipoproteína AI, la proteína relacionada con ras Rap-1b, la proteína ribosómica L13, L-lactato deshidrogenasa B, la tropomiosina 1 o la histona H4 se identificaron en nuestro estudio, aunque no se habían relacionado previamente con la infección por PRRSV. A partir de las proteínas sobreexpresadas se generó una red de grupos funcionales utilizando las herramientas bioinformáticas Cluego y Cluepedia, la cual mostró, que la mayoría de estas proteínas putativas estuvieron involucradas principalmente en la "regulación de la muerte celular" dentro de la categoría de ontología génica de procesos biológicos, mientras que se agruparon en la "vía principal del splicing de ARNm" y "desgranulación de neutrófilos" dentro de la categoría de reactoma y procesos del sistema inmune. Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is still considered one of the costliest viral diseases impacting on the modern pig industry worldwide. PRRS virus (PRRSV), the causative agent of PRRS, is also a key player in porcine respiratory disease complex (PRDC), modulating the host immune response, leading to persistent infection, and favouring secondary bacterial infections. PRRSV replicates primarily in the lung, being the pulmonary alveolar macrophages (PAMs) the target cell for viral replication and CD163 scavenger receptor the essential mediator for viral internalisation and disassembly. PRRSV induces a mild to severe interstitial pneumonia, with modulation and impairment of pulmonary macrophage subpopulations, which may be complicated to suppurative bronchopneumonia. Since 2006, outbreaks of virulent PRRSV-1 strains have been described across Europe. They were characterised by high mortality rates, fever and severe respiratory disorders associated with an earlier and exacerbated infl ammatory response with a marked tissue injury in the lung and lymphoid organs. Furthermore, PRRSV elicits a distinct immune response depending on both the virulence of the strain and the infected tissue, therefore the evaluation of target organs may pave the way to decipher the immunopathogenesis of PRRSV infection with strain of different virulence. In the light of the above statements, the present PhD dissertation focuses on the assessment of the lesion patterns, cell death phenomena and the expression of several immune markers of potential interest, particularly the scavenger receptor CD163, in the lung of infected animals as well as the systemic immune response. Thus, this thesis aims to dissect the immunopathogenesis of the respiratory disease caused by PRRSV-1 strains of different virulence in the acute phase of infection. The fi rst study of this PhD Thesis aims to compare the expression, distribution and kinetics of PRRSV-N-protein, CD163 and CD107a positive cells in the lung and tonsil from experimentally-infected piglets with three different PRRSV-1 strains: a virulent PRRSV-1 subtype 3 strain (SU1-bel) and two low virulent subtype 1 strains, LV and 215–06. Piglets were sequentially euthanised at 3, 7 and 35 dpi. SU1-bel strain replicated more effi ciently in the lungs and tonsils. The number of CD163⁺ cells decreased in both tissues from all infected groups at 7 dpi, followed by an increase at the end of the study, highlighting a negative correlation with the frequency of PRRSV-N-protein⁺ cells. A signifi cant increase in CD107a+ cells was observed in all infected groups at 35 dpi but no differences were observed among them. Whereas the initial decrease of CD163⁺ cells appears to be associated to virus replication and cell death, the later recovery of the CD163⁺ population may be due to either the induction of CD163 in immature cells, the recruitment of CD163⁺ cells in the area of infection, or both. These results suggest that the host is able to restore its macrophage subpopulations as well as their potential biological functions after one-month post-infection with PRRSV-1 strains, finding the greatest recovery in SU1-bel-infected animals. In the second study, our goal was to compare the clinical signs, gross and microscopic lesions as well as the expression of CD163 within live PAM subset from BALF. Conventional piglets were intranasally inoculated with two PRRSV-1 strains of different virulence, the virulent subtype 3 Lena strain or the low virulent subtype 1 3249 strain and euthanised at 1, 3, 6, 8 and 13 dpi. More severe clinical signs as well as higher macroscopic and microscopic lung scores were observed in Lena-infected piglets compared to 3249-infected pigs. A decreased frequency of PAMs in BALF was detected earlier in Lena group. Besides, the frequency and median fluorescence intensity of CD163 within PAMs were much lower in Lena-infected pigs than in 3249-infected pigs. This outcome may result from the effect of PRRSV replication, PRRSV-induced inflammation, the influx of immature macrophages to restore lung homeostasis and/or the evidence of CD163low cells after CD163+ cells decrease in BALF. In the third study, we focused on evaluating Regulated Cell Death (RCD) events by means of the expression of caspases after Lena and 3249 strains infection. Lung tissue samples from the previous experiment were collected at 1, 3, 6, 8 and 13 dpi and hence, processed for their analysis. Lena virulent strain induced a significantly higher frequency of TUNEL+ cells when comparing with the frequency of cCasp3+ cells during the first week post-infection. In addition, both PRRSV-1 strains triggered cCasp8 and in a lesser extent cCasp9 after one-week post-infection together with a replenishment of CD163+ pulmonary macrophages. These results highlight the induction of several RCD pathways beyond apoptosis, such as necroptosis and pyroptosis, during the first week post-infection followed by activation of, mainly, the extrinsic apoptosis pathway during the second week post-infection. Moreover, the recovery of CD163+ macrophages at second week post-infection represents an attempt to restore pulmonary macrophage subpopulations lost during the early stages of the infection. The goal of the fourth study was to explore the role of several immune markers potentially involved during the fi rst week post-infection in the regulation of the infl ammatory response and sensitisation of lung to secondary bacterial infections upon two PRRSV-1 strains of different virulence, Lena and 3249 strains. Sera and lung tissue samples were collected and accordingly processed for their corresponding analyses. Viraemia titres and clinical signs were higher in Lena-infected piglets with an increase in the sera levels of IFN-γ and IL-6 compared to 3249-infected pigs. Lena strain triggered an earlier and stronger onset of lung lesions due to extensive consolidated areas in the apical and medial lung lobes which corresponded microscopically with foci of suppurative bronchopneumonia. Lung viral load and PRRSV-N-protein+ cells were always higher in Lena-infected animals with PRRSV-N-protein+ cells associated with a marked drop in CD163+ macrophages. The number of CD14+ and iNOS+ cells gradually increased upon PRRSV-1 infection, being more intense in Lena-infected pigs. The frequency of CD200R1+ and FoxP3+ cells peaked in both PRRSV-1 strains at 8 dpi, highlighting a strong correlation among CD200R1+ cells and lung injury in Lena-infected pigs. These results point out the role of molecules involved in the earlier and higher extent of lung lesions in piglets infected with the virulent Lena strain, underlining the activation of routes potentially involved in the restraint of the local infl ammatory response. Finally, the fi fth study consisted in an approach to molecular histopathology by MALDI-MSI with the goal of identifying new peptides involved in PRRSV-1 immunopathogenesis and lung lesion patterns. Analyses were conducted in 3 selected animals per group at 6 and 8 dpi. These time-points were selected according to the detection of marked clinical sings, gross and microscopic lung lesion scores as well as viral load in Lena- and 3249-infected piglets after previous studies. MALDI-MSI study revealed a profi le of 54 differentially overexpressed peptides and their putative associated proteins when comparing both infected PRRSV-1-infected groups with control group at 6 and 8 dpi. Some of these putative proteins have been previously described upon PRRSV infection, such as heat shock protein beta-1, heat shock protein 72, interferon-induced GTP-binding protein Mx1, pro-apoptotic protein BAKM variant, apolipoprotein A-IV, annexin A6, matrix metallopeptidase 9, vimentin, complement C3, fi lamin-A, annexin IV or cytoskeleton-associated protein 4. But also other overexpressed putative proteins, such as apolipoprotein A-I, ras-related protein Rap-1b, ribosomal protein L13, L-lactate dehydrogenase B chain, tropomyosin 1 or histone H4 were also identifi ed in our studies but not previously associated with PRRSV infection. A functionality grouped network of the overexpressed proteins created by Cluego and Cluepedia tools, showed that the majority of these putative proteins were mainly involved in “regulation of cell death” within biological processes, and they were in “mRNA splicing-major pathway” and “neutrophil degranulation” within reactome pathways and immune system processes.

Esta tesis doctoral se presenta como compendio de publicaciones de los trabajos derivados del proyecto “SAFEPORK Zoonosis Alimentarias en el cerdo Ibérico: prevalencia y control para la obtención de alimentos seguros”, financiado con el Fondo Europeo de Desarrollo Regional, y gestionado por la Agencia de Innovación y Desarrollo de Andalucía (IDEA) (referencia #351504). El cerdo Ibérico finaliza su periodo de engorde principalmente en la dehesa, ecosistema que aporta grandes mejoras en lo que se refiere al bienestar de los animales, pero que por otro lado favorece la interacción con otras especies animales, tanto domésticas como silvestres, lo que hace que las medidas de bioseguridad sean de más difícil adopción en las explotaciones de cerdo Ibérico, aumentando la susceptibilidad frente a determinados patógenos zoonósicos. Entre los principales agentes zoonósicos alimentarios descritos por la EFSA destacan Campylobacter spp., Salmonella spp. y Listeria monocytogenes. La importancia de estos zoonósicos alimentarios tanto desde el punto de vista de la salud pública como desde el punto de vista comercial, a la hora de abrir fronteras comerciales, hace necesario la consideración de este problema de manera global en las distintas áreas de producción del cerdo Ibérico con el fin de determinar el flujo de dichos agentes e implantar medidas para reducir su incidencia y por tanto garantizar la obtención de productos que no pongan en riesgo la salud del consumidor. El primer objetivo de esta tesis doctoral ha sido determinar la prevalencia de los distintos patógenos zoonósicos que afectan al cerdo Ibérico en la dehesa mediante estudio de los animales sacrificados en matadero. Para ello se ha desarrollado el trabajo (Morales- Partera et al., 2018, Food Control, 92, 208-215) que evaluó la prevalencia y diversidad de Salmonella spp., Campylobacter spp. y Listeria monocytogenes a lo largo de la cadena de producción del cerdo Ibérico en matadero. Para ello se recolectaron un total de 750 muestras (5 muestras / animal; 15 animales / granja; 5 granjas / matadero) de dos mataderos y se analizaron mediante metodologías ISO específicas los distintos patógenos. Salmonella spp. (12,93%; IC95 10,72-15.52%), Campylobacter spp. (17,17%, IC95 13,00-21,74%) y L. monocytogenes (9,07%; IC95 7,21-11,33%) fueron identificados en diferentes fases de la cadena de producción, con la prevalencia más alta detectada en las tonsilas para Salmonella spp. (30,67%; IC95 23,85-38,44%) y L. monocytogenes (39,33%, IC95 31,87-47,32%) y en heces para Campylobacter spp. (57,33%; IC95 49,33- 64,96%). Se detectaron trece serotipos diferentes de Salmonella, siendo la Salmonella Typhimurium monofásica la más frecuente. C. coli, C. jejuni y L. monocytogenes, serotipos 4b y 1 / 2a, también fueron identificados. En cuanto a la prevalencia total de Salmonella spp. en muestras de piel fue significativamente mayor en el matadero B que en el A. Además, se observó una prevalencia más alta, aunque no significativa, de los patógenos seleccionados en muestras de carne del matadero B con respecto al matadero A (10,67% vs 0% para Campylobacter spp.; y 4% vs 0% para Salmonella spp. y L. monocytogenes). Nuestros resultados resaltan el riesgo de contaminación de la carne de cerdo por los microorganismos en estudio y señalan la importancia de implementar medidas de control específicas. El segundo objetivo ha consistido en aplicar medidas correctoras que permitan disminuir la prevalencia de los distintos agentes zoonósicos alimentarios de interés. Para esto se ha llevado a cabo el trabajo (Morales-Partera et al., 2019, actualmente en revisión). Este estudio evaluó el efecto de Pediococcus acidilactici como alternativa a los antibióticos y su impacto en los parámetros productivos y la microbiota fecal de cerdos en fase de engorde. Un total de 57 cerdos se seleccionaron al azar y se distribuyeron por peso en dos grupos: (1) grupo control, con un peso corporal inicial de 143,28 ± 14,26 kg que recibió una dieta control; y (2) grupo tratado, con un peso corporal inicial de 146,41 ± 13,71 kg que recibió la dieta de control suplementada con Pediococcus acidilactici durante los últimos 31 días de la etapa final antes de su llegada a matadero. En los días 0, 22 y 31 desde el inicio del estudio, se registraron el peso y la ganancia media diaria (ADG). A los 0 y 31 días se recogieron muestras fecales individuales de 8 cerdos por grupo para el recuento de enterobacterias, Escherichia coli, Campylobacter spp., bacterias del ácido láctico y detección de Salmonella spp. Se observó una reducción significativa en el recuento de Campylobacter spp. en animales tratados (P = 0.004) en comparación con el grupo de control. Este estudio indica que la suplementación con Pediococcus acidilactici representa una aproximación útil para controlar la carga de Campylobacter spp.en el tracto intestinal en cerdos criados en extensivo antes de su llegada a matadero. El tercer y último objetivo de esta tesis doctoral ha sido determinar la viabilidad de los patógenos seleccionados frente a las condiciones de curación empleadas en los productos del cerdo Ibérico. Para ello se llevó a cabo el trabajo (Morales-Partera et al., 2017, Int J Food Microbiol, 258, 68-72), en el que se analiza la eficacia del proceso de curación de los lomos de cerdos Ibéricos criados en extensivo en la reducción de tres de los patógenos más importantes transmitidos por los alimentos. Un total de 28 segmentos de lomo de cerdo, con un peso promedio de 0,57 ± 0,12 kg, se dividieron en cuatro grupos, tres de ellos inoculados por inmersión con 7 log CFU / ml de Salmonella Typhimurium, Campylobacter coli o Listeria innocua y el último se inoculó por inmersión con medio estéril (grupo control). Los lomos se trataron con una mezcla de aditivos y especias propios del curado, se embutieron y se curaron durante 64 días. Se evaluó el análisis microbiológico, el pH y la actividad del agua (aw) en cuatro etapas. Como se esperaba, los valores de pH y aw disminuyeron con el tiempo de curado. S. Typhimurium y C. coli disminuyeron significativamente (3,28 y 2,14 unidades logarítmicas, respectivamente), pero se observó una reducción limitada de L. innocua (0,84 unidad logarítmica) a lo largo del proceso de curado. En nuestro estudio, tres factores se consideraron críticos para la viabilidad de los patógenos estudiados a lo largo del proceso de curación: (i) la concentración inicial de las bacterias, (ii) la reducción progresiva del pH y (iii) la reducción de los valores de aw. Nuestros resultados animan al incremento de la presión de muestreo en diferentes etapas del proceso de producción de la caña de lomo para garantizar la ausencia de los tres patógenos. This PhD is presented as a compendium of publications from the research Project “SAFEPORK Food Zoonoses in the Iberian pig: prevalence and control to obtan safe food”, financed with the European Regional Development Fund, and managed by the Agency for Innovation and Development of Andalusia (IDEA) (reference #351504). The Iberian pig finishes its fattening period mainly in the Dehesa, an ecosystem that provides great improvements in terms of animal welfare, but on the other hand favors the interaction with other animal species, both domestic and wild, which makes that biosecurity measures are more difficult to be adopted in Iberian pig farms, increasing susceptibility to certain zoonotic pathogens. Among the main food zoonotic agents described by EFSA we can find Campylobacter spp., Salmonella spp. and Listeria monocytogenes. The importance of these food-borne zoonotic pathogens both from the public health and from the commercial points of view, when opening commercial borders, makes it necessary to consider this problem globally in the different areas of production of the Iberian pig in order to determine the circulation of these agents and implement measures to reduce their incidence and therefore ensure the procurement of products that do not endanger the health of the consumer. The first aim of this PhD thesis was to determine the prevalence of the different zoonotic pathogens that affect the Iberian pig in the dehesa by studying slaughtered animals (Morales-Partera et al., 2018, Food Control, 92, 208-215). To evaluate the prevalence and diversity of these microorganisms along the free-range pork production chain, a total of 750 samples (5 samples/animal; 15 animals/farm; 5 farms/slaughterhouse) were collected from two slaughterhouses and analysed by specific ISO methodologies. Salmonella spp. (12.93%, CI95 10.72-15.52%), Campylobacter spp. (17.17%, CI95 13.00-21.74%) and L. monocytogenes (9.07%, CI95 7.21-11.33%) were recovered at different stages of the production chain, with the highest prevalence detected in tonsils for Salmonella spp. (30.67%, CI95 23.85-38.44%) and L. monocytogenes (39.33%, CI95 31.87-47.32%) and in faeces for Campylobacter spp. (57.33%, CI95 49.33-64.96%). Thirteen different Salmonella serotypes were detected with monophasic Salmonella Typhimurium as the most frequent one. C. coli, C. jejuni and L. monocytogenes serotype 4b and 1/2a were also identified. A significant higher prevalence of Salmonella spp. in total and from skin samples in slaughterhouse B than in slaughterhouse A was detected. In addition, a higher, although not significant, prevalence of the selected pathogens was observed in meat samples from slaughterhouse B with respect to slaughterhouse A (10.67% vs 0% for Campylobacter spp.; and 4% vs 0% for Salmonella spp. and L. monocytogenes). Our results highlight the risk of contamination of pork meat by the microorganisms under study and point out the importance of implementing specific control measures. The second aim of this PhD thesis was to apply corrective measures to reduce the prevalence of zoonotic agents detected along the production chain (Morales-Partera et al., 2019, under review). This study evaluated the effect of Pediococcus acidilactici as alternative to antibiotics and its impact on performance parameters and faecal microbiota of finishing pigs. A total of 57 free-range pigs were randomly allocated and blocked by weight into two groups: (1) control group, with an initial BW of 143.28±14.26 kg which received a control diet; and (2) treated group, with an initial BW of 146.41±13.71 kg which received the control diet supplemented with Pediococcus acidilactici during the last 31 days of the finishing stage prior to their delivery to the slaughterhouse. At days 0, 22 and 31 from the beginning of the study weight and average daily gain (ADG) were recorded. Individual faecal samples from 8 pigs per group at 0 and 31 days were analysed for enumeration of Enterobacteria, Escherichia coli, Campylobacter spp., lactic acid bacteria and detection of Salmonella spp. A significant decrease in the counts of Campylobacter spp. in treated animals (P=0.004) in comparison with the control group was detected. This study indicates that supplementation with Pediococcus acidilactici may represent a useful approach to control Campylobacter spp. load in the intestinal tract of free-range finishing pigs prior to slaughter. The third objective of this PhD thesis was to determine the viability of selected pathogens against dry-curing conditions used in Iberian pig products (Morales-Partera et al., 2017, Int J Food Microbiol, 258, 68-72). In this study, the efficacy of the dry curing process of pork loins obtained from free-range pigs in the reduction of three of the most important foodborne pathogens is analysed. A total of 28 pork loin segments, with an average weight of 0.57 ± 0.12 kg, were divided into four groups with three being inoculated by immersion with 7 log CFU/ml of either Salmonella Typhimurium, Campylobacter coli or Listeria innocua and the last one inoculated by immersion with sterile medium (control group). The loin segments were treated with a seasoning mixture of curing agents and spices, packed in a synthetic sausage casing and cured for 64 days. Microbiological analysis, pH and water activity (aw) were assessed at four stages. The values of pH and aw decreased with curing time as expected. S. Typhimurium and C. coli dropped significantly (3.28 and 2.14 log units, respectively), but limited reduction of L. innocua (0.84 log unit) was observed along the curing process. In our study, three factors were considered critical: the initial concentration of the bacteria, the progressive reduction of pH and the reduction of aw values. Our results encourage performing periodic análisis at different stages of the manufacturing of dry-cured pork loins to ensure the absence of the three evaluated foodborne pathogens.

La linfadenitis se puede definir como el proceso que cursa con la inflamación de los nódulos linfáticos superficiales o profundos como respuesta a la infección por diferentes microorganismos y se caracteriza macroscópicamente por la aparición de granulomas, piogranulomas o abscesos, que pueden extenderse desde los nódulos linfáticos a otros órganos por difusión linfohemática, principalmente a pulmones, hígado y bazo, dando lugar a la aparición de lesiones similares. Debido al carácter subclínico de estas infecciones, las lesiones pasan desapercibidas en la mayoría de los casos y no son detectadas hasta la inspección postmortem en el matadero, siendo su generalización responsable del decomiso total de las canales afectadas. Entre los agentes causales de la linfadenitis porcina destacan las micobacterias del complejo Mycobacterium tuberculosis (CMT), las micobacterias del complejo Mycobacterium avium (CMA) y otros géneros bacterianos, como Rhodococcus, Corynebacterium o Streptococcus, que poseen un riesgo zoonósico variable. El primer objetivo de esta tesis doctoral ha sido evaluar técnicas de diagnóstico rápido de la tuberculosis (TB) en ganado porcino, incluyendo una dúplex PCR a tiempo real y cinco ensayos serológicos basados en distintos antígenos de Mycobacterium bovis. El segundo objetivo ha consistido en identificar los principales microorganismos aislados a partir de cuadros de linfadenitis del cerdo en extensivo. Como tercer y último objetivo de este trabajo se ha evaluado cómo el proceso de curación de lomos y paletas del cerdo ibérico afecta a la viabilidad de los principales microorganismos no tuberculosos aislados en nuestro estudio (Streptococcus suis, Streptococcus dysgalactiae y Trueperella pyogenes).

El PRRSV es el causante del síndrome reproductivo yrespiratorio porcino; una enfermedad que, a pesar de los esfuerzosrealizados por controlarla y disminuir su impacto económico, siguesiendo considerada como una de las enfermedades más importantes queafectan al sector porcino.Los dos genotipos del PRRSV, el genotipo Europeo o tipo 1(PRRSV-1), representado por la cepa Lelystad (LV), y el genotipoNorteamericano o tipo 2 (PRRSV-2), cuyo prototipo es el aisladoATCC-VR-2332, presentan entre sí una elevada variabilidad genética ybiológica. Inicialmente, se creía que todas las cepas del genotipoEuropeo eran genéticamente homólogas. Sin embargo, el análisis de lasecuencia de la ORF5 y OFR7 han justificado la división del genotipoEuropeo en cuatro subtipos genéticos bien diferenciados: el subtipo 1 oPan-europeo, y los subtipos 2, 3 y 4 de Europa del Este.La amplia variabilidad biológica, genética e incluso antigénica delos diferentes aislados del PRRSV-1, así como las elevadas pérdidaseconómicas que esta enfermedad ocasiona en el sector porcino, justificanla realización de estudios que tengan como objetivo aclarar losmecanismos patogénicos desencadenados por las diferentes cepas de estevirus. En esta tesis doctoral hemos evaluado la expresión del antígenoviral, el cuadro lesional y la expresión de diferentes citoquinas proinflamatoriase inmunomoduladoras en el pulmón y en los órganoslinfoides primarios (timo y médula ósea) tras la infección con una cepa..., Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) isthe causative agent of a disease of pigs, named porcine reproductive andrespiratory syndrome (PRRS). Despite efforts in controlling it andreducing its economic impact, PRRS is still considered one of the mostimportant diseases affecting the swine industry.PRRSV is divided into two distinct genotypes, European PRRSVor Type 1 (PRRSV-1) with the prototype Lelystad strain (LV), andNorth American or Type 2 (PRRSV-2), whose prototype is the ATCCVR-2332 strain, with high genetic and biological diversity among bothgenotypes. Initially, PRRSV-1 was thought to be geneticallyhomogenous. However, deep analysis of PRRSV-1 ORF5 and OFR7sequences defined four distinct genetic subtypes: subtype 1 or Pan-European, and subtypes 2, 3 and 4 in Eastern Europe.The wide biological, genetic and antigenic diversity of thedifferent PRRSV-1 strains, as well as the high economic losses to thepork industry associated with this disease justify studies that aim toclarify the pathogenic mechanisms triggered by different virus strains. Inthe present thesis we evaluated the expression of viral antigen, themorphologic lesion and the expression of several proinflammatory andimmunomodulatory cytokines in lungs and primary lymphoid organs(thymus and bone marrow) after the infection with a prototype PRRSV-1Lelystad (LV), two field strains (SU1-bel, of high virulence, and 215-06,...

El PRRSV es el causante del síndrome reproductivo y respiratorio porcino; una enfermedad que, a pesar de los esfuerzos realizados por controlarla y disminuir su impacto económico, sigue siendo considerada como una de las enfermedades más importantes que afectan al sector porcino. Los dos genotipos del PRRSV, el genotipo Europeo o tipo 1 (PRRSV-1), representado por la cepa Lelystad (LV), y el genotipo Norteamericano o tipo 2 (PRRSV-2), cuyo prototipo es el aislado ATCC-VR-2332, presentan entre sí una elevada variabilidad genética y biológica. Inicialmente, se creía que todas las cepas del genotipo Europeo eran genéticamente homólogas. Sin embargo, el análisis de la secuencia de la ORF5 y OFR7 han justificado la división del genotipo Europeo en cuatro subtipos genéticos bien diferenciados: el subtipo 1 o Pan-europeo, y los subtipos 2, 3 y 4 de Europa del Este. La amplia variabilidad biológica, genética e incluso antigénica de los diferentes aislados del PRRSV-1, así como las elevadas pérdidas económicas que esta enfermedad ocasiona en el sector porcino, justifican la realización de estudios que tengan como objetivo aclarar los mecanismos patogénicos desencadenados por las diferentes cepas de este virus. En esta tesis doctoral hemos evaluado la expresión del antígeno viral, el cuadro lesional y la expresión de diferentes citoquinas proinflamatorias e inmunomoduladoras en el pulmón y en los órganos linfoides primarios (timo y médula ósea) tras la infección con una cepa... Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is the causative agent of a disease of pigs, named porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS). Despite efforts in controlling it and reducing its economic impact, PRRS is still considered one of the most important diseases affecting the swine industry. PRRSV is divided into two distinct genotypes, European PRRSV or Type 1 (PRRSV-1) with the prototype Lelystad strain (LV), and North American or Type 2 (PRRSV-2), whose prototype is the ATCCVR- 2332 strain, with high genetic and biological diversity among both genotypes. Initially, PRRSV-1 was thought to be genetically homogenous. However, deep analysis of PRRSV-1 ORF5 and OFR7 sequences defined four distinct genetic subtypes: subtype 1 or Pan- European, and subtypes 2, 3 and 4 in Eastern Europe. The wide biological, genetic and antigenic diversity of the different PRRSV-1 strains, as well as the high economic losses to the pork industry associated with this disease justify studies that aim to clarify the pathogenic mechanisms triggered by different virus strains. In the present thesis we evaluated the expression of viral antigen, the morphologic lesion and the expression of several proinflammatory and immunomodulatory cytokines in lungs and primary lymphoid organs (thymus and bone marrow) after the infection with a prototype PRRSV-1 Lelystad (LV), two field strains (SU1-bel, of high virulence, and 215-06,...

Aunque las enfermedades de carácter zoonósico pueden cursar de forma inaparente osubclínica en los animales, éstas tienen una importante repercusión en el ámbito de lasalud pública. Este aspecto es de especial interés en sistemas de producción extensivos enlos que los animales domésticos están en contacto tanto con otros animales domésticoscomo con especies silvestres, favoreciendo la circulación de patógenos entre ellos. Entreestos patógenos cabe destacar las infecciones por Brucella spp. y Salmonella spp. y lasinfestaciones por Toxoplasma gondii y Trichinella spp., todas ellas consideradas de altoriesgo zoonósico por la Agencia Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA). Por esta razón,hemos realizado un estudio serológico que permita conocer de forma indirecta la presenciay difusión de estos agentes en el cerdo Ibérico. Durante el bienio 2008-2009 recopilamos untotal de 709 sueros procedentes de 79 explotaciones de cerdo Ibérico. Los suerosobtenidos fueron analizados mediante kits comerciales de ELISA para la detección deanticuerpos específicos frente a los patógenos nombrados con anterioridad. La presenciade larvas enquistadas de Trichinella spp. fue analizada mediante la técnica de digestiónartificial a partir de los músculos de los pilares del diafragma. Los resultados obtenidos ennuestro estudio permiten concluir que la infección por Salmonella spp. (73.42%, intervalo deconfianza del 95% [IC95] 65.6-81.78), y la infestación por Toxoplasma gondii (58.23%, IC9547.33-69.07) están ampliamente difundidas en las granjas y animales analizados, adiferencia de Brucella spp. y Trichinella spp. que presentaron una escasa prevalencia(3.8%, IC95 0.18-7.42; y 0%, respectivamente). No se observó ninguna larva de Trichinellaspp. enquistada.Debido a la elevada seroprevalencia detectada frente a Salmonella spp., se realizó unsegundo estudio orientado a determinar la prevalencia de Salmonella spp., y los principalesserotipos, fagotipos y patrones de resistencia antimicrobiana en cerdos ibéricos criados enla dehesa. Para ellos, un total de 804 nódulos linfáticos ileocólicos procedentes de tantosanimales de 67 explotaciones se analizaron siguiendo el método descrito en la norma ISO6579:2002. Los resultados mostraron una baja prevalencia individual (5.3% animalespositivos), aunque un 33 por ciento de las explotaciones resultaron infectadas (22/67). Los..., Zoonotic agents such as Brucella spp., Salmonella spp., Toxoplasma gondii and Trichinellaspp., all considered high risk zoonotic pathogens by the European Food Safety Agency(EFSA), may cause no symptoms of infection in free-range pigs yet still have a significantpublic health impact. A serological survey was therefore performed to determine the historyof occurrence of these pathogens in such pigs in southern Spain. A total of 709 serumsamples were collected at abattoir from pigs from 79 farms, and analysed for specificantibodies against the above pathogens using commercially available ELISA kits. EncystedTrichinella spp. larvae were also sought following the artificial digestion method ofdiaphragm pillar muscle. The results showed Salmonella spp. to be widely distributedamong the sampled herds (73.42%, 95% confidence interval [CI95] 65.6-81.78), andToxoplasma gondii to be present in over half (58.23%, CI95 47.33-69.07). Theseroprevalence of Brucella spp. was very low (3.8%, CI95 0.18-7.42) and antibodies againstTrichinella spp. were not detected. No encysted Trichinella spp. larvae were microscopicallydetected.Due to the high seroprevalence detected against Salmonella spp., an epidemiological studywas carried out to determine the prevalence of Salmonella spp. infection, as well as thedistribution of serovars, phage types and antimicrobial resistance patterns, in pigs reared infree-range systems in southern Spain. A total of 804 animals belonging to 67 free-range pigherd in southern Spain were sampled. Microbiological assessment was performed onileocolic lymph nodes collected at slaughter according to ISO 6579:2002 procedures.Overall, 33% of the herds were found to be infected and the prevalence of positive pigs was5.3%. Salmonella serotypes most frequently detected were S. Anatum and Typhimurium,although uncommon serotypes such as S. Muenchen, S. Hessarek and S. Mikawasimawere also isolated. All isolates were tested against 16 antimicrobials and exhibitedresistance to streptomycin (46%), tetracycline (30%), sulphonamides (25%) and ampicillin(23%). Multi-drug resistance, defined as resistance to ≥4 antimicrobials, was 36%. Thecomparison of these results with those previously obtained from pigs reared in intensive...

El Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRS, del inglés Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) es una enfermedad vírica caracterizada por inducir una respuesta inmune errática en el hospedador y es considerada como una de las enfermedades más importantes en la industria del porcino debido a las importantes pérdidas económicas que provoca. A pesar de que varios estudios se han realizado con el objetivo de elucidar la respuesta inmune provocada frente al virus del PRRS (PRRSV, del inglés PRRS virus) todavía quedan muchos aspectos por entender. El PRRSV se replica, principalmente, en los macrófagos alveolares porcinos (MAPs) y, en menor medida, en macrófagos de otros órganos y en las células dendríticas, describiéndose la replicación del virus tanto en pulmón como en los órganos linfoides de cerdos infectados con el PRRSV, y sugiriéndose que estos órganos tendrían un importante papel en la patogenia de esta enfermedad. Sin embargo, la mayoría de los estudios centrados en analizar la respuesta inmune provocada tras una infección con el PRRSV se han realizado principalmente sobre muestras de suero y de pulmón. El principal objetivo de esta tesis fue evaluar el papel de la expresión de citoquinas y los fenómenos de apoptosis en los órganos linfoides en la patogenia del PRRS. Para llevar a cabo este estudio, se utilizaron veintiocho lechones, de cinco semanas de edad, que fueron inoculados con el aislado 2982 del PRRSV, y sacrificados a 3, 7, 10, 14, 17, 21 y 24 días post-inoculación (dpi). Cuatro lechones, de las mismas características, fueron usados como control, inoculándolos con medio estéril, y sacrificándolos al final del experimento. De todos los animales se tomaron muestras de pulmón, tonsila y nódulos linfáticos que fueron fijadas en formol tamponado al 10 %, en solución de sales de Zinc, y en solución de Bouin, para el estudio histopatológico e inmunohistoquímico. En nuestro estudio evaluamos la expresión de IL-1¯, IL-6 y TNF-¯ en la tonsila, y en los nódulos linfáticos retrofaríngeo y mediastínico de cerdos infectados con el PRRSV, encontrando una expresión diferente de cada citoquina en función del órgano analizado, lo que muestra un comportamiento diferente del PRRSV en los órganos linfoides. Este hallazgo podría estar relacionado con la falta de una respuesta inmune eficaz del hospedador frente al PRRSV. Así, mientras que en la tonsila la expresión de estas citoquinas proinflamatorias fue muy pobre, en el nódulo linfático mediastínico se observó un incremento de la expresión de TNF-¯ e IL-1¯, siendo la IL-6 la citoquina más expresada en el nódulo linfático retrofaríngeo El antígeno del PRRSV se observó fundamentalmente en la médula o paracorteza de los órganos linfoides analizados, encontrando tanto en la tonsila como en el nódulo linfático retrofaríngeo una expresión bimodal, con un primer pico a los 3 dpi y un segundo a los 14 dpi, mientras que en el nódulo linfático mediastínico observamos un pico de expresión al comienzo del experimento disminuyendo posteriormente hasta el final del mismo. Las células inmunomarcadas tanto para el PRRSV como para las citoquinas proinflamatorias fueron principalmente macrófagos...