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Dissertação de mestrado em Genética Molecular, Cynara cardunculus L. (C. cardunculus) is a Mediterranean plant used for many years for cheese production and energy applications. Recently, the presence of sesquiterpenes lactones in leaves and seeds of C. cardunculus was reported. Cynaropicrin, a type of sesquiterpene lactone, was the main compound detected, being known for its various biological activities. In this work, the bioactivity of two different extracts of C. cardunculus leaves extracts were evaluated: a crude ethanolic extract (EC) obtained by Pulsed Ultrasound Assisted Extraction (PUAE) and a fractionated extract (EF) obtained by PUAE followed by membrane fractionation process, with an enrichment of cynaropicrin concentration. Two human skin cell lines, HaCaT keratinocytes and BJ-5ta fibroblasts were used to evaluate the effect of exposure to the extracts (0,5, 1, 2, 5, 10, 15 and 50 pg/ml) regarding cell toxicity, viability and migration. The anti-inflammatory potential of these extracts, by quantification of TNF-α released by J774.A1 murine macrophages, and quantification of IL-18 released by HaCaT cells. Higher concentrations of extracts and cynaropicrin were identified as cytotoxic and concentrations above 1 µg/ml caused toxicity to both cell lines. Their effects on migration capability of BJ-5ta and HaCaT cells in a context of wound healing in vitro, and the results show a small increase of cells migrating towards the inflicted scratch. The lowest concentrations of extracts were tested on human keratinocytes and murine macrophages to evaluate their anti-inflammatory potential, as they could reduce for 12h the production of pro-inflammatory cytokine in cells stimulated with DNCB (HaCaT) and LPS (J774.A1). Extracts did not, by themselves, induce inflammation in J774.A1 and in HaCaT cells. These results identify ane opportunity to develop topic applications based on extracts of C. cardunculus for improved treatment of wounds, as a better, more natural treatment of inflammation., Cynara cardunculus L. (C. cardunculus) é uma planta mediterrânea com vários usos, desde produção de queijo ate aplicações energéticas. Recentemente, foi reportada a presença de lactonas sesquiterpenicas nas folhas e sementes de C. cardunculus. A cinaropicrina, pertencente a este grupo, foi o principal composto detetado, sendo conhecida pelas suas inúmeras atividades biológicas. Neste trabalho foram avaliados in vitro os efeitos celulares de dois extratos diferentes de folhas de C. cardunculus urn extrato etanólico bruto (CE) obtido por Extração Assistida por Ultrassom Pulsado (PUAE) e um extrato fracionado (EF) obtidos por PUAE, seguidos de processo de fracionamento por membrana, com enriquecimento da concentração de cinaropicrina. Foram utilizadas duas linhas celulares de pele humana, queratinócitos HaCaT e fibroblastos BJ-5ta, para avaliar as consequências da exposição aos extratos (0,5, 1, 2, 5, 10, 15 and 50 pg/ml) a nível da toxicidade, viabilidade e migração celulares, assim como foi analisado o potencial anti-inflamatório por quantificação de TNF-α libertada por macrófagos de ratinho (J774.A1) e de IL-18 libertada por células HaCaT. Verificou-se que as concentrações mais altas de extratos e de cinaropicrina são citotóxicos, tendo concentrações superiores a 1 µg/ml demonstrado toxicidade em ambas as linhas celulares de pele. Também foi estudado o efeito dos extratos na capacidade de migração de células BJ-5ta e HaCaT num ensaio de cicatrização in vitro, e os resultados mostram um pequeno aumento na percentagem de células migradas em direção a ferida simulada, indicando algum potencial neste sentido. O potencial anti-inflamatório foi igualmente testado com as menores concentrações de extratos, verificando-se alguma redução, as 12h, da produção de citoquinas pró-inflamatórias em células estimuladas com DNCB (ern HaCaT) e LPS (J774.A1), respetivamente. Os extratos, por si só, não induziram inflamação nestas células. Os resultados abriram a oportunidade de desenvolver aplicações tópicas baseadas em extratos de C. cardunculus, que podem contribuir para um tratamento melhor e mais natural da inflamação, embora mais informação seja necessária para prever o eventual beneficio terapêutico destes extratos., O presente trabalho foi apoiado por: MedCynaraBioTec (ALT20-03-0145-FEDER- 039495) - Seleção de genótipos de Cynara cardunculus para novas aplicações biotecnológicas: a melhoria da cadeia de valor de cardo, uma cultura mediterrânea bem-adaptada e ValBioTecCynara (ALT20-03- 0145-FEDER- 000038) - Valorização econ6mica do Cardo (Cynara cardunculus): estudo da variabilidade natural e aplicações biotecnológicas, ambas co-financiadas pela FEDER no âmbito do Programa Alentejo 2020.

Cynara cardunculus é uma planta espontânea, que tradicionalmente é utilizada para o fabrico de queijo. No entanto, apresenta outras potencialidades que podem gerar valor acrescentado. A planta é uma fonte de cinaropicrina (principal componente do conteúdo lipofílico das folhas) que influência as atividades fisiológicas ou celulares dos seres vivos que as consomem. O presente trabalho teve como objetivo descrever a variabilidade fenotípica de populações silvestres de Cynara cardunculus existentes no Alto e Baixo Alentejo, avaliando, simultaneamente, se existe alguma relação entre os descritores morfológicos e ecológicos das populações com a respetiva concentração de cinaropicrina. Foram selecionadas 14 populações situadas no Alto e Baixo Alentejo, para se proceder à caracterização, in loco, de descritores da morfologia externa da planta e à determinação da concentração de cinaropicrina, de 7 indivíduos selecionados aleatoriamente em cada população, por HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência). Nas 14 populações procedeu-se ainda à caracterização edáfica e bioclimática de cada núcleo. A análise da variabilidade e inter populacional revela a existência de uma grande variabilidade morfológica entre as populações estudadas. Verificou-se ainda uma correlação estatisticamente significativa entre a concentração de cinaropicrina e alguns dos descritores bioclimáticos analisados (P, Io1, Ic, Tmim e Tmax). Contudo, o mesmo não se verificou entre os descritores morfológicos, à exceção do peso seco da folha que evidenciou correlação moderada, e edáficos com a concentração de cinaropicrina. Os resultados evidenciam a necessidade de ampliação da amostra, quer em número de indivíduos e populações (alargando a área estudada), quer em diferentes anos de amostragem. Cynara cardunculus is a spontaneous plant, which is traditionally used for the manufacture of cheese. However, it presents other potentialities that can generate added value. The plant is a source of cynaropicrin (the main component of the lipophilic content of leaves) that influences the physiological activities and the cells of living beings as they consume. The present work aimed to describe the phenotypic variability of wild populations of Cynara cardunculus in Alto and Baixo Alentejo regions, simultaneously evaluating the existence of some relationship between the morphological and ecological descriptors of populations with a respective concentration of cynaropicrin. Fourteen populations located in Alto and Baixo Alentejo were selected for in situ localization, delocators of plant external morphology and determination of the concentration of cynaropicrin, from 7 in fact randomly selected in each population, by HPLC (high performance liquid chromatography efficiency). In the other 14 populations, the edaphic and bioclimatic characterization of each nucleus was also carried out. An analysis of inter-population variability reveals a great morphological variety among the studied generations. There was a statistically significant statistic between the cynaropicrin and some of the analyzed bioclimatic descriptors (P, Io1, Ic, Tmim, Tmax). However, the same was not found among the morphological descriptors except for the leaf dry weight that showed moderate, and edaphic with a concentration of cynaropicrin. The evidence is a sample amplification test, in number of individuals and a population, in different years of sampling.

Mestrado em Biotecnologia, ramo de Biotecnologia Industrial e Ambiental Submitted by Carla Jesus (cjesus@ua.pt) on 2017-12-12T12:46:28Z No. of bitstreams: 1 Tese final-Melissa.pdf: 1258271 bytes, checksum: b1b6979632ce82c0f43be651cf4d9f49 (MD5) Made available in DSpace on 2017-12-12T12:46:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese final-Melissa.pdf: 1258271 bytes, checksum: b1b6979632ce82c0f43be651cf4d9f49 (MD5) Previous issue date: 2016-12-14

Mestrado em Biotecnologia, ramo de Biotecnologia Industrial e Ambiental O desenvolvimento de estratégias sustentáveis para a extração e recuperação de compostos naturais de valor acrescentado a partir de biomassa é um requisito fundamental para a sua valorização. A cinaropicrina, um dos componentes principais do Cynara cardunculus L. (cardo), exibe uma ampla gama de atividades biológicas, incluindo anti-inflamatórias e anti-tumorais, sendo assim considerado de grande interesse. Com o objetivo de evitar o uso de solventes orgânicos voláteis, neste trabalho estudaram-se soluções aquosas de líquidos iónicos (LIs) para a extração da cinaropricina do Cynara cardunculus L. (cardo). Os LIs estudados envolvem cloretos de imidazólio e alcanoatos de colinío. Estudaram-se também soluções aquosas de surfactantes convencionais para avaliar o seu desempenho face às soluções de LIs. As condições operacionais estudadas para optimizar a extração da cinaropricina incluem a concentração, a razão sólido/líquido (biomassa/solvente), o tempo de extração e a temperatura. O rendimento de extração máximo da cinaropicrina, com soluções aquosas de LIs foi de 4,09 m/m%, com a concentração a 500mM, temperatura igual a 25ºC, durante 1h e com R(S/L)=1:40. Este valor é proximo do obtido com diclorometano (4,53 m/m%). Assim, a utilização de soluções aquosas de LIs para a extração da cinaropicrina a partir da folha do cardo representa uma alternativa relevante para reduzir o impacto ambiental dos processos de extração deste composto e melhorar a sua sustentabilidade. The development of sustainable strategies for the extraction and recovery of increased-value natural compounds from biomass is a crucial requirement for the valorization. The cynaropicrin, one of the main components present in Cynara cardunculus L. (cardoon), displays a wide range of biological activities, including anti-inflammatory and antitumor, and therefore considered of great interest. Aiming at avoiding the use of volatile organic solvents, in this work, aqueous solutions of ionic liquids (ILs) were investigated. The ILs studied comprise imazolium chlorides and cholinium alkanoates. Aqueous solutions of conventional surfactants were also prepared and used to compare with the performance of ILs for the extraction of cynaropicrin. The operating conditions evaluated to increase the extraction yield of cinaropricin include the concentration, the solid/liquid (biomass/solvent) ratio, extraction time and temperature. The maximum extraction yield of cinaropicrin with aqueous solutions of ILs was 4.09% w/w, with concentration of 500mM, at 25ºC for 1h and with R(S/L)=1:40. The value is near to the one obtained with dichloromethane, namely 4.53% w/w. Therefore, the use of ILs aqueous solutions for the extraction of cynaropicrin from cardoon leaf represents a relevant alternative to reduce the environmental impact of extraction methods of this compounds and to improve their sustainability.

Mestrado em Biotecnologia - Biotecnologia Alimentar Submitted by Cristina Santos (cmaria@ua.pt) on 2018-01-17T10:47:11Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Rafael Carmo.pdf: 2201762 bytes, checksum: b7b83fe68e6fa9fc39fafbec4cd66f3a (MD5) Made available in DSpace on 2018-01-17T10:47:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Rafael Carmo.pdf: 2201762 bytes, checksum: b7b83fe68e6fa9fc39fafbec4cd66f3a (MD5) Previous issue date: 2016

Mestrado em Biotecnologia - Biotecnologia Alimentar O objetivo principal do presente trabalho foi estudar a aplicação de solventes eutécticos profundos (DES) na extração de cinaropicrina, um composto lipofílico de elevado valor comercial e com várias propriedades farmacêuticas, a partir das folhas do cardo. Este trabalho foi dividido em duas partes principais: preparação e caracterização de DES e extração e quantificação da cinaropicrina. Os DES utilizados foram preparados a partir de misturas de sais de amónio e ácidos carboxílicos. De modo a avaliar e caracterizar os DES a utilizar no processo de extração, primeiramente determinaram-se os parâmetros solvatocrómicos, densidade e viscosidade dos mesmos. Posteriormente foram selecionados os DES com as propriedades mais promissoras, e os resultados obtidos no processo de extração demonstraram a elevada seletividade e eficiência destes solventes para a extração de cinaropicrina a partir de folhas do cardo. Estudaramse também soluções aquosas de DES, o que permitiu obter uma eficiência máxima de extração de 6,2 (m/m) % de cinaropicrina. A sustentabilidade do processo de extração foi finalmente otimizada pela realização de vários ciclos de extração, reutilizando quer a biomassa quer as soluções aquosas de DES. Este estudo permitiu obter eficiências máximas de extração de 8,96 (m/m) % de cinaropicrina reutilizando a biomassa, e de 7,45 (m/m) % reutilizando o solvente. Após a extração de cinaropicrina, e tirando partido dos limites de solubilidade de cinaropicrina em solução aquosa em função da concentração de DES, adicionou-se água como anti-solvente resultando numa percentagem de recuperação máxima de cinaropicrina de 73,6 (m/m) %. Em resumo, esta dissertação demonstra o potencial de DES na extração de compostos bioativos a partir de fontes naturais. No entanto a complexidade do resíduo solido obtido deste processo deixa em aberto uma serie de desafios para a continuidade deste estudo, com vista à valorização da folha do cardo. The main objective of this work was to study the application of deep eutectic solvents (DES) in the extraction of cynaropicrin, a lipophilic compound of high commercial value and with various pharmaceutical properties, from cardoon leaves. This work was divided into two main parts: preparation and characterization of DES and extraction and quantification of cynaropicrin. The DES used were prepared from mixtures of ammonium salts and carboxylic acids. In order to evaluate and characterize the DES to use in the extraction process, their solvatochromic parameters, density and viscosity were firstly determined. After selecting the most promising DES according to their properties, the results obtained in the extraction process demonstrated the high selectivity and efficiency of these solvents to extract cynaropicrin from cardoon leaves. Aqueous solutions of DES were also studied, which allowed to obtain a maximum extraction efficiency of 6.20 (w/w) % of cynaropicrin. The sustainability of the extraction process was finally optimized by carrying out several extraction cycles, reusing either the biomass or the aqueous solutions of DES. This study yielded a maximum extraction efficiency of 8.96 (w/w) % of cynaropricin reusing the biomass, and of 7.45 (w/w) % reusing the solvent. After the cynaropicrin extraction, and taking advantage of the cynaropicrin’s solubility limits in aqueous solutions according to the DES concentration, water was added as an anti-solvent resulting in the recovery of 73.6 (w/w) % of cynaropicrin. In summary, this work demonstrates the potential of DES in the extraction of bioactive compounds from natural sources. However, considering the complexity of the solid residue obtained a number of challenges will remain open aiming at the valorization of cardoon leaves.