Search

El pàncrees és una glàndula secretora formada per teixit exocrí i endocrí. El compartiment endocrí està format per les cèl•lules alpha (productores de glucagó), les cèl•lules beta (productores d'insulina), les cèl•lules delta (somatostatina), les cèl•lules PP (polipèptid pancreàtic) i les cèl•lules epsilon (grelina). La Diabetis Mellitus és un grup de malalties metabòliques que es caracteritzen per mantenir nivells elevats de glucosa en sang com a resultat de la incapacitat de produir o utilitzar la insulina. Les cèl•lules productores d'insulina són les cèl•lules beta del pàncrees. Actualment, el tractament de la diabetis es basa en injeccions periòdiques d'insulina. Per solucionar i millorar la vida d'aquests pacients hi ha molts grups que treballen per trobar noves fonts de cèl•lules productores d'insulina que recuperin la massa de cèl•lules beta perdudes durant la diabetis. Per a això, és necessari conèixer detalladament els passos que se succeeixen per generar una cèl•lula productora d'insulina a partir d'una cèl•lula indiferenciada. Durant la organogènesi pancreàtica s'activen un conjunt de factors de transcripció que són essencials per a la correcta formació de l'òrgan, entre ells el factor proendocrí Neurogenina3 (Neurog3), així com també un seguit de senyals extrínsecs (vies de senyalització) que participen en aquest procés. Neurogenina3 és un factor de transcripció de la família bHLH que exerceix un paper essencial en la diferenciació endocrino-pancreàtica, ja que en la seva absència no hi ha formació de les cèl•lules endocrines del pàncrees. En el primer objectiu d'aquesta tesi hem identificat possibles noves dianes de Neurog3, mitjançant l'ús d'un model de diferenciació endocrina in vitro de cèl•lules ductals pancreàtiques, en el qual la sobreexpresió de Neurog3 indueix l'activació del programa transcripcional endocrino-pancreàtic. Mitjançant l'estudi de canvis globals en el perfil d'expressió gènica d'aquestes cèl•lules hem identificat un conjunt de gens relacionats amb la via de senyalització Wingless (Wnt) com a dianes potencials de Neurog3 in vitro. Entre aquests gens, hem centrat els nostres estudis en l'anàlisi del gen que codifica pel lligand de la via Wnt, Wnt9a. El segon objectiu d'aquesta tesi se centra a estudiar la possible participació del lligand Wnt9a en el procés de diferenciació endocrina del pàncrees. Així, vam demostrar per primera vegada la presència en pàncrees embrionari de ratolí del mRNA de Wnt9a, així com la regulació gènica d'aquest lligand per part de factors de transcripció que participen al programa de diferenciació endocrina. Estudiem també el paper de Wnt9a dins de la cascada endocrino-pancreàtica, demostrant un paper regulador de Wnt9a sobre els efectes promoguts per Neurog3 en alguns dels gens endocrins estudiats. Aquests resultats ens han portat al tercer objectiu d'aquesta tesi: caracterització de la diferenciació endocrino-pancreàtica en el model murí gen-anul•lat per Wnt9a. A estadi e18.5 (just abans del naixement) observem un augment generalitzat de les cèl•lules productores d'hormones del compartiment endocrí (cèl•lules β insulina-positives, cèl•lules α glucagó-positives i cèl•lules δ somatostatina-positives) en relació a l'àrea pancreàtica total, que correlaciona amb una major taxa de proliferació d'aquestes. L'anàlisi de l'expressió gènica realitzat a estadi e15.5 (moment de màxima expansió endocrina) no mostra diferències en els nivells del mRNA de Neurog3, indicant que l'augment en el compartiment endocrí observat a e18.5 no es deu a una major especificació endocrina. No obstant això, l'estudi de diferents factors integrants del programa transcripcional endocrí mostra un augment en l'expressió de Pdx1 en els animals deficients que podria explicar l'augment en cèl•lules beta observat a e18.5. Per tant, en aquesta tesi definim per primera vegada la relació directa entre factors de transcripció bHLH i components de la via Wnt en pàncrees, així com identifiquem la presència del mRNA de Wnt9a en pàncrees embrionari de ratolí i en illots adults. Demostrem la regulació gènica de Wnt9a per part de factors de la cascada de transcripció endocrina, així com la regulació d'aquests per part de Wnt9a sota l'acció de Neurog3. Identifiquem, mitjançant l'estudi del model animal gen anul•lat per Wnt9a, un augment del compartiment endocrí abans del naixement, a causa d'una major taxa de proliferació, en absència de Wnt9a. Per tant, el conjunt d'aquests resultats indicaria que la via de senyalització Wnt juga un paper important durant el procés de diferenciació endocrina del pàncrees, suggerint una connexió entre el programa transcripcional endocrí i la via de senyalització intracel•lular Wnt., The pancreas is a gland consisting of secretory exocrine and endocrine tissue. The endocrine compartment is formed by the alpha cells (glucagon producing), the beta cells (insulin producing), delta cells (somatostatin), PP (pancreatic polypeptide) cells and epsilon cells (ghrelin). Diabetes Mellitus is a group of metabolic diseases characterized by maintaining high levels of blood glucose resulting from the inability to produce or use insulin. Currently, the treatment for diabetes is based on regular injections of insulin. There are many groups working on finding new sources of insulin-producing cells to recover beta cells mass lost during diabetes development. For this reason, it’s necessary to detail the molecular steps that occur from an undifferentiated cell to an insulin-producing cell. During pancreatic organogenesis, a set of transcription factors that are essential for proper formation of the organ are activated, including the proendocrine factor Neurogenin3 (Neurog3), as well as a number of extrinsic signals (signalling pathways). Neurogenin3 is a transcription factor that belongs to bHLH transcription factors family. It plays an essential role in pancreatic-endocrine differentiation, since in its absence there is no formation of endocrine cells. In the first objective of this thesis we have identified potential new targets for Neurog3, using an in vitro model of endocrine differentiation process, pancreatic ductal cells (mPAC), in which adenoviral overexpression of Neurog3 induces the activation of the transcriptional differentiation program. Using whole genomic profile study, we identified a set of genes related to signalling Wingless (Wnt) pathway as potential targets of Neurog3 in vitro. Among these genes, we focused our studies on the analysis of the gene encoding the ligand of the Wnt pathway, Wingless- type MMTV integration site 9A (Wnt9a). The second objective of this thesis focuses on the study of the possible role of Wnt9a during endocrine differentiation. Thus, we demonstrate for the first time, the presence of Wnt9a mRNA in mouse embryonic pancreas, as well as its regulation by transcription factors involved in endocrine differentiation program. We studied the role of Wnt9a within the endocrine differentiation cascade, demonstrating a regulatory role of Wnt9a on some Neurog3 activated genes. Finally, we did the characterization of the endocrine differentiation process in the Wnt9a knock out animal mouse model. At embryonic stage (e) 18.5 (just before birth), we observed a general increase in the major hormone-producing cells of the endocrine compartment (β cell insulin-positive, α cells glucagon-positive cells and δ somatostatin- positive) in relation to the total pancreatic area, which correlated with a high rate of proliferation. The analysis of gene expression performed at (e) 15.5 (time of maximum endocrine expansion) shows no difference in levels of Neurog3 mRNA, indicating that the increase in the endocrine compartment observed at (e) 18.5 is not due to a greater endocrine specification. However, the study of transcriptional endocrine factors shows an increase in the expression of Pdx1 gene in the deficient Wnt9a animals; this could explain the increase in beta cells observed at (e) 18.5. Therefore, this thesis define for the first time the direct relationship between bHLH transcription factors and components of the Wnt pathway in the pancreas, as well as the identification of Wnt9a mRNA in embryonic mouse pancreas and in adult islets. We demonstrate the regulation of Wnt9a by transcription factors of the endocrine cascade and the regulation of some of them by Wnt9a. We have identified an increase of the endocrine compartment, just before birth, in Wnt9a deficient animals, probably due to a higher rate of proliferation in the absence of Wnt9a. Hence, all these results indicate that Wnt signalling pathway plays an important role during pancreatic endocrine differentiation, suggesting a connection between the endocrine transcriptional program and Wnt signalling.