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The genus Lippia comprises approximately 200 species of herbs, shrubs and small trees, distributed throughout the South and Central America and tropical Africa. The species Lippia gracilis Schauer is an endemic aromatic plant of the Brazilian Northeast normally found in the states of Bahia, Sergipe and Piauí. The traditional communities of Caatinga, a semi-arid region of the Brazilian Northeast, use its leaves to treat throat and mouth infections, cutaneous diseases, ulcers, vagina disorders, acne, Pityriasis alba, dandruff, burns, wounds, sinusitis, bronchitis, nasal congestion, headache, jaundice and paralysis. Considering that the main investigations into the L. gracilis Schauer species are focused on its volatile constituents, in this report, we describe the isolation, by liquid chromatography with diode array detector-solid phase extraction/nuclear magnetic resonance (LC-DAD-SPE/NMR), of five flavonoids besides free and glycosidically bound carvacrol from an infusion of the leaves of a genotype of this species.

Chromatographic methods are commonly used for analysis of small molecules in different biological matrices. An important step to be considered upon a bioanalytical method's development is the capacity to yield reliable and reproducible results. This review discusses validation procedures adopted by different governmental agencies, such as Food and Drug Administration (USA), European Union (EU) and Agência Nacional de Vigilância Sanitária (BR) for quantification of small molecules by bioanalytical chromatographic methods. The main parameters addressed in this review are: selectivity, linearity, precision, accuracy, quantification and detection limits, recovery, dilution integrity, stability and robustness. Also, the acceptance criterions are clearly specified.

Chromatographic methods are commonly used for analysis of small molecules in different biological matrices. An important step to be considered upon a bioanalytical method's development is the capacity to yield reliable and reproducible results. This review discusses validation procedures adopted by different governmental agencies, such as Food and Drug Administration (USA), European Union (EU) and Agência Nacional de Vigilância Sanitária (BR) for quantification of small molecules by bioanalytical chromatographic methods. The main parameters addressed in this review are: selectivity, linearity, precision, accuracy, quantification and detection limits, recovery, dilution integrity, stability and robustness. Also, the acceptance criterions are clearly specified.

Orientadores: Cesar Costapinto Santana, Quezia Bezerra Cass Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica Resumo: O objetivo deste trabalho foi a síntese, em larga escala, da fase estacionária quiral tris(3,5-dimetilfenilcarbamato) de amilose e posterior investigação desta na separação preparativa dos enantiômeros do omeprazol por cromatografia líquida de alta eficiência. O carbamato de amilose, caracterizado por análise elementar e espectroscopia na região do infravermelho, apresentou valores experimentais de CHN próximos aos valores teóricos e absorções no infravermelho próximas a 1720 cm-1, referente ao grupo C=O, a 1220 cm-1, referente à ligação C-N e em 3294 cm-1, referente à ligação N-H. Experimentos de pulsos com soluções do traçador e da mistura racêmica, em diferentes temperaturas e vazões da fase móvel, foram realizados para avaliar a homogeneidade das colunas e sua influência no processo de separação, os coeficientes de dispersão axial e de tranferência de massa e o comportamento termodinâmico da adsorção. Uma análise estatística dos dados de porosidade foi realizada através dos testes t e F mostrando que, com um nível de confiança de 95%, apenas algumas colunas apresentam porosidades equivalentes embora os erros cometidos na determinação da porosidade total e no processo de empacotamento sejam os mesmos. A recuperação do enantiômero de interesse, S-(-)-omeprazol, variou de 10-100% quando a porosidade total sofreu variações da ordem de 3%. Os gráficos de van Deemter mostraram uma relação linear entre a altura equivalente a um prato e a velocidade superficial da fase móvel. O enantiômero S-(-)- apresentou maiores coeficientes de transferência de massa e o enantiômero R-(+)- maiores constantes de Henry. O fator de separação e a resolução apresentaram valores iguais a 1,30 e 1,96, respectivamente, a 40 °C e 1,0 mL/min. Observou-se um decréscimo nos valores desses parâmetros após um determinado tempo de uso da coluna. Os valores negativos de 0 S D e 0 H D indicam um aumento na ordem do sistema cromatográfico e que a adsorção dos enantiômeros da fase móvel na fase estacionária é entalpicamente favorável. O modelo de isoterma de Langmuir foi bem correlacionado aos dados experimentais de equilíbrio no intervalo de concentração analisado. Palavras-chave: fase estacionária quiral, omeprazol, cromatografia líquida de alta eficiência Abstract: The aim of this work was the synthesis, in large scale, of the amylose tris(3,5- dimethylphenylcarbamate) chiral stationary phase and further evaluate in the omeprazole enantiomer preparative separation by high performance liquid chromatography. The amylose carbamate, characterized by elemental analysis and infrared spectroscopy, showed CHN experimental values close to theoretical values and infrared absorptions at 1720 cm-1 which is assigned to C=O group, at 1220 cm-1 which is assigned to C-N bond and at 3294 cm-1 which is assigned to N-H bond. Pulse experiments with solutions of the inert and racemic mixture at different flow rates and temperature were carried out to evaluate column homogeneity and its influence on separation process, axial dispersion and mass transfer coefficients and adsorption thermodynamic behavior. A statistical analysis of the porosity data was performed through of the t and F tests showing that with 95% confidence level only some columns presented equivalent porosities although the errors made in the total porosity determination and packing process are equal. The recovery of the interest enantiomer, S-(-)-omeprazole, varied of 10 until 100% when total porosity varied in the order of 3%. The van Deemter plots showed a linear dependence between height equivalent to a theoretical plate and mobile phase superficial velocity. S-(-)- enantiomer presented higher values of mass transfer coefficients and the enantiomer R-(+)-omeprazole presented higher values of Henry constants. The separation factor and resolution values were 1.30 and 1.96 at 40 °C and 1.0 mL/min, respectively. It was observed a decrease of these parameter values after a use time of the column. The negative values of 0 S D and 0 H D indicates an increase in the order of chromatographic system and that the enantiomer adsorption from the mobile phase to stationary phase is enthalpically favorable. The Langmuir isotherm model was well correlated to equilibrium experimental data in the range of investigated concentration. Key-words: chiral stationary phase, omeprazole, high performance liquid chromatography Doutorado Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos Doutor em Engenharia Química

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) is a ubiquitous enzyme found in all known groups of organisms, acting in the reversible conversion of oxaloacetate (OAA) to phosphoenolpyruvate (PEP) and CO2, in the presence of divalent metal ion, and dependent of ATP or GTP. Their catalytic activity is usually measured by coupled assays with malate or pyruvate kinase/lactate dehydrogenases as preferred second enzyme. Thus, the PEPCK reaction product is converted by the action of a NADH-dependent enzyme, wherein the catalytic reaction is followed by the decrease in the absorbance at 340 nm due to the consumption of NADH. The main drawback in coupled assays is that any interference in the activity of the second enzyme will affect the result of the first enzyme. In addition, in the case of PEPCK, NADH has been reported as inhibitor of some of these enzymes. To overcome these problems, herein we report a direct assay to quantity PEP by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS). The difficulty related to PEPCK’s substrates and products are their higher hydrophilicity and poor retention in reverse-phase elution mode, which leads to coelution or low peak resolution. In spite of this, PEP was quantified in coelution with OAA by the differentiation obtained by the mass spectra data. The developed method was validated, and all the significant figures were in accordance with the adopted criteria. For that, PEPCK of T. cruzi was expressed as an active enzyme in Escherichia coli and purified by anionic exchanged and affinity chromatography. The method was used, then, to monitor the purification of T. cruzi PEPCK as well as to determine all the kinetics parameters of the purified enzyme. The direct method herein disclosed can be used for others PEPCKs. Moreover, a ligand fishing assay based on the immobilization of PEPCKs to magnetic particles was modulated based on a series of synthetic compounds that were screened towards PEPCKs using the solution activity assay here developed. In searching for selective binders, the affinity-based assay was used to screen four ethanolic extracts of Brazilian Cerrado plants: Qualea grandiflora, Diospyros burchellii, Anadenanthera falcata and Byrsonima coccolobifolia. The chemical characterization of the identified ligands was carried out by means of LC-HRMS analysis. These results are fully discussed. The efforts to produce a PEPCK immobilized capillary enzyme reactor to be used as a bioaffinity column in a flow assay is also presented. A enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK) é amplamente distribuída nos organismos e atua na conversão reversível do fosfoenolpiruvato (PEP) para oxaloacetato (OAA), na presença de CO2 e um cátion divalente, dependente de ATP ou GTP. A sua atividade catalítica é normalmente monitorada por ensaios acoplados com malato desidrogenase ou piruvato quinase/lactato desidrogenase. Assim, o produto da reação da PEPCK é convertido em outro pela ação de uma enzima NADH-dependente, com o monitoramento do NADH consumido através da diminuição da absorbância a 340 nm. A principal desvantagem dos ensaios acoplados é que qualquer interferência na atividade da segunda enzima afeta a atividade da primeira enzima. Também, o NADH foi reportado como inibidor da PEPCK de alguns organismos. Para superar estes problemas, relatamos aqui um ensaio direto para quantificar o PEP por cromatografia a líquido hifenada à espectrometria de massas (LC-MS). A dificuldade relacionada aos substratos e produtos da PEPCK é sua elevada hidrofilicidade e baixa retenção no modo reverso de eluição, o que leva a coeluição ou baixa resolução de picos. Apesar disso, o PEP foi quantificado em coeluição com OAA através da diferenciação obtida pelos íons no espectro de massas. O método desenvolvido foi qualificado e todos os valores estiveram de acordo com os critérios adotados. Assim, a PEPCK de T. cruzi foi expressa como uma enzima ativa em E. coli e purificada por cromatografia aniônica e de afinidade. O método LC-MS foi utilizado, então, para monitorar a purificação da PEPCK de T. cruzi, bem como para determinar todos os parâmetros cinéticos da enzima purificada. O método direto aqui reportado pode ser usado para outras PEPCKs. Além disso, um ensaio de captura de ligantes, através da imobilização da PEPCK em partículas magnéticas, foi modulado com base em uma série de compostos sintéticos que foram selecionados para PEPCK usando o ensaio de atividade em solução aqui desenvolvido. Na busca por ligantes seletivos, foram realizados ensaios de ligand fishing, baseados em afinidade, para a triagem em quatro extratos etanólicos de plantas brasileiras do cerrado: Qualea grandiflora, Diospyros burchellii, Anadenanthera falcata e Byrsonima coccolobifolia. A caracterização química dos ligantes identificados foi realizada através de análise por LC-HRMS. Esses resultados são totalmente discutidos. Os esforços para produzir um reator capilar de enzima imobilizada com a PEPCK para ser usado como uma coluna de bioafinidade em um ensaio de fluxo também são apresentados. CAPES: Código do Financiamento 001

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) ARGINASE: FROM THE IMMOBILIZATION TO MODULATION OF AFFINITY ASSAY IN COLLECTIONS OF NATURAL PRODUCTS. The use of natural products from plants dates from antiquity and they are often targets as they exhibit biological properties of interest for new drug discovery. Unfortunately screening natural products for biologically active compounds, is laborious, time consuming and Costly. To meet this end, new affinity assay model based on the use immobilized protein have developed and it was the objective of this work. This work consisted of the immobilization of arginase on to magnetic beads (Arg-MBs) for screening of natural products extracts. The modulation of the assay was initially carried out for the compounds: catechin and epicatechin (reported as arginase inhibitors) and as negative control (not inhibitor), acyclovir. For the assays, two ethanolic extracts were selected: Byrsonima coccolobifolia (Malpighiaceae) and Tabebuia ochracea (Bignoniaceae). From the leaves extract of Byrsonima coccolobifolia (Malpighiaceae) 12 ligands were identified, and 9 of these characterized by LC-HRMS. While from crude ethanolic roots extract of Tabebuia ochracea (Bignoniaceae) nineteen ligands were fished out. For chemical elucidation, these compounds need to be isolated in milligram scale. The number of ligands identified in the two ethanolic extracts showed the potential of the affinity assay developed. The development of the assays, results and studies for structural elucidation of the ligands identified will be discussed in detail in this dissertation. ARGINASE: DA IMOBILIZAÇÃO À MODULAÇÃO DE ENSAIOS DE AFINIDADE EM COLEÇÕES DE PRODUTOS NATURAIS Desde a antiguidade plantas são usadas para remediar uma dada patologia, e são frequentemente alvos, pois exibem propriedades biológicas de interesse para a descoberta de novos medicamentos. Infelizmente, a triagem de produtos naturais para compostos biologicamente ativos é trabalhosa, demorada e dispendiosa. Assim, novos modelos de triagem baseado em afinidade têm sido desenvolvidos com proteínas imobilizadas e foi o objetivo desse trabalho. Este trabalho consistiu na imobilização da arginase em partículas magnéticas (Arg-MBs) para triagem em matrizes de produtos naturais. A modulação do ensaio foi feita inicialmente para os compostos: catequina e epicatequina (reportados como inibidores de arginase) e como controle negativo (não inibidor da enzima), o aciclovir. Para os ensaios, dois extratos etanólicos foram selecionados: Byrsonima coccolobifolia (Malpighiaceae) e Tabebuia ochracea (Bignoniaceae). Do extrato das folhas de Byrsonima coccolobifolia (Malpighiaceae) 12 ligantes foram identificados, sendo 9 destes inferidos por LC-HRMS. No extrato de raízes de Tabebuia ochracea (Bignoniaceae) dezenove ligantes foram retidos. Para caracterização esses compostos deverão ser isolados em escala multimiligrama. O número de ligantes identificados nos dois extratos etanólicos demostrou o potencial do ensaio de afinidade desenvolvido. O desenvolvimento dos ensaios, resultados e os estudos para elucidação estrutural dos ligantes identificados serão detalhadamente discutidos nessa dissertação. CAPES: código de financiamento - 001

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Cathepsins, human lysosomal enzymes, are associated with the development of various diseases, and cruzaine is an important enzyme in the development of the protozoan Trypanosoma cruzi, causes Chagas' disease. Cysteine proteases, cathepsins and cruzaine, are known as papain-like, due to their structural similarities and catalytic mechanism. Papain is a commercial enzyme, inexpensive and stable, and thus, it has been used as a model for screening assays for cysteine-proteases’ ligands. As the classical assays for these enzymes are spectrophotometrically-based, herein a direct method for measuring the enzymatic product of the reaction using liquid chromatography hyphenated to mass spectrometry is described. For that, new reaction conditions were employed. Under this condition, in solution papain showed a KM of 52.9 ± 3.12 μM. For developing new assay conditions and considering the advantages of use of immobilized enzymes, papain was covalently immobilized on to magnetic particles (P-MB), producing a bioreactor with a KM of 34.9 ± 3.59 μM. For qualifying P-PB screening assay, 10 known cysteine protease inhibitors including acridones, quinolinones, flavonoids, and dipeptidyl nitriles were screened. Maltose was used as a non-binder of papain. With the exception of maltose that showed no inhibitory capacity, in the solution assay (2,1 x 10-3 U) the percentage of inhibition ranged from 13 to 100%, while with P-MBs (1,4 x 10-3 U) the inhibition range was from 34 to 85%. Ligand Fishing assay, papain bioreactors showed affinity for all known binders of cysteine proteases, and no affinity for maltose. Six of them presented expressive affinity only ratio for the active P-MB, with no retention to inactive P-MB control. The other four binders varied their affinity ratio in the range of 2.0 to 3.5. With the ethanolic extract from the stem of Melia azedarach, 11 compounds were fished, among them catechin and epicatechin. The results herein described demonstrates that papain bioreactors can be used for screening cysteine-proteases’ ligands. As catepsinas, enzimas lisossomais humanas, estão associadas ao desenvolvimento de várias doenças, e a cruzaína é uma enzima importante no desenvolvimento do protozoário Trypanossoma Cruzi, causador da doença de Chagas. As catepsinas e a cruzaína são cisteíno proteases, conhecidas como papain-like, devido suas similaridades estruturais e mecanismo catalítico com a papaína. A papaína é uma enzima comercial, de baixo custo, estável, e foi utilizada como modelo no desenvolvimento de métodos de triagem para ligantes de cisteíno proteases. Uma vez que os métodos clássicos de triagem são espectrofotométricos, o ensaio aqui descrito mesura diretamente o produto da reação enzimática por cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massa (LC-MS/MS). Neste contexto, novas condições reacionais foram determinadas. A papaína em solução apresentou um KM de 52,9 ± 3,12 μM. A fim de desenvolver um novo modelo de triagem, um biorreator de papaína, P-MB (KM de 34,9 ± 3,59 μM), foi produzido pela imobilização covalente da enzima em partículas magnéticas. Para qualificação do ensaio de prospecção de ligantes usando a P-MB, 10 inibidores conhecidos de cisteíno proteases (acridonas, quinolinonas, flavonoides e dipeptidil nitrilas) foram ensaiados com a papaína. Com exceção da maltose, com valor de inibição em torno de 3%, a porcentagem de inibição da papaína em solução (2,1 x 10-3 U), variou de 13 a 100%, enquanto com as P-MBs (1,4 x 10-3 U) a inibição variou entre 34 e 85%. No ensaio de Ligand Fishing, os biorreatores de papaína apresentaram afinidade por todos os ligantes conhecidos de cisteíno proteases, e não-afinidade com a maltose. Seis deles apresentaram expressivos valores de afinidade pela P-MB ativa, sem nenhuma retenção com a P-MB controle. Os outros quatro ligantes mostraram razão de afinidade entre 2,0 a 3,5. Com o extrato etanólico do caule de Melia azedarach foram bioconjugados 11 compostos entre eles a catequina e a epicatequina. Os resultados descritos nesse trabalho inferem que biorreatores de papaína podem ser usados em ensaios de triagem para ligantes de cisteíno proteases. CNPq: 132831/2017-1

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Over the centuries, chemical reactions have been carried out in the same way in standardized glassware. On the other hand, continuous flow reactions are gaining interest regularly and demand for the related hardware toolkit is also increasing every day. In this scenario, the current work describes assembly of different continuous flow reaction systems that enable: I. Synthesis of trisubstituted 1,2,3-triazoles using molecular sieve as a solid catalyst; II. Organocatalytic applications of multicomponent reaction-derived prolyl pseudo-peptide catalysts supported on the renewable polymer applied to asymmetric Michael addition; III. Photochemical process for the synthesis of indoles and indolines. Moreover, an instrumental setup configuration was created that combines the advantages of chromatography and online analysis of the reactional parameters. Reações químicas vem sendo realizadas da mesma forma em vidrarias padronizadas por séculos. Em contrapartida, reações em fluxo contínuo vem ganhando interesse e seu "hardware toolkit" crescendo a cada dia. Para enfatizar isso, este trabalho descreve uma montagem de diferentes sistemas de reação em fluxo contínuo que possibilitaram: I. Síntese de 1,2,3-triazóis trissubstituídos usando peneira molecular como catalisador sólido; II. Aplicações organocatalíticas de pseudopeptídeos de prolina derivados de reações multicomponentes suportados em polímero renovável aplicado a adição assimétrica de Michael; III. Processo fotoquímico para a síntese de indóis e indolinas. Além disso, foi criada uma configuração instrumental que combina as vantagens da cromatografia e análise online dos parâmetros reacionais. CAPES: Código de Financiamento 001

Fundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico do Maranhão (FAPEMA) As a solution to the paradigm of achieving maximum efficiency in a shorter analysis time, Ultra High-performance Liquid Chromatography (UHPLC) coupled to mass spectrometry (MS / MS) have been successfully explored. The biggest problem still liesin sample preparation which causes waste of time and generates residue, demanding usually high use of organic solvents. Methods by direct injection of samples furnishes more efficient and greener approaches and have been efficiently used for LC-MS/MS analysis. The present work describes the challenges involved in the quantification of three benzophenones in breast milk by direct injection of the sample using albumin serum bovine restricted access phases (RAM-BSA). This work describes the results obtained for the determination in breast milk of 2,4-dihydroxybenzophenone (BP-1), 2-hydroxy-4-methoxybenzophenone (BP-3) and 2-hydroxy-4-methoxybenzophenone sulfonic acid (BP-4). . The results of obtained showed protein exclusion levels greater than 82% for three different aliquots (n = 3). The studies of matrix effect, process efficiency and recovery were not satisfactory due to strong interaction of analytes with the RAM-BSA phases and also to memory effect. Sample preparation by precipitation of protein was used as a proof of concept but the memory effect remained even when we used different analytical columns, different elution modes, and bovine milk as a matrix, indicating contamination of the chromatographic system and making it impossible for the validation of the method. The screening of breast milks samples by LC-HRMS obtained from 26 different mothers allowed the identification of BP-1, BP-3 and BP-4 in 88% of the analyzed samples. Como solução ao paradigma de obtenção de máxima eficiência em menor tempo de análise, separações no âmbito da Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (UHPLC) acoplado a espectrometria de massas (MS/MS) têm sido exploradas com sucesso. O maior problema ainda reside, no entanto, no preparo de amostras que além de provocar perda de tempo, gera resíduo e demanda grandes volumes de solventes orgânicos. Métodos por injeção direta de amostras com o intuito de atender a demanda por métodos mais eficientes e com menor geração de resíduos têm sido eficientemente usados para análises por LC-MS/MS. O presente trabalho descreve questões e desafios na quantificação de três benzofenonas em leite materno por injeção direta de amostra usando colunas de fases de acesso restrito (RAM). Perante as informações obtidas um método para determinação de 2,4-dihidroxibenzofenona (BP-1), 2-hidroxi-4-metoxibenzofenona (BP-3) e 2-hidroxi-4-metoxibenzofenona-sulfónico (BP-4) em leite materno foi proposto. Considerando a complexidade da matriz por sua composição, principalmente de proteínas, lipídeos e oligossacarídeos a extração dos analitos de interesse torna-se bastante desafiadora para o desenvolvimento de métodos analíticos quantitativos. Decidiu-se adotar a abordagem de injeção direta, utilizando colunas de meios de acesso restrito preparadas pela imobilização de albumina de soro bovino (RAM-BSA). Os resultados dos níveis de exclusão de proteína foram superiores a 82% para três alíquotas diferentes (n = 3). Os estudos de efeito de matriz, eficiência do processo e recuperação não foram satisfatórios devido à forte interação dos analitos com as fases RAM-BSA e também ao efeito memória. O preparo de amostra por precipitação de proteína foi avaliado como prova de conceito, porém o efeito memória permaneceu mesmo quando foram utilizadas diferentes colunas analíticas, modos de eluição diferentes, e leite bovino como matriz, indicando a contaminação do sistema cromatográfico e impossibilitando a validação do método. A triagem de amostras de leites maternos por LC-HRMS obtidos de 26 diferentes nutrizes permitiu a identificação da BP-1, BP-3 e BP-4 em 88% das amostras analisadas.

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Não recebi financiamento Parabens are the most popular antimicrobials used for more than 100 years in personal care products, the most known are methylpaben, ethylparaben, propylparaben and butylparaben. The continued release of these antimicrobials turned them into corganic pollutants. Therefore, methods that allow quantification at low limits are important. The present study discusses the development and validation of the analytical method by direct injection of samples into solid phase extraction using liquid chromatography coupled to the mass spectrometer for determination at low levels in spring water and waste water (ng/L) from the city of São Carlos - SP. Methylparaben at 20.0 ng/L was found in river water sample from latitude 22°00’68”S, longitude: 47°90’47”W ; methylparaben at 18.0 ng/L and butylparaben 4.1 ng/L were found in urban water sample latitude: 22°02’21”S, longitude: 47°91’40”W around Monjolinho River. The attractiveness of the developed method consists of the low volume of samples and solvents required for analyses. The four parabens were quantified in the native matrix in a total run time of 9.5 min. Os parabenos são antimicrobianos utilizados em larga escala por mais de 100 anos em produtos de higiene pessoal. Os mais utilizados são metilparabeno, etilparabeno, propilparabeno e butilparabeno. A liberação contínua desses antimicrobianos os coloca na categoria de poluentes orgânicos pseudo persistentes. Assim, métodos que possibilitem a quantificação em baixos limites em matrizes ambientais são importantes. O presente trabalho apresenta os resultados do desenvolvimento e validação de método analítico para quantificação desses quatro parabenos em água de efluentes por extração em fase sólida on-line usando cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas. O método desenvolvido foi aplicado para análises de águas de efluente coletadas ao longo do rio Monjolinho em São Carlos, SP, Brasil. Metilparabeno na concentração de 20,0 ng/L foi encontrado próximo da jusante da confluência com o córrego do Tijuco Preto, latitude 22°00’68”S, longitude: 47°90’47”W e tanto o metilparabeno quanto o butilparabeno foram encontrados no trecho médio do Monjolinho, latitude: 22°02’21”S, longitude: 47°91’40”W nas respectivas concentrações de 18,0 ng/L e 4,1 ng/L. O atrativo do método desenvolvido consiste no baixo volume de água necessário para as análises e o baixo volume de solventes produzido para descarte. Os quatro parabenos foram quantificados na matriz nativa com tempo de corrida cromatográfica de 9,5 min.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Several species of Phyllanthus genus are widely used in popular medicine, even though very few phytochemical reports on species such as: P. caroliniensis, P. stipulatus and P. tenellus are found in the literature. Furthermore, the official reference quality control methods, especially those related with authenticity assessment, are nonspecific for the species under analysis. Thereby, this work reports on the online chemical characterization of the ethanolic extract of six Phyllanthus species by liquid chromatography hyphenated to mass spectrometry (LC-MS) and liquid chromatography hyphenated to nuclear magnetic spectroscopy using automated solid phase extraction system, as interface (LC-SPE-NMR). The chapter 2 discusses the classification of commercial Phyllanthus samples acquired from different establishments in several Brazilian municipalities. The identification of various chemical markers from authentic samples of each species allowed the classification of commercial samples. The obtained results showed that they were misused, in spite of their labels nominating them as P. niruri, the majority of the tested samples were P. tenellus. None was classified as P. niruri. Chapter 3 discusses the use of statistical models for the chromatographic method development and also for the handling of MS data. Development of the method was carried out by experimental design furnishing chromatographic runs with short analysis time and high number of chromatographic bands. Statistical analysis using principal component analysis (PCA) allowed the unmistakable differentiation of species and pointed out to several of compounds responsible for this. Through the interpretation of the MS/MS data, using the mass analyzers QqToF and IT-MS, 22 compounds had their chemical structure elucidated, some of which have never been reported in the literature. Chapter 4 describes the results obtained by LC-SPE-NMR for the unequivocal structural elucidation of the secondary metabolites of the ethanolic extract of P. tenellus. The use of automated SPE interface facilitated the isolation of the compounds of interest, eliminating the need of using semi-preparative chromatography. The interpretation of NMR spectra enabled the identification of 9 compounds confirming the structures inferred by LC-MS. Diversas espécies pertencentes ao gênero Phyllanthus são amplamente empregadas na medicina tradicional, mesmo assim poucos trabalhos são reportados na literatura para algumas espécies como: P. tenellus, P. caroliniensis e P. stipulatus. Ademais, os métodos oficiais de controle de qualidade, especialmente os relacionados a autenticidade vegetal, são pouco específicos para as espécies em análise. Desse modo, este trabalho reporta a caracterização química “online” de extratos etanólicos de seis espécies de Phyllanthus por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS) e cromatografia líquida hifenada a ressonância magnética nuclear utilizando sistema automatizado de extração em fase sólida como interface (LC-SPE-NMR). O capítulo 2 discute a classificação de amostras comerciais de Phyllanthus adquiridas em diversos municípios brasileiros. A identificação de diversos marcadores químicos a partir de amostras autênticas de cada espécie possibilitou a classificação das amostras comercias. Os resultados obtidos demonstraram que estas são empregadas incorretamente, em discordância com o especificado em seus rótulos que as classificavam como P. niruri, a maioria das amostras avaliadas eram P. tenellus. Nenhuma foi classificada como P. niruri. O capítulo 3 discute o uso de métodos estatísticos tanto no desenvolvimento do método cromatográfico quanto no tratamento dos dados de MS. O desenvolvimento do método foi realizado por meio de planejamento experimental resultando em método rápido e com elevado número de bandas cromatográficas. A análise estatística utilizando modelo de análise de componentes principais (PCA) permitiu a inequívoca diferenciação das espécies e apontou para dezenas de compostos responsáveis por tal. Através da interpretação dos dados de massas utilizando os analisadores de massas QqToF e IT, 22 compostos foram identificados, alguns dos quais nunca relatados na literatura. O capítulo 4 descreve os resultados obtidos por LC-SPE-NMR para identificação inequívoca de metabólitos secundários presente no extrato etanólico de P. tenellus. A utilização de interface automatizada de SPE facilitou o isolamento dos compostos de interesse, eliminando a necessidade de utilização de cromatografia semipreparativa. A interpretação dos espectros de NMR possibilitou a identificação de 8 compostos confirmando as estruturas postuladas por LC-MS. FAPESP: 2011/11021-3

Orientador: Ana Valéria Colnaghi Simionato Cantú Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: O prognóstico precoce das neoplasias malignas se tornou um dos maiores desafios da medicina moderna, pois permite que as intervenções e terapias efetivas possam contribuir para a redução da mortalidade e morbidade por câncer. Os nucleosídeos têm sido pesquisados como um grupo potencial de biomarcadores tumorais presentes em diversos fluidos biológicos. Porém, são disponibilizadas poucas informações sobre a quantidade dos nucleosídeos presentes em soro sanguíneo de indivíduos com diferentes neoplasias, principalmente sobre o câncer de pâncreas. Dessa forma, foram analisados oito nucleosídeos em soro sanguíneo de indivíduos saudáveis e com câncer (pâncreas e próstata) para avaliar a capacidade discriminante entre os grupos. A quantificação foi realizada em um HPLC-MS/MS com precipitação prévia das proteínas do soro sanguíneo com solvente orgânico, sem extração por fase sólida (SPE). O nucleosídeo timidina não apresentou sinal detectável em nenhuma das amostras de saudáveis ou doentes (abaixo do limite de detecção) e os nucleosídeos adenosina, 2-deoxiadenosina e inosina, apresentaram sinais abaixo do LQ, inviabilizando a quantificação em amostras reais. Para os demais nucleosídeos (uridina, 5-metiluridina, guanosina e xantosina) foi realizado o processo de validação, apresentando linearidade, precisão e exatidão de acordo com o órgão legislador. Após a validação, os nucleosídeos foram quantificados nas amostras de soro sanguíneo de 57 indivíduos saudáveis, 57 com câncer de pâncreas e 57 com câncer de próstata, sendo submetidos a análises estatísticas. Ao avaliar a concentração dos nucleosídeos em uma determinada população através da diferenciação entre os estados patológicos (doentes) e normais (saudáveis), foi possível observar as discriminações do grupo saudável em relação aos doentes, com maiores medidas de sensibilidade (96,5 %), especificidade (97,4 %), VPP (94,8 %), VPN (98,2 %) e acurácia (96,9 %) em relação aos métodos usualmente utilizados no diagnóstico de câncer de pâncreas (CA 19.9) e próstata (PSAt). No entanto, a discriminação entre os dois tipos de câncer (próstata e pâncreas) não foi aparente. Desta forma, embora não tenha sido observada uma discriminação distinta entre os grupos câncer, assim como um biomarcador especifico de cada tipo de neoplasia, foi possível diferenciar as amostras dos indivíduos com câncer e saudáveis, sendo possível utilizar a quantificação dos nucleosídeos no acompanhamento das terapias e intervenções realizadas, além de auxiliar nos exames rotineiramente utilizados, de forma a evitar resultados falso-positivos ou falso-negativos Abstract: Early prognosis of malignant neoplasms has become one of the greatest challenges of modern medicine because it allows interventions and effective therapies can contribute to reducing mortality and morbidity from cancer. The nucleosides have been studied as a potential pool of tumor biomarkers present in various biological fluids. But they are provided little information about the amount of nucleoside present in blood serum of patients with different malignancies, particularly of pancreatic cancer. Thus, eight nucleosides were analyzed in serum from healthy individuals and cancer (pancreas and prostate) to evaluate the discriminating power between groups. Quantitation was performed on a HPLC-MS / MS with prior precipitation of the serum proteins with the organic solvent without solid phase extraction (SPE). The thymidine nucleoside did not show any detectable signal in the samples from healthy patients or patients (below detection limit) and the nucleosides adenosine, 2-deoxyadenosine and inosine presented below LOQ signals, preventing the measurement of actual samples. For other nucleosides (uridine, 5-methyluridine, guanosine and xanthosine) was performed the validation process, with linearity, precision and accuracy according to the legislator. After validation, the nucleosides were measured in serum samples from 57 healthy subjects, 57 with pancreatic cancer and 57 with prostate cancer and submitted to statistical analysis. In assessing the concentration of the nucleoside in a given population by differentiating between pathological conditions (patients) and normal (healthy), we observed discrimination healthy group compared to patients with higher sensitivity measures (96.5%), specificity (97.4%), PPV (94.8%), VPN (98.2%) and accuracy (96.9%) compared to the methods commonly used in the diagnosis of pancreatic cancer (CA 19.9) and prostate (PSAT). However, discrimination between the two types of cancer (prostate and pancreas) was not apparent. Thus, although it was not observed a distinct discrimination between cancer groups, as well as a specific biomarker of each type of cancer, it was possible to differentiate the samples of individuals with cancer and healthy, and you can use the quantification of nucleosides in the monitoring of therapies and interventions, and help in the tests routinely used in order to avoid false-positive or false-negative results Doutorado Química Analítica Doutora em Ciências CAPES

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) The presence of drugs in the environment is an important issue in environmental risk assessment. The fluoroquinolones represent a class of compounds widely used in human and veterinary medicine, and its apport in the environment is continuous and lacking of monitoring. In this scope, it is important to evaluate the levels of these compounds in the environment and their toxicological impact on aquatic organisms. The present study discuss the development and validation of analytical methods for direct injection of samples using liquid chromatography coupled to mass spectrometry for multiresidual determination of fluoroquinolones in effluents of São Carlos – SP, and toxicity tests of ciprofloxacin (CIP) on fish. For monitoring of effluent samples, six fluoroquinolones were evaluated: CIP, gemifloxacin, moxifloxacin, ofloxacin, enrofloxacin, and norfloxacin (NOR). In effluent samples from wastewater treatment plant, CIP and NOR were quantified at concentrations of 195 ng L-1 and 270 ng L-1, respectively. Toxicity studies of CIP in species of O. niloticus exposed to different concentrations (0.5, 1.0 and 5.0 μg L-1) for periods of 7 and 14 days were evaluated by enzymatic and non-enzymatic systems. The biochemical assays demonstrated that fishes were not able to perform the detoxification, which was evidenced by the severe damage in their cells, especially on the gills and liver of the fishes. In vitro studies were carried out in species of O. mykiss, evaluating the biotransformation and bioaccumulative potential of some drugs commonly used in fish farms, including fluoroquinolones. The results using this in vitro model corroborate to the understanding of similarities and differences among different species of fish, as well as the assessment of environmental impact due to these compounds present in the environment. A presença de fármacos no meio ambiente é uma importante questão na avaliação de impactos ambientais. As fluoroquinolonas (FQs) representam uma classe de compostos amplamente utilizada na medicina humana e veterinária, e seu aporte no ambiente é contínuo e ausente de monitoramento. Diante deste panorama, é importante a avaliação dos níveis destes compostos, bem como o impacto toxicológico em organismos aquáticos. O presente trabalho discute o desenvolvimento e validação de métodos analíticos, por injeção direta de amostras usando a cromatografia líquida hifenada ao espectrômetro de massas, para a determinação multiresidual de FQs, em efluentes do município de São Carlos – SP, a para ensaios de toxicidade do ciprofloxacino (CIP) em peixes. Para o monitoramento em efluentes, seis FQs foram avaliadas: CIP, gemifloxacino, moxifloxacino, ofloxacino, enrofloxacino, e norfloxacino (NOR). As FQs não foram encontradas nos 4 pontos de coleta ao longo do Monjolinho, mas em amostras de influente da estação de tratamento de esgoto de São Carlos foram quantificadas a CIP (195 ng L-1) e a NOR (270 ng L-1). Foram feitos ensaios de estresse oxidativo, por avaliação de sistemas enzimáticos e não enzimáticos em espécie O. niloticus, expostos ao CIP em diferentes concentrações (0,5, 1,0 e 5,0 μg L-1) em períodos de 7 e 14 dias. Estes ensaios bioquímicos demonstraram que o organismo do peixe não foi capaz de realizar a detoxificação, evidenciado pelos danos severos ocorridos à níveis celulares, principalmente nas brânquias e fígado. Frações S9 de fígado de trutas (O. mykiss) foram utilizadas a fim de avaliar a biotransformação e o potencial bioacumulativo de alguns fármacos comumente utilizados em pisciculturas. Os resultados obtidos com o modelo in vitro corroboram para o entendimento das similaridades e diferenças entre as espécies de peixes, e também para a avaliação do impacto ambiental causado por estes compostos presentes no meio ambiente. FAPESP: 2010/19000-2

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Angiotensin converting enzyme 1 (ACE1) is a dipeptidyl carboxypeptidase that converts angiotensin I (decapeptide) to a vasoconstrictor octapeptide angiotensin II. Thus, ACE presents an important role in blood pressure regulation. There are many synthetic commercially available ACE inhibitors such as captopril, lisinopril and enalapril. Due to their side effects, naturally occurring inhibitors have been prospected. In order to endorse this research field we have developed a new tool for ACE ligand screening. To this end, ACE was extracted from bovine lung, purified and chemically immobilized in modified ferrite magnetic beads (ACEMBs). The ACE-MBs have shown a Michaelian kinetic behavior towards hippurylhistidyl- leucine (HHL) and was also able to catalyze the conversion of angiotensin I to angiotensin II. Moreover, as proof of concept, the ACE-MBs was inhibited by lisinopril with an IC50 of 10 nM. At the fishing assay, ACE-MBs were able not only to fish out the reference inhibitor, but also three peptides from a pool of tryptic digested BSA. ACE-MBs emerge as new straightforward tool for ACE kinetics determination, inhibition and binder screening. Enzima conversora de angiotensina 1 (angiotensin converting enzyme 1, ACE1) é uma dipeptidil carboxipeptidase que catalisa a reação para conversão da angiotensina I, um decapeptídeo inativo, para angiotensina II, um octapeptídeo vasoconstritor. Assim, a ACE1 exerce um papel essencial na regulação da pressão arterial e tratamento de hipertensão. Existem diversos inibidores de ACE1 sintéticos disponíveis comercialmente, como captopril, lisinopril e enalapril. No entanto, o uso contínuo desses fármacos pode causar diversos efeitos adversos como falência renal, hipotensão e hipercalemia. Devido a isso, inibidores de ACE1 de origem natural tem sido prospectados. Com o objetivo de contribuir para esse campo de pesquisa, neste trabalho foi desenvolvido uma ferramenta para a busca de ligantes de ACE1. Para isso, a ACE1 foi extraída de pulmão bovino e subsequentemente purificada com o auxílio de filtros de exclusão por tamanho e mais duas etapas de cromatografia de afinidade. Para acompanhar o processo de purificação, ensaios de atividade utilizando o substrato sintético hipuril-histidil-leucina (HHL) foram estabelecidos, e foi desenvolvido um método cromatográfico para suas análises, através do monitoramento do ácido hipúrico (HA), produto da reação catalisada. Após a sua purificação, a ACE foi quimicamente imobilizada em partículas nanomagnéticas (NMB-ACE), que permitiu a realização de ensaios enzimáticos para a sua caracterização, obtendose um comportamento michaeliano para o substrato HHL. Além disso, a especificidade do reator enzimático foi testado frente a seu substrato natural e testes de inibição com o lisinopril foram realizados, obtendo um valor de IC50 próximo ao encontrado para a enzima livre. Por fim, a seletividade do reator enzimático foi avaliada pelo ensaio de bioconjugação, resultando na pesca de 3 peptídeos presente em uma mistura de mais de 100 peptídeos. Sendo assim, os estudos apresentados nesse trabalho confirmam o estabelecimento do NMB-ACE como uma ferramenta para a busca de ligantes de ACE em misturas complexas.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) The derivatization of organocatalysts with functional appendages suitable to anchor onto solid supports is usually achieved by stepwise syntheses. As an alternative to such a strategy, this work describes a one-pot approach to silylated prolyl-peptide catalysts by a multicomponent reaction that enables the simultaneous incorporation of the catalytic and the heterogenizable (triethoxysilane) moieties. A microreactor with high catalytic efficacy and reproducibly in the conjugate addition of aldehydes to nitroolefins was obtained by grafting onto HPLC-grade silica (10 μm) and packing into a column with a selected catalyst. A 3 D continuous-flow system that includes the on-line monitoring of the reaction outcome was set up. For that, the microreactor was coupled to a chromatographic column for the separation of the remaining substrates from the Michael adduct in the second dimension, followed by a chiral polysaccharide column for the analysis of conversion and stereoselectivity. This approach represents a new instrumental setup that combines the advantages of multidimensional chromatography and flow catalysis. A derivação de Organocatalisadores com apêndices funcionais adequados para ancorar em suportes sólidos é geralmente obtida por síntese “passo a passo”. Como uma alternativa para tal estratégia, este trabalho descreve uma abordagem de síntese one-pot de catalisadores prolil-peptio sililados através de uma reação multicomponentes, que permite a incorporação simultânea do sítio catalítico e o grupo funcional de ancoragem (trietoxisilano). Um micro-reactor foi obtido, tendo elevada eficácia catalítica e reprodutibilidade, na adição conjugada de aldeídos a nitro-olefinas, enxertando sobre sílica de grau HPLC (10 um) e preenchendo uma coluna com um catalisador escolhido. Um sistema de fluxo contínuo 3D que inclui a monitoração em linha do resultado da reação foi ajustado para cima. Para isso, o micro-reator foi acoplado a uma coluna cromatográfica para a separação dos substratos restantes do aduto de Michael na segunda dimensão, seguido por uma coluna de polissacarídeo quiral para a análise de conversão e estereosselectividade. Essa abordagem representa uma nova configuração do instrumento que combina as vantagens de cromatografia multidimensional e reações catálisadas em fluxo.

Made available in DSpace on 2017-07-21T14:42:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigo Moreira Caetano Pinto.pdf: 2408271 bytes, checksum: dd930813a70ef7a000eb483899333bfd (MD5) Previous issue date: 2014-02-24 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The use of natural products with therapeutic or nutraceutical purposes is growing in the brazilian society, due the easily access to this. However, the indiscriminate use or use of wrongly identified species represent a risk of the user. Thus, phytochemical and pharmacological studies, and the development of analytical methods to the quality control of these products are important actions to ensure the reliability of them. Thus, it is necessary a consistent quality evaluation of vegetal raw materials, that endorse its identity and quality. The erva-mate (Ilex paraguariensis A.St.-Hil. - Aquifoliaceae) is a south brazilian native specie, heavily consumed as stimulant drink. This plant have presented a great economic value as raw material, due the growing interest of the cosmetic and pharmaceutical industries, mainly arising the stimulant, antioxidant and lipolytic potential. The high performance liquid chromatography (HPLC) is a fast and efficient method to the qualitative and quantitative evaluation of medicinal plants and its extracts. The development of analytical methods to quality control of these materials is a necessary action for the pharmaceutical, cosmetic and food industries. To the industries, the Quality by Design approach – that proposes the creation of a design of experiments (DOE) that evaluate simultaneously many relevant factors to the separation efficiency – is an alternative to the classic optimization of HPLC methods, because allows the efficient evaluation of more variables in a short time. In this sense, the aim of this work was realize a factorial study (QbD-DOE) of the main variables that may affect the optimization of a chromatographic method to vegetal extracts, and proposes the development of an analytical method. Were analyzed many relevant factors to the resolution of the chromatographic bands. In a first step, were evaluated the stationary phase, pH range, organic modifier type and the gradient time. In a second stage, was evaluated de pH value, final % of organic modifier, temperature and flow rate. The developed method was used to the evaluation of chemical characteristics of seven commercial samples of erva-mate obtained in the market of Ponta Grossa. The fingerprint was employed in a chemometric study, that allowed classify the samples according the chemical profiles, arising of plantation place, processment and extractor solvent. Yet, the obtained chromatographic run enabled the quantitative analysis of three chemical markers (chlorogenic acid, caffeine and theobromine). The contents of the markers founded by the validated method in the evaluated samples were different between aqueous (A) and hydroethanolic (H) extracts, due the differences on extraction potential of these solvents/procedures. The biggest content of caffeine were founded in the sample 5 (92.7 mg/100 g of dry leaves (A) and 349.19 mg/100g (H)). The same sample presented the least content of theobromine, in hydroethanolic extract (45.88 mg/100g), probably because the both xanthines are sourced of the same biosynthetic route. The chlorogenic acid were founded in highest proportion in the sample 2 (388.15 mg/100g (H) and 110.42 mg/100g (H)). The findings of this study reinforce the use of liquid chromatography as an analytical method, that associated to statistical tools may increase the strategies of erva-mate quality control, as vegetal raw material. A utilização de produtos naturais com fins terapêuticos ou nutracêuticos é crescente na sociedade brasileira devido à facilidade de acesso a estes. Entretanto o uso indiscriminado ou sem uma correta identificação da espécie vegetal que se está utilizando pode se apresentar como um risco ao usuário. Desta forma estudos fitoquímicos, farmacológicos e principalmente o desenvolvimento de métodos analíticos de controle da qualidade destes produtos e seus extratos se constituem em ações importantes para se garantir a confiabilidade dos mesmos. Desta forma, é necessário que a avaliação da qualidade de matérias-primas vegetais seja consistente e respalde sua identidade e qualidade. A erva-mate (Ilex paraguariensis A.St.-Hil. - Aquifoliaceae) é uma espécie vegetal nativa do sul do Brasil, muito consumida como bebida estimulante e vem se apresentando como uma matéria prima de grande valor econômico devido ao crescente interesse das indústrias de medicamentos, cosméticos e alimentos em decorrência principalmente do seu potencial antioxidante, estimulante e lipolítico. A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é um método rápido e eficiente para a avaliação qualitativa e quantitativa de plantas medicinais e seus extratos e o desenvolvimento de métodos analíticos para avaliação da sua qualidade se constitui em uma ação necessária a ser empregada no controle de qualidade de indústrias farmacêuticas, cosméticas e alimentícias. Para as indústrias, a abordagem Quality by Design – que propõe a criação de um desenho experimental que avalia simultaneamente múltiplos fatores relevantes para a eficiência da separação – se constituí em uma alternativa de estudo à otimização clássica de métodos por CLAE, pois permite que mais variáveis sejam avaliadas em um menor tempo e com maior eficiência. Desta forma, foi objetivo deste trabalho realizar um estudo fatorial das principais variáveis que podem interferir na otimização de um método cromatográfico para extratos vegetais e assim propor o desenvolvimento de um método analítico. Num primeiro momento, foram avaliadas a fase estacionária, faixa de pH, tipo de modificador orgânico e o tempo de corrida. Numa segunda etapa, foram avaliados o valor exato de pH, a concentração final do modificador orgânico, a temperatura e o fluxo. O método desenvolvido foi utilizado para avaliação das características químicas de sete amostras comerciais de erva mate obtidas no comércio da cidade de Ponta Grossa. O cromatograma fingerprint foi utilizado para a realização de um estudo quimiométrico que permitiu classificar as amostras quanto a semelhanças e diferenças químicas decorrentes da região de plantio, procedimento de processamento empregado e solvente extrator usado. Ainda, a corrida cromatográfica obtida possibilitou avaliação quantitativa de três marcadores químicos (ácido clorogênico, cafeína e teobromina). Os teores dos marcadores encontrados nas amostras avaliadas, através do método cromatográfico validado variaram entre as amostras de extrato aquoso (A) e hidroalcoólico (H), devido à diferença de potencial extrativo entre esses solventes/procedimentos. O maior teor de cafeína foi encontrado na amostra 5 (92, 7 mg/100 g de folhas secas (A) e 349,19 mg/100g (H)). A mesma amostra apresentou o menor teor de teobromina no extrato hidroalcoólico (45,88 mg/100g), provavelmente porque as duas xantinas dividem a mesma rota de biossíntese. O ácido clorogênico foi encontrado em maior proporção na amostra 2 (388,15 mg/100g (H) e 110,42 mg/100g (A)). Os achados deste estudo reforçam o uso da cromatografia líquida, como um método analítico que associado a ferramentas estatísticas possibilitam incrementar as estratégias de controle de qualidade da erva-mate enquanto matéria-prima vegetal.

Universidade Federal de Minas Gerais This work describes the results obtained from studies carried out to quantify phenyl-β-D-glucuronide (FG) and nitrophenyl-β-D-glucuronide (NFG) in human urine by direct injection sample using LC-MS/MS system. The columns RAM-BSA SAX and RAM-BSA C8 were prepared and evaluated in relation to their exclusion capability of urine macromolecules and retention capability of FG by direct injection samples. Both columns presented good retention capability for glucuronide, however, the RAM-BSA SAX column was more efficient in exclusion since this column did not have any interferences eluting after the exclusion time. However, the RAM-BSA SAX column can not be used for FG quantification by LC-MS/MS because the chromatographic condition of this column presented high buffer concentration (40 mM ammonium formate), which resulted in total suppression of the FG signal. Therefore, the column RAM-BSA C8 was selected for the development of the methods. In this study we evaluated triple quadrupole (QqQ) and ion trap (IT) mass spectrometry for both selected glucuronides. It was not possible to obtain selectivity in the analytical conditions developed using UHPLC-QqQ. When we used the IT analyzer, we obtained selectivity in a multidimensional mode for the FG using the column RAM-BSA C8 in the first dimension and the column Ascentis Express F5 in the second dimension. For the NFG we achieved selectivity in a unidimensional mode. The figures of merit obtained with external standarization calibration curve with spiked pooled urines were accurate and precise. For FG, the LQ and LD were 1.0 μg/mL and 0.5 μg/mL, respectively, and to NFG, the LQ and LD were 4.0 μg/mL and 3.0 μg/mL. For the method application we adopted calibration by standard addition to minimize the individual differences between urine donors. To all six toxicological samples analyzed, just one exceeded the regulatory limits for urinary phenol. For NFG, there were no toxicological samples available, thus the method was applied in spiked samples in the laboratory. Este trabalho descreve os resultados obtidos nos estudos feitos para quantificar fenil-β-D-glucuronídeo (FG) e nitrofenil-β-D-glucuronídeo (NFG), em urina humana por injeção direta de amostra, utilizando-se sistemas LC-MS/MS. Para injeção direta de amostras, as colunas RAM-BSA SAX e RAM-BSA C8 foram preparadas e avaliadas em relação à capacidade de exclusão das macromoléculas da urina e à capacidade de retenção do FG. Ambas as colunas apresentaram boa capacidade de retenção para o glucuronídeo, no entanto, quanto à exclusão, a coluna RAM-BSA SAX mostrou-se mais eficiente, visto que nesta coluna não houve eluição de interferentes, após o tempo de exclusão. Porém, a coluna RAM-BSA SAX não pode ser utilizada para a quantificação de FG por LCMS/ MS, pois as condições cromatográficas estabelecidas para esta coluna envolveram alta concentração de tampão (formiato de amônio 40 mM), o que acarretou na supressão total do sinal referente ao FG. Portanto, a coluna RAMBSA C8 foi selecionada para o desenvolvimento dos métodos. Neste trabalho avaliaram-se os analisadores do tipo triplo quadrupolo (QqQ) e ion trap (IT) para ambos os glucuronídeos estudados. Nas condições analíticas desenvolvidas utilizando-se UHPLC-QqQ, não foi possível se obter seletividade. Quando o IT foi utilizado como analisador, a seletividade foi obtida no modo multidimensional para o FG, utilizando-se a coluna RAM-BSA C8 na primeira dimensão e a coluna Ascentis Express F5 na segunda dimensão, e no modo simples para o NFG. As figuras de méritos obtidas por padronização externa, a partir de uma curva construída fortificando-se um pool de urinas, foram exatas e precisas, com LQ de 1,0 μg/mL e LD de 0,5 μg/mL, para FG, e LQ de 4,0 μg/mL e LD de 3,0 μg/mL, para o NFG. Para aplicação dos métodos, a calibração por adição de padrão foi adotada para contornar as diferenças individuais entre as urinas dos doadores. Das seis amostras toxicológicas analisadas, uma amostra ultrapassou o valor de referência da normalidade para fenol urinário. Para o NFG, na ausência de amostras toxicológicas, o método foi aplicado em amostras-padrão preparadas no laboratório.

This work describes for the first time an isocratic method in a single analytical run to quantify deacetyl iodixanol (iodixanol related compound C), iopentol (iodixanol related compound D) and cyclized iodixanol (iodixanol related compound E), as impurities in iodixanol. Iodixanol is a drug substance, dimeric, nonionic, water-soluble, used as a radiographic contrast medium, which is administered by intravascular injection. The impurities A and B were not evaluated in this work, since they are not commercially available as standards. The method was also validated for the quantitative assay, since there is no chromatographic method described in the current USP compendium for the assay. The impurities can be formed during the synthesis process of iodixanol, and it is important to quantify them due to their related toxicity. In this work, the reverse and hydrophilic interaction (HILIC) modes of elution were evaluated. The hydrophilic elution mode was selected due to good efficiency and selectivity. In both modes of elution, columns having the technology fused-core were used, since they demonstrate high efficiency due to their better mass transfer in comparison to conventional HPLC columns. The chromatographic separation was carried out on a kinetex® HILIC column (150 x 4.6 mm; 2.6 μm) at 20 °C using acetonitrile-formic acid (pH 3.2; 1.0 mmol L-1) (92:08, v/v) at a flow rate of 0.8 mL/min. The compounds were monitored at 243 nm and the total time of analysis was 45 min. The method was validated in accordance with the current ICH guidelines for determination of impurities which include selectivity, linearity, accuracy, precision, limits of quantification and detection and robustness. The limits of quantification (LOQ) were 0.479; 0.0606 and 0.133 μg/mL for the impurities C, D and E, respectively. Furthermore, the validated methods were tested in iodixanol samples. The test results of the analyses of impurities and assay in those samples are presented and discussed accordingly. Este trabalho descreve pela primeira vez um método isocrático em uma única corrida analítica para quantificação das impurezas deacetil iodixanol (iodixanol composto relacionado C), iopentol (iodixanol composto relacionado D) e iodixanol ciclizado (iodixanol composto relacionado E) na matéria-prima iodixanol. Iodixanol é um composto dímerico, não-iônico, solúvel em água, usado para contraste para raios X com administração intravascular. As impurezas A e B não foram avaliadas neste trabalho, uma vez que não existem padrões disponíveis comercialmente dos mesmos. O método também foi validado para a quantificação de teor, uma vez que não existe método cromatográfico descrito no compêndio atual da USP para o teor. Estas impurezas podem ser formadas durante a síntese do iodixanol, e a importância da quantificação destas está relacionada à toxicidade. Neste trabalho foram avaliados os modos de eluição reverso e por interação hidrofílica (HILIC). O modo HILIC foi o selecionado, pois ofereceu boa eficiência cromatográfica com boa seletividade. Em ambos os modos, o uso de colunas de tecnologia fused-core foi empregado, por apresentar alta eficiência devido à sua melhor transferência de massa em comparação com as colunas analíticas convencionais. A separação cromatográfica foi conduzida utilizando-se a coluna analítica kinetex® HILIC (150 x 4,6 mm; 2,6 μm) a 20 °C e acetonitrila ácido fórmico (pH 3,2; 1,0 mmol L-1) (92:08, v/v) com 0,8 mL/min de vazão. Os compostos foram monitorados a 243 nm e o tempo total de análise foi de 45 min. Os métodos foram validados em acordo com as recomendações atuais do ICH para a determinação de impurezas, nas quais incluem seletividade, linearidade, exatidão, precisão, limites de quantificação e de detecção, e robustez. Os limites de quantificação foram de 0,479; 0,0606 e 0,133 μg/mL para as impurezas C, D e E, respectivamente. Deste modo, os métodos validados foram aplicados em amostras de iodixanol. Os resultados para a análise de impurezas e teor nestas amostras são, portanto, apresentados e discutidos.

Universidade Federal de Sao Carlos The development of ligand screening assays plays a very important role in the discovery of biologically active compounds. In this context, the use of immobilized capillary reactors has been adopted as a new technique for high throughput screening assays, which furnishes high selectivity, reproducibility. This work describes the covalent immobilization of electric fish (Electrophorus electricus) and human acetylcholinesterases (AChE) on fused silica capillaries and magnetic beads. The selected enzyme acts on the central nervous system and is a validated target for the treatment of Alzheimer s disease as for new insecticides. Zonal chromatography with the acetylcholinesterase capillary bioreactors was employed to determine kinetics constants, to a ligand screening assay of 79 compounds, and to inhibition mechanisms determination of the 05 identified ligands. A new approach to the screening of natural product extracts was developed based on ligand fishing experiments and zonal chromatography. For that, the magnetic beads were used for the ligand fishing experiments and capillary bioreactors for the activity assays. The later was employed also under nonlinear condition to determine the affinity constant of the fished ligand. This work reports also the identification by a solution assay of a new acetylcholinesterase substrate and, the studies by zonal bioaffinity chromatography to identify the bi-substrate mechanism. O desenvolvimento de ensaios para a triagem de ligantes é de grande importância para a descoberta de compostos biologicamente ativos. Neste contexto, o emprego de biorreatores enzimáticos tem sido adotado em ensaios em massa para triagem de ligantes, uma vez que possuem elevada seletividade com alta reprodutibilidade e produtividade. Este trabalho descreve a imobilização covalente da acetilcolinesterase de peixe-elétrico (Electrophorus electricus) e humana em capilares de sílica fundida e partículas magnéticas. A enzima selecionada justifica-se uma vez que atua no sistema nervoso central e é um alvo validado para o tratamento da doença de Alzheimer e desenvolvimento de inseticidas. Os biorreatores capilares de acetilcolinesterase foram empregados por cromatografia zonal para determinação das constantes cinéticas, e também para a triagem de 79 compostos com determinação do mecanismo de ação dos 05 ligantes identificados. Um novo modelo de triagem de extratos de produtos naturais foi desenvolvido usando os biorreatores de partículas magnéticas para pescar ligantes e os biorreatores capilares para determinar o percentual de atividade. O uso dos biorreatores capilares em cromatografia zonal não-linear permitiu caracterizar a afinidade do ligante selecionado. Este trabalho reporta também, um novo substrato identificado através de ensaios em solução para a acetilcolinesterase e, os estudos por cromatografia zonal de bioafinidade, para o mecanismo bi-substrato.

Universidade Federal de Sao Carlos This work reports the application of bioanalitycal methods by direct injection sample for the quantification of drugs in breast milk. Columns with stationary phase type RAM-BSA, in conventional scale and microbore, were prepared and evaluated in the exclusion of total protein and human milk oligosaccharides. In the conventional scale, the RAM-BSA C18 column (4.6 mm id) was used in a single-column mode for cleanup and simultaneous quantification of carbamazepine and its major metabolite, employing an analyzer of the type ion trap. Selectivity, extraction efficiency, accuracy and precision were achieved employing 100 μL of the sample, without preparation, with detection limits of 20.0 ng/mL for CBZ and 40.0 ng/mL for CBZE. The developed method was validated and applied to analyze breast milk samples from one nursing mother. CBZ and CBZE were quantified in the concentrations of 2.26 μg/mL and 1.54 μg/mL, respectively. To our knowledge, this is the first report on the simultaneous determination of CBZ and its active metabolite by direct injection of human milk serum. The method for quantification of fluoxetine and norfluoxetine by direct injection of nature human milk employing a liquid chromatography tandem mass spectrometry system was performed in a multidimensional system with total analysis time of 12 min. The chromatographic system was configured using a RAM-BSA C18 (2.1 mm, i.d.) column in the first dimension that was able to excluded 94% of proteins. A fused core column was used in the the second dimension as analytical column. Selectivity, extraction efficiency, accuracy and precision were achieved employing 10 μL of the sample, without sample clean-up, with quantification limits of 3.0 ng/mL and 4.0 ng/mL for FLU and NOR, respectively. O presente trabalho reporta a aplicação de métodos bioanalíticos com injeção direta de amostra para a quantificação de fármacos no leite materno. Colunas contendo fase do tipo RAM-BSA, em escala convencional e microbore, foram preparadas e avaliadas na exclusão de proteínas totais e oligossacarídeos de leite materno. Na escala convencional, a coluna RAM-BSA C18 (4,6 mm d.i.) foi utilizada no modo simples de análise para clean-up e quantificação simultânea de carbamazepina e do seu metabolito principal, empregando-se um analisador do tipo ion trap. Seletividade, eficiência de extração, a exatidão e precisão foram obtidos, injetandose 100 μL de amostra sem pré-tratamento. Foram alcançados limites de detecção de 20,0 ng/mL para CBZ e 40,0 ng/mL para ECBZ. O método desenvolvido foi validado e aplicado para a análise de uma amostra de leite materno de uma mãe em tratamento com carbamazepina. Ambos, CBZ e CBZE, foram quantificados nas concentrações de 2,26 μg/mL e 1,54 μg/mL, respectivamente. Para nosso conhecimento, este é o primeiro trabalho sobre a determinação simultânea de CBZ e seu metabólito ativo por injeção direta de leite materno. O método para a quantificação de fluoxetina e norfluoxetina por injeção direta de leite materno utilizando um sistema de 2D LC-MS foi desenvolvido com um tempo total de análise de 12 minutos. O sistema cromatográfico foi configurado usando uma coluna RAM-BSA C18 (2,1 mm d.i.), na primeira dimensão, que foi capaz de excluir 94% de proteínas. Uma coluna do tipo fused core foi utilizada na segunda dimensão, como coluna analítica. Seletividade, eficiência da extração, exatidão e precisão foram obtidos com a injeção de apenas 10 μL de amostra, sem pré-tratamento. Os limites de quantificação conseguidos foram de 3,0 ng/mL e 4,0 ng/mL para FLU e NOR, respectivamente.

Universidade Federal de Minas Gerais Different types of preparative chromatography techniques were applied to the enantiomeric purification of a series of chiral drugs. The efficiency of multicolumn chromatography with variable zones (VARICOL®) process and also the application for the resolution of drugs modafinil, atenolol and albendazole sulfoxide were investigated and is fully discussed in this work. The initial conditions for the separations were determined by theoretical simulation, using the software HELP 10.3 by Novasep®. For the modafinil separation, different feed concentrations were evaluated for the same zone distribution and period. The most efficient process provided 96.0% of enantiomeric purities for both enantiomers with a production rate of 2.24 g/dia. The enantiomers of albendazole sulfoxide were separated by the VARICOL® process, and the enantiomeric purities obtained were of 99.5% and 99.0% for rafinate and extract, respectively, with a production rate of, approximately, 2.0 g/dia. For both developed method, the mobile phase used was exclusively methanol, which was recovered around 95 %. Atenolol was efficiently enantiorresolved by CHIRALCEL OD®, however, the enantiomers were not obtained with high purities by the VARICOL® process due to their low solubility in the mobile phase and the high cycle time. This work describes also, for the first time, the absolute configuration of albendazole sulfoxide as (−)-(S) and (+)-(R)- enantiomers.To this end, vibrational circular dichroim and theoretical calculations were applied. The albendazol sulfoxide enantiomers were used for In Vitro tests against Taenia Solium cysts, the macroscopic, the microscopic and the biochemical behavior for the cysts were evaluated; (+)-(R)-albendazole sulfoxide was the enantiomer with the highest anthelmintic effect. Elution chromatography was used for the resolution of 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA) and omeprazole. MDMA was separated by the use of recycling in mass overload conditions, enantiomeric purities of 99.0% and 96.0% were obtained for (R)-(-)- and (S)-(+)- MDMA, respectively, with production rate of 40.0 mg/mL. Racemic MDMA and both enantiomers were used to evaluate oxidative stress status parameters. The enantiomers showed distinct effects in the liver redox state with the (R)-(−)- enantiomer being the responsible for the highest oxidative damage. For omeprazole separation, stack injections with mass overload was used, a production rate of 1.10 g/dia and high enantiomeric purities (99.0%) were attained and for this process, furthemore the mobile phase was totally recycled. Diferentes técnicas cromatográficas em escala preparativa foram aplicadas para a purificação de misturas enantioméricas. O estudo da eficiência do processo de cromatografia multicoluna com comprimento de zona variável (VARICOL®), assim como sua aplicação para a separação dos fármacos modafinil, atenolol e albendazol sulfóxido são descritos neste trabalho e os resultados obtidos são detalhadamente discutidos. As condições iniciais de operação foram ajustadas através da simulação teórica no programa HELP 10.3 (Novasep®). Para a separação do modafinil, diferentes concentrações de alimentação foram avaliadas, para uma mesma configuração de zonas e período. O método mais eficiente desenvolvido para este fármaco proporcionou purezas enantioméricas de 96,0% para ambos enantiômeros, com taxas de produção acima de 2,24 g/dia. O albendazol sulfóxido foi eficientemente separado pelo processo VARICOL®, obteve-se purezas enantioméricas de 99,5% e 99,0% para o refinado e extrato, respectivamente, com taxa de produção de, aproximadamente, 2,0 g/dia. Em ambos os procedimentos a fase móvel composta por 100% de metanol foi recuperada em 95,0%. O atenolol foi enantiorresolvido, de maneira eficiente, pela coluna CHIRALCEL OD®, a baixa solubilidade deste composto na fase móvel e o longo tempo de ciclo, impossibilitou a obtenção de seus enantiômeros com altas purezas pelo processo VARICOL®. Os enantiômeros puros do albendazol sulfóxido foram submetidos a teste sobre cistos de Taenia Solium, o comportamento macroscópico, microscópico e bioquímico dos céstodos foi avaliado e, de maneira geral, o (+)-albendazol sulfóxido teve maior efeito anti-helmíntico. A configuração absoluta do centro estereogênico dos enantiômeros do albendazol sulfóxido foi determinada pela primeira vez, para isso utilizou-se dicroísmo circular vibracional e cálculos teóricos. A cromatografia de eluição foi utilizada para a resolução dos enantiômeros do MDMA e do omeprazol. O ecstasy foi enantiorresolvido com reciclo em condições de sobrecarga de massa, obteve-se boas purezas enantioméricas - 99,0% para o (R)-(-)-MDMA e 96,0% para o (S)-(+)-MDMA e taxa de produção de 40,0 mg/mL. Os enantiômeros do MDMA foram utilizados em testes de estresse oxidativo, apresentando diferente comportamento. Para o isolamento dos enantiômeros puros do omeprazol, utilizouse injeções do tipo stack com sobrecarga de massa, taxa de produção de 1,10 g/dia, alta purezas enantioméricas para ambos enantiomêros (acima de 99,0 %) e o uso de fase móvel totalmente reciclada são atrativos deste procedimento.

Universidade Federal de Minas Gerais Purine Nucleoside Phosphorylases (PNPs) are key enzymes of the purine salvage pathway, and therefore are considered attractive targets for new drugs search. In this context, the development of effective and selective bioassays for PNP ligands screening is an important task. This work describes the covalent immobilization of human and Schistossoma mansoni PNP on fused silica capillaries. The activity of the immobilized enzyme reactors (IMERs) was monitored on line, employing multidimensional zonal chromatography, by the quantification of the product formed throughout the enzymatic reaction. This method enabled the determination of kinetic constants, screening, identification and characterization of enzymatic inhibitors. Two potent human PNP inhibitors were recognized and characterized. Through the use of inhibitors with different potencies, previously characterized by zonal chromatography, the affinity-based ligands screening employing frontal chromatography was validated. Frontal affinity chromatography analysis demonstrated to be a valuable method for the rapid identification of new ligands, while the main advantage of the multidimensional zonal chromatography method herein described consists on the ability to directly evaluate the effect of the ligands in the biological function of these enzymes. The methods described in this work represent an improvement to the PNPs inhibitors consolidated screening assays, since they directly quantify the enzymatic reaction product or are able to rank the inhibitors according to their affinities, resulting in a rapid automated analysis and false positives free. Purina Nucleosídeo Fosforilases (PNPs) são enzimas chave na via de salvação de purinas, e por isso são consideradas alvos atrativos para a busca por novos fármacos. Nesse contexto, o desenvolvimento de bioensaios seletivos e eficazes para a triagem de novos ligantes das PNPs é de importância crucial. Este trabalho descreve a imobilização covalente das PNPs humana e de Schistosoma mansoni em capilares de sílica fundida. A atividade das enzimas imobilizadas (IMERs) foi monitorada on line, por cromatografia zonal multidimensional, através da quantificação do produto formado na reação enzimática. Este método possibilitou a determinação das constantes cinéticas, a triagem, identificação e caracterização de inibidores enzimáticos. Dois inibidores potentes da PNP humana foram reconhecidos e caracterizados. Através do uso destes inibidores de diferentes potências, previamente caracterizados por cromatografia zonal, a triagem de ligantes por afinidade empregando a cromatografia frontal foi validada para o IMER baseado na PNP humana. As análises por cromatografia de afinidade frontal demonstraram ser uma estratégia valiosa na identificação rápida de novos ligantes, enquanto o método multidimensional desenvolvido apresenta como principal vantagem a capacidade de avaliar diretamente o efeito dos ligantes na função biológica destas enzimas. Os métodos descritos neste trabalho representam um avanço aos métodos consolidados de triagem de inibidores das PNPs, pois quantifica diretamente o produto formado da reação enzimática ou os classifica por afinidade, resultando em análises rápidas, automatizadas e sem falsos positivos.

Universidade Federal de Sao Carlos The development of new methods for analysis and quantification of drugs and their metabolites in biological fluids is of great interest in various areas of knowledge. The pre-treatment of complex matrices is a fundamental step for the quantification of compounds in trace levels. Methods of direct injection of samples by 2D liquid chromatography systems have led to higher precision and accuracy, and quantification limits ever smaller. The use of RAM columns allows the exclusion of proteins and other macromolecules present in biological matrix and extraction of lower molecular weight analytes through hydrophobic, ionic or affinity interactions. In this work, a number of different RAM columns were evaluated with different materials adsorbed or bound on the silica surface (BSA, methylcellulose and - lactoglobulin). As well as, columns with different modes and mechanism of the analytes retention (C8, C18, SAX, SCX) were used. Using the technique of column coupling and a mass spectrometer as detector, ampicillin, was quantified, in bovine milk samples having a RAM-BSA column, in the first dimension coupled to an ACQUITY UPLC BEH column, in the second dimension. MRM mode with three specific transitions, 350> 106, 350> 160 and 350> 192 m/z, were monitored. The first, more intense, was used for quantification while the other two were used for confirmation. The developed method is simple, with analysis time of 14 minutes without any pretreatment of samples, except for centrifugation. O desenvolvimento de novos métodos para a análise e quantificação de fármacos e seus metabólitos em fluidos biológicos é de grande interesse em diversas áreas do conhecimento. O pré-tratamento de matrizes complexas é uma etapa fundamental para quantificação de compostos em níveis de traços. Métodos de injeção direta de amostras em sistemas de cromatografia líquida 2D têm propiciado maiores precisão e exatidão, além de limites de quantificação cada vez menores. As colunas RAM permitem fazer a exclusão de proteínas e outras macromoléculas presentes na matriz biológica e a extração de analitos de menor massa molecular através de interações hidrofóbicas, iônicas ou afinidade. Neste trabalho, avaliaram-se diversas colunas que possuem diferentes materiais adsorvidos/ligados em sua superfície (BSA, metilcelulose e -lactoglobulina) bem como colunas com diferentes mecanismo e modos para a retenção dos analitos de interesse (C8, C18, SAX, SCX). Utilizando a técnica de acoplamento de colunas com detecção por espectrometria de massas (LC-UHPLC-MS) foi possível quantificar ampicilina em leite bovino empregando uma coluna RAM-BSA, na primeira dimensão, acoplada a uma coluna ACQUITY UPLC BEH, na segunda dimensão. Utilizando o modo MRM, monitoraram-se três transições específicas, 350 > 106, 350 > 160 e 350 > 192 m/z, sendo a primeira, de maior intensidade, para a quantificação e as demais para confirmação. O método desenvolvido é simples, com tempo de análise de 14 minutos, sem qualquer pré-tratamento de amostra, a não ser a centrifugação.

Financiadora de Estudos e Projetos Chemical characterization by liquid chromatography and chemometric analysis of Bauhinia species (popularly known as pata-de-vaca ) with applications in quality control of commercial samples. The infusion of leaves from Bauhinia species, is commonly used in the treatment to combat various diseases, among them diabetes. Studies show that B. forficata species possesses the most hypoglycemic activity among the species of the genus. However, due to the extreme morphological similarity between its leaves in comparison to other species , occasionally the popular use in the decoction of leaves is improper. Thus, it is necessary to develop methods of quality control of herbal drugs, in order to certify the authenticity of them. The chemical profiles (fingerprints) obtained by chromatographic analysis of plant extracts, brings a large amount of information, providing multivariable systems that can be used as a good parameter for quality control. The present study reports the separation optimization of the constituents obtained from aqueous extract on Bauhinia species by gradient elution on reverse phase. The chromatograms were first aligned using the MatLab® software and the COW algorithm (Correlation Optimized Warping) and after, the chromatograms were subjected on exploratory chemometric analysis Principal Component Analysis (PCA) and Hierarchical Cluster Analysis (HCA) and used to create models for supervised chemometric classification (KNN, SIMCA and PLS-DA) performed using the Pirouette® software. 170 chromatograms of extracts obtained from leaves of botanically identified trees from three different species - B. forficata, B. longifolia and B. variegata - were used on analysis by PCA and HCA, which allowed the visualization of the distribution of 15 commercial samples of "pata-de-vaca". Those samples were also analyzed using the supervised classification models, and among them, 3 were classified as B. forficata, 6 were classified as B. longifolia and 5 of them were classified as B. variegata. For one of the samples it was not possible to classify its species due to large difference among the determinations obtained from the three distinct analytic tools Caracterização Química por Cromatografia Líquida e Análise Quimiométrica de espécies vegetais de Bauhinia com aplicação em controle de qualidade de amostras comerciais de pata-de-vaca . A infusão de folhas de espécies de Bauhinia, conhecida popularmente como pata-de-vaca , é comumente utilizada no tratamento a várias enfermidades, dentre elas o diabetes. Estudos demonstram que a espécie Bauhinia forficata é a que apresenta maior atividade hipoglicemiante dentre as espécies do gênero. Porém, devido à grande semelhança morfológica das folhas desta com as de outras espécies, ocasionalmente seu uso popular na decocção de suas folhas é feita de maneira inadequada. Desta forma, faz-se necessário o desenvolvimento de métodos para o controle de qualidade das drogas vegetais, com o objetivo de atestar a autenticidade destas. Os perfis químicos (fingerprints) obtidos por análises cromatográficas de extratos vegetais, trazem uma quantidade grande de informações, constituindo sistemas multivariados que podem ser utilizados como parâmetro de controle químico de qualidade. O presente trabalho relata a otimização da separação dos constituintes do extrato aquoso de espécies de Bauhinia por eluição gradiente no modo reverso. Posteriormente os cromatogramas foram alinhados utilizando-se o software MatLab® com o algoritmo COW (Correlation Optimized Warping) e, logo após, os cromatogramas foram submetidos a análises quimiométricas exploratórias (PCA e HCA) e usados para a criação de modelos quimiométricos supervisionados de classificação (KNN, SIMCA e PLS-DA) utilizando-se o software Pirouette®. Cento e setenta cromatogramas de extratos obtidos a partir das folhas de árvores identificadas botanicamente de três diferentes espécies - B. forficata, B. longifolia e B. variegata - foram utilizados para as Análise de Componentes Principais (PCA) e Análise de Agrupamento Hierárquico (HCA), que permitiram a visualização da distribuição nos eixos das PC s de 15 amostras comerciais de pata-de-vaca . Estas foram também analisadas utilizando-se os modelos supervisionados de classificação, onde de todas elas 3 foram classificadas como B. forficata, 6 delas classificadas como B. longifolia e 5 classificadas com B. variegata. Apenas para uma das amostras não foi possível a classificação de sua espécie devido a uma grande diferença entre as determinações dos três modelos distintos.

Universidade Federal de Sao Carlos This work presents the results of the use of High Performance Liquid Chromatography coupled to mass spectrometry in the chemical differentiation/characterization of aqueous extracts of plant samples of the genus Phyllanthus, commonly named as "stone braker". The species studied were P. amarus, P. stipulatus, P. niruri and P. tenellus. For medical purposes, the Brazilian Pharmacopoeia recognizes only P. niruri and P. tenellus. Samples of the plants used were grown and collected on the campus of Federal University of São Carlos (UFSCar). The goal of the work here reported was to compare the four species through the characterization of secondary metabolites. Structural characterization of secondary metabolites was achieved by interpretation of fragmentation data obtained in the online experiments of MS/MS and MS3using ion trap mass spectrometer equipped with an electrospray ionization source in positive and negative mode of ionization. Several chemical compounds were elucidated; some of them presents in all four species while others were found in a single species, this work presents and discusses the results. Furthermore two compounds from the species of P. stipulatus were isolated by semi-preparative liquid chromatography. These two isolated compounds were fully characterized by mass spectrometry and NMR, as corilagin and quercetin-3-O-β-D-glucuronopyranoside, an unusual flavonol in natural products O presente trabalho apresenta os resultados do uso de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência hifenada à espectrometria de massa na diferenciação/caracterização química de extratos aquosos de amostras vegetais popularmente conhecidas como quebra-pedra pertencente ao gênero Phyllanthus. As espécies estudadas foram P. amarus, P. stipulatus, P. niruri e P. tenellus, sendo estas duas últimas as oficiais na Farmacopeia Brasileira. As amostras vegetais utilizadas foram cultivadas e coletadas no campus da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar). O objetivo do trabalho foi comparar quimicamente as quatro espécies de Phyllanthus através da caracterização de seus metabólitos secundários. A caracterização estrutural dos metabólitos secundários foi alcançada por meio da interpretação dos dados de fragmentação obtidos nos experimentos on-line de MS/MS e MS3 usando espectrômetro de massa tipo íon trap equipado com fonte de ionização tipo electrospray, no modo negativo e positivo de ionização. Diversos compostos químicos foram elucidados, sendo alguns destes comuns às quatro espécies e outros exclusivos de uma única espécie, esse trabalho apresenta e discute os resultados encontrados. Separações por LC-UV semipreparativa também foram realizadas, purificando-se assim dois compostos a partir da espécie P. stipulatus. A elucidação estrutural foi realizada utilizando técnicas espectroscópicas como espectrometria de massa e RMN, sendo estes caracterizados como corilagina e quercetina-3-O-β-D-glucuronopiranosídeo, um flavonol pouco usual em produtos naturais.

Orientadores: Susanne Rath, Jarbas José Rodrigues Rohwedder Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: O preparo de amostra representa uma etapa determinante e crítica no processo de análise e a extração em fase sólida (SPE) é uma técnica amplamente empregada no preparo de matrizes complexas. O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de dispositivos e procedimentos que permitem aplicar campos elétricos em SPE empregando cartuchos (E-SPE®), visando adicionar os mecanismos da eletroforese ao processo cromatográfico. Para tanto, foram desenvolvidos eletrodos e cartuchos que possibilitam a aplicação de campos elétricos, além de um sistema para monitorar e controlar parâmetros eletrocromatográficos tais como: vazão, corrente elétrica, potencial elétrico e temperatura. Com esses dispositivos foram realizadas extrações com aplicação de campo elétrico empregando compostos modelo aniônicos, catiônicos e anfotéricos. Para permitir uma melhor compreensão dos fenômenos envolvidos foram avaliados diversos parâmetros de extração, entre esses: concentração de íons em solução, pH, modificador orgânico, volume de solução de lavagem e tipo de sorvente. O sistema foi avaliado também na determinação de antimicrobianos em leite. Dependendo da polaridade empregada sobre os eletrodos, a aplicação do campo elétrico foi capaz de modular (acelerar ou retardar) a saída dos compostos modelo do cartucho. Os resultados de extração obtidos demonstraram a eficácia dos dispositivos desenvolvidos, além da grande potencialidade do uso de campos elétricos em SPE para obter maiores recuperações dos analitos de interesse e/ou remoção de interferentes Abstract: Sample preparation is a crucial and determinant step for the analysis process and solid phase extraction (SPE) is a widely used technique in the preparation of complex matrices. The aim of this work was the development of devices and procedures for applying electric fields to SPE cartridges (SPE-E ®), in order to add the mechanisms of electrophoresis to the chromatographic process. For this purpose, electrodes and cartridges that allow the application of electric fields were developed, besides a system to monitor and control electrochromatographic parameters such as: flow, electric current, electric potential and temperature. By means of these devices, extractions with application of electric fields were performed using anionic, cationic and amphoteric model compounds. In order to allow a better understanding of the phenomena involved several extraction parameters were evaluated, among these: the concentration of ions in solution, pH, organic modifier, volume of washing solution and type of sorbent. The system was also evaluated for the determination of antibiotics in milk. Depending on the polarity of the electrodes used, the application of an electric field was able to modulate (accelerate or retard) the output of the model compounds from the cartridge. The extraction results obtained showed the effectiveness of the devices developed, and the immense potential of the use of electric fields in SPE to obtain better recoveries of the analytes and/or for removing interferents Doutorado Química Analítica Doutor em Ciências

Universidade Federal de Minas Gerais The liquid chromatography enantiomeric separation of a series of seventeen chiral sulfoxides was systematically investigated using multimodal elution with the new synthetic polymeric stationary phases based on monomers N-(2- acryloylamino-(1R,2R)-cyclohexyl)-acrylamine (P-CAP®), N,N0-[(1R,2R)-1,2- diphenyl-1,2-ethanediyl]bis-2-propenamide (P-CAP-DP®) and trans-9,10-dihydro- 9,10-ethanoanthracene-(11S,12S)-11,12-dicarboxylic acid bis-4-vinylphenylamide (DEAVB). The sulfoxide series was composed of aryl alkyl sulfoxides, benzoimidazole sulfoxides and the drugs modafinil, albendazole sulfoxide, omeprazole, lansoprazole, pantoprazole and rabeprazole. This work examines the effectiveness of the polymeric chiral stationary phases for the separation of chiral sulfoxides and describes the superiority of DEABV for these separations in three different elution modes. The first ever reversed phase enantiomeric separations on these columns is demonstrated. Besides that, the use of non standard chromatography solvents was evaluated for the sulfoxides series on the polymeric stationary phases. The study of the development of polysaccharides chiral stationary phases (CSPs) immobilized on to aminopropilsilica was carried out using thermal or photochemical methods. The photochemical method was more effective and provided the production of a CSP based on amilose tris-3,5- dimethylphenylcarbamate (CSP 7). This column showed stability for non standards mobile phases; however, has showed low enantiorresolution power for the compounds investigated. Using the photochemical approach an amilose tris-3,5- dimetoxiphenylcarbamate (CSP 8) was also prepared. The immobilization conditions needs, however, futher investigations and these results will be also presented and discussed in this work. Este trabalho descreve a investigação do poder de enantiorresolução de novas fases estacionária quirais (CSP) de polímero sintético preparadas a partir dos monômeros poli(trans-1,2-ciclohexanediil-bis acrilamida (P-CAP®), N,N´- [(1R,2R)-1,2-difenil-1,2-etanodil]bis-2-propenamida (P-CAP-DP®) e trans-9,10- dihidro-9,10-etanoantraceno-(11S,12S)-11,12-acido dicarboxilico bis-4-vinilfenilamida (DEAVB) para uma série de dezessete sulfóxidos quirais. A série de sulfóxidos composta por aril alquil sulfóxidos, sulfóxidos benzoimidazólicos e pelos fármacos quirais modafinil, albendazol sulfóxido, omeprazol, lansoprazol, pantoprazol e rabeprazol foram eluidos no modo multimodal. O estudo sistemático da eficiência das três colunas de polímero sintético na enantiorresolução da séries de sulfóxidos quirais e a superioridade da DEAVB nas separações destes compostos nos três diferentes modos de eluição são apresentados. A P-CAP®, P-CAP-DP® e DEAVB também foram avaliadas pela primeira vez no modo reverso de eluição e a estabilidade destas colunas foi investigada pelo uso de solventes cromatográficos não usuais. O estudo do desenvolvimento de fases estacionárias quirais de derivados de polissacarídeos imobilizados em sílica APS foi realizado utilizando-se métodos térmicos ou fotoquímicos. O método fotoquímico foi mais eficiente e proporcionou o preparo da coluna de tris-3,5-dimetilfenilcarbamato de amilose (CSP 7). Esta coluna apresentou estabilidade frente a solventes cromatográficos não usuais, porém demonstrou baixo poder de enantiorresolução para os compostos quirais avaliados. Através do procedimento fotoquímico a CSP de tris-3,5- dimetoxifenilcarbamato de amilose (CSP 8) também foi preparada. Todavia, as condições de imobilização necessitam de maiores investigações, estes resultados estão também presentes e discutidos neste trabalho.

Universidade Federal de Sao Carlos The use of restricted access media columns for direct injection of samples chemically complex is consolidated, but not for environmental samples. This work describes the conditions for exclusion of aquatic fulvic and humic acids. The analyses were performed comparing the areas obtained after direct injection of standards in a chromatography column of gel permeation (Tsk gel® G3000PWXL), and those obtained in in-line mode with the RAM-BSA. Through a calibration curve, using standards of sodium polystyrene sulfonates of different molecular weights, in order of the 18000 Da, the molecular weight of eluted fractions were determined. This work reports the development, validation and application of sensitive, precise and accuracy methods, by high performance liquid chromatography with direct injection of samples for the enantioselective determination of omeprazole, lansoprazole and pantoprazole drugs in environmental matrices (wastewater from the city of São Carlos, Brazil and estuarine water of the River Douro, Porto-Portugal). The methods were developed by multidimensional liquid chromatography using an octyl restricted access media bovine serum albumin column (RAM-BSA C8) in the first dimension for the exclusion of macromolecules and extraction of drugs. The enantiomeric separation of omeprazole was achieved in the second dimension with a chiral column, amylose tris (3,5-dimetylphenylcarbamate) coated onto APS-Nucleosil support, and the chiral column amylose tris (3,5- dimethoxyphenylcarbamate) coated onto APS-Nucleosil support it was used for simultaneous enantiomeric separation of lansoprazole and pantoprazole. Aliquots of 500μL of the samples were injected directly into the multidimensional chromatographic system with detection for ultraviolet-visible spectroscopy (UV-vis). The quantification limits obtained for the enantiomers of omeprazole were 15μg.L-1, and for the enantiomers of lansoprazole and pantoprazole 5.0 and 7.5μg.L-1, respectively. Lower quantification limits were obtained for the enantiomers of lansoprazole (0,60μg.L-1) and pantoprazole (0,40μg.L-1) by replacement of the UV-vis detector for the mass spectrometer in a multiple reaction monitoring (MRM) mode and increasing the injection volume for 1000μL. O uso de colunas de fases de acesso restrito para injeção direta de amostras quimicamente complexas está consolidado, mas não para amostras ambientais. Este trabalho descreve as condições para exclusão de ácidos húmicos e fúlvicos aquáticos. As análises foram feitas comparando as áreas obtidas após injeção direta dos padrões numa coluna cromatográfica de permeação em gel (Tsk gel® G3000PWXL), e as obtidas no modo in-line com as colunas RAM-BSA. Através de uma curva de calibração utilizando padrões de poliestirenos sulfonatos de sódio com diferentes pesos moleculares foi determinado, na ordem de 18000 Da, o peso molecular das frações eluídas. Este trabalho reporta o desenvolvimento, validação e aplicação de métodos sensíveis, precisos e exatos, por cromatografia líquida de alta eficiência com injeção direta de amostras para a determinação enantiosseletiva dos fármacos omeprazol, pantoprazol e lansoprazol, em matrizes ambientais (água residual da cidade de São Carlos-Brasil e água do estuário do Rio Douro, Porto-Portugal). Os métodos foram desenvolvidos por cromatografia liquida multidimensional utilizando-se uma coluna de fase acesso restrito de albumina sérica bovina (RAM-BSA C8), na primeira dimensão, para exclusão das macromoléculas e para extração dos fármacos. A separação enantiomérica do omeprazol foi realizada na segunda dimensão com uma coluna quiral, tris (3,5-dimetilfenilcarbamato) de amilose em APS-Nucleosil e, para os métodos envolvendo a separação enantiomérica simultânea do lansoprazol e pantoprazol foi utilizada a coluna quiral tris (3,5- dimetoxifenilcarbamato) de amilose em APS-Nucleosil. Alíquotas de 500μL das amostras foram injetadas diretamente no sistema cromatográfico multidimensional com detecção por espectroscopia na região do ultravioletaxix visível (UV-vis). Os limites de quantificação obtidos para os enantiômeros do omeprazol foram de 15μg.L-1, e para os enantiômeros do lansoprazol e pantoprazol 5,0 e 7,5μg.L-1, respectivamente. Limites inferiores de quantificação foram obtidos para os enantiômeros do lansoprazol (0,60μg.L-1 ) e pantoprazol (0,40μg.L-1), pela substituição do detector de UV-vis por um espectrômetro de massas, no modo MRM (Multiple Reaction Monitoring), e aumento do volume de injeção para 1000μL.

Universidade Federal de Minas Gerais This work present the development and application of methods by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) to the quality control of vegetable samples known as stone breaker , that correspond to Phyllanthus species, two of them entered in Brazilian Pharmacopoeia: P.niruri L. and P. tenellus Roxb. A chromatographic profile analytical method was developed and validated, using HPLC with diode array detection (DAD), for the analysis of aqueous extracts of Phyllanthus authentic samples, which consisted of six species grown under controlled conditions in two different sites (Campinas and São Carlos, Brazil) and also not cultivated samples, collected in 27 cities of São Paulo state. Chemometric methods of exploratory analysis were used to interpret the chromatographic informations, such as Principal Component Analysis (PCA) and Hierarquical Cluster Analysis (HCA). Classification models (SIMCA, KNN e PLS-DA) were developed and validated and demonstrated that the Phyllanthus species can be differentiated from each other through their chromatographic profiles and multivariate analysis. The chromatographic method was applied in the analysis of 25 stone breaker commercial samples and their authenticity was determined by the classification models: the results showed that most products are produced with the P. tenellus species, although they are marketed as P. niruri; two samples was determined as adulteration since they were not classified as any Phyllanthus species. A chemical marker was purified by semi-preparative HPLC-UV from the crude aqueous extract of P. niruri specie; spectroscopy characterization determined its structure as corilagin, an hydrolisable tannin. An analytical method by HPLC-UV was developed and validated for quantification of this marker in extracts of Phyllanthus species and stone breaker commercial samples. For the cultivated samples, there was significant variability in the concentration of corilagin according to the place of cultivation and the time of year; among the non-cultivated P. tenellus samples, there was large differences in the marker concentration, result of the influence of different habitats in secondary metabolism of the plant. The corilagin quantification therefore was not feasible to determine the authenticity/quality of commercial samples, but can be used in the monitoring of Phyllanthus cultivated species. In two commercial samples the marker was not detected, which characterized as adulterated samples of stone breaker . O presente trabalho apresenta o desenvolvimento e aplicação de métodos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) para o controle de qualidade de amostras vegetais conhecidas como quebra-pedra , que correspondem a espécies do gênero Phyllanthus, duas delas inscritas na Farmacopéia Brasileira: P.niruri L. e P. tenellus Roxb. Um método analítico de perfil cromatográfico foi desenvolvido e validado, utilizando CLAE com detecção por arranjo de diodos (DAD), para a análise de extratos aquosos de amostras autênticas de Phyllanthus, que consistiram de seis espécies cultivadas sob condições controladas, em dois diferentes locais (Campinas e São Carlos/SP, Brasil) e também de amostras não cultivadas, coletadas em 27 municípios do estado de São Paulo. Para a interpretação das informações cromatográficas, métodos quimiométricos de análise exploratória foram utilizados: Análise de Componentes Principais (PCA) e Análise de Agrupamentos Hierárquicos (HCA). Modelos quimiométricos de classificação (SIMCA, KNN e PLS-DA) foram elaborados e validados e demonstraram que as espécies de Phyllanthus podem ser diferenciadas entre si através de seus perfis cromatográficos e análise multivariada. O método cromatográfico foi aplicado na análise de 25 amostras comerciais de quebra-pedra e sua autenticidade foi determinada através dos modelos de classificação: os resultados demonstraram que a maior parte dos produtos é produzida com a espécie P. tenellus, embora sejam comercializados como P. niruri; para duas amostras foi determinada adulteração, uma vez que não foram classificadas como nenhuma espécie de Phyllanthus. Utilizando CLAE-UV semi-preparativa, um marcador químico foi purificado a partir do extrato aquoso bruto da espécie P. niruri; a caracterização espectroscópica determinou sua estrutura como sendo a corilagina, um tanino hidrolisável. Um método analítico por CLAE-UV foi desenvolvido e validado para a quantificação desse marcador em extratos de espécies de Phyllanthus e em amostras comerciais de quebra-pedra . Para as amostras cultivadas, verificou-se significativa variabilidade na concentração de corilagina em função do local de cultivo e da época do ano; entre as amostras não-cultivadas de P. tenellus, houve grandes diferenças na concentração do marcador, resultado da influência de diferentes habitat s no metabolismo secundário do vegetal. A quantificação de corilagina, portanto, não se mostrou viável na determinação da autenticidade/qualidade de amostras comerciais, porém pode ser utilizada no monitoramento de espécies cultivadas de Phyllanthus. Em duas amostras comerciais o marcador não foi detectado, o que as caracterizou como amostras adulteradas de quebra-pedra .

Universidade Federal de Minas Gerais This work reports the quantification of NADH formed by an immobilized enzyme reactor (IMER) of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) of T. cruzi using multidimensional high-performance liquid chromatography. For this, The IMER was used in the first dimension while an analytical C8 column was used in the second dimension. The conditions of the pre-treatment of the fused silica capillary tubes and the covalent immobilization of the enzyme into the capillary were successfully optimized, resulting in increased enzymatic activity and stability. Kinetic studies for the T. cruzi GAPDH-IMER were carried out to verify the influence of the immobilization over the enzyme affinity for the substrate and cofactor. The kinetic results for the IMERs of human and parasite GAPDH enzymes were compared to those obtained with the enzymes in solution, and showed that the covalent immobilization method used affected mainly the affinity of the human enzyme for the substrate. The human and parasite GAPDH-IMERs were employed for the ligand screening. The ligands recognized by the IMERs were the same identified by the enzymes in solution, showing that the immobilized enzymes kept the ability of recognizing the activity compounds modulators. The IMERs demonstrated to be a useful tool also for inhibitors binding reversibility characterization. In view of the high costs and difficulties involved on enzyme purification, the methods described in this work represents a valuable way of preserving enzyme activity and carrying out a variety of biochemical experiments. Este trabalho descreve a quantificação do NADH formado pela reação do biorreator da enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) de T. cruzi usando cromatografia liquida de alta eficiência multidimensional. Para isto, o biorreator foi usado na primeira dimensão e uma coluna analítica C8 na segunda dimensão. As etapas de pré-tratamento dos capilares de s匀ica fundida e da imobilização covalente da enzima, neste suporte, foram otimizadas com sucesso, resultando no aumento da atividade e da estabilidade da enzima. Os estudos cin騁icos para a enzima GAPDH-Tc imobilizada foram realizados para verificar se o método de imobilização empregado afetou a afinidade da enzima pelo substrato ou cofator. Os resultados obtidos com os biorreatores das enzimas GAPDH-Tc e humana foram comparados 瀲ueles obtidos com as enzimas em solução, e evidenciaram que o método de imobilização covalente afetou principalmente a afinidade da enzima humana pelo substrato. Os biorreatores das enzimas do parasita e humana foram empregados para a triagem de ligantes. Os ligantes reconhecidos pelos biorreatores foram os mesmos identificados pelas enzimas em solução, evidenciando que a enzima imobilizada reteve a capacidade de reconhecer os compostos capazes de modular a atividade enzim疸ica. Os biorreatores mostraram-se uma ferramenta 偀il na caracterização dos inibidores quanto ・reversibilidade da ligação. Considerando os altos custos e as dificuldades envolvidas na purificação de enzimas, os procedimentos descritos neste trabalho representam um valioso método para preservar a atividade enzim疸ica e para a realização de uma variedade de ensaios bioquímicos.

Universidade Federal de Sao Carlos This work reports the development of analytical methods, using High Performance of Liquid Chromatography (HPLC), to quantify unreacted monomers from dental reline autopolimerizing acrylic resins. The quantification of these unreacted methacrylates is directly related with theirs toxicity, once that these may not only be irritant to the mucosa, but may also cause allergic and inflammatory reactions. In addition to this, high concentrations of unreacted monomers may cause alterations in physical and mechanical properties. For this purpose, three experimental resins (RE1, RE2 and RE3) and a commercial resin, Tokuyama Rebase Fast II (TKY), were selected to be analyzed. The development of these experimental resins has been carried out in cooperation with Faculty of Dentistry, Araraquara (FOAr - Unesp) and the dental corporation VIPI Ltda (Pirassununga, SP). The relevance of development these new resins is related to the necessity to have a national confectioned resin, because all resins used for these treatments are imported and reducing the cost of treatment. For quantification of unreacted monomers was necessary to extract them from the resins, so the extraction procedure was carried out in an ice-bath using methanol as extraction solvent. This procedure was validated through extractions in replicates. The monomers quantified were acetoacetoxy ethyl methacrylate (AAEM) from TKY resin, ethylene glycol dimethacrylate (EDMA), buthanediol dimethacrylate (BDMA) and cyclo hexyl metharylate (CHMA) all from experimental resins. Higher concentrations were found for experimental resins which the unreacted monomers concentrations range were, approximately 120μg/mL to 500μg/mL, 150μg/mL to 500μg/mL and 100 to 300μg/mL for resins RE3, RE1 e RE2, respectively Only for TKY resin was carried out a procedure to evaluate the quantity of unreacted monomer leached out in vitro in artificial saliva. There were found concentration in the range from 5.00 to 64.0μg/mL, in view of that the higher concentrations were leached from resin in the first 24 hours and after one week of artificial saliva immersion it was not observed the leaching of AAEM monomer. Neste trabalho, foram desenvolvidos métodos analíticos, por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), para a quantificação de monômeros metacrilatos não polimerizados de resinas acrílicas autopolimerizáveis, utilizadas em tratamentos odontológicos para reembasamento de bases de prótese. A importância da quantificação de metacrilatos residuais está associada à sua toxicidade, uma vez que podem causar reações alérgicas e irritações na mucosa bucal do paciente. Além disso, altas concentrações de monômeros não polimerizados podem comprometer as propriedades físicas e mecânicas da resina e, consequentemente, a qualidade do tratamento de reembasamento. Para isso, foram analisadas três resinas experimentais e uma resina comercial, a Tokuyama Rebase Fast II (TKY). As resinas experimentais (RE1, RE2 e RE3) estão em desenvolvimento pela empresa VIPI Indústria Comércio Exportação e Importação de Produtos Odontológicos Ltda, em colaboração com a Faculdade de Odontologia de Araraquara (FOAr - Unesp). O desenvolvimento dessas novas resinas deve-se à necessidade de se ter uma resina de fabricação nacional, visando reduzir o custo do tratamento, uma vez que as resinas utilizadas para este fim são todas importadas. Para a quantificação de monômeros residuais, realizou-se a extração destes a partir das resinas com metanol refrigerado em banho de gelo, e processo foi validado através de extrações em replicata. Os monômeros quantificados foram: metacrilato de acetoacetoxietil (AAEM - resina TKY), dimetacrilato de butila (BDMA), dimetacrilato de etila (EDMA) e metacrilato de cicloexila (CHMA) - resinas experimentais. As maiores concentrações foram encontradas para as resinas experimentais, nas quais as concentrações de monômeros não polimerizados variaram aproximadamente de 120μg/mL a 500μg/mL, de 150μg/mL a 500μg/mL e de 100 a 300μg/mL para as resinas RE3, RE1 e RE2, respectivamente. A variação encontrada para a resina TKY foi de 70 a 110μg/mL. Para a resina comercial (TKY) foi realizado um estudo no sentido de avaliar a quantidade de monômero não polimerizado e liberado in vitro em saliva artificial. Foram encontradas concentrações de 5,00 a 64,0μg/mL, sendo que os maiores valores foram obtidos nas primeiras 24 horas. Após uma semana de imersão em saliva artificial não se observou a liberação do monômero AAEM.

Universidade Federal de Minas Gerais This work reports the investigation of a series of bovine serum albumin (BSA) restricted access media columns (RAM) for on-line milk samples deproteinization using water, phosphate and acetate buffer as mobile phase. The retention factor (k) of aminoglycosides antibiotics (streptomycin, neomycin and gentamycin) on the RAM columns was evaluated using buffers and ion pair chromatography. The results showed a wide variation on aminoglicosides antibiotics retentions time; a RAM-ADS column was also investigated and the same results was observed. During the RAM columns studies, an investigation of two analytical columns, C18 and phenyl (Hyperil 15 x 0,46 cm i.d.), were performed using ion pair chromatography. Perfluorinated acids (TFA, HFBA and PFPA) were evaluated as moblile phase and the detection was accomplished by an evaporative light scattering detector (ELSD). This study allowed the development of analytical methods for quality control of gentamycin, neomycin and streptomycin in veterinary pharmaceutical formulations. The developed methods showed good selectivity, sensibility, accuracy and precision for all compounds allowing it to be successfully used to commercials phormulation. This works also presents a study for on line determination of cephalosporinic antibiotics in bovine milk by multidimentional chromatography using RAM-BSA column for sample clean-up. The chromatographic conditions optimzed for these compounds were not adequate for the MS/MS quantification due to suppression and/or enhancement of compound s ionization. Still a sensitive and enantioselective multidimensional high performance liquid chromatography (HPLC) method for determination of albendazole metabolites: albendazole sulphoxide, albendazole sulphone and albendazole 2-aminesulphone in bovine milk was development and validated at this work. The compounds, (±)-albendazole sulphoxide, albendazole sulphone and 2-aminesulphone were extracted from bovine milk using a octyl restricted access media bovine serum albumin column (C8-RAM-BSA) (5.0 x 0.46 cm i.d.) and analyzed on a chiral column containing amylose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate) coated onto APS-Nucleosil support, as stationary phase (15.0 x 0.46 cm i.d.). The validated method showed linearity, precision, accuracy and adequate sensitivity, allowing it to be appropriate for pharmacokinetics studies and residual limits control. A matrix effect study was conducted to investigated its influence on the LC-MS method development. Este trabalho apresenta o desenvolvimento e avaliação de colunas RAM-BSA na exclusão de proteínas do leite bovino e da capacidade de retenção dessas colunas para os antibióticos aminoglicosídeos (estreptomicina, neomicina e gentamicina). O perfil cromatográfico da exclusão das proteínas foi avaliado utilizando água, solução fosfato de potássio dibásico e solução acetato de amônio como fase móvel. A capacidade de retenção das colunas RAM-BSA para os antibióticos aminoglicosídeos foi avaliada utilizando cromatografia no modo reverso de eluição, com o uso de soluções tamponadas, e cromatografia de pareamento iônico. Foi verificado, com todas as fases móveis avaliadas, uma grande variação nos tempos de retenção dos analitos. Uma coluna RAM-ADS foi também utilizada e, da mesma forma que as colunas RAM-BSA nenhum tempo de retenção adequado foi obtido. Durante o estudo de retenção nas colunas RAM-BSA foi também realizada, uma avaliação do fator de retenção (k) dos antibióticos aminoglicosídeos utilizando cromatografia de pareamento iônico (TFA, HFBA e PFPA como agentes de pareamento iônico) nas colunas fenil e C18 (Hyperil 15 x 0,46 cm d.i.) e ELSD como detector. Esse estudo proporcionou o desenvolvimento de métodos analíticos para o controle de qualidade de medicamentos veterinários. Foram desenvolvidos métodos de análise para os três antibióticos avaliados e os métodos apresentaram linearidade, sensibilidade, seletividade, exatidão e precisão adequadas, de modo que foram aplicados com sucesso na análise de medicamentos veterinários comerciais. Este trabalho também apresenta um estudo para o desenvolvimento de um método por injeção direta utilizando colunas RAM-BSA para análise de antibióticos cefalosporínicos em leite bovino com detecção por espectrometria de massa. As propriedades físico-químicas destes compostos exigiram a utilização de soluções tamponadas e agentes de pareamento iônico, os quais dificultaram o acoplamento com o MS influenciando diretamente na ionização destes compostos, impedindo o desenvolvimento do método. O desenvolvimento e validação de um método, sensível e enantiosseletivo por CLAE-multidimensional para a determinação dos metabólitos do albendazol (albendazol-sulfóxido, albendazol-sulfona e albendazol-2-aminosulfona) em leite bovino por detecção por MS também foi realizado. Uma coluna RAM-BSA C8 (5,0 x 0,46 cm d.i.) foi acoplada em uma coluna quiral tris(3,5-dimetilfenilcarbamato) de amilose em sílica APS-Nucleosil (15,0 x 0,46 cm d.i.) e o método validado mostrou linearidade, precisão, exatidão e sensibilidade adequada para ser utilizado em estudos de resíduos em alimentos e/ou farmacocinéticos destes compostos. Ainda, durante este trabalho foi realizado um estudo do efeito de matriz para verificar a influência desta na validação do método por LC-MS.

Universidade Federal de Sao Carlos This work reports the investigation of a series of bovine serum albumin (BSA) restricted access media columns (RAM) for on-line egg samples deproteinization. High exclusion percentage of egg s proteins were obtained with the three RAM BSA columns prepared (C8, C18 and phenyl) using only water as eluent. However, an increase of pressure of the chromatographic system was observed at each injection, which made unfeasible the use of these columns for direct injection of the egg samples. To prolong the life-time of the RAM-BSA columns, acetonitrile was used as a protein precipitate agent. This clean-up procedure allowed the repetitive injection of 300 µL of whole egg samples. For the simultaneous quantification of sulfamethoxazole (SMX) and trimethoprim (TMP) in eggs samples, RAM-BSA columns, in different lengths (10 and 5 cm) sizes and different chromatographic conditions were thoroughly evaluated. A bidimensional higher performance liquid chromatography configuration having a RAM C18 BSA column in the first dimension, and a C18 analytical column in the second dimension were used for simultaneous quantification of these antibiotics. The developed method showed good selectivity, accuracy and precision with limits of quantification 80 ng/mL for both compounds. Thus, the validated method is reliable and sensitive for monitoring residues in whole eggs samples. Neste trabalho foi preparada e avaliada uma série de colunas de acesso restrito (RAM) de albumina sérica bovina (BSA) para a desproteinização on-line de amostras de ovo. As três colunas preparadas (C8, C18 e fenil) mostraram elevada percentagem de exclusão de proteínas do ovo, usando somente água como eluente. No entanto, foi observado aumento da pressão no sistema cromatográfico, a cada injeção, o que tornou inviável a injeção direta das amostras de ovo, nas condições inicialmente avaliadas. Para prolongar a vida útil das colunas RAM-BSA foi necessário a utilização de um agente de precipitação de proteínas, e dentre os agentes avaliados, acetonitrila mostrou-se o solvente mais eficiente, permitindo a injeção repetitiva de volumes de 300µL de amostras de ovo, sem alteração da pressão no sistema cromatográfico. Para o desenvolvimento do método de análise simultânea dos antibióticos sulfametoxazol (SMX) e trimetoprima (TMP) em ovos, no modo multidimensional, foram também avaliadas colunas RAM-BSA de diferentes comprimentos (10 e 5 cm) e em diferentes condições cromatográficas. O sistema, composto por uma coluna RAM C18-BSA, acoplada a uma coluna analítica C18, permitiu o desenvolvimento do método com excelente precisão, exatidão e com adequada sensibilidade. Os limites de quantificação foram de 80 ng/mL, para ambos compostos. Desta forma, o método desenvolvido poderá ser utilizado para o monitoramento de resíduos destes antibióticos em amostras de ovo.

Financiadora de Estudos e Projetos The relative retention and enantioselectivity of a homologue series constituted by five benzimidazoles, K+/H+ - ATPase pump inhibitors, was determined for three amylose tris-phenylcarbamate chiral stationary phases (CSP), under reverse and normal phase modes of elution, using ethanol as a organic modifier. It was verified similar retention profiles for the benzimidazoles homologue series on the three evaluated chiral phases, under reversed mode of elution. The switch between reversed to polar organic mode of elution, under same conditions of reversed mode, and even with a percentage of water, in the mobile phase, around 15% it is clearly observed and discussed. Also, the benzimidazoles series retention profiles on three chiral columns were similar when in the normal elution mode. However, a switch from normal to polar organic mode is slow, indicating that retention/separation mechanisms, that operate in both elution modes, are very comparable. The discrimination chiral capacity of these stationary phases was differentiated when ethanol was used as organic modifier on three elution modes. The amylose tris (3,5 dimethylphenylcarbamate) phase (CSP-2) showed high resolution (Rs) power (0.90 ¡Ü Rs ¡Ü 3.46 and 1.25 ¡Ü á ¡Ü 2.24) for omeprazole enantiomers on the three elution modes. The amylose tris [(S)-phenyethyllcarbamate) phase (CSP-3), in turn, display resolution capacity for all series of homologous enantiomers in normal mode of elution. Herein, it was established for first time a relation between normal and reversed elution mode through the isoelution point determination. Under the same percentage of ethanol, in normal mode, and water in reversed mode, the retentions are similar, when polysaccharides phases are used as chiral selectors. The enantiomeric separations of enantiomers series were carried out in multimilligram scale, and the determination of its elution order was evaluated in the three elution modes. The omeprazole enantiomers separation was performed in multimilligram scale, as a model, using the solid-phase injection technique. The results were compared with those obtained from the separation by means of classical volume injection of sample. These results are presented and discussed. A retenção relativa e a enantiosseletividade de uma séria homóloga de cinco benzimidazóis, inibidores da bomba K+/H+-ATPase, foram determinados em três fases quirais de tris-fenilcarbamatos de amilose, no modo reverso e normal de eluição, utilizando etanol como modificador orgânico. Foram verificados perfis de retenção similares para a série homóloga de benzimidazóis, nas três fases quirais avaliadas no modo reverso de eluição. A passagem do modo reverso para o modo polar-orgânico de eluição, mesmo sob condições de modo reverso, e ainda com porcentagem de água, na fase móvel, em torno de 15% é claramente observada e discutida. Os perfis de retenção da série de benzimidazóis nas três colunas quirais também foram similares quando a eluição foi no modo normal. Entretanto, a mudança do modo normal para o modo polar-orgânico é lenta, indicando que os mecanismos de retenção/separação, que operam nos dois modos de eluição, são mais próximos. A capacidade de discriminação quiral destas fases estacionárias foi diferenciada quando se utilizou etanol como modificador orgânico nos três modos de eluição. A fase tris (3,5 dimetilfenilcarbamato) de amilose (CSP-2) mostrou alto poder de resolução (0,90 . Rs . 3,46 e 1,25 . α . 2,24) para os enantiômeros do omeprazol nos três modos de eluição. A fase tris [(S)-feniletilcarbamato] de amilose (CSP-3.1), por sua vez, apresentou capacidade de resolução para todos os enantiômeros da série homóloga no modo normal de eluição. Neste trabalho, foi estabelecida, pela primeira vez, uma relação entre o modo normal e reverso de eluição através da determinação do ponto de isoeluição. Numa mesma porcentagem de etanol, no modo normal, e de água, no modo reverso, as retenções são similares, quando se utilizam as fases de polissacarídeos como seletores quirais. Foram realizadas as separações enantioméricas dos enantiômeros da série em escala multi-miligramas, e a determinação da ordem de eluição dos mesmos foi avaliada nos três modos de eluição. A separação dos enantiômeros do omeprazol foi feita em escala multi-miligrama, como modelo, usando a técnica de injeção em fase sólida. Os resultados foram comprados com os obtidos da separação utilizando o modo clássico de injeção de amostras. Estes resultados são apresentados e discutidos.

Universidade Federal de Sao Carlos This study describes the use of oxo diperoxo molybdenum (VI) complex using 2,2-bipyridine and N,N -dioxide-2,2 -bipyridine as ligands for the oxidation of a series of aliphatic and aromatic sulfides, ketosulfides, sulfinyl acids and olefinic sulfides. The preparation of these complexes, the reactivity and the chemeoselectivity in these sulfides oxidation reactions are discussed. This work also describes the enantioselectivity results obtained for the oxidation reaction of a series of alkyl aryl prochiral sulfides using the MoO5(N,N-DMLA) chiral complex. The enantioresolution of the series of alkyl aryl sulfoxides, using chiral polysaccharide stationary phases, in multimodal elution, is also demonstrated. The reactivity of MoO5(pyridine oxide)(H2O) complex, coated and uncoated to silica gel, for the series of alkyl aryl sulfides oxidation reactions were also thoroughly evaluated for comparison with the results obtained in previous studies with a different series of sulfide. The result obtained in this work discloses that, in these oxidation, reactions the reactivity depends, not only of the used complex, but also, of the nucleophilicity of the used sulfides. The preparation of MoO5(N,N-DMLA) chiral complex, by a variety of methods, and the characterization of the obtained products by infrared, ultraviolet 13C-NMR, microanalyses and optical activity are also reported. Este trabalho descreve o uso de oxo diperoxo complexos de molibdênio (VI) contendo 2,2 -bipiridinas e N,N -dióxido-2,2, -bipiridinas, substituídas, como ligantes bidentados, para a oxidação de uma série de sulfetos pró-quirais funcionalizados, dentre eles, sulfetos alifáticos, aromáticos, cetossulfetos, sulfetos ácidos e olefínicos. O preparo dos complexos, sua reatividade e quimiosseletividade, em reações de oxidação de sulfetos são discutidos, levando em consideração estudos teóricos já desenvolvidos e os efeitos eletrônicos dos substituintes dos ligantes utilizados. O trabalho também reporta os resultados obtidos na oxidação enantiosseletiva de uma série de alquil aril sulfetos pró-quirais com o complexo quiral MoO5(N,N-DMLA), mostrando resultados promissores em relação aos excessos enantioméricos obtidos, assim como a influência estérica e eletrônica dos grupos substituintes dos sulfetos. A enantiorresolução da série de alquil aril sulfóxidos foi demonstrada, usando fase estacionária quiral de polissacarídeo, em eluição multimodal. A reatividade do complexo aquiral MoO5(óxido de piridina)(H2O), adsorvido à sílica e não adsorvido, também foi avaliada para a série de alquil aril sulfetos, e comparada com os resultados obtidos anteriormente para uma série de diferentes sulfetos. Os resultados obtidos neste trabalho mostraram que, na oxidação, a reatividade depende não só do complexo utilizado, mas também das características nucleofílicas de cada sulfeto. O preparo do complexo quiral MoO5(N,N-DMLA), através de diferentes métodos, e a caracterização do mesmo por infravermelho, ultravioleta-visível, 13C-RMN, análise elementar e atividade ótica também é reportado.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-01-11Bitstream added on 2014-06-13T18:47:18Z : No. of bitstreams: 1 urban_vm_dr_arafo.pdf: 2869944 bytes, checksum: e7264bf2de7fc0a0dde924482741fd32 (MD5) Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-01-11Bitstream added on 2014-06-13T18:47:18Z : No. of bitstreams: 1 urban_vm_dr_arafo.pdf: 2869944 bytes, checksum: e7264bf2de7fc0a0dde924482741fd32 (MD5) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Os objetivos deste estudo foram avaliar: 1. o efeito de tratamentos póspolimerização (MW-irradiação por energia de microondas e WB-imersão em água aquecida) sobre o grau de conversão (DC) de resinas acrílicas para reembasamento imediato (Ufi Gel hard-U, Kooliner-K e Tokuso Rebase Fast-T) e de uma resina acrílica para base de prótese (Lucitone 550-L), submetida a dois ciclos de polimerização (LS-curto e LL-longo) por espectroscopia FT-Raman; 2. o peso molecular (M w) do pré-polímero dos materiais U, K, T e L e das amostras polimerizadas da resina K (controle; MW e WB) por GPC; 3. o efeito de MW e WB na temperatura de transição vítrea (Tg) das resinas para reembasamento imediato (Duraliner II-D, K, New Truliner-N, U e T) e da resina para base de prótese (LS e LL) por DSC; 4. o efeito de WB na liberação de compostos residuais (isobutil metacrilato-IBMA, 1,6-hexanediol dimetacrilato-1,6-HDMA e DBNP-dibutil-n-ftalato) a partir das resinas para reembasamento imediato K, N, U e T para saliva artificial por CLAE; 5. o efeito de WB na liberação de produtos de degradação (ácido metacrílico-MA e ácido benzóico-BA) a partir das resinas para reembasamento imediato K, N, U e T para saliva artificial por CLAE. Amostras do grupo controle não foram submetidas a nenhum tratamento. Os resultados de DC (%) foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis ( =0,05). Os resultados de Tg (ºC) foram analisados pela análise de variância (ANOVA), seguido pelo teste de Tukey ( =0,05). Os resultados da liberação de monômero ' 224 residual e plastificante (μg/mL) foram submetidos aos testes de Wilcoxon ou de Mann-Whitney ( =0,05). Os resultados da liberação de produtos de degradação (μg/mL) foram submetidos aos testes de Wilcoxon, Mann-Whitney ou Kruskal- Wallis ( =0,05). Para as amostras do grupo controle, não houve diferenças significantes entre o DC das resinas U e LL e entre... The aims of this study were to evaluate: 1. the effect of post-polymerization treatments (MW-microwave irradiation and WB-water-bath) on the degree of conversion (DC) of reline resins (Ufi Gel hard-U, Kooliner-K, and Tokuso Rebase Fast-T) and denture base resin (Lucitone 550-L), submitted to two polymerization cycles (LS-short and LL-long) by FT-Raman spectroscopy; 2. the molecular weight (M w) of the powder of U, K, T, and L materials and of K polymerized specimens (control; MW; and WB) by GPC; 3. the effect of MW and WB on the glass transition temperature (Tg) of the reline resins (Duraliner II-D, K, New Truliner-N, U and T) and the heat-polymerized resin (LS and LL) by DSC; 4. the effect of WB on the leaching of residual compounds (isobutyl methacrylate- IBMA, 1,6-hexanediol dimethacrylate-1,6-HDMA, and DBNP-dibutyl-nphthalate) from the reline resins (K, N, U, and T) in artificial saliva by HPLC; 5. the effect of WB on the leaching of degradation products (methacrylic acid-MA and benzoic acid-BA) from the reline resins K, N, U, and T in artificial saliva by HPLC. Control group specimens were left untreated. DC (%) data were analyzed using Kruskal-Wallis test (_=.05). Tg (ºC) data were analyzed using ANOVA/Tukey's test (_=.05). The results (æg/mL) of residual monomer and plasticizer leachability were submitted to Wilcoxon or Mann-Whitney tests (_=.05). The results (æg/mL) of degradation products leachability were submitted to Wilcoxon, Mann-Whitney or Kruskal-Wallis tests (_=.05). For DC control specimens, there were no significant differences between U and LL and among LL, K, and T. LS specimens had the highest DC. Only material K exhibited an increased DC after WB. All powders had M w from 4.0x105 to 6.5x105 and narrow M w distributions (2.1 to 3.6). Polymerization and post-polymerization produced K specimens with M w values similar to that of K powder...(Complete abstract, click electronic address below).

Orientador: Cesar Costapinto Santana Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica Doutorado Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos Mestre em Engenharia Química

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003-02-27Bitstream added on 2014-06-13T19:16:53Z : No. of bitstreams: 1 urban_vm_me_arafo.pdf: 1219036 bytes, checksum: 4e3be4eb79ce75a36f6d11fd248eff4f (MD5) Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003-02-27Bitstream added on 2014-06-13T19:16:53Z : No. of bitstreams: 1 urban_vm_me_arafo.pdf: 1219036 bytes, checksum: 4e3be4eb79ce75a36f6d11fd248eff4f (MD5) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) O objetivo deste estudo foi estabelecer, inicialmente, um método analítico em CLAE, para comparar o conteúdo de monômero residual de uma resina autopolimerizável para reembasamento imediato (Duraliner II - D) e uma resina termopolimerizável utilizada na confecção de bases de próteses (Lucitone 550 - L). Além disso, foi avaliado o efeito de dois tratamentos térmicos sobre esse conteúdo. Os monômeros utilizados como padrões foram o MMA (resina L) e o BMA (resina D). As condições cromatográficas para a análise foram: coluna ODS (15,0 x 0,46 cm), com 5 mm de tamanho de partícular e 100 Å de tamanho de poro, fase móvel ACN : H2O (55%: 45%) + 0,01% TEA, fluxo 0,8 mL/min, l 230 nm, volume de injeção 100 mL. As resinas foram proporcionadas e polimerizadas de acordo com as instruções dos fabricantes. Os corpos-de-prova (n = 18) dos dois materiais foram divididos em 3 grupos, com 6 corpos-de-prova cada. O grupo I (GI) não foi submetido a nenhum tratamento (controle). Para o grupo II (GII), os corpos-de-prova foram irradiados com microondas, a 550 W por 3 min para o material L e a 650 W por 4 min para o material D. Para o grupo III (GIII), os corpos-de-prova dos materiais L e D foram submetidos ao tratamento térmico por imersão em água a 55oC por 60 min e 10 min, respectivamente. Cada corpo-de-prova foi, então, fragmentado e submetido ao procedimento de extração em MeOH por 2 horas. Os valores de conteúdo de monômero residual foram transformados em porcentagem e analisados pelo teste de Kruskall-Wallis, ao nível de confiança de 99%. Em todos os grupos avaliados, o material D apresentou valores médios de monômero residual (GI - 0,87%; GII - 0,71%; GIII - 0,52%) significativamente maiores (p