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The microbiota has a strong influence on health and disease in humans. A causative shift favoring pathobionts is strongly linked to diseases. Therefore, anti-microbial agents selectively targeting potential pathogens as well as their biofilms are urgently demanded. Here we demonstrate the impact of ethyl pyruvate, so far known as ROS scavenger and antiinflammatory agent, on planktonic microbes and biofilms. Ethyl pyruvate combats preferably the growth of pathobionts belonging to bacteria and fungi independent of the genera and prevailing drug resistance. Surprisingly, this anti-microbial agent preserves symbionts like Lactobacillus species. Moreover, ethyl pyruvate prevents the formation of biofilms and promotes matured biofilms dissolution. This potentially new anti-microbial and anti-biofilm agent could have a tremendous positive impact on human, veterinary medicine and technical industry as well.

Manure from animal farms and sewage sludge contain pathogens and opportunistic organisms in various concentrations depending on the health of the herds and human sources. Other than for the presence of pathogens, these waste substances are excellent nutrient sources and constitute a preferred organic fertilizer. However, because of the pathogens, the risks of infection of animals or humans increase with the indiscriminate use of manure, especially liquid manure or sludge, for agriculture. This potential problem can increase with the global connectedness of animal herds fed imported feed grown on fields fertilized with local manures. This paper describes a simple, easy-to-use, low-tech hygienization method which conserves nutrients and does not require large investments in infrastructure. The proposed method uses the microbiotic shift during mesophilic fermentation of cow manure or sewage sludge during which gram-negative bacteria, enterococci and yeasts were inactivated below the detection limit of 3 log10 cfu/g while lactobacilli increased up to a thousand fold. Pathogens like Salmonella, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, E. coli EHEC O:157 and vegetative Clostridium perfringens were inactivated within 3 days of fermentation. In addition, ECBO-viruses and eggs of Ascaris suum were inactivated within 7 and 56 days, respectively. Compared to the mass lost through composting (15–57%), the loss of mass during fermentation (< 2.45%) is very low and provides strong economic and ecological benefits for this process. This method might be an acceptable hygienization method for developed as well as undeveloped countries, and could play a key role in public and animal health while safely closing the nutrient cycle by reducing the necessity of using energy-inefficient inorganic fertilizer for crop production.

Im vorliegenden Heft der Schriftenreihe werden die Ergebnisse von zwei Projekten vorgestellt, die sich mit futtermittelhygienischen Aspekten befassten und von Wissenschaftlern der Universität Leipzig erarbeitet wurden. Untersuchungen zur Beeinflussung der Toxinexpression von Clostridium botulinum Typ B und C unter in-vitro-Bedingungen / Untersuchungen zu Vorkommen und Verbreitung von Clostridium botulinum in Rinderbeständen des Freistaates Sachsen / Mykotoxinscreening in Blut, Galle und Milch bei gesunden und kranken Kühen

Die Rindertuberkulose ist eine chronische Erkrankung, die von Mycobacterium (M.) bovis und M. caprae, Mitgliedern des Mycobacterium-tuberculosis-Komplex (MTC), ausgelöst wird. Tuberkulose-Erregern werden sowohl mittels kultureller als auch molekulare Untersuchungsmethoden nachgewiesen. Ziel der vorliegenden Studie war es, die Sensitivität des DNA-Nachweises von Tuberkulose-Erregern zu steigern. Dafür wurden drei Fragestellung im Bereich der molekularen Mykobakterien-Diagnostik bearbeitet. I) Zur Verbesserung der Lyse der mykobakteriellen Zellwand als Voraussetzung für eine Zunahme der Freisetzung von DNA wurden im Vergleich zu einer standardisierten DNA-Isolierungsmethode vier verschiedene Lyseprotokolle (thermische, enzymatische, thermo-enzymatische und mechanische Lyse) entwickelt und mit M. bovis BCG durchgeführt. Die Verbesserung wurde anhand der cycle threshold (Ct)-Werte einer MTC-spezifischen Real-Time (rt) Polymerase-Kettenreaktion (PCR) geprüft. Zwei Lyseprotokolle (thermische und mechanische Lyse) wurden bei zehn Gewebeproben (Lymphknoten, Leber und Lunge) von zehn Tieren (acht Rinder, ein Lama und ein Luchs) mit nachgewiesener Tuberkulose ange-wendet. II) Ausserdem, wurde eine rt-PCR mit dem 16S rRNA Gen als Zielgen (16S-rt-PCR) für den direkten Nachweis von Erregern der Gattung Mycobacterium im Gewebe entwickelt. III) Ein neu entwickelter Spoligotyping-Microarray wurde mit der konventionellen Spoligoty-ping-Methode verglichen, um die neue Methode in Bezug die Sensitivität des Nachweises und des diskriminatorischen Potenzials direkt bei infizierten Gewebeproben zu analysieren. Bei der konventionellen Methode erfolgt die Hybridisierung des PCR-Produktes auf einer Nylon Membran, auf der spezifische Oligonukleotide fixiert sind. Bei der Microarray-Methode sind diese auf einem Microarray-Chip fixiert. Die Ergebnisse der Untersuchungen (I) zur Lyse der Zellwand bei M. bovis BCG zeigten, dass bei der mechanischen Lyse eine Zunahme um 14 % und bei der thermischen Lyse eine Zunahme an PCR-Produkt von 6 % im Vergleich zur Standardlyse erbrachte. Bei beiden Lyseprotokollen wurde eine statistische Signifikanz von α = 1 % (Mann-Whitney-Test) im Vergleich zur Standardlyse errechnet. Bei den tuberkulösen Gewebeproben wurde bei der mechanischen Lyse eine durchschnitliche Zunahme an PCR-Produkt um circa 9 % im Vergleich zur Standardlyse erzielt. Dieser Unterschied war jedoch auf Grund der geringen Probeanzahl nicht statistisch signifikant. II) Bei der Untersuchung von 43 Mykobakterien-Spezies, sechs Mitgliedern des MTC (unter anderen M. bovis BCG) und 37 Non Tuberculous Mycobacteria (NTM) Spezies, konnten alle mit der entwickelten Real-Time PCR (16S-rt-PCR) nachgewiesen werden. DNA-Extrakte von acht nicht zur Gattung Mycobacterium gehörenden Spezies wurden mit der 16S-rt-PCR nicht erfasst. Ein Erreger der Gattung Gordonia und ei-ner der Gattung Rhodococcus wurden auf Grund ihres engen Verwandtschaftsgrades jedoch ebenfalls mit der 16S-rt-PCR detektiert. Die oben erwähnten mittels MTC-spezifischer rt-PCR (Zielgen IS 1081) als infiziert identifizierten zehn Gewebeproben, wurden mittels 16S-rt-PCR untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass beiden rt-PCR Systeme eine vergleichbare Sensitivität aufwiesen. III) Bei dem Vergleich zwischen den Spoligotyping-Methoden zeigte sich die neue Methode um einen Faktor von 100 bei der M. bovis BCG-Reinkultur und um einen Fak-tor von 10 bei DNA-Extrakten aus tuberkulösen Gewebeproben sensitiver als die konventionelle Methode. Im Rahmen dieser Arbeit hat sich der Einsatz der mechanischen Lyse für die Verbesserung der Freisetzung von mykobakterieller DNA als routinefähig erwiesen. Die entwickelte 16S-rt-PCR erwies sich als brauchbare Methode für den Nachweis von Erregern der Gattung Mycobacterium. Die Microarray-Methode stellte sich wesentlich einfacher, sensitiver und schneller dar als die konventionelle Methode. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass alle drei Ansätze dieser Arbeit einen Beitrag zur Verbesserung der molekularen Labordiagnostik der Tuberkulose leisten. Bovine tuberculosis is a chronic disease, that results from infection of Mycobacterium (M.) bovis and M. caprae, members of Mycobacterium tuberculosis complex (MTC), respectively. The laboratory diagnosis of bovine tuberculosis is possible with culture as well as considerate fast molecular methods. The aim of this study was to improve the sensitivity of DNA detec-tion of tuberculosis-causing pathogens. Therefore, three different issues were addressed in the complex molecular procedure targeted. I) four different lytic protocols (thermal, enzymatic, thermo-enzymatic and mechanical lysis) were developed and compared to a standardized DNA isolation protocol that was performed on pure culture of Mycobacterium (M.) bovis BCG in order to improve the mycobacterial cell wall lysis leading to an increase of DNA release. The efficiencies of the lysis protocols were assessed by the resulting cycle threshold (Ct) values of a MTC-specific real time (rt) Polymerase Chain Reaction (PCR). Two lysis protocols (thermal and mechanical) were selected to fur-ther testing of ten tuberculosis-infected tissue samples (lymph nodes, liver and lungs) from ten animals (eight cattle, one lama and one lynx). II) In addition, a real time PCR using the 16S rRNA gene as target sequence was developed, which is also suitable to detect pathogens of Genus Mycobacterium on tissue samples. III) A comparison of a newly developed microarray and the conventional spoligotyping method was realised, to analyse the applicability of the microarray in relation of the sensitivity of the method and to analyse discriminatory potential directly from infected tissue samples. During the conventional spoligotyping method, the PCR product is hybridized with specific oligonucleotides, fixed on a nylon membrane. Using the newly developed method these oligonucleotides are fixed on a microarray-chip. The results I) of the mycobacterial cell wall lysis experiment with pure culture of M. bovis BCG showed an increase of 14 % by using mechanical lysis and an increase by 6 % of the PCR product by using thermal lysis compared to the standard protocol. Using the mechanical lysis as well as the thermal lysis a statistically significant (α = 1 % (Mann-Whitney-Test)) im-provement compared to the standard lysis was achieved. Mechanical lysis was performed on tuberculous tissue samples and the results of the lysis were improved by 9 % compared to the standard lysis. However, the difference between mechanical and standard lysis was not statistically significant due the small sample number. II) Forty-three different mycobacterial species, six members of MTC (among them M. bovis BCG) and 37 Non Tuberculous Mycobacteria (NTM), were detected using the newly developed real time PCR (16S-rt-PCR). Eight non-mycobacterial species were not detected using this rt-PCR, whereas one of genus Rhodococcus and one of genus Gordonia were detected by the 16S-rt-PCR due to their close genetic similarity to the genus Mycobacterium. The ten tuberculosis-infected tissue samples (see above) testing positive using a MTC-specific real time rt-PCR (target gene IS 1081) were sub-jected to the 16S-rt-PCR. Both rt-PCR systems showed a comparable sensitivity. III) By comparing the two spoligotyping-methods, the ArrayStrip™–format method was more sensitive than the conventional method by a factor of 100 applied to pure culture and by a factor of 10 when applied to DNA extracts from infected tissue samples. In conclusion, the mechanical lysis proved to be a practical method to liberate mycobacterial DNA. The newly developed rt-PCR was suitable to detect members of the genus Mycobacterium. The spoligotyping ArrayStrip™–format method appeared to be substantially easier to perform, more sensitive, and less time-consuming than the conventional method. The three methods described were suitable to improve the molecular laboratory diagnosis of tuberculosis.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Identifikation neuer immunologischer Indikatoren (Biomarker) für den allgemeinen Gesundheitszustand von Hochleistungsmilchkühen. Diese Biomarker sollen möglichst einfach und schnell mittels eines Stalltests nachweisbar sein, weshalb die gelösten Proteine in der Milch im Fokus standen. Die neuen Biomarker sollten nicht nur Mastitis, sondern vor allem auch Entzündungen außerhalb des Euters anzeigen können. Zu Beginn sollte das Gesamtspektrum an Immunkomponenten erfasst werden, weshalb zunächst auf Proteinexpressionsebene angesetzt wurde. Das schloss die Analyse von vorhandenen Immunzellpopulationen in Blut- und Milchproben ein, um einen Überblick über potentielle Produzenten der immunologischen Indikatoren zu erhalten. Es konnte erstmals Cluster of Differentiation (CD) 25 (alpha-Kette des Interleukin-2-Rezeptors, IL2R) auf bovinen polymorphnukleären, neutrophilen Granulozyten (PMN) aus peripherem Blut nachgewiesen werden. Die Expression (mittlere Fluoreszenzintensität, MFI) von CD25 stieg dabei mit dem Schweregrad der entzündlichen Erkrankung an. Die Ergebnisse konnten auf Transkript- wie auch auf Proteinexpressionsebene bestätigt werden. Gleiche Tendenzen waren auch für Milchzellen erkennbar. In der statistischen Analyse zeigte CD25 auf PMN im peripheren Blut ein hohes Abgrenzungsvermögen für erkrankte Kühe. Die Messung von CD25 auf PMN könnte somit zur Bestimmung des allgemeinen Gesundheitszustandes von Hochleistungsmilchkühen genutzt werden.

Erst kürzlich wurde der Lipolyse-stimulierte Lipoproteinrezeptor (LSR, engl. lipolysis-stimulated lipoprotein receptor) als der zelluläre Oberflächenrezeptor von CDT und Iota-Toxin, zweier Vertreter der Iota-Toxin-Familie der clostridialen Aktin-ADP-ribosylierenden Toxine, identifiziert. In dieser Arbeit sollte geprüft werden, ob CST, ein weiterer Vertreter der Iota-Toxin-Familie, ebenfalls LSR für den Zelleintritt nutzt. Zunächst wurden die Toxinkomponenten CSTa und CSTb erstmals rekombinant hergestellt. Dazu wurden die für CSTa und CSTb codierenden Genabschnitte mittels PCR amplifiziert und anschließend in einen Expressionsvektor kloniert. Als Expressionsvektor wurde in dieser Arbeit der pHis1522-Vektor verwendet. Zur Amplifizierung wurden die Plasmide in E. coli transformiert und anschließend aufgereinigt. Die Proteinexpression erfolgte in B. megaterium, weil dieses Bakterium sich bereits zur Expression anderer clostridialer Toxine bewährt hatte. Zur Aufreinigung der 6xHis-getaggten Proteine wurde die Nickel-Affinitätschromatographie eingesetzt. Als nächstes wurde gezeigt, dass die rekombinant hergestellten Toxinkomponenten CSTa und CSTb biologisch aktiv waren. Dazu wurden CaCo2-Zellen mit CST behandelt und anschließend die Morphologie der Zellen untersucht. CaCo2-Zellen, die mit CSTa und CSTb behandelt wurden, wiesen Vergiftungserscheinungen wie eine typische Zellabrundung auf. Mit dem „Aktin-Nach-ADP-Ribosylierungs-Assay“ und der fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung von TRITC-Phalloidin-gefärbtem Aktin wurde gezeigt, dass das rekombinant hergestellte CST Aktin-ADP-ribosylierende Eigenschaften besaß. Nachdem gezeigt war, dass rekombinant hergestelltes CST sich wie ein biologisch aktives, binäres Aktin-ADP-ribosylierendes Toxin verhält, konnte mithilfe der Vergiftung von H1-HeLa(+LSR)-Zellen und nativen H1-HeLa-Zellen, die kein LSR exprimierten, nachgewiesen werden, dass die Wirkung des Toxins LSR-abhängig ist. FACS-Analysen und Kolokalisationsstudien mit Alexa488-gefärbtem CSTb und Antikörper-gefärbtem LSR erbrachten zusätzlich den Beweis, dass CSTb auf der Zelloberfläche an LSR bindet und bei der Aufnahme in die Zellen mit LSR in endozytischen Vesikeln kolokalisiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass das C. spiroforme Toxin (CST) ebenfalls LSR als Rezeptor für den Zelleintritt verwendet.

Die Mastitis beim Milchrind hat eine große ökonomische Bedeutung, daher liegt derzeit ein Forschungsschwerpunkt auf der Aktivierung und Stabilisierung der körpereigenen Abwehr zur Bekämpfung von Euterentzündungen. Besonders im peripartalen Zeitraum liegt eine Prädisposition für Infektionen vor, da eine physiologische Abwehrschwäche besteht. Daher erscheint die Förderung der Bildung von Antikörpern durch Impfungen sinnvoll. Getestet wurde der Einfluss von bestandsspezifischen E. coli-Vakzinen auf das Immunsystem, das Erregervorkommen in der Milch und die Eutergesundheit. Differenziert wurden Impfstoffe, die einerseits aus den Originalkulturen der antigenen Erreger (sogenannte large colony variants, LCV) oder aber aus den kleineren, intrazellulär persistierenden Erregern (small colony variants, SCV) hergestellt wurden. Letztlich zeigte sich bei Anwendung der Vakzinen an Milchrindern kein Unterschied zwischen LCV und SCV, bei beiden Impfstoffen war eine vakzinationsbedingte deutliche Steigerung der Antikörpertiter, welche einen Einfluss auf Erregervorkommen und Eutergesundheit hatte, erkennbar.

1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Magen- Darm- Trakt des Pferdes 2 2.1.1 Anatomischer Aufbau und Funktion des Verdauungskanales 2 2.1.2 Entwicklung der Magen- Darm- Flora 3 2.1.3 Magen- Darm- Trakt und seine Flora - allgemeine Betrachtungen 4 2.1.4 Einflussfaktoren auf die Flora des Magen- Darm- Traktes 7 2.1.5 Fohlenrossediarrhoe 9 2.2 Abwehrmechanismen des Magen- Darm- Traktes 11 2.2.1 Resistenz 12 2.2.2 Aufbau und Funktion der Darmbarriere 12 2.2.3 Darmassoziiertes Immunsystem 14 2.3 Immunstatus des neugeborenen Fohlens 17 2.3.1 Entwicklung des fetalen Immunsystems 17 2.3.2 Passive Immunantwort 18 2.3.3 Immunstatus während der neonatalen Periode 20 2.3.4 Hypogammaglobulinämie 21 2.4 Beeinflussung der Magen- Darm- Flora durch Präbiotika 22 2.5 Hormonstatus der Sexualhormone der Stute im peripartalen Zeitraum 24 3 Tiere, Material und Methoden 27 3.1 Versuchsdurchführung 27 3.2 Tiermaterial 27 3.3 Bestandscharakterisierung 28 3.4 Futtermittel 35 3.5 Beprobungsschema 36 3.6 Probenentnahme 37 3.6.1 Entnahme der Blutprobe 37 3.6.2 Entnahme der Kotproben 38 3.7 Labordiagnostische Untersuchungen 38 3.7.1 Mikrobiologische Untersuchungen 38 3.7.1.1 Aufbereitung der Probe 38 3.7.1.2 Kultivierung der aeroben Keime 39 3.7.1.3 Kultivierung der anaeroben Keime 40 3.7.2 Immunologische Untersuchungen 41 Inhaltsverzeichnis II 3.7.3 Bestimmung der klinischen Parameter 41 3.8 Statistische Auswertung und Darstellung der Daten 42 4 Ergebnisse 44 4.1 Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchung 44 4.1.1 Aerobe Gesamtkeimzahl 44 4.1.2 Enterobakterien 46 4.1.3 Anaerobe Gesamtkeimzahl 47 4.1.4 Lactobacillus ssp.- Keimzahl 49 4.1.5 Enterococcus ssp.- Keimzahl 52 4.1.6 Bacteroides spp.- Keimzahl 54 4.1.7 Clostridium perfringens Keimzahl 56 4.1.8 Bifidobacterium ssp.- Keimzahl 57 4.1.9 Hefen Keimzahl 58 4.2 Ergebnisse der immunologischen Untersuchungen 59 4.2.1 Gesamt Immunglobulin- G- Gehalt in mg/ml Serum 59 4.2.2 Immunglobulin G gegen das Lipopolysaccarid von E. coli J5 (IgG- anti- LPS) 62 4.2.3 Immunglobulin G gegen die Phospholipase C von Clostridium perfringens (IgG- anti- PLC) 65 4.3 Klinische Ergebnisse 68 4.3.1 Klinische Ergebnisse Stuten Versuchsdurchgang 2006 68 4.3.2 Klinische Ergebnisse Fohlen Versuchsdurchgang 2006 69 4.3.3 Klinische Ergebnisse Stuten Versuchsdurchgang 2007 70 4.3.4 Klinische Ergebnisse Fohlen Versuchsdurchgang 2007 71 5 Diskussion 74 5.1 Methodenkritik 74 5.1.1 Auswahl der Probanden 74 5.1.2 Probennahme 74 5.1.3 Auswertung Klinik 75 5.2 Diskussion der Ergebnisse - Stute 75 5.2.1 Präpartale Einflussfaktoren 75 5.2.2 Hormonelle Situation und Einfluss auf die Mikrobiota 76 5.2.3 Gesamtkonzentration an Immunglobulin G 78 5.2.4 Fohlenrosse 78 5.2.5 Immunglobulin G gegen das Lipopolysaccarid von E. coli 81 5.2.6 Immunglobulin G gegen die Phospholipase C von C. perfringens 83 Inhaltsverzeichnis III 5.2.7 Bifidobacterium ssp.- Keimzahl 83 5.3 Diskussion der Ergebnisse - Fohlen 83 5.3.1 Erkrankungshäufigkeit 83 5.3.2 Darmflora 85 5.3.3 Immunglobulin G gegen das Lipopolysaccarid von E. coli 86 5.3.4 Anaerobe Gesamtkeimzahl, Laktobazillen- und Bacteroideskeimzahl 87 5.3.5 Fohlenrosse 89 5.3.6 Gesamtkonzentration an Immunglobulin G 93 5.3.7 Immunglobulin G gegen die Phospholipase C von C perfringens 95 6 Zusammenfassung 101 7 Summary 103 8 Literaturverzeichnis 105 Abbildungsverzeichnis 117 Tabellenverzeichnis 119 Anhang A: Bakteriologische und immunologische Untersuchungen 122 Anhang B: Verwendete Nährmedien 141 Danksagung 145

Hintergrund: Die Pathogenese nicht-familiärer kolorektaler Neoplasien ist heute noch nicht bekannt. Die Besonderheiten der Epidemiologie der Erkrankung sprechen für die Beteiligung von Umweltfaktoren, wie sozioökonomischer Faktoren, der Ernährung oder der bakteriellen Flora des Darmes. Eine intrazelluläre, von E.coli dominierte Flora wurde in Kolonbiopsien dieser Patienten beschrieben. Methoden: Es wurden Virulenzfaktoren von Escherichia coli untersucht, die aus gewaschenen koloskopischen Biopsien von 43 Patienten mit kolorektalen Adenomen und Karzinomen isoliert worden waren. 100 Stämme wurden mittels PCR auf Gene für folgende Virulenzfaktoren untersucht: s-Fimbrien (sfa), pyelonephritisassoziierter Pilus (pap), Hämolysin A (hlyA), hitzestabiles und -labiles Toxin (ST, LT, EAST), Intimin (eae), Verotoxin (stx), Invasionsplasmid (ipa), cytolethal distending toxin (cdt) und cytotoxic necrotizing factor 1 (cnf1). Für die Kontrollgruppe wurden E.coli aus Biopsien von 55 Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED) und unspezifischer Kolitis, von 16 Patienten mit Colon irritabile (IBS) und aus Stuhlproben von 29 gesunden Probanden isoliert und untersucht. Ergebnisse: Bei 69% der Patienten mit kolorektalen Karzinomen und bei 58% der Patienten mit kolorektalen Adenomen wurde mindestens einer der Virulenzfaktoren gefunden, dagegen nur bei 25 bis 39% der IBS- und CED- Patienten sowie der gesunden Probanden (p Background: Pathogenesis of non-hereditary colorectal neoplasia is poorly understood. The differences in regional incidence indicate an influence of environmental factors, as socio-economic conditions, nutrition and intestinal flora. An intracellular flora with a predominance of Escherichia coli in colon biopsies has been described in these patients. Methods: We studied virulence factors of Escherichia coli isolated from washed colonoscopic biopsies of 43 patients with colorectal carcinoma and adenoma. 100 strains of E.coli were isolated and used for detection of a broad range of virulence genes by PCR encoding: s-fimbriae (sfa), pyelonephritis-associated pili (pap), hemolysin A (hlyA), heatstable and heatlable toxins (ST, LT, EAST), verotoxin (stx), invasionplasmidantigen (ipaH), intimin (eae), cytolethal distending toxin (cdt) and cytotoxic necrotizing factor 1 (cnf1). E.coli from biopsies of 55 patients with inflammatory bowel disease (IBD) and non-specific colitis, of 16 patients with irritable bowel syndrom (IBS) and from stool samples of 29 healthy individuals were isolated and examined as controls. Results: The prevalence of virulent strains bearing at least one of the tested genes was 69% in colorectal carcinoma and 58% in colorectal adenoma, but only 25 to 39% of IBD and IBS patients and healthy individuals (p