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The spore-forming microbiota is mainly responsible for the deterioration of pasteurized milk with long shelf life in the United States. The identification of these microorganisms, using molecular tools, is of particular importance for the maintenance of the quality of milk. However, these molecular techniques are not only costly but also labor-intensive and time-consuming. The aim of this study was to compare the efficiency of boiling in conjunction with four other methods for the genomic DNA extraction of sporulated bacteria with proteolytic and lipolytic potential isolated from raw milk in the states of Paraná and Maranhão, Brazil. Protocols based on cellular lysis by enzymatic digestion, phenolic extraction, microwave-heating, as well as the use of guanidine isothiocyanate were used. This study proposes a method involving simple boiling for the extraction of genomic DNA from these microorganisms. Variations in the quality and yield of the extracted DNA among these methods were observed. However, both the cell lysis protocol by enzymatic digestion (commercial kit) and the simple boiling method proposed in this study yielded sufficient DNA for successfully carrying out the Polymerase Chain Reaction (PCR) of the rpoB and 16S rRNA genes for all 11 strains of microorganisms tested. Other protocols failed to yield sufficient quantity and quality of DNA from all microorganisms tested, since only a few strains have showed positive results by PCR, thereby hindering the search for new microorganisms. Thus, the simple boiling method for DNA extraction from sporulated bacteria in spoiled milk showed the same efficacy as that of the commercial kit. Moreover, the method is inexpensive, easy to perform, and much less time-consuming., A microbiota esporulada é a principal responsável pela deterioração do leite pasteurizado de longa vida útil nos Estados Unidos. A identificação destes micro-organismos é de especial importância para a qualidade do leite e ferramentas moleculares são fundamentais nesse processo. No entanto, exigem a execução de etapas onerosas e laboriosas que podem inviabilizar algumas pesquisas. O objetivo do presente trabalho foi comparar a eficiência do método de extração de DNA por fervura com outros quatro métodos para extração de DNA genômico de bactérias esporuladas com potencial proteolítico e lipolítico isoladas do leite cru dos estados do Paraná e Maranhão, Brasil. Foram utilizados protocolos que se baseavam na lise celular por digestão enzimática, agitação com fenol, aquecimento em micro-ondas, tiocianato de guanidina e este trabalho propõe um método por fervura simples para o estudo desses micro-organismos. Observaram-se variações nos métodos de quantificação do DNA extraído e baixo coeficiente de correlação de Person entre esses métodos. No entanto, observou-se que tanto no protocolo de lise celular por digestão enzimática (kit comercial) quanto na fervura simples proposta pelo presente estudo, houve êxito na realização da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para pesquisa dos genes rpoB e 16S rRNA para todas as 11 cepas de micro-organismos testadas. Os outros protocolos não apresentaram sucesso na extração de DNA para a totalidade da microbiota avaliada, já que somente algumas amostras tiveram êxito nas reações de PCR, fato que os inviabiliza para a pesquisa desses micro-organismos. Dessa forma, o método de fervura simples das suspensões de bactérias esporuladas deteriorantes do leite demonstrou a mesma eficiência do kit comercial para a extração do DNA desses micro-organismos, sendo um método de baixo custo e de fácil e rápida execução.

The aim of this study was to compare the microbiological and physicochemical quality of raw milk produced by small and large dairy producers in Paraná, Brazil. Samples of raw milk were collected from small (49) and large (21) dairy producers. Dairy farms were characterized by observation and application of questionnaires. The total bacterial count (TBC) was obtained by flow cytometry and Petrifilm® AC, while the somatic cell count (SCC) was obtained by only flow cytometry. The content of fat, proteins, lactose, and solids in the mil were determined by infrared. Differences were observed in the techniques employed by small and large dairy producers, which may have influenced the microbiological quality of raw milk. Milk contamination significantly greater in milk produced by small farmers, which is evident from the average TBC of 3.8 × 106 CFU/mL obtained from milk produced by small farmers as compared to the TBC of 1.5 × 104 CFU/mL obtained from larger dairy farms. Twenty-four (49%) small diary producers are no-compliant with the current standards for microbiological quality of refrigerated raw milk established by the law, while all larger producers were compliant with the standards. The average SCC of milk obtained from small producers was 2.2 × 105 SC/mL, while that of large milk producers was 3.9 × 105 SC/mL. Milk produced by small producers contained significantly higher fat, protein, lactose, and solids content. Milk produced by larger dairy farmers was mainly composed of lactose. In brief, the microbiological quality of milk from larger producers was higher, and SCC is proportional to the productivity. In addition, milk obtained from small dairy producers has a higher solid content., O objetivo do presente trabalho foi comparar a qualidade microbiológica e físico-química do leite cru refrigerado roduzido por pequenos e grandes produtores do estado do Paraná, Brasil. Foram avaliadas amostras de leite cru refrigerado, oriundas de pequenos (49) e grandes (21) produtores. A caracterização das propriedades foi realizada através da observação e aplicação de questionários. A Contagem Bacteriana Total (CBT) foi realizada por citometria de fluxo e em PetrifilmTM AC, a Contagem de Células Somáticas (CCS) por citometria de fluxo e os percentuais de gordura, proteína, lactose e sólidos totais por infravermelho. Foram observadas diferenças de tecnificação entre os pequenos e grandes produtores, o que provavelmente influenciou a qualidade microbiológica do leite cru. A contaminação do leite foi substancialmente superior no leite produzido por pequenos produtores, como demonstrado pelas médias de CBT 3,8 x 106 UFC/mL e 1,5 x 104 UFC/mL, respectivamente para pequenas e grandes propriedades. Considerando o padrão vigente de qualidade microbiológica do leite cru refrigerado determinado pela legislação, 24 (49%) pequenos produtores estão em desacordo, enquanto todos os grandes produtores estão em conformidade com a legislação. A CCS média foi de 2,2 x 105 CS/mL para os pequenos e 3,9 x 105 CS/mL para os grandes produtores de leite. O leite oriundo dos pequenos produtores apresentou percentuais médios de gordura, proteína e sólidos totais significativamente superiores. O percentual de lactose foi o único quesito que apresentou resultado significativamente superior para o leite dos grandes produtores. Em suma, a qualidade microbiológica foi superior no leite de grandes produtores, os problemas com CCS são proporcionais à produtividade e a composição apresenta maior composição de sólidos no leite obtido por pequenos produtores.