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Objetivos: O fator de crescimento de hepatócitos (HGF) é um mitógeno secretado por células estromais mesenquimais (MSCs) que regula o crescimento, a motilidade e a morfogênese celular. No microambiente tumoral da medula óssea (MO) (nicho), o HGF interage com o receptor MET nas células leucêmicas ativando vias de sinalização que contribuem para a resistência quimioterápica e, consequentemente, o desenvolvimento de novos compostos que atuam na interação HGF/MET, torna-se crucial para o tratamento da leucemia mieloide aguda (LMA). Assim, investigamos os efeitos de três novos inibidores de MET, B2000, B6000 e C1000 (Brigham University, WO 2011/127192 A2) in vitro e in vivo. Métodos: Células mononucleares da medula óssea humana (BMNCs) de pacientes com LMA e doadores saudáveis (HD) e linhagens leucêmicas (OCI-AML3, MOLM-13) foram tratadas com inibidores de MET e as taxas de apoptose foram avaliadas. O valor de IC50 foi calculado através de resultados de ensaios de viabilidade. A expressão proteica de HGF foi avaliada por imunofluorescência. In vivo, camundongos portadores de LMA agressiva foram tratados com os inibidores de MET (10 mg/kg; 1x/dia; 5 dias) e medula óssea, sangue periférico e baço foram coletados. Um sistema 3D que mimetiza o nicho da MO foi desenvolvido usando uma esponja hemostática para cultura de células estromais mesenquimais (MSCs), células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) e células leucêmicas. Análises de sinergia foram realizadas usando o pacote Synergy Finder em R. Resultados: Os inibidores promoveram apoptose de BMNCs de pacientes com LMA (p < .01) sem modular células saudáveis. Nas células Molm-13 e OCI-AML3, o tratamento com os compostos resultou em valores baixos de IC50 (< 10 μM). Para validar esses achados em um modelo fisiopatológico, camundongos leucêmicos foram tratados com os inibidores de MET. O composto C1000 demonstrou o efeito mais citotóxico, inibindo a proliferação de células leucêmicas na medula óssea, baço e sangue periférico (p 10). Conclusão: Nossos achados pré-clínicos sugerem que inibidores de MET representam uma classe de agentes terapêuticos com potencial para melhorar significativamente o tratamento de pacientes com LMA. A combinação com Venetoclax pode oferecer uma opção terapêutica mais eficaz e com menor toxicidade, aumentando as chances de cura e melhorando a qualidade de vida dos pacientes. Apoio: FAPESP #2017/21801-2, #2019/25247-5, #2021/05320-0; CNPq #303405/2018-0.

Objetivos: Embora a terapia da leucemia mieloide aguda (LMA) tenha registado progressos na última década, a recaída continua a ser o maior desafio terapêutico. As Pim quinases regulam a proliferação e sobrevivência celular e inibem a apoptose ativando vias anti-apoptóticas, como a BCL2, conferindo um pior prognóstico em pacientes com LMA e contribuindo para a recidiva da doença. Portanto, direcionar especificamente as quinases PIM é uma estratégia para o tratamento da LMA. Dessa forma, investigamos os efeitos de um novo inibidor da Pan-PIM quinase, PIM447 (Novartis), em células leucêmicas e exploramos a combinação de PIM447 e Venetoclax, um quimioterápico inibidor de BCL2. Métodos: Células mononucleares (CMs) da medula óssea (MO) de pacientes com LMA e doadores saudáveis (HD) e linhagens de leucemia (OCI-AML3, MOLM-13) foram tratadas com PIM447 e as taxas de apoptose foram avaliadas. A eficácia do PIM447 foi testada em um ensaio organotípico de microscopia, usando CMs de MO de AML cocultivadas com células estromais mesenquimais (MSCs) em meio AIMV-10% FBS e 1,5 mg/mL de colágeno I. Em um modelo xenográfico, camundongos NSG leucêmicos (Molm-13-GFP) foram tratados com PIM447 (2 mg/kg) por 5 dias e medula óssea, sangue periférico e baço foram coletados. A expressão das proteínas BCL2, MCL1 e BCLXL foi avaliada por citometria de. Cocultura de células estromais mesenquimais (MSCs), células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) e células (Molm-13) foi realizada em um sistema 3D. O pacote Synergy Finder em R foi usado para análises de sinergia. Resultados: O tratamento aumentou em 57% as taxas de apoptose nas CMs de MO leucêmicas (p -10). Em um modelo de nicho da MO, o tratamento com PIM447 inibiu em 70% a proliferação de células Molm-13 (p >,0001) e em 17% blastos de pacientes com LMA (p >,05), sendo mais potente quando combinado com Venetoclax (Molm13: redução de 90%, p < 0001; blastos: redução de 60%). Conclusão: Nossos resultados indicam que o PIM447 possui potente atividade citotóxica contra células leucêmicas, tornando-o um candidato promissor para terapia direcionada em LMA. A combinação sinérgica com um inibidor de BCL2 permite superar a resistência conferida pelo microambiente da medula óssea, abrindo novas perspectivas para o tratamento dessa doença. Apoio: FAPESP 2017/21801-2, 2019/25247-5, 2021/05320-0; CNPq 303405/2018-0.

Objetivos: PIM-quinases, associadas à progressão de cânceres induzidos pelo fator de crescimento de hepatócitos (HGF) por meio de seu receptor, MET, interagem com a serina protease tipo kunitz-2 (SPINT2), no microambiente tumoral (TME) e sua interação pode representar uma importante estratégia terapêutica multialvo na leucemia mieloide aguda (LMA). Analisamos a interação entre SPINT2, HGF e pan-PIM quinases avaliando a expressão gênica e os efeitos de um inibidor de pan-PIM quinase, PIM447 (Novartis), em células leucêmicas e no TME. Métodos: Expressão de mRNA foi obtida do estudo OHSU (2018) e TCGA (cBio Portal). A análise de correlação foi obtida pelo coeficiente de Spearman (r). Células mesenquimais estromais (MSC) da medula óssea (BM) de 5 doadores saudáveis (HD) e 5 pacientes com LMA foram tratadas com 5-Azacitidina (Aza). OCIAML3, MOLM13, U937, RS4;11, Jurkat foram tratadas com PIM447 e as taxas de apoptose foram determinadas. Sangue periférico e células mononucleares (MC) da BM (PBMC/BMMC) de HD foram testados quanto à citotoxicidade. Células leucêmicas foram examinadas para espécies reativas de oxigênio (ROS), produção de óxido nítrico (NO) e potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm). Foram realizadas coculturas de células de leucemia com monócitos/macrófagos derivados de monócitos (MDMs) ou MSC com SPINT2 superexpresso. Estatística foi realizada por Kruskal Wallis, ANOVA ou Mann-Whitney (p < 0,05). Resultados: A expressão gênica de 188 pacientes com LMA mostrou que os níveis de HGF correlacionaram-se positivamente com PIM1/PIM2/PIM3 ((r) =,8727;.9094;.9093), p

Introdução: As Neoplasias Mielodisplásicas (NM) surgem de alterações clonais nas células tronco hematopoiéticas, causando citopenias e risco de desenvolver leucemia mieloide aguda (LMA). Mutações genéticas patogênicas têm impacto terapêutico e prognóstico, mas exomas e painéis genéticos tradicionais geram dados complexos, de interpretação incerta e de alto custo. Estudos de NGS indicam poucos genes com potencial prognóstico e terapêutico, mas a validação desses dados em populações brasileiras ainda não ocorreu. Objetivo: Avaliar a incidência das mutações mais prevalentes e de significado clínico relevante em pacientes brasileiros com NM e propor um painel genético reduzido. Métodos: O estudo incluiu pacientes com NM acompanhados no Hemocentro da Unicamp de 2020-23. Dados clínico-laboratoriais foram coletados de prontuário. As mutações foram identificadas por sequenciamento de DNA com o painel TruSight Myeloid, abrangendo 54 genes. Foram usados para análise dos dados os softwares DRAGEN Amplicon, VarAFT, CancerVar e Maftools. O estudo foi aprovado pelo CEP e todos os pacientes assinaram o TCLE. Resultados: Foram incluídos no estudo 31 pacientes: sexo 12F/19M, idade mediana 68 anos (27-89). A classificação OMS 2016 foi: MDS-SLD (n = 4), MDS-MLD (n = 13), MDS-EB1 (n = 4), MDS-RS-SLD (n = 1), MDS-RS-MLD (n = 8), MDS-del(5q) (n = 1). Quanto ao IPSS-R, as categorias de risco foram: muito baixo (n = 6), baixo (n = 11), intermediário (n = 4), alto (n = 8), muito alto (n = 1), NA (n = 1). Parâmetros hematimétricos: Hb 10,05 g/dL (6,7 – 14,1), neutrófilos 1650 cél./mm3 (268-5534) e plaquetas 164 mil cél./mm3 (130 – 854). A análise genética revelou mutações em: TET2 (48%, n = 15), principalmente missense, patológico em 4; SF3B1 (29%, n = 9, sendo 8 com sideroblastos em anel), todas missense, patológico em 3; U2AF1 (16%, n = 5), todas missense, patogênica em 3. SRSF2, ZRSR2 e STAG2 mutadas (13%, n = 4 cada), com padrões frameshift, inframe e nonsense, respectivamente. ASXL1, EZH2 e ETV6 apresentaram mutações (10%, n = 3 cada). Outras mutações patogênicas de menor prevalência (

A refratariedade é um problema recorrente no tratamento de pacientes trombocitopênicos que impede a restauração dos níveis normais de plaquetas circulantes após transfusões. Sua principal causa é a incompatibilidade entre os antígenos HLA Classe I das plaquetas transfundidas e os anticorpos do paciente. A produção de plaquetas in vitro a partir de células-tronco editadas geneticamente pode se tornar futuramente uma fonte de plaquetas universais. A linhagem de células-tronco/estromais mesenquimais derivadas de tecido adiposo (ASCL), ou adipócitos desdiferenciados (DFAT), são geradas a partir da desdiferenciação de adipócitos por meio do método “Ceiling Culture”, podem ser obtidas em abundância e diferenciar em megacariócitos e plaquetas em condições adequadas. Os antígenos HLA Classe I são fixados na superfície das células humanas por meio da ligação à proteína Beta-2 Microglobulina (B2M), expressa pelo gene B2M. Neste trabalho realizamos edição gênica em ASCL, obtendo populações carentes de antígenos HLA classe I, por meio de nocaute do gene B2M usando a ferramenta CRISPR/Cas9. Um RNA guia (sgRNA) foi projetado e sintetizado especificamente para quebra de DNA no éxon 2 do gene B2M. O sgRNA clonado no plasmídeo pL-CRISPR.EFS.GFP, foi sequenciado pelo método de sequenciamento automático de Sanger para confirmação. O plasmídeo clonado, juntamente com outros dois (segunda geração) para montagem de partículas lentivirais, foram transfectados em células HEK 293T e os lentivírus resultantes foram coletados e armazenados a -80°C até o uso. Diferentes lotes de lentivírus produzidos foram agrupados e utilizados em transduções de células K562 para a estimativa da produção lentiviral, quantificada através da detecção de proteína verde fluorescente (GFP) por citometria de fluxo. Células HEK 293T também foram usadas para testes iniciais de transdução e eficiência do nocaute usando três sgRNAs clonados e seus respectivos lentivírus, isoladamente ou em combinação. Os lentivírus portadores do plasmídeo clonado com sgRNA “guide#2”foram os mais eficazes na redução dos níveis de HLA Classe I na superfície das células HEK 293T e então escolhidos para a continuação do estudo. As transduções de ASCL, com MOI de aproximadamente 13,5 resultaram em populações de células viáveis e GFP positivas, sem antígenos HLA classe I. A maior redução foi observada no dia 7 pós-transdução, resultando em 96,4% de células negativas. Mais de 80% das células permaneceram negativas quando avaliadas nos dias 21 e 28. ASCL não editadas foram diferenciadas in vitro, originando megacariócitos e plaquetas, que foram caracterizados por microscopia óptica, citometria de fluxo normal e de imagem (anticorpos CD41, CD42b e CD61 e marcador nuclear Hoechst) e microscopia eletrônica de transmissão. No entanto, experimentos adicionais estão em andamento para comprovar a funcionalidade das plaquetas produzidas. A atual eficiência de transdução e nocaute do gene B2M usando CRISPR/Cas9, bem como a redução drástica dos níveis de antígenos HLA Classe I detectados na superfície das células ASCL nos permitirão armazenar as células modificadas em estado criogênico para posterior indução da diferenciação em plaquetas. Portanto, esta abordagem pode ser uma boa estratégia para gerar plaquetas funcionais, sem antígenos HLA Classe I.

Enteric infections caused by the ingestion of contaminated water, especially by Escherichia coli, are important to define the virulence properties of these bacteria. Due to frequent infantile diarrhea in the city of Ouro Preto, Minas Gerais state, Brazil, the phenotypic and genotypic diarrheagenic properties of E. coli isolated from drinking water were studied. The culture supernatants of 39 (40%) among a total of 97 E. coli isolates from drinking water were positive by suckling mouse assay and induced cytotoxic effects on Vero cells. The enterotoxic and cytotoxic activities were present in the fraction with less than 10 kDa and were not lost when heated up to 60°C and 100°C for 30 minutes. PCR assays showed that among these 39 Vero cytotoxigenic E. coli, four (10.2%) were positive for ST II (estB) and two (5%) positive for αHly (hlyA). Gene amplification of SLT (stx 1, stx 2), ST I (estA), LT (eltI, eltII), EAST1 (astA), EHly (enhly) and plasmid-encoded enterotoxin (pet) were not observed. This heat-stable cytotoxic enterotoxin of E. coli is probably a new putative diarrheagenic virulence factor, as a toxin presenting these characteristics has not yet been described.

Introduction: Dendritic cell (DC) vaccines have demonstrated good efficacy in preventing relapse and in increasing survival of patients affected by a variety of both solid and hematological tumors. Most protocols used to generate these cells involve the automated separation of peripheral blood monocytes from patients. This approach requires specialized equipment, which elevates the cost of this type of therapy, potentially limiting the widespread access to patients., Method: In this study, we compare the yield and quality of dendritic cells generated from monocytes and isolated by an automated method or by manual methods using gradient centrifugation., Results: The results demonstrate the equivalence of the 3 methods in relation to the yield and final quality of the product, however with considerable differences between the costs of these procedures. In addition, this study also demonstrates the feasibility of the antigenic pulse with autologous tumor cell lysates, constituting a source of antigens, not only easily obtained and manipulated, but also specific to the patient's tumor., Conclusion: These findings may have important implications for emerging centers interested in using this medical approach and potentially increase the access of a greater number of patients to this therapeutic option., Competing Interests: Conflicts of interest The authors declare no conflicts of interest., (Copyright © 2022 Associação Brasileira de Hematologia, Hemoterapia e Terapia Celular. All rights reserved.)

Loss of endoplasmic reticulum (ER) homeostasis leads to ER stress, thus prolonged activation can lead to apoptosis. Herein, artesunate (ART) induced ER stress in leukaemia cells, resulting in eIF2α phosphorylation, activation of transcription factor 4, subsequent CHOP upregulation and XBP1 splicing. Furthermore, in vitro cyclin/CDKs reduction induced G1-phase arrest. An in vivo xenograft model showed a consistent pattern of ART in reducing tumour burden, supporting roles in the UPR pathway, which we speculate could lead to apoptosis by NOXA activation. Moreover, ART were capable of increasing the survival of mice. Taken together, our data indicate that ART may represent an interesting weapon to fight leukaemia., Competing Interests: The authors declare no conflict of interest., (© 2021 The Authors. eJHaem published by British Society for Haematology and John Wiley & Sons Ltd.)

NR4A3 is a key tumor suppressor in myeloid malignancy, mice lacking both NR4A1 and family member NR4A3 rapidly develop lethal acute myeloid leukemia (AML). We identified a long non-coding transcript in the NR4A3 locus and pursued the characterization of this anonymous transcript and the study of its role in leukemogenesis. We characterized this novel long non-coding transcript as a sense polyadenylated transcript. Bone marrow cells from AML patients expressed significantly reduced levels of lncNR4A3 compared to healthy controls (controls = 15, MDS= 20, p=0.05., AML= 21, p<0.01). Expression of NR4A3 , as previously reported, was also significantly reduced in AML. Interestingly, the expression of both coding and non-coding transcripts was highly correlated (Pearson R = 0.3771, P<0.01). Transient over-expression of LncNR4A3 by nucleofection led to an increase in the RNA and protein level of NR4A3 , reduction of proliferation in myeloid cell lines K-562 and KG1 (n=3 and 2 respectively, p<0.05) and reduced colony formation capacity in primary leukemic cells. A mass spectrometry-based quantitative proteomics approach was used to identify proteins dysregulated after lncNR4A3 over-expression in K-562. Enrichment analysis showed that the altered proteins are biologically connected (n=4, p<0.001) and functionally associated to RNA binding, transcription elongation, and splicing. Remarkably, we were able to validate the most significant results by WB. We showed that this novel transcript, lncNR4A3 regulates NR4A3 and we hypothesize this regulatory mechanism is mediated by the modulation of the RNA processing machinery., Competing Interests: The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest., (Copyright © 2020 Congrains, Niemann, Duarte, Ferro and Olalla-Saad.)

LEF1 antisense RNA 1 (LEF1-AS1) is an antisense long non-coding RNA encoded in the lymphoid enhancer-binding factor 1 (LEF1) locus. LEF1-AS1 is a conserved transcript dysregulated in hematopoiesis. This study aimed to functionally characterize the role of this transcript in myeloid malignancy and explore a possible regulatory effect of LEF1-AS1 upon LEF1. We show that LEF1-AS1 is highly expressed in normal hematopoietic stem cells but barely detectable in myeloid malignant cell lines. Additionally, bone marrow cells from myelodysplastic syndrome (n=12) and acute myeloid malignancy patients (n=28) expressed significantly reduced levels of LEF1-AS1 compared to healthy controls (n=15). Artificial LEF1-AS1 over-expression inhibited proliferation in HL60 and led to an upregulation of tumor suppressors p21 and p27, and reduced ERK1/2 activation. Unexpectedly, no underlying modulation of LEF1 was detected. Ectopic expression of LEF1-AS1 also inhibited proliferation in HELA, a cell line lacking endogenous expression of LEF1, supporting a LEF1-independent mechanism. Additionally, transient over-expression of LEF1-AS1 in AML patient cells also led to reduced proliferation and colony formation capacity. We used a mass spectrometry-based proteomics approach. Proteomic quantification identified the modulation of an important metabolic regulator, Fumarase, and concomitant accumulation of the metabolite fumarate., (© 2019 The Authors. Journal of Cellular and Molecular Medicine published by John Wiley & Sons Ltd and Foundation for Cellular and Molecular Medicine.)

Myelodysplastic syndromes (MDS) are clonal hematopoietic stem cell-based disorders characterized by ineffective hematopoiesis, increased genomic instability and a tendency to progress toward acute myeloid leukemia (AML). MDS and AML cells present genetic and epigenetic abnormalities and, due to the heterogeneity of these molecular alterations, the current treatment options remain unsatisfactory. Hypomethylating agents (HMA), especially azacitidine, are the mainstay of treatment for high-risk MDS patients and HMA are used in treating elderly AML. The aim of this study was to investigate the potential role of the epigenetic reader bromodomain-containing protein-4 (BRD4) in MDS and AML patients. We identified the upregulation of the short variant BRD4 in MDS and AML patients, which was associated with a worse outcome of MDS. Furthermore, the inhibition of BRD4 in vitro with JQ1 or shRNA induced leukemia cell apoptosis, especially when combined to azacitidine, and triggered the activation of the DNA damage response pathway. JQ1 and AZD6738 (a specific ATR inhibitor) also synergized to induce apoptosis in leukemia cells. Our results indicate that the BRD4-dependent transcriptional program is a defective pathway in MDS and AML pathogenesis and its inhibition induces apoptosis of leukemia cells, which is enhanced in combination with HMA or an ATR inhibitor.

Background: New sequencing technologies have enabled the identification of mutations in Ten-eleven-translocation 2 (TET2), an enzyme that catalyzes the conversion of 5-methylcytosine into 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC) in myeloid neoplasms. We have recently identified reduced TET2 mRNA expression in myelodysplastic syndromes (MDS) and acute myeloid leukemia (AML), which is associated with a poor overall survival in MDS. We herein aimed to investigate TET2 mutations and their impact on TET2 expression in a cohort of patients with myeloid neoplasms, including MDS and AML patients., Findings: TET2 mutations were observed in 8 out of 19 patients (42 %) with myeloid neoplasms. The TET2 expression profile was similar between in wild type and in TET2 mutated patients., Conclusion: Our results suggest that TET2 expression is reduced in MDS/AML patients, independently of mutational status.