Dissertação de mestrado, Biologia Marinha, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2016 Skeletogenesis is a highly conserved developmental process that involves osteogenic and chondrogenic mechanisms, and vast number molecular determinants. High conservation of skeletogenesis and the numerous technical advantages of zebrafish, make this organism a suitable scientific model for the study of this process. In this context, miRNAs recently emerged as important and highly conserved regulators of skeleton formation in vertebrates. MiRNAs are a sub-class of ncRNAs with ~22 nucleotides that function as negative or positive regulators of gene expression and are involved in crucial biological mechanisms. Not surprisingly, miRNAs have been implicated in several physiological and pathological processes, including in skeleton formation. Nevertheless, their in vivo effects in zebrafish have now started to be demonstrated. In our lab, three miRNAs, miR-214, miR-20a, and miR-29a, were recently implicated in both fish and mammalian skeletogenesis. However, there is lack of information regarding the effects of these miRNAs in vivo. Therefore, the purpose of this study was to investigate the skeletogenic effects of these miRNAs using zebrafish as model. We started by investigating levels and sites of expression of miR-20a and miR-29a (already performed for miR-214) throughout zebrafish development, using qPCR and in situ hybridization techniques. Simultaneously, we proceeded to 1) the creation of transgenic zebrafish lines overexpressing miR-214, miR-20a, and miR-29a, in a constitutive manner (using constructs containing cmv promoters); and 2) the creation of transgenic zebrafish lines overexpressing miR-20a, in skeleton tissues (using cartilage-specific collagenXa1 promoter and bone-specific osteocalcin promoter). So far, only one founder specimen, for cmv-miR-29a construct, was obtained. As an alternative approach, we forced the overexpression of miR-29a in zebrafish larvae by microinjecting embryos with up to 9 μM of miRNA mimic of dre-miR-29a in eggs, and investigated skeleton phenotypes at 6 dpf. Os reguladores fundamentais para uma correta formação óssea são semelhantes entre os vertebrados superiores, como é o caso dos mamíferos, e os teleósteos. Comparativamente, os peixes possuem uma elevada conservação dos eventos que ocorrem durante o desenvolvimento e dos mecanismos moleculares encarregues da sua regulação, nomeadamente durante a formação da cartilagem e do osso durante os estágios larvares. Esta conservação dos processos resulta numa partilha das características anatómicas e do desenvolvimento entre o esqueleto dos vertebrados superiores e dos peixes. Assim sendo, o peixe-zebra emerge como um modelo científico apropriado para o estudo da esqueletogenese. As vantagens deste pequeno vertebrado consistem na sua fácil e pouco dispendiosa manutenção, no facto dos seus primeiros estágios larvares serem translúcidos, o que permite o acompanhamento pormenorizado do desenvolvimento sem recorrer a técnicas invasivas de observação, a sua elevada utilização pela comunidade científica, que ajuda na validação dos resultados obtidos e na obtenção fácil de informação acerca do organismo em estudo. Neste contexto, os miRNAs surgiram recentemente como importantes reguladores da esqueletogénese altamente conservados entre vertebrados. Os miRNAs caracterizam-se por serem uma sub-classe de RNAs não codificantes com aproximadamente 22 nucleótidos e que podem funcionar como reguladores positivos ou negativos durante a expressão génica. Foram documentadas diversas funções associadas a esta classe de moléculas desde o seu envolvimento em processos biológicos cruciais, como processos celulares tipo apoptose e diferenciação celular, inativação do cromossoma X e durante o desenvolvimento. Cada miRNA pode ser responsável pela regulação de centenas de genes, levando à conclusão de que uma larga maioria dos genes humanos serão controlados por miRNAs. Por essa mesma razão, foi também reportado o seu envolvimento em diversos processos patológicos, como é o caso do cancro, em que diversos miRNAs possuem uma expressão desregulada. Apesar da informação referente ao modo de ação deste tipo de moléculas ter aumentado nos últimos anos, pouco ainda se sabe acerca do seu envolvimento na regulação dos genes responsáveis por um correto desenvolvimento ósseo. Os efeitos in vivo destas moléculas no peixe-zebra começam agora a ser estudadas, tal como é o caso desta dissertação. Neste trabalho pretendeu-se investigar as funções putativas de três miRNAs, o miR-214, miR-20a e o miR-29a, no desenvolvimento do esqueleto do peixe-zebra. Estes miRNAs foram recentemente estudados no nosso laboratório utilizando linhas celulares derivadas do osso de peixe, tendo-se observado genericamente uma conservação entre peixes e mamíferos dos seus efeitos osteogénicos. Começámos por investigar os níveis de expressão de do miR-20a e o miR-29a (a expressão do miR-214 foi já estudada) ao longo do desenvolvimento do peixe-zebra, desde a fase de 1000 células até aos noventa dias pós fertilização, altura em que o peixe se encontra maturado sexualmente e é possível proceder à diferenciação entre os sexos. A quantificação dos miRNAs foi efetuada recorrendo a uma técnica de PCR quantitativo, que revelou picos de expressão: aos 2 dias pós fertilização no caso do miR-20a e dos 6-12 dias pós fertilização no caso do miR-29a. Estes picos de expressão poderão estar ligados à formação óssea em peixe-zebra, cujo desenvolvimento sofre profundas alterações durante esses períodos. Simultaneamente, foram efetuadas recolhas de animais para a avaliação do local da expressão, através da técnica de hibridizações in situ em secções histológicas de peixe-zebra, ou ainda recorrendo a uma técnica de whole mount. As amostras escolhidas para a realização da hibridização in situ foram selecionadas consoante os valores obtidos durante a quantificação dos miRNAs e apenas foram processadas as amostras que revelaram maior quantidade de miRNA expresso, como foi o caso dos dias 2, 6, 12, 15, 22 pós-fertilização. Apesar das sondas de LNA aumentarem a sensibilidade da técnica de hibridização in situ, os miRNAs pouco abundantes continuam a ser de difícil visualização. Após diversas alterações ao protocolo, nomeadamente ao nível da temperatura de hibridização, recurso ao uso de proteinase K e concentração da sonda, a técnica continuou a revelar-se infrutífera. Possíveis explicações para a não detecção dos miRNAs analisados poderão estar relacionadas com: degradação das sondas (uma vez que nem o controlo positivo, o miR-199, detetado em estudos anteriores, foi aqui identificado); ou a presença de RNAses em algum dos reagentes utilizados. Outro tipo de abordagem adotada, para o estudo funcional destes miRNAs, consistiu na tentativa de criação de cinco linhas transgénicas distintas de peixe-zebra, com sobre-expressão destes miRNAs: três linhas transgénicas que sobre-expressavam os miR-214, miR-20a e miR-29a (respetivamente) de um modo constitutivo, através do uso de um promotor cmv; e duas linhas transgénica que sobre-expressavam o miR-20a de um modo mais específico, associado à cartilagem e ao osso e recorrendo ao uso dos promotores de colagénio 10 e osteocalcina, respetivamente. Até ao momento foi apenas encontrado um founder entre os peixes-transgénicos injetados com o construct cmv-miR-29a. Finalmente, numa alternativa para compreender os efeitos miR-29a, foi realizado um estudo recorrendo a uma molécula mimetizadora (miRNAmimic) do dre-miRNA-29a (estudo realizado de forma semelhante aquele anteriormente realizado para o miR-214 por V. Roberto). Esta técnica visa a simulação da presença exacerbada dos miRNAs num sistema, neste caso durante o início do desenvolvimento larvar do peixe-zebra. O objetivo era perceber os efeitos do miR-29a no desenvolvimento inicial do esqueleto através das alterações fenotípicas resultantes. Diversos estudos preliminares foram necessários, uma vez que concentrações previamente usadas no estudo semelhante realizado no nosso laboratório para o miR-214 (18 μM) revelaram ser tóxicas, induzindo uma elevada taxa de mortalidade e de malformações ao fim de três dias após a microinjeção. Durante o decorrer da experiência a mortalidade foi registada e decorreu-se à captura de imagens dos embriões. Findados os 6 dias após microinjeção, 11 larvas foram recolhidas peixe-zebra wild type, 16 para a concentração de 0 μM e 20 larvas para cada uma das concentrações mais elevadas testadas (2.5 μM e 5 μM). Posteriormente procedeu-se ao processamento histológico das mesmas para recorrer à observação de possíveis fenótipos.