Search

The aim of this thesis was to compare the degradation of human oral epithelial proteins by proteinases of different Candida yeast species. We focused on proteins associated with Candida invasion in the cell-to-cell junction, the basement membrane zone, the extracellular matrix, and local tissue inflammatory regulators. Another main objective was to evaluate the effect of the yeast/hyphal transition and pH on the degradative capability of Candida. The enzymatic activity of the Candida proteinases was verified by gelatin zymography. Laminins-332 (Lm-322) and -511(Lm-511) produced by human oral keratinocytes were gathered from the growth media, and E-cadherin (E-Cad) was isolated from the cell membrane of the keratinocytes by immunoprecipitation. The proteins were incubated with Candida cells and cell-free fractions, and degradation was detected by fluorography. Fibronectin degradation was visualised by sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) activation and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) fragmentation was detected by using the Western blot and enhanced chemoluminescence (ECL) techniques. Residual activity of TIMP-1 was evaluated by a casein degradation assay. A fluorimetric assay was used to detect and compare Candida proteinase activities with MMP-9. These studies showed that the ability of the different Candida yeast species to degrade human Lm-332, fibronectin, and E-Cad vary from strain to strain and that this degradation is pH-dependent. This indicates that local acidic pH in tissue may play a role in tissue destruction by activating Candida proteinases and aid invasion of Candida into deeper tissue. A potential correlation exists between the morphological form of the yeasts and the degradative ability; the C. albicans yeast form seems to be related to superficial infections, and hyphal forms can apparently invade deeper tissues between the epithelial cells by degradation of E-Cad. Basement membrane degradation is possible, especially in the junctional epithelium, which contains only Lm-332 as a structural component. Local tissue host inflammatory mediators, such as MMP-9, were activated, and TIMP-1 was degraded by certain Candida species, thus indicating the possibility of a weakened host tissue defence mechanism in vivo. Candida-hiivasienitulehdukset ovat yleistyvä ongelma väestön ikääntyessä immunivastetta heikentävien tautien ja lääkkeiden suuta kuivattavien sivuvaikutusten vuoksi. Candida- hiivasienten aiheuttamat tulehdukset ovat kolmanneksi yleisin mikrobitauti sairaalapotilailla ja lääkeresistentit hiivasienikannat ovat hälyyttävästi lisääntymässä. Selkeää kuvaa hiivasieni-infektion etenemisestä ei ole. Näiden seikkojen vuoksi onkin tärkeää, että tutkimusten avulla selvitetään mitkä tekijät vaikuttavat tulehduksen etenemiseen.Tähän väitöskirjatyöhön sisältyvien tutkimusten päämääränä oli selvittää voivatko Candida-hiivasienten entsyymit hajottaa suun limakalvon proteiineja ja aiheuttaa tällä mekanismilla tulehduksen etenemisen syvemmälle kudoksiin. Laboratoriotutkimuksissa testasimme seitsemää eri ienkudoksessa esiintyvää proteiinia. Näihin kuuluivat: epiteelin rakenneproteiinit laminiini-332, laminiini-511, fibronektiini ja E- kadheriini sekä matriksin metalloproteaasi-9 (MMP-9), metalloproteaasien toimintaa estävät proteiinit TIMP-1 ja TIMP-2. Candida- hiivasienikannoiksi valittiin yleisimmin esiintyvä hiivalaji Candida albicans sekä nykyisin yhä useammin tulehduksia aiheuttavia hiivakantoja, joihin kuuluvat Candida dubliniensis, Candida glabrata, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei ja Candida tropicalis. Lisäksi testasimme geneettisesti muunneltuja hiivakantoja. Saatujen tulosten perusteella voidaan todeta, että useimmat Candida- hiivakannat pystyvät hajottamaan suun limakalvon proteiineja. Näyttää mahdolliselta, että Candidat voivat edetä ientaskun epiteelin liitosepiteelin läpi tai epiteelisolujen välistä kudoksiin. Tietyt Candida-hiivakannat voivat aktivoida ienkudoksessa olevia MMP-9 entsyymejä joko suoraan tai välillisesti hajottamalla niitä estäviä proteiineja ja voivat näin edistää ientulehduksen etenemistä. Tutkimustulosten perusteella on mahdollista kehittää fluoresenssiin perustuva diagnostinen testi hiivatulehduksen toteamiseksi.